本發(fā)明涉及甾體藥物及其中間體的制備方法，特別涉及一種醋酸潑尼松及其中間體的制備方法。

背景技術(shù)：

甾體類藥物是銷售額僅次于抗生素的世界第二大類藥物，不同的甾體藥物分子結(jié)構(gòu)均由甾體激素中間體衍生而來。甾體激素中間體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法包括植物提取皂素法，其對環(huán)境有害，反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不唯一且成本較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

甾體激素具有很強的抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克的藥理作用，是治療風(fēng)濕、心血管、淋巴白血病、細胞性腦炎、皮膚病、抗腫瘤和搶救危重病人的重要用藥。其中，醋酸潑尼松是一種重要的甾體藥物，其化學(xué)式為：

醋酸潑尼松主要用于各種急性嚴重細菌感染，嚴重過敏性疾病、膠原性疾病(紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎等)、風(fēng)濕病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、嚴重支氣管哮喘、急性淋巴白血病、各種腎上腺皮質(zhì)功能不全癥等。

近年來，隨著我國醫(yī)藥生產(chǎn)技術(shù)的不斷進步，利用生物制造法選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈生產(chǎn)甾體中間體雄烯二酮(4ad)的技術(shù)已非常成熟，而且植物性甾醇廣泛存在于植物的根、莖、葉、果實和種子中，是植物細胞膜的組成部分，在所有來源于植物種子的油脂中都含有甾醇，目前利用最多的是谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等。因植物性甾醇來源廣泛，發(fā)酵技術(shù)成熟，使得4ad的制造成本比較低廉，特別是近年來，另一個甾體中間體雙烯價格的不斷上漲，相應(yīng)地以4ad為原料來制備甾體藥物具有較好的成本優(yōu)勢，同時，通過將4ad經(jīng)過三步反應(yīng)合成得到甾體藥物的重要中間體17α-羥基黃體酮也已經(jīng)工業(yè)化大生產(chǎn)，市面上有大量供應(yīng)。

因此，有必要開拓出一種采用17α-羥基黃體酮為原料，解決醋酸潑尼松生產(chǎn)過程中的于c11位羰基和1，2位雙鍵的引入不理想的工藝難點，以滿足醫(yī)學(xué)發(fā)展的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，本發(fā)明旨在提供一種醋酸潑尼松的制備方法，以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的17α-羥基黃體酮為原料，解決了醋酸潑尼松生產(chǎn)過程中的于c11位羰基和1，2位雙鍵的引入不理想的工藝難點，同時，該工藝路線具有成本低廉，操作簡單的特點，且可大大減少環(huán)境污染的壓力。

為了達到上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案：

一種醋酸潑尼松及其中間體的制備方法，以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的17α-羥基黃體酮為原料，首先通過混合微生物發(fā)酵法同時引入11位羥基和引入1，2位雙鍵，先得到11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮中間體；然后經(jīng)過氧化反應(yīng)，得到17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮，最后經(jīng)上碘置換反應(yīng)制得醋酸潑尼松，其具體技術(shù)路線如下所示：

上述醋酸潑尼松的制備方法，其具體步驟包括：

1)以17α-羥基黃體酮為原料通過混合微生物發(fā)酵，同時進行cll-羥化反應(yīng)和c1,2脫氫反應(yīng)制備11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮；

2)對11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮進行戴斯-馬丁試劑氧化，得到氧化反應(yīng)產(chǎn)物17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮；

3)對氧化反應(yīng)產(chǎn)物進行上碘置換反應(yīng)制得醋酸潑尼松。

作為優(yōu)選，進一步，第一步中以17α-羥基黃體酮為原料通過生物發(fā)酵法制備11α,17α-二羥基黃體酮的具體步驟為：

1)菌絲體培養(yǎng)

a)黑根霉菌絲培養(yǎng)

在搖瓶中加入培養(yǎng)基,接入黑根霉孢子,置于26℃,160rpm搖床,培養(yǎng)24-36h后,離心收集菌絲體，并在發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)備用；

b)簡單節(jié)桿菌菌體培養(yǎng)

在搖瓶中加入培養(yǎng)基,接入簡單節(jié)桿菌,置于30℃,120rpm搖床中,培養(yǎng)24-36h后,離心收集菌體，并在發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)備用；

2)混合培養(yǎng)，得目標產(chǎn)物

在反應(yīng)在ph為5～7、溫度為20～35℃的水相緩沖溶液中進行靜息細胞轉(zhuǎn)化,首先將生長成熟的黑根霉菌絲體置于含有緩沖液的發(fā)酵罐中,以17α-羥基黃體酮為原料,采用水溶液懸浮溶液,攪拌,培養(yǎng)1-2d后,加入成熟的簡單節(jié)桿菌菌體,繼續(xù)轉(zhuǎn)化3-5d后,薄層色譜分析，直至原料反應(yīng)完全為止，分離提純，得到目標產(chǎn)物11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮。

作為優(yōu)選，進一步，第二步中進行戴斯-馬丁試劑氧化的步驟為：

1)dmp氧化劑的制備

在配制罐中，加入7體積份的硫酸，邊攪拌邊加入1.5-2.4重量份的鄰碘苯甲酸，劇烈攪拌保持55℃，并加入1.4-2.2重量份的溴酸鉀，升溫至65℃并攪拌3-4小時，冷卻至0℃，過濾并用乙醇洗滌，干燥得化合物a備用；

在配制罐中加入4體積份的醋酐，0.1-0.5重量份的結(jié)晶水的對甲苯磺酸，邊攪拌邊加入化合物a升溫至80℃攪拌2小時，冷卻至0℃過濾，用ch3ch2-o-ch2ch3洗滌，即可得氧化劑b，備用；

2)氧化反應(yīng)

在反應(yīng)罐中，加入5-50重量份的溶劑(二氯甲烷)和1重量份的原料即11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮，攪拌溶清，分批加入配置好的氧化劑b，溫度控制在20-40℃，攪拌，直至原料反應(yīng)完全，加入飽和nahco3溶液洗滌，靜置，放料離心；接著用水沖洗，然后甩干，烘料，得類白色的固體氧化物即17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮。

作為優(yōu)選，進一步，第三步中進行上碘置換反應(yīng)，制備醋酸潑尼松的具體步驟為：

1)配制碘液：在碘液配制罐內(nèi)加入0.15重量份的無水氯化鈣、0.8-1.0重量份的碘和1.2重量份的甲醇，攪拌降溫溶解，備用；配制無水氯化鈣甲醇溶液：在配制罐中加入0.15重量份的無水氯化鈣和1.2重量份的甲醇，攪拌溶解，備用；配制氯化銨水溶液：在氯化銨配置罐中加入1重量份的氯化銨和5體積份的水，攪拌溶解，備用；

2)在上碘反應(yīng)罐中放入5體積份的氯仿、1重量份的氧化物即17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮、步驟1)配制好的無水氯化鈣甲醇溶液、0.5重量份的氧化鈣，攪拌，降溫至2-5℃，開始滴加步驟1)配制好的碘液，滴加2-4小時，再繼續(xù)保溫反應(yīng)，中控，直至反應(yīng)完全時停止反應(yīng)。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的17α-羥基黃體酮為原料，采用黑根霉菌和簡單節(jié)桿菌混合靜息細胞發(fā)酵，解決了醋酸潑尼松生產(chǎn)過程中的于c11位羰基和1，2位雙鍵的引入不理想的工藝難點，同時，該合成路線具有成本低廉，操作簡單的特點，且可大大減少環(huán)境污染的壓力。

2、本發(fā)明提供一種全新的氧化體系，可將化合物11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮的c11位羥基氧化成c11位羰基，此氧化方法成本較低，容易操作，污染小，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

3、產(chǎn)品質(zhì)量好；本發(fā)明提高了最終產(chǎn)物的選擇性，降低了產(chǎn)物的雜質(zhì)含量，使其符合糖皮質(zhì)激素類藥品的色度標準，同時醋酸潑尼松粗產(chǎn)品的hplc含量高達98％以上，采用此路線制備醋酸潑尼松，其收率和質(zhì)量可達到滿意的水平。

附圖說明

圖1為醋酸潑尼松hplc圖譜；

圖2為磷酸緩沖溶液ph對黑根霉菌轉(zhuǎn)化率的影響；

圖3為磷酸緩沖溶液ph對簡單節(jié)桿菌轉(zhuǎn)化率的影響；

圖4為磷酸緩沖溶液ph對混合發(fā)酵的影響；

圖5為投料濃度對混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程的影響。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明的實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

一種醋酸潑尼松的制備方法，以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的17α-羥基黃體酮為原料，首先通過混合微生物發(fā)酵法同時引入11位羥基和引入1，2位雙鍵，先得到11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮中間體；然后經(jīng)過氧化反應(yīng)，得到17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮，最后經(jīng)上碘置換反應(yīng)制得醋酸潑尼松，具體步驟為：

(1)以17α-羥基黃體酮為原料通過混合微生物發(fā)酵法制備11α,17α-二羥基黃體酮的具體步驟為：

1)菌絲體培養(yǎng)

a)黑根霉菌絲培養(yǎng)

在搖瓶中加入培養(yǎng)基,接入黑根霉孢子,置于26℃,160rpm搖床,培養(yǎng)24-36h后,離心收集菌絲體，并在發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)備用；

b)簡單節(jié)桿菌菌體培養(yǎng)

在搖瓶中加入培養(yǎng)基,接入簡單節(jié)桿菌,置于30℃,120rpm搖床中,培養(yǎng)24-36h后,離心收集菌體，并在發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)備用；

2)混合培養(yǎng)，得目標產(chǎn)物

在反應(yīng)在ph為5.2～7、溫度為20～35℃的水相緩沖溶液中進行靜息細胞轉(zhuǎn)化,首先將生長成熟的黑根霉菌絲體置于含有緩沖液的發(fā)酵罐中,以17α-羥基黃體酮為原料,采用水溶液懸浮溶液,攪拌,培養(yǎng)1-2d后,加入成熟的簡單節(jié)桿菌菌體,繼續(xù)轉(zhuǎn)化3-5d后,薄層色譜分析，直至原料反應(yīng)完全為止，分離提純，得到目標產(chǎn)物11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮。

作為優(yōu)選，在混合培養(yǎng)時，所述的水相緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液。

作為優(yōu)選，在混合培養(yǎng)時，磷酸鹽緩沖溶液體系中最適的ph為6.2，在此ph下，17α-羥基黃體酮的最適投料濃度為2g/l時，轉(zhuǎn)化率最高。

(2)進行戴斯-馬丁試劑氧化，制備藥物中間體

1)配置氧化劑

在配制罐中，加入7體積份的硫酸，邊攪拌邊加入1.5-2.4重量份的鄰碘苯甲酸，劇烈攪拌保持55℃，并加入1.4-2.2重量份的溴酸鉀，升溫至65℃并攪拌3-4小時，冷卻至0℃，過濾并用乙醇洗滌，干燥得化合物a備用；

在配制罐中加入4體積份的醋酐，0.1-0.5重量份的結(jié)晶水的對甲苯磺酸，邊攪拌邊加入化合物a升溫至80℃攪拌2小時，冷卻至0℃過濾，用ch3ch2-o-ch2ch3洗滌，即可得氧化劑b，備用；

2)氧化反應(yīng)

在反應(yīng)罐中，加入5-50重量份的溶劑(二氯甲烷)和1重量份的原料即11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮，攪拌溶清，分批加入配置好的氧化劑b，溫度控制在20-40℃，攪拌，直至原料反應(yīng)完全，加入飽和nahco3溶液洗滌，靜置，放料離心；接著用水沖洗，然后甩干，烘料，得類白色的固體氧化物即17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮。

(3)進行上碘置換反應(yīng)，制備醋酸潑尼松的具體步驟為：

1)配制碘液：在碘液配制罐內(nèi)加入0.15重量份的無水氯化鈣、0.8-1.0重量份的碘和1.2重量份的甲醇，攪拌降溫溶解，備用；配制無水氯化鈣甲醇溶液：在配制罐中加入0.15重量份的無水氯化鈣和1.2重量份的甲醇，攪拌溶解，備用；配制氯化銨水溶液：在氯化銨配置罐中加入1重量份的氯化銨和5體積份的水，攪拌溶解，備用；

2)在上碘反應(yīng)罐中放入5體積份的氯仿、1重量份的氧化物即17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮、步驟1)配制好的無水氯化鈣甲醇溶液、0.5重量份的氧化鈣，攪拌，降溫至2-5℃，開始滴加步驟1)配制好的碘液，滴加2-4小時，再繼續(xù)保溫反應(yīng)，中控，直至反應(yīng)完全時停止反應(yīng)。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實施例1

一種醋酸潑尼松藥物中間體的制備方法，所述的醋酸潑尼松藥物中間體為11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮，其具體制備步驟為：

1)菌絲體培養(yǎng)

a)黑根霉菌絲培養(yǎng)

在搖瓶中加入培養(yǎng)基,接入黑根霉孢子,置于26℃,160rpm搖床,培養(yǎng)24-36h后,離心收集菌絲體，并在發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)備用；

b)簡單節(jié)桿菌菌體培養(yǎng)

在搖瓶中加入培養(yǎng)基,接入簡單節(jié)桿菌,置于30℃,120rpm搖床中,培養(yǎng)24-36h后,離心收集菌體，并在發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)備用；

2)混合培養(yǎng)，得目標產(chǎn)物

在反應(yīng)在ph為5～7、溫度為20～35℃的水相緩沖溶液中進行靜息細胞轉(zhuǎn)化,首先將生長成熟的黑根霉菌絲體置于含有緩沖液的發(fā)酵罐中,以17α-羥基黃體酮為原料,采用水溶液懸浮溶液,攪拌,培養(yǎng)24h后,加入成熟的簡單節(jié)桿菌菌體,繼續(xù)轉(zhuǎn)化72h后,薄層色譜分析，直至原料反應(yīng)完全為止，分離提純，得到目標產(chǎn)物11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮，經(jīng)檢測hplc含量為93.2％。。

實施例2

一種醋酸潑尼松藥物中間體的制備方法，所述的醋酸潑尼松藥物中間體為17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮，其具體制備步驟為：

1)dmp氧化劑的制備

在配制罐中，加入7體積份的硫酸，邊攪拌邊加入1.5-2.4重量份的鄰碘苯甲酸，劇烈攪拌保持55℃，并加入1.4-2.2重量份的溴酸鉀，升溫至65℃并攪拌3-4小時，冷卻至0℃，過濾并用乙醇洗滌，干燥得化合物a備用；

在配制罐中加入4體積份的醋酐，0.1-0.5重量份的結(jié)晶水的對甲苯磺酸，邊攪拌邊加入化合物a升溫至80℃攪拌2小時，冷卻至0℃過濾，用ch3ch2-o-ch2ch3洗滌，即可得氧化劑b，備用；

2)氧化反應(yīng)

在反應(yīng)罐中，加入5-50重量份的溶劑(二氯甲烷)和1重量份的原料即11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮，攪拌溶清，分批加入配置好的氧化劑b，溫度控制在20-40℃，攪拌，直至原料反應(yīng)完全，加入飽和nahco3溶液洗滌，靜置，放料離心；接著用水沖洗，然后甩干，烘料，得類白色的固體氧化物即17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮，經(jīng)檢測hplc含量為97.8％。

實施例3

一種醋酸潑尼松的制備方法，以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的17α-羥基黃體酮為原料，首先通過生物發(fā)酵法同時引入11位羥基和引入1，2位雙鍵，先得到11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮中間體；然后經(jīng)過氧化反應(yīng)，得到17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮，最后經(jīng)上碘置換反應(yīng)制得醋酸潑尼松，具體步驟為：

(1)以17α-羥基黃體酮為原料通過生物發(fā)酵法制備11α,17α-二羥基黃體酮的具體步驟為：

1)菌絲體培養(yǎng)

a)黑根霉菌絲培養(yǎng)

在搖瓶中加入培養(yǎng)基,接入黑根霉孢子,置于26℃,160rpm搖床,培養(yǎng)24-36h后,離心收集菌絲體，并在發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)備用；

b)簡單節(jié)桿菌菌體培養(yǎng)

在搖瓶中加入培養(yǎng)基,接入簡單節(jié)桿菌,置于30℃,120rpm搖床中,培養(yǎng)24-36h后,離心收集菌體，并在發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)備用；

2)混合培養(yǎng)，得目標產(chǎn)物

在反應(yīng)在ph為5.2～7、溫度為10～45℃的水相緩沖溶液中進行靜息細胞轉(zhuǎn)化,首先將生長成熟的黑根霉菌絲體置于含有緩沖液的發(fā)酵罐中,以17α-羥基黃體酮為原料,采用水溶液懸浮溶液,攪拌,培養(yǎng)24h后,加入成熟的簡單節(jié)桿菌菌體,繼續(xù)轉(zhuǎn)化72h后,薄層色譜分析，直至原料反應(yīng)完全為止，分離提純，得到目標產(chǎn)物11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮。

(2)進行戴斯-馬丁試劑氧化，制備藥物中間體

1)配置氧化劑

在配制罐中，加入7體積份的硫酸，邊攪拌邊加入1.5-2.4重量份的鄰碘苯甲酸，劇烈攪拌保持55℃，并加入1.4-2.2重量份的溴酸鉀，升溫至65℃并攪拌3-4小時，冷卻至0℃，過濾并用乙醇洗滌，干燥得化合物a備用；

在配制罐中加入4體積份的醋酐，0.1-0.5重量份的結(jié)晶水的對甲苯磺酸，邊攪拌邊加入化合物a升溫至80℃攪拌2小時，冷卻至0℃過濾，用ch3ch2-o-ch2ch3洗滌，即可得氧化劑b，備用；

2)氧化反應(yīng)

在反應(yīng)罐中，加入5-50重量份的溶劑(二氯甲烷)和1重量份的原料即11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮，攪拌溶清，分批加入配置好的氧化劑b，溫度控制在20-40℃，攪拌，直至原料反應(yīng)完全，加入飽和nahco3溶液洗滌，靜置，放料離心；接著用水沖洗，然后甩干，烘料，得類白色的固體氧化物即17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮。

(3)進行上碘置換反應(yīng)，制備醋酸潑尼松的具體步驟為：

1)配制碘液：在碘液配制罐內(nèi)加入0.15重量份的無水氯化鈣、0.8-1.0重量份的碘和1.2重量份的甲醇，攪拌降溫溶解，備用；配制無水氯化鈣甲醇溶液：在配制罐中加入0.15重量份的無水氯化鈣和1.2重量份的甲醇，攪拌溶解，備用；配制氯化銨水溶液：在氯化銨配置罐中加入1重量份的氯化銨和5體積份的水，攪拌溶解，備用；

2)在上碘反應(yīng)罐中放入5體積份的氯仿、1重量份的氧化物即17α-羥基孕甾-1，4-二烯-3,11,20-三酮、步驟1)配制好的無水氯化鈣甲醇溶液、0.5重量份的氧化鈣，攪拌，降溫至2-5℃，開始滴加步驟1)配制好的碘液，滴加2-4小時，再繼續(xù)保溫反應(yīng)，中控，直至反應(yīng)完全時停止反應(yīng)，經(jīng)檢測hplc含量為98.2％。

實驗分析1

在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的17α-羥基黃體酮為原料時，引入11位羥基和引入1，2位雙鍵的過程中，為了提高生產(chǎn)效率，通過混合發(fā)酵法進行實現(xiàn)cll-羥化反應(yīng)和c1,2脫氫反應(yīng)，其中，采用了黑根霉菌和簡單節(jié)桿菌進行細胞靜息發(fā)酵培養(yǎng)。在進行混合發(fā)酵時，對發(fā)酵體系中的水相緩沖溶液的ph值進行探究。

(1)緩沖溶液ph對黑根霉靜息細胞轉(zhuǎn)化過程的影響

配制12個50ml濃度為0.2mol/l的nah2po4-nahpo4磷酸緩沖溶液樣品,置于250ml的搖瓶中,調(diào)節(jié)ph分別為5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,每個ph梯度下配制兩個平行樣品,滅30min。將培養(yǎng)成熟的黑根霉菌絲放入該緩沖溶液中進行靜息細胞轉(zhuǎn)化,17α-羥基黃體酮的投料濃度為1g/l,26℃,160rpm搖床中轉(zhuǎn)化48h后,取樣進行hplc分析,結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出,緩沖液ph從5.5到7.5之間變化對轉(zhuǎn)化率的影響并不是很明顯,轉(zhuǎn)化率都在60％以上。而ph為8.0時,轉(zhuǎn)化率明顯下降,過高的ph使黑根霉的羥化酶的酶活降低。當(dāng)ph為7.0時,底物的轉(zhuǎn)化率最高,為84.25％。

(2)緩沖溶液ph對簡單節(jié)桿菌靜息細胞轉(zhuǎn)化過程的影響

如步驟1配制不同ph的磷酸緩沖溶液,進行簡單節(jié)桿菌的靜息細胞轉(zhuǎn)化工藝研究,17α-羥基黃體酮的投料濃度為1g/l,采用4％的乙醇懸浮投料,30℃、120rpm搖床中轉(zhuǎn)化72h后,取樣進行hplc分析,結(jié)果如圖3所示。緩沖液ph從6.0到7.5之間的變化對簡單節(jié)桿菌的轉(zhuǎn)化率影響不大,轉(zhuǎn)化率都在92％左右。ph為8.0時的轉(zhuǎn)化率最低。在ph為7.0時,轉(zhuǎn)化率最高,達到了92.14％。而簡單節(jié)桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的合適ph在7.2-7.3之間。說明脫氫酶受緩沖液的影響不大,比較穩(wěn)定。

(3)緩沖溶液ph對混合發(fā)酵過程影響

配制不同ph的磷酸緩沖溶液進行黑根霉和簡單節(jié)桿菌的混合發(fā)酵研究,中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率如圖4所示,其中中間產(chǎn)物為11α，17α-羥基黃體酮,最終產(chǎn)物為11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮。

從圖4中可以看到,隨著ph的增大,最終產(chǎn)物的量先增大后減少,之后又增大再迅速減少,出現(xiàn)兩個峰值。當(dāng)ph6.2時,出現(xiàn)第一個最大值,終產(chǎn)物占到了93.52％,而之后在7.0時,出現(xiàn)第二個峰值為78.92％。而中間產(chǎn)物的量一直比較小,維持在21％之內(nèi),在ph為6.5時,有最大值20.12％。未轉(zhuǎn)化的底物在ph6.0時為。之后隨著ph的增大,一直增加,在ph為8.0時,未轉(zhuǎn)化的底物量占到了總量的85.17％。

從(1)、(2)中可以看出,ph小于7.5時,黑根霉和簡單節(jié)桿菌在緩沖液中的催化能力差別不大,所以在混合發(fā)酵過程,ph在7.5之前的底物的轉(zhuǎn)化率相對都比較高,最終產(chǎn)物的量都在60％以上。隨著ph從5.5增大到7.0,黑根霉的羥化能力和簡單節(jié)桿菌的脫氫能力都不斷增強,經(jīng)過24h的羥化反應(yīng)后,生成的羥化物的量很有可能也隨著ph的增大而增大,少量的黑根霉的羥化產(chǎn)物在為簡單節(jié)桿菌進行脫氫反應(yīng)提供底物的同時,也可能是脫氫反應(yīng)的誘導(dǎo)劑,從而加速了脫氫的效果,而羥化脫氫物反過來又可能對羥化反應(yīng)起了進一步的誘導(dǎo)作用,兩者形成了良勝循環(huán),所以在ph6.2時,底物被完全轉(zhuǎn)化,最終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率達到了93.2％。而ph在5.5時由于兩菌種的酶活都不如ph6.2時的酶活高,故轉(zhuǎn)化效果不如ph6.2時。之后隨著ph的增大,羥化產(chǎn)物積累的比較多,可能對簡單節(jié)桿菌的脫氫起到了抑制作用,最終產(chǎn)物有所下降,反過來脫氫效果的變差也在一定程度上反抑制了黑根霉的羥化反應(yīng),所以使得未轉(zhuǎn)化的底物也不斷增多,而在ph7.o時,雖然未轉(zhuǎn)化的底物比較多,但是因為該ph下,黑根霉和簡單節(jié)桿菌的協(xié)同作用轉(zhuǎn)換率達到了最高，所以最終產(chǎn)物的量還是比較高。而當(dāng)ph為8.0時,羥化酶和脫氫酶活性大大降低,使得只有極少量底物被微生物所催化,最終產(chǎn)物的量和中間產(chǎn)物的量分別只有10.7％和4.1％。因此,綜合考慮最終產(chǎn)物的生成量和未轉(zhuǎn)化底物的量,確定該混合發(fā)酵體系的最佳ph為6.2。

實驗分析2

實驗考察了在最適的緩沖液ph為6.0時,不同底物投料濃度下,混合發(fā)酵過程的終產(chǎn)物、中間產(chǎn)物和未轉(zhuǎn)化底物的變化情況。結(jié)果如圖5所示，可見,投料濃度為2g/l時,終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率有93.6％。隨著投料濃度的增大,底物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率呈直線不斷降低,而中間產(chǎn)物的量一直維持在10％左右,當(dāng)投料濃度為10g/l時,才開始有所下降。未轉(zhuǎn)化的底物則是隨著投料濃度的增大而增大。因此考慮到終產(chǎn)物的得率,比較適合的投料濃度為2g/l。

本發(fā)明以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的17α-羥基黃體酮為原料，采用黑根霉菌和簡單節(jié)桿菌混合靜息細胞發(fā)酵，解決了醋酸潑尼松生產(chǎn)過程中的于c11位羰基和1，2位雙鍵的引入不理想的工藝難點，同時，該技術(shù)路線具有成本低廉，操作簡單的特點，且可大大減少環(huán)境污染的壓力；本發(fā)明提供一種全新的氧化體系，可將化合物11α,17α-二羥基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮的c11位羥基氧化成c11位羰基，此氧化方法成本較低，容易操作，污染小，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。同時，本發(fā)明提高了最終產(chǎn)物的選擇性，降低了產(chǎn)物的雜質(zhì)含量，使其符合糖皮質(zhì)激素類藥品的色度標準，同時醋酸潑尼松粗產(chǎn)品的hplc含量高達98％以上，采用此路線制備醋酸潑尼松，其收率和質(zhì)量可達到滿意的水平。

最終，以上實施例僅用以說明發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。