本發(fā)明涉及結直腸癌檢測
技術領域：
，具體來說是一種應用數(shù)字PCR檢測結直腸癌患者尿液中EGFR基因突變的方法。
背景技術：
：據(jù)國家癌癥中心全國腫瘤登記數(shù)據(jù)報告，我國城市和農村地區(qū)結直腸癌發(fā)病率分別列所有惡性腫瘤的第3位及第5位，病死率分別居第4位和第5位，我國結直腸癌的發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢，手術仍是治療結直腸癌的主要手段，但效果并不理想。表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）EGFR廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞表面，EGFR信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用，EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關信號通路中關鍵因子的活性或細胞定位異常，均會引起腫瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的發(fā)生，EGFR存在于大多數(shù)細胞中，在多種腫瘤中都有表達，如結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌等，其中在結直腸癌的陽性表達率為25%?77%。近年來，應用靶向藥物治療癌癥取得了重要進展，已證實EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TyrosineKinaseInhibitors,EGFR-TKIs）在EGFR突變的肺癌患者治療中取得確切的療效，因此，在目前抗腫瘤分子靶向治療中，EGFR成為靶向藥物治療結直腸癌最受關注的治療靶點之一.EGFR基因突變常集中在細胞內的酪氨酸激酶區(qū)域，突變率最高的是19外顯子的2種缺失突變（delE746-A750)和21外顯子的點突變（L858R)，研究顯示二者在所有EGFR基因突變中的比例占90%以上，其中，外顯子21上的L858R點突變通常是替代突變，2573位的T由G取代，導致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸變?yōu)榫彼?CTG—CGG)，因此EGFR外顯子21L858R點突變的檢測，可以為篩選靶向治療患者提供參考，同時可用于癌癥患者用藥期間耐藥性突變監(jiān)測。在結直腸癌患者中，EGFR基因突變率較高，具有重要的研究意義，但是，如何準確而有效的檢測EGFR突變狀態(tài)仍是一個迫切需要解決的問題，在目前診斷檢測中，樣本來源和檢測方法是主要限制方向，現(xiàn)在普遍通過侵入式活組織檢查法確診，價格昂貴、復雜，既費時又費力，不能及時檢查或不便多次檢測，而檢測方法中，PCR產(chǎn)物測序法雖然是公認的檢測標準，但是靈敏度并不高；PCR-RFLP可用于檢測基因多態(tài)性，雖然靈敏，但是由于其設計操作復雜費時，使用起來受限制；變性高效液相色譜（DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC）具有靈敏度高，檢測快，高通量，且操作自動化的優(yōu)點，但是由于其對檢測類型有一點的選擇，且成本較高，使用起來很受限制，因此，缺少一種低成本、無創(chuàng)、易操作且特異性高的EGFR突變檢測方法。ARMS法又稱突變擴增阻滯系統(tǒng)，是以TaqDNA聚合酶缺少3`-5`外切酶活性，不能修復擴增時引物3`末端單個堿基的錯配為基礎，引物的3`端堿基與位點等位基因互補時，則繼續(xù)擴增，當引物3`端堿基與位點等位基因錯配時，則擴增停止或者是效率嚴重下降，ARMS-PCR方法靈敏度不足以對血液、尿液等體液進行檢測，局限了臨床醫(yī)生對靶向藥物療效的判斷。1999年Vogelstein和Kinzler首次提出了"數(shù)字PCR(digitalPCR,dPCR)"的概念，dPCR具有極高的檢測敏感性，且具有不易被PCR反應抑制劑干擾等特點，目前，dPCR技術以其極高的敏感性、絕對計數(shù)能力和無需定標等特性而在腫瘤分子診斷工作中得到了廣泛的應用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術中的檢測精確度差、靈敏度不足的缺陷，提供一種應用數(shù)字PCR檢測結直腸癌患者尿液中EGFR基因突變的方法來解決上述問題。本發(fā)明公開了一種應用數(shù)字PCR檢測結直腸癌患者尿液中EGFR基因突變的方法，具體步驟為：步驟一、提取尿液中的DNA模板：a、收集40ml尿液樣本，在4℃、5000rpm的條件下離心10min，離心完成后收集底部的沉淀；b、取1.5mlTE緩沖液，加入到步驟a收集的沉淀內，混合均勻后，在8000rpm的條件下離心5min，離心完成后，收集底部的沉淀；c、另取1.5mlTE緩沖液，加入到步驟b收集的沉淀內，混合均勻后，在8000rpm的條件下離心5min，離心完成后，收集底部的沉淀；d、取500ul裂解液和10ul蛋白酶K加入到步驟c收集的沉淀內，在55℃的條件下，水浴1小時，沉淀溶解，得到溶液；e、將溶液取出，冷卻至室溫后，向溶液內加入等體積的飽和酚，混合均勻后，在5000rpm的條件下離心10min，離心完成后，棄上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的異戊醇，混勻，在5000rpm的條件下，離心10min，棄上清，得到混合液；g、加入占步驟f制得的混合液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，再加入2.5倍步驟f制得的混合液體積的無水乙醇，混合均勻后，在-20℃的條件下放置1h后，10000rpm離心15min，棄上清；h、加入500μL70%的乙醇溶液洗滌2次，晾干后，加入50μLTE緩沖液，即完成了對尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板，在－20℃的條件下保存?zhèn)溆?；步驟二、制備ddPCR反應液：室溫條件下溶解PCR引物、blocker及TaqMan探針，并制備10x引物/blocker/TaqMan-MGB引物預混液，其中，PCR上下游引物和blocker的濃度均為0.9μmol/L，TaqMan探針的濃度為0.2μmol/L，之后，將引物預混液、DNA模板、ddPCRSuperMix（BioRad）配置成20μLddPCR反應液，反應液的構成如下表所示：；步驟三、制備微滴：將配好的ddPCR反應液加入到微滴發(fā)生板上，將微滴發(fā)生板裝入到QX100八通道微滴發(fā)生器，在每個孔中加入70μL微滴生成油來形成微滴；步驟四、PCR擴増：將樣本生成的微滴手動轉移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封，然后置于PCR儀中進行PCR擴増；步驟五、檢測微滴：PCR擴增后，將96孔PCR板置于QX100微滴分析儀中，依次吸取每個樣本中的微滴并隨載液流逐一通過雙色檢測器，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性；步驟六、分析數(shù)據(jù)以及顯示結果：采用QuantaSoft軟件分析ddPCR數(shù)據(jù)確定等位基因分型，當樣本中至少有2個微滴出現(xiàn)在FAM信號的陽性區(qū)域時，認為該樣本此突變?yōu)殛栃?，否則為陰性。作為優(yōu)選，所述的裂解液的組分構成為：10mMTris-HCl，1mMEDTA,0.5%SDS。作為優(yōu)選，所述的步驟二中，所述的引物預混液中，引物序列如下：正向引物序列F:5`-AGATCACAGATTTTGGGCG-3`反向引物序列R:5`-GAAAATGCTGGCTGACCTAAA-3`TaqMan-MGB探針序列：5`-FAM-GTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG-BHQ-3`Blocker序列:5`-ATCACAGATTTTGGGCT-PO4-3`。作為優(yōu)選，所述的步驟四中，檢測的熱循環(huán)模式為：95℃孵育10min；95℃15s，63℃孵育1min，共45個循環(huán)；最后置于4℃中。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點：本發(fā)明將ARMS和數(shù)字PCR結合起來，通過檢測患者尿液中EGFR突變情況，解決了現(xiàn)有技術中對結直腸癌患者進行EGFR基因突變檢測時繁瑣、費時和靈敏度低等問題，尤其是提供了病理組織之外的非創(chuàng)傷性檢測。本發(fā)明檢測的突變位點為EGFR基因L858R突變，所述試劑盒中，檢測EGFR基因L858R突變的引物對由5`-AGATCACAGATTTTGGGCG-3`所示的上游引物和5`-GAAAATGCTGGCTGACCTAAA-3`所示的下游引物組成，TaqMan-MGB探針的核巧酸序列如5`-FAM-GTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG-BHQ-3`所示，blocker序列如5`-ATCACAGATTTTGGGCT-PO4-3`所示，Blocker是指一種3`端磷酸化或者間臂等修飾的寡核苷酸，在PCR反應中沒有探針延伸擴增的功能，blocker和模板的特異結合部位覆蓋了探針的結合部位，當非突變DNA存在時，blocker與之結合致使探針無法和非突變DNA結合，從而提高探針和突變DNA結合的特異性。附圖說明圖1表示EGFR21外顯子L858R突變患者檢測結果；圖2表示EGFR21外顯子未突變患者的檢測結果。具體實施方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。如圖1-2所示，本發(fā)明公開了一種應用數(shù)字PCR檢測結直腸癌患者尿液中EGFR基因突變的方法，具體步驟為：步驟一、提取尿液中的DNA模板：a、收集40ml尿液樣本，在4℃、5000rpm的條件下離心10min，離心完成后收集底部的沉淀；b、取1.5mlTE緩沖液，加入到步驟a收集的沉淀內，混合均勻后，在8000rpm的條件下離心5min，離心完成后，收集底部的沉淀；c、另取1.5mlTE緩沖液，加入到步驟b收集的沉淀內，混合均勻后，在8000rpm的條件下離心5min，離心完成后，收集底部的沉淀；d、取500ul裂解液和10ul蛋白酶K加入到步驟c收集的沉淀內，在55℃的條件下，水浴1小時，沉淀溶解，得到溶液；e、將溶液取出，冷卻至室溫后，向溶液內加入等體積的飽和酚，混合均勻后，在5000rpm的條件下離心10min，離心完成后，棄上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的異戊醇，混勻，在5000rpm的條件下，離心10min，棄上清，得到混合液；g、加入占步驟f制得的混合液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，再加入2.5倍步驟f制得的混合液體積的無水乙醇，混合均勻后，在-20℃的條件下放置1h后，10000rpm離心15min，棄上清；h、加入500μL70%的乙醇溶液洗滌2次，晾干后，加入50μLTE緩沖液，即完成了對尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板，在－20℃的條件下保存?zhèn)溆?；步驟二、制備ddPCR反應液：室溫條件下溶解PCR引物、blocker及TaqMan探針，并制備10x引物/blocker/TaqMan-MGB引物預混液，其中，PCR上下游引物和blocker的濃度均為0.9μmol/L，TaqMan探針的濃度為0.2μmol/L，之后，將引物預混液、DNA模板、ddPCRSuperMix（BioRad）配置成20μLddPCR反應液，反應液的構成如下表所示：；步驟三、制備微滴：將配好的ddPCR反應液加入到微滴發(fā)生板上，將微滴發(fā)生板裝入到QX100八通道微滴發(fā)生器，在每個孔中加入70μL微滴生成油來形成微滴；步驟四、PCR擴増：將樣本生成的微滴手動轉移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封，然后置于PCR儀中進行PCR擴増；步驟五、檢測微滴：PCR擴增后，將96孔PCR板置于QX100微滴分析儀中，依次吸取每個樣本中的微滴并隨載液流逐一通過雙色檢測器，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性；步驟六、分析數(shù)據(jù)以及顯示結果：采用QuantaSoft軟件分析ddPCR數(shù)據(jù)確定等位基因分型，當樣本中至少有2個微滴出現(xiàn)在FAM信號的陽性區(qū)域時，認為該樣本此突變?yōu)殛栃?，否則為陰性。作為優(yōu)選，所述的裂解液的組分構成為：10mMTris-HCl，1mMEDTA,0.5%SDS。作為優(yōu)選，所述的步驟二中，所述的引物預混液中，引物序列如下：正向引物序列F:5`-AGATCACAGATTTTGGGCG-3`反向引物序列R:5`-GAAAATGCTGGCTGACCTAAA-3`TaqMan-MGB探針序列：5`-FAM-GTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG-BHQ-3`Blocker序列:5`-ATCACAGATTTTGGGCT-PO4-3`。作為優(yōu)選，所述的步驟四中，檢測的熱循環(huán)模式為：95℃孵育10min；95℃15s，63℃孵育1min，共45個循環(huán)；最后置于4℃中。實施例1以檢測位于c.2573的EGFR外顯子21上L858R點突變?yōu)槔唧w方法為：步驟一、提取尿液中的DNA模板：a、收集結直腸癌患者尿液樣本40ml，在4℃、5000rpm的條件下離心10min，離心完成后收集底部的沉淀；b、取1.5mlTE緩沖液，加入到步驟a收集的沉淀內，混合均勻后，在8000rpm的條件下離心5min，離心完成后，收集底部的沉淀；c、另取1.5mlTE緩沖液，加入到步驟b收集的沉淀內，混合均勻后，在8000rpm的條件下離心5min，離心完成后，收集底部的沉淀；d、取500ul裂解液和10ul蛋白酶K加入到步驟c收集的沉淀內，在55℃的條件下，水浴1小時，沉淀溶解，得到溶液；e、將溶液取出，冷卻至室溫后，向溶液內加入等體積的飽和酚，混合均勻后，在5000rpm的條件下離心10min，離心完成后，棄上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的異戊醇，混勻，在5000rpm的條件下，離心10min，棄上清，得到混合液；g、加入占步驟f制得的混合液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，再加入2.5倍步驟f制得的混合液體積的無水乙醇，混合均勻后，在-20℃的條件下放置1h后，10000rpm離心15min，棄上清；h、加入500μL70%的乙醇溶液洗滌2次，晾干后，加入50μLTE緩沖液，即完成了對尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板，在－20℃的條件下保存?zhèn)溆茫徊襟E二、制備ddPCR反應液：室溫條件下溶解PCR引物、blocker及TaqMan探針，并制備10x引物/blocker/TaqMan-MGB引物預混液，其中，PCR上下游引物和blocker的濃度均為0.9μmol/L，TaqMan探針的濃度為0.2μmol/L，之后，將引物預混液、DNA模板、ddPCRSuperMix（BioRad）配置成20μLddPCR反應液，反應液的構成如下表所示：；步驟三、制備微滴：將配好的ddPCR反應液加入到微滴發(fā)生板上，將微滴發(fā)生板裝入到QX100八通道微滴發(fā)生器，在每個孔中加入70μL微滴生成油來形成微滴；步驟四、PCR擴増：將樣本生成的微滴手動轉移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封，然后置于PCR儀中進行PCR擴増；步驟五、檢測微滴：PCR擴增后，將96孔PCR板置于QX100微滴分析儀中，依次吸取每個樣本中的微滴并隨載液流逐一通過雙色檢測器，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性；步驟六、分析數(shù)據(jù)以及顯示結果：采用QuantaSoft軟件分析ddPCR數(shù)據(jù)確定等位基因分型，當樣本中至少有2個微滴出現(xiàn)在FAM信號的陽性區(qū)域時，認為該樣本此突變?yōu)殛栃?，否則為陰性。所述的裂解液的組分構成為：10mMTris-HCl，1mMEDTA,0.5%SDS。所述的步驟二中，所述的引物預混液中，引物序列如下：正向引物序列F5`-AGATCACAGATTTTGGGCG-3`反向引物序列R5`-GAAAATGCTGGCTGACCTAAA-3`TaqMan-MGB探針序列5`-FAM-GTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG-BHQ-3`Blocker序列5`-ATCACAGATTTTGGGCT-PO4-3`所述的步驟四中，檢測的熱循環(huán)模式為：95℃孵育10min；95℃15s，63℃孵育1min，共45個循環(huán)；最后置于4℃中。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明要求的保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。當前第1頁1 2 3