技術(shù)特征：

1.一種應(yīng)用數(shù)字PCR檢測結(jié)直腸癌患者尿液中EGFR基因突變的方法，其特征在于：具體步驟為：

步驟一、提取尿液中的DNA模板：

收集40ml尿液樣本，在4℃、5000rpm 的條件下離心 10min，離心完成后收集底部的沉淀；

b、取1.5 ml TE 緩沖液，加入到步驟a收集的沉淀內(nèi)，混合均勻后，在8000rpm 的條件下離心5min，離心完成后，收集底部的沉淀；

c、另取1.5 ml TE 緩沖液，加入到步驟b收集的沉淀內(nèi)，混合均勻后，在8000rpm 的條件下離心5min，離心完成后，收集底部的沉淀；

d、取500ul裂解液和10 ul蛋白酶K加入到步驟c收集的沉淀內(nèi)， 在55℃的條件下，水浴1小時，沉淀溶解，得到溶液；

e、將溶液取出，冷卻至室溫后，向溶液內(nèi)加入等體積的飽和酚，混合均勻后，在5000 rpm的條件下離心10 min，離心完成后，棄上清；

f、加入432μL的氯仿和18μL的異戊醇，混勻，在5000 rpm的條件下，離心10 min，棄上清，得到混合液；

g、加入占步驟f制得的混合液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，再加入2.5倍步驟f制得的混合液體積的無水乙醇，混合均勻后，在-20℃ 的條件下放置1h后，10000 rpm離心15min，棄上清；

h、加入500μL 70%的乙醇溶液洗滌2次，晾干后，加入50μL TE緩沖液，即完成了對尿液中 DNA的抽提，得到了DNA模板，在－20℃的條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二、制備ddPCR反應(yīng)液：

室溫條件下溶解PCR引物、blocker及TaqMan探針，并制備10x引物/ blocker/ TaqMan-MGB 引物預(yù)混液，其中，PCR上下游引物和blocker的濃度均為0.9 μmol/L，TaqMan探針的濃度為0.2 μmol/L，之后，將引物預(yù)混液、DNA模板、ddPCR SuperMix（Bio Rad）配置成20 μL ddPCR反應(yīng)液，反應(yīng)液的構(gòu)成如下表所示：

；

步驟三、制備微滴：

將配好的ddPCR反應(yīng)液加入到微滴發(fā)生板上，將微滴發(fā)生板裝入到QX100八通道微滴發(fā)生器，在每個孔中加入70 μL微滴生成油來形成微滴；

步驟四、PCR擴(kuò)増：

將樣本生成的微滴手動轉(zhuǎn)移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封，然后置于PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)増；

步驟五、檢測微滴：

PCR擴(kuò)增后，將96孔PCR板置于QX100微滴分析儀中，依次吸取每個樣本中的微滴并隨載液流逐一通過雙色檢測器，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性；

步驟六、分析數(shù)據(jù)以及顯示結(jié)果：

采用QuantaSoft軟件分析ddPCR數(shù)據(jù)確定等位基因分型，當(dāng)樣本中至少有2個微滴出現(xiàn)在FAM信號的陽性區(qū)域時，認(rèn)為該樣本此突變?yōu)殛栃?，否則為陰性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用數(shù)字PCR檢測結(jié)直腸癌患者尿液中EGFR基因突變的方法，其特征在于：所述的裂解液的組分構(gòu)成為：10mM Tris-HCl ，1mM EDTA, 0.5% SDS。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用數(shù)字PCR檢測結(jié)直腸癌患者尿液中EGFR基因突變的方法，其特征在于：所述的步驟二中，所述的引物預(yù)混液中，引物序列如下：

正向引物序列 F: 5`-AGATCACAGATTTTGGGCG-3`

反向引物序列 R: 5`-GAAAATGCTGGCTGACCTAAA-3`

TaqMan-MGB探針序列：5`-FAM-GTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG-BHQ-3`

Blocker序列: 5`-ATCACAGATTTTGGGCT-PO4-3`。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用數(shù)字PCR檢測結(jié)直腸癌患者尿液中EGFR基因突變的方法，其特征在于：所述的步驟四中，檢測的熱循環(huán)模式為：95 ℃孵育10min；95℃15s， 63℃孵育1min，共45個循環(huán)；最后置于4 ℃中。