本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫抑制劑重組蛋白設(shè)計和合成方法。

背景技術(shù)：

白細(xì)胞介素-35（Interleukin 35, IL-35）是IL-12家族成員。2009年Collison等首次發(fā)現(xiàn)其可由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory Tcell, Treg）分泌產(chǎn)生，并具有免疫抑制功能。近年來大量研究均證實其在腫瘤、感染性疾病及肉芽腫性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有調(diào)節(jié)作用。

IL-35亞基是通過與其受體gp130和IL-12Rβ2結(jié)合啟動JAK-STAT信號通路共同參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)。且只有IL-12Rβ2和gp130組成的異二聚體通過磷酸化構(gòu)成STAT1-STAT4異二聚體才能使IL-35與受體結(jié)合后發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能。IL-35極有可能成為基于免疫調(diào)控機(jī)制的疾病治療新靶點(diǎn)。

目前，國內(nèi)外還未見針對IL-35受體融合蛋白的相關(guān)報道。

因此，構(gòu)建gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白真核表達(dá)載體，將為在體外環(huán)境中研究IL-35信號通路的臨床價值奠定重要基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是填補(bǔ)了IL-35受體融合蛋白領(lǐng)域的空白，采用基因融合的方法將IL-35的兩個受體gp130和IL-12Rβ2胞外段基因融合入一真核表達(dá)載體，為在體外環(huán)境中研究IL-35及其受體阻斷劑的研究奠定基礎(chǔ)。

一種免疫抑制劑重組蛋白，該免疫抑制劑重組蛋白的真核載體為GV140-gp130-IL-12Rβ2，包含了人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段，該基因片段包括人gp130和IL-12Rβ2胞外段的基因。其獲得方法為：

所述免疫抑制劑重組蛋白中包含人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段通過以下方法獲得：

第一步，為使用PCR方法擴(kuò)增gp130和IL-12Rβ2胞外段的基因，并最終采用轉(zhuǎn)化方法獲得融合蛋白基因；首先結(jié)合人gp130胞外段序列和IL-12Rβ2胞外段序列設(shè)計擴(kuò)增兩者的引物序列，序列包含連接子、酶切位點(diǎn)；gp130胞外段的引物序列：上游5’-AA GGA TCC ATAGGTGATCCCACTTGCTT-3’，下游5’-AA AGA TCT GGG CTC TAC GTA GAA CAG AAT GTT-3’；IL-12Rβ2胞外段的引物序列：上游5’-AA AGA TCT ATTGGCTTTACCTTGCAG-3’，下游5’-TT CTC GAG TTA TCATGCAAGAGAGGCGATGTG-3’；

第二步，采用PCR方法，以人PBMC cDNA為模板，使用第一步中設(shè)計的引物序列進(jìn)行胞外段基因擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為：90-95 ℃ 2-5min；90-95 ℃ 20-40s，50-60 ℃ 40-50s和70-75 ℃ 2-5min，25-35個循環(huán)；70-75℃5-10min，4℃保存；PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果；

第三步，回收第二步中PCR凝膠后給擴(kuò)增產(chǎn)物末端添加堿基“A”，T4 DNA連接酶連接過夜，獲得pUCm-T-gp130胞外段基因和pUCm-T-IL-12Rβ2胞外段基因重組體；

第四步，承接第三步中pUCm-T-gp130胞外段基因和pUCm-T-IL-12Rβ2胞外段基因重組體以Bgl II和 Xho I雙酶切后，T4 DNA連接酶連接過夜，獲得pUCm-T-gp130-IL-12Rβ2胞外段融合基因重組體；

第五步，使用第四步中獲得的融合基因重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用BamH I及 Xho I雙酶切，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳中得gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因。

gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因的合成方法，為采用PCR方法擴(kuò)增所述基因片段，設(shè)計該基因片段的引物序列，引物序列含交換配對堿基、酶切位點(diǎn)及用于PCR釣取目的基因的序列；上游引物：5’-ACG GGC CCT CTA GAC TCG AGC GCC ACC ATG GAA CAG AAT GTT TAT GGA ATC-3’，下游應(yīng)物：5’-AGT CCA GTG TGG TGG AAT TCT ATT GGC TTT ACC TTG CAG ACA AAA TTC-3’。

為使gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段穩(wěn)定表達(dá)并應(yīng)用于體外研究，構(gòu)建gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒GV140-gp130-IL-12Rβ2，其方法是：

第一步，采用GV140載體，元件順序：CMV-MCS-myc-6His，使用EcoRI使其線性化以便于基因轉(zhuǎn)染；

第二步，人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染入第一步制得的線性表達(dá)載體；35-40℃反應(yīng)25-30min，冰水浴中冷卻3-8min后轉(zhuǎn)化；將8-12μL交換反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到90-110μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置25-35min；40-45℃熱激80-100s，冰水孵育1-4min；加入500μLLB培養(yǎng)基，置于37℃搖床振蕩培育45min-2h。

本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、創(chuàng)造性的將IL-35信號通路中最重要的兩個受體的基因片段進(jìn)行融合。為進(jìn)一步研究IL-35的作用奠定基礎(chǔ)。

2、為進(jìn)一步擴(kuò)增目的基因，設(shè)計合成了含交換配對堿基、酶切位點(diǎn)及用于PCR釣取目的基因5’端部分序列的特異性引物，制備出高質(zhì)量的gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因用于交換。

3、選擇GV140質(zhì)粒作為真核表達(dá)載體。該質(zhì)粒具有促進(jìn)目的基因高表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動子及增加mRNA表達(dá)穩(wěn)定性的poly A結(jié)構(gòu)，且具有便于后期融合蛋白純化的6His標(biāo)記。使得目的基因在細(xì)胞中大量擴(kuò)增并穩(wěn)定表達(dá)。

附圖說明

圖1、gp130-IL-12Rβ2胞外段基因電泳圖；

圖2、GV140-gp130-IL-12Rβ2胞外段基因質(zhì)粒電泳圖。

具體實施方式

實施例1

所述免疫抑制劑重組蛋白中包含人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段通過以下方法獲得：

第一步，為使用PCR方法擴(kuò)增gp130和IL-12Rβ2胞外段的基因，并最終采用轉(zhuǎn)化方法獲得融合蛋白基因；首先結(jié)合人gp130胞外段序列和IL-12Rβ2胞外段序列設(shè)計擴(kuò)增兩者的引物序列，序列包含連接子、酶切位點(diǎn)；gp130胞外段的引物序列：上游5’-AA GGA TCC ATAGGTGATCCCACTTGCTT-3’，下游5’-AA AGA TCT GGG CTC TAC GTA GAA CAG AAT GTT-3’；IL-12Rβ2胞外段的引物序列：上游5’-AA AGA TCT ATTGGCTTTACCTTGCAG-3’，下游5’-TT CTC GAG TTA TCATGCAAGAGAGGCGATGTG-3’；

第二步，采用PCR方法，以人PBMC cDNA為模板，使用第一步中設(shè)計的引物序列進(jìn)行胞外段基因擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為：90℃ 2min；91℃ 20s，50 ℃ 40s和70℃ 2min，25個循環(huán)；70℃5min，4℃保存；PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果；

第三步，回收第二步中PCR凝膠后給擴(kuò)增產(chǎn)物末端添加堿基“A”，T4 DNA連接酶連接過夜，獲得pUCm-T-gp130胞外段基因和pUCm-T-IL-12Rβ2胞外段基因重組體；

第四步，承接第三步中pUCm-T-gp130胞外段基因和pUCm-T-IL-12Rβ2胞外段基因重組體以Bgl II和 Xho I雙酶切后，T4 DNA連接酶連接過夜，獲得pUCm-T-gp130-IL-12Rβ2胞外段融合基因重組體；

第五步，使用第四步中獲得的融合基因重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用BamH I及 Xho I雙酶切，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳中得gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因。

目的基因片段序列如下：

TTGGAACAGA ATGTTTATGG AATCACAATA ATTTCAGGCT TGCCTCCAGA AAAACCTAAA AATTTGAGTT GCATTGTGAA CGAGGGGAAG AAAATGAGGT GTGAGTGGGA TGGTGGAAGG GAAACACACT TGGAGACAAA CTTCACTTTA AAATCTGAAT GGGCAACACA CAAGTTTGCT GATTGCAAAG CAAAACGTGA CACCCCCACC TCATGCACTG TTGATTATTC TACTGTGTAT TTTGTCAACA TTGAAGTCTG GGTAGAAGCA CAGAATGCCC TTGGGAAGGT TACATCAGAT CATATCAATT TTGATCCTGT ATATAAAGTG AAGCCCAATC CGCCACATAA TTTATCAGTG ATCAACTCAG AGGAACTGTC TAGTATCTTA AAATTGACAT GGACCAACCC AAGTATTAAG AGTGTTATAA TACTAAAATA TAACATTCAA TATAGGACCA AAGATGCCTC AACTTGGAGC CAGATTCCTC CTGAAGACAC AGCATCCACC CGATCTTCAT TCACTGTCCA AGACCTTAAA CCTTTTACAG AATATGTGTT TAGGATTCGC TGTATGAAGG AAGATGGTAA GGGATACTGG AGTGACTGGA GTGAAGAAGC AAGTGGGATC ACCTATTGCA AGAGAGGCGA TGTGACTGTG AAGCCTTCCC ATGTAATTTT ACTTGGATCC ACTGTCAATA TTACATGCTC TTTGAAGCCC AGACAAGGCT GCTTTCACTA TTCCAGACGT AACAAGTTAA TCCTGTACAA GTTTGACAGA AGAATCAATT TTCACCATGG CCACTCCCTC AATTCTCAAG TCACAGGTCT TCCCCTTGGT ACAACCTTGT TTGTCTGCAA ACTGGCCTGT ATCAATAGTG ATGAAATTCA AATATGTGGA GCAGAGATCT TCGTTGGTGT TGCTCCAGAA CAGCCTCAAA ATTTATCCTG CATACAGAAG GGAGAACAGG GGACTGTGGC CTGCACCTGG GAAAGAGGAC GAGACACCCA CTTATACACT GAGTATACTC TACAGCTAAG TGGACCAAAA AATTTAACCT GGCAGAAGCA ATGTAAAGAC ATTTATTGTG ACTATTTGGA CTTTGGAATC AACCTCACCC CTGAATCACC TGAATCCAAT TTCACAGCCA AGGTTACTGC TGTCAATAGT CTTGGAAGCT CCTCTTCACT TCCATCCACA TTCACATTCT TGGACATAGT GAGGCCTCTT CCTCCGTGGG ACATTAGAAT CAAATTTCAA AAGGCTTCTG TGAGCAGATG TACCCTTTAT TGGAGAGATG AGGGACTGGT ACTGCTTAAT CGACTCAGAT ATCGGCCCAG TAACAGCAGG CTCTGGAATA TGGTTAATGT TACAAAGGCC AAAGGAAGAC ATGATTTGCT GGATCTGAAA CCATTTACAG AATATGAATT TCAGATTTCC TCTAAGCTAC ATCTTTATAA GGGAAGTTGG AGTGATTGGA GTGAATCATT GAGAGCACAA ACACCAGAAG AAGAGCCTAC TGGGATGTTA GATGTCTGGT ACATGAAACG GCACATTGAC TACAGTAGAC AACAGATTTC TCTTTTCTGG AAGAATCTGA GTGTCTCAGA GGCAAGAGGA AAAATTCTCC ACTATCAGGT GACCTTGCAG GAGCTGACAG GAGGGAAAGC CATGACACAG AACATCACAG GACACACCTC CTGGACCACA GTCATTCCTA GAACCGGAAA TTGGGCTGTG GCTGTGTCTG CAGCAAATTC AAAAGGCAGT TCTCTGCCCA CTCGTATTAA CATAATGAAC CTGTGTGAGG CAGGGTTGCT GGCTCCTCGC CAGGTCTCTG CAAACTCAGA GGGCATGGAC AACATTCTGG TGACTTGGCA GCCTCCCAGG AAAGATCCCT CTGCTGTTCA GGAGTACGTG GTGGAATGGA GAGAGCTCCA TCCAGGGGGT GACACACAGG TCCCTCTAAA CTGGCTACGG AGTCGACCCT ACAATGTGTC TGCTCTGATT TCAGAGAACA TAAAATCCTA CATCTGTTAT GAAATCCGTG TGTATGCACT CTCAGGGGAT CAAGGAGGAT GCAGCTCCAT CCTGGGTAAC TCTAAGCACA AAGCACCACT GAGTGGCCCC CACATTAATG CCATCACAGA GGAAAAGGGG AGCATTTTAA TTTCATGGAA CAGCATTCCA GTCCAGGAGC AAATGGGCTG CCTCCTCCAT TATAGGATAT ACTGGAAGGA ACGGGACTCC AACTCCCAGC CTCAGCTCTG TGAAATTCCC TACAGAGTCT CCCAAAATTC ACATCCAATA AACAGCCTGC AGCCCCGAGT GACATATGTC CTGTGGATGA CAGCTCTGAC AGCTGCTGGT GAAAGTTCCC ACGGAAATGA GAGGGAATTT TGTCTGCAAG GTAAAGCCAA G

為便于采用PCR方法擴(kuò)增gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段，設(shè)計所述基因片段的引物序列，該序列含交換配對堿基、酶切位點(diǎn)及用于PCR釣取目的基因的序列。上游引物：5’-ACG GGC CCT CTA GAC TCG AGC GCC ACC ATG GAA CAG AAT GTT TAT GGA ATC-3’，下游應(yīng)物：5’-AGT CCA GTG TGG TGG AAT TCT ATT GGC TTT ACC TTG CAG ACA AAA TTC-3’。

為使得gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段穩(wěn)定表達(dá)并應(yīng)用于體外研究，構(gòu)建gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒GV140-gp130-IL-12Rβ2，其方法是：

第一步，采用GV140載體，元件順序：CMV-MCS-myc-6His，使用EcoRI使其線性化以便于基因轉(zhuǎn)染；

第二步，人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染入第一步制得的線性表達(dá)載體；35℃反應(yīng)25min，冰水浴中冷卻3min后轉(zhuǎn)化；將8μL交換反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到90μl感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置25min；40℃熱激80s，冰水孵育1min；加入500μl LB培養(yǎng)基，置于37℃搖床振蕩培育45min。

實施例2

所述免疫抑制劑重組蛋白中包含人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段通過以下方法獲得：

第一步，為使用PCR方法擴(kuò)增gp130和IL-12Rβ2胞外段的基因，并最終采用轉(zhuǎn)化方法獲得融合蛋白基因；首先結(jié)合人gp130胞外段序列和IL-12Rβ2胞外段序列設(shè)計擴(kuò)增兩者的引物序列，序列包含連接子、酶切位點(diǎn)；gp130胞外段的引物序列：上游5’-AA GGA TCC ATAGGTGATCCCACTTGCTT-3’，下游5’-AA AGA TCT GGG CTC TAC GTA GAA CAG AAT GTT-3’；IL-12Rβ2胞外段的引物序列：上游5’-AA AGA TCT ATTGGCTTTACCTTGCAG-3’，下游5’-TT CTC GAG TTA TCATGCAAGAGAGGCGATGTG-3’；

第二步，采用PCR方法，以人PBMC cDNA為模板，使用第一步中設(shè)計的引物序列進(jìn)行胞外段基因擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5min；93 ℃ 40s，60 ℃50s和75 ℃5min， 35個循環(huán)；75℃ 10min，4℃保存；PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果；

第三步，回收第二步中PCR凝膠后給擴(kuò)增產(chǎn)物末端添加堿基“A”，T4 DNA連接酶連接過夜，獲得pUCm-T-gp130胞外段基因和pUCm-T-IL-12Rβ2胞外段基因重組體；

第四步，承接第三步中pUCm-T-gp130胞外段基因和pUCm-T-IL-12Rβ2胞外段基因重組體以Bgl II和 Xho I雙酶切后，T4 DNA連接酶連接過夜，獲得pUCm-T-gp130-IL-12Rβ2胞外段融合基因重組體；

第五步，使用第四步中獲得的融合基因重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用BamH I及 Xho I雙酶切，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳中得gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因。

目的基因片段序列如下：

TTGGAACAGA ATGTTTATGG AATCACAATA ATTTCAGGCT TGCCTCCAGA AAAACCTAAA AATTTGAGTT GCATTGTGAA CGAGGGGAAG AAAATGAGGT GTGAGTGGGA TGGTGGAAGG GAAACACACT TGGAGACAAA CTTCACTTTA AAATCTGAAT GGGCAACACA CAAGTTTGCT GATTGCAAAG CAAAACGTGA CACCCCCACC TCATGCACTG TTGATTATTC TACTGTGTAT TTTGTCAACA TTGAAGTCTG GGTAGAAGCA CAGAATGCCC TTGGGAAGGT TACATCAGAT CATATCAATT TTGATCCTGT ATATAAAGTG AAGCCCAATC CGCCACATAA TTTATCAGTG ATCAACTCAG AGGAACTGTC TAGTATCTTA AAATTGACAT GGACCAACCC AAGTATTAAG AGTGTTATAA TACTAAAATA TAACATTCAA TATAGGACCA AAGATGCCTC AACTTGGAGC CAGATTCCTC CTGAAGACAC AGCATCCACC CGATCTTCAT TCACTGTCCA AGACCTTAAA CCTTTTACAG AATATGTGTT TAGGATTCGC TGTATGAAGG AAGATGGTAA GGGATACTGG AGTGACTGGA GTGAAGAAGC AAGTGGGATC ACCTATTGCA AGAGAGGCGA TGTGACTGTG AAGCCTTCCC ATGTAATTTT ACTTGGATCC ACTGTCAATA TTACATGCTC TTTGAAGCCC AGACAAGGCT GCTTTCACTA TTCCAGACGT AACAAGTTAA TCCTGTACAA GTTTGACAGA AGAATCAATT TTCACCATGG CCACTCCCTC AATTCTCAAG TCACAGGTCT TCCCCTTGGT ACAACCTTGT TTGTCTGCAA ACTGGCCTGT ATCAATAGTG ATGAAATTCA AATATGTGGA GCAGAGATCT TCGTTGGTGT TGCTCCAGAA CAGCCTCAAA ATTTATCCTG CATACAGAAG GGAGAACAGG GGACTGTGGC CTGCACCTGG GAAAGAGGAC GAGACACCCA CTTATACACT GAGTATACTC TACAGCTAAG TGGACCAAAA AATTTAACCT GGCAGAAGCA ATGTAAAGAC ATTTATTGTG ACTATTTGGA CTTTGGAATC AACCTCACCC CTGAATCACC TGAATCCAAT TTCACAGCCA AGGTTACTGC TGTCAATAGT CTTGGAAGCT CCTCTTCACT TCCATCCACA TTCACATTCT TGGACATAGT GAGGCCTCTT CCTCCGTGGG ACATTAGAAT CAAATTTCAA AAGGCTTCTG TGAGCAGATG TACCCTTTAT TGGAGAGATG AGGGACTGGT ACTGCTTAAT CGACTCAGAT ATCGGCCCAG TAACAGCAGG CTCTGGAATA TGGTTAATGT TACAAAGGCC AAAGGAAGAC ATGATTTGCT GGATCTGAAA CCATTTACAG AATATGAATT TCAGATTTCC TCTAAGCTAC ATCTTTATAA GGGAAGTTGG AGTGATTGGA GTGAATCATT GAGAGCACAA ACACCAGAAG AAGAGCCTAC TGGGATGTTA GATGTCTGGT ACATGAAACG GCACATTGAC TACTGTAGAC AACAGATTTC TCTTTTCTGG AAGAATCTGA GTGTCTCAGA GGCAAGAGGA AAAATTCTCC ACTATCAGGT GACCTTGCAG GAGCTGACAG GAGGGAAAGC CATGACACAG AACATCACAG GACACACCTC CTGGACCACA GTCATTCCTA GAACCGGAAA TTGGGCTGTG GCTGTGTCTG CAGCAAATTC AAAAGGCAGT TCTCTGCCCA CTCGTATTAA CATAATGAAC CTGTGTGAGG CAGGGTTGCT GGCTCCTCGC CAGGTCTCTG CAAACTCAGA GGGCATGGAC AACATTCTGG TGACATGGCA GCCTCCCAGG AAAGATCCCT CTGCTGTTCA GGAGTACGTG GTGGAATGGA GAGAGCTCCA TCCAGGGGGT GACACACAGG TCCCTCTAAA CTGGCTACGG AGTCGACCCT ACAATGTGTC TGCTCTGATT TCAGAGAACA TAAGATCCTA CATCTGTTAT GAAATCCGTG TGTATGCACT CTCAGGGGAT CAAGGAGGAT GCAGCTCCAT CCTGGGTAAC TCTAAGCACA AAGCACCACT GAGTGGCCCC CACATTAATG CCATCACAGA GGAAAAGGGG AGCATTTTAA TTTCATGGAA CAGCATTCCA GTCCAGGAGC AAATGGGCTG CCTCCTCCAT TATAGGATAT ACTGGAAGGA ACGGGACTCC AACTCCCAGC CTCAGCTCTG TGAAATTCCC TACAGAGTCT CCCAAAATTC ACATCCAATA AACAGCCTGC AGCCGCGAGT GACATATGTC CTGTGGATGA CAGCTCTGAC AGCTGCTGGT GAAAGTTCCC ACGGAAATGA GAGGGAATTT TGTCTGCAAG GTAAAGCCAA G

為便于采用PCR方法擴(kuò)增gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段，設(shè)計所述基因片段的引物序列，該序列含交換配對堿基、酶切位點(diǎn)及用于PCR釣取目的基因的序列。上游引物：5’-ACG GGC CCT CTA GAC TCG AGC GCC ACC ATG GAA CAG AAT GTT TAT GGA ATC-3’，下游應(yīng)物：5’-AGT CCA GTG TGG TGG AAT TCT ATT GGC TTT ACC TTG CAG ACA AAA TTC-3’。

為使得gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段穩(wěn)定表達(dá)并應(yīng)用于體外研究，構(gòu)建gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒GV140-gp130-IL-12Rβ2，其方法是：

第一步，采用GV140載體，元件順序：CMV-MCS-myc-6His，使用EcoRI使其線性化以便于基因轉(zhuǎn)染；

第二步，人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染入第一步制得的線性表達(dá)載體；40℃反應(yīng)30min，冰水浴中冷卻5min后轉(zhuǎn)化；將12μL交換反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到110μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置35min；45℃熱激100s，冰水孵育4min；加入500μLLB培養(yǎng)基，置于37℃搖床振蕩培育2h。