交叉引用

本申請要求于2010年7月22日提交的美國臨時(shí)專利申請No.61/366,823，該申請通過引用整體并入本文。

關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明

本發(fā)明是在由美國國家衛(wèi)生研究院頒發(fā)的第CA058207號撥款下借助政府資助進(jìn)行的。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。

引言

癌癥轉(zhuǎn)錄模式的廣泛研究已導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)區(qū)分惡性與良性癌癥以及區(qū)分最具侵略性的癌癥與侵略性較差的癌癥的分子靶標(biāo)。癌癥通常過表達(dá)許多蛋白質(zhì)，包括某些細(xì)胞表面抗原，例如細(xì)胞表面受體。結(jié)合此類過表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的抗體可促進(jìn)此類癌癥的檢測和治療。已利用許多方法來產(chǎn)生可用作潛在治療劑的癌細(xì)胞表面受體的抗體。對過表達(dá)的細(xì)胞表面受體和結(jié)合它們的抗體的鑒定提供了開發(fā)癌癥治療的路徑，尤其提供了具有較差預(yù)后和對傳統(tǒng)療法具有抗性的那些癌癥亞型。CD44和EphA2是兩種此類過表達(dá)的細(xì)胞表面受體，并且由轉(zhuǎn)錄特征識別和蛋白質(zhì)組分析為人們所知，在基底乳腺癌中過表達(dá)。

對在許多癌癥上過表達(dá)的細(xì)胞表面受體特異的抗體已被用于開發(fā)靶向的免疫治療劑。例如，HER2、CD20和EGFR在許多腫瘤上過表達(dá)并且已開發(fā)識別這些受體的抗體來治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌(曲妥珠單抗(trastuzamab))、淋巴瘤(利妥昔單抗(rituximab))和結(jié)直腸瘤(西妥昔單抗(cetuximab))。數(shù)種治療方法(包括抗體-藥物綴合物、免疫毒素和靶向核酸遞送)需要不僅結(jié)合受體而且在結(jié)合時(shí)內(nèi)化到細(xì)胞中的抗體。

簡述

本文公開了結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原CD44或腫瘤相關(guān)抗原EphA2的抗體，以及相關(guān)組合物及使用方法。使用方法包括癌癥療法、診斷和篩選方法。在某些實(shí)施方案中，抗體結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗原(例如，酵母展示的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗原)，在其他實(shí)施方案中，它們在與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合后被胞吞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體F2-1A6特異性結(jié)合的CD44表位或與抗體F2-1A6競爭結(jié)合CD44。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的CD44結(jié)合時(shí)被胞吞(被細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1A6的V_H CDR1、F2-1A6的V_H CDR2和F2-1A6的V_H CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1A6的V_LCDR1、F2-1A6的V_L CDR2和F2-1A6的V_L CDR3。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與包含F(xiàn)2-1A6的全長V_H和F2-1A6的全長V_L的抗體競爭結(jié)合CD44表位。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體F2-1H9特異性結(jié)合的CD44表位或與抗體F2-1H9競爭結(jié)合CD44。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的CD44結(jié)合時(shí)被胞吞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1H9的V_H CDR1、F2-1H9的V_H CDR2和F2-1H9的V_HCDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1H9的V_L CDR1、F2-1H9的V_L CDR2和F2-1H9的V_L CDR3。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1H9的全長V_H和F2-1H9的全長V_L。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體特異性結(jié)合的CD44表位；或與選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體競爭結(jié)合CD44。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含：E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_H CDR1；E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_HCDR2；和E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_H CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含：E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_L CDR1；E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_L CDR2；和E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_L CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含：E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全長V_H；和E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全長V_L。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體2D6特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體2D6競爭結(jié)合EphA2。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1A7特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1A7競爭結(jié)合EphA2。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1A9特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1A9競爭結(jié)合EphA2。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。

在另一方面，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1B1特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1B1競爭結(jié)合EphA2。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體特異性結(jié)合的EphA2表位或與選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體競爭結(jié)合EphA2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含：A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_H CDR1；A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_H CDR2；和A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_H CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含：A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_L CDR1；A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_L CDR2；和A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_L CDR3。

在某些實(shí)施方案中，任一種前述單克隆抗體是單鏈Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab’)₂或(scFv’)₂。任一種所述抗體可被標(biāo)記和/或與抗癌劑綴合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含表面和內(nèi)部空間的脂類納米粒子，所述內(nèi)部空間包含抗癌劑，其中前述分離的抗體中的任一種或多種與所述脂類納米粒子的表面連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)脂類納米粒子與表達(dá)細(xì)胞表面EphA2或細(xì)胞表面CD44的細(xì)胞接觸時(shí)，所述抗體與細(xì)胞表面EphA2或細(xì)胞表面CD44結(jié)合并且脂類納米粒子被胞吞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了組合物，其包含藥學(xué)上可接受的載體和任何一種前述抗體或任何一種前述脂類納米粒子。所述組合物可被配制用于胃腸外施用?？蛇x地，所述組合物可被配制用于靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)或室內(nèi)施用或用于增強(qiáng)傳送的遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含該組合物的試劑盒。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用一定量的任何一種前述抗體或任何一種前述脂類納米粒子，其中所述量足以延緩癌癥的發(fā)展。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體被內(nèi)化到癌細(xì)胞中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測受試者的癌細(xì)胞的方法，包括使任何一種前述抗體的抗體與疑似為癌性的所述受試者細(xì)胞接觸并且檢測與所述細(xì)胞結(jié)合的所述抗體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的核酸，包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列：包含克隆F2-1A6的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H；包含克隆F2-1A6的抗體的V_LCDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L；包含克隆F2-1H9的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H；包含克隆F2-1H9的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L；包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H；或包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列：包含克隆F2-1A6的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H和包含克隆F2-1A6的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L；包含克隆F2-1H9的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H和包含克隆F2-1H9的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_LCDR3的V_L；或包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H和包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的核酸，其包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列：包含克隆2D6的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H、包含克隆2D6的抗體的V_LCDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L、包含克隆D2-1A7的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H、包含克隆D2-1A7的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L、包含克隆D2-1A9的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H、包含克隆D2-1A9的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L、包含克隆D2-1B1的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H、包含克隆D2-1B1的抗體的V_L CDR1、V_LCDR2和V_L CDR3的V_L；包含選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H；包含選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_LCDR3的V_L；或分離的核酸，其包含編碼1)和2)；3)和4)；5)和6)；7)和8)；或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了表達(dá)載體，其包含任一種前述核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了重組宿主細(xì)胞(“基因修飾的宿主細(xì)胞”)，其包含所述載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞表達(dá)抗-EphA2抗體或抗-CD44抗體。

本申請涉及下述實(shí)施方案。

1.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體F2-1A6特異性結(jié)合的CD44表位或與抗體F2-1A6競爭結(jié)合CD44。

2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的分離的單克隆抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的CD44結(jié)合時(shí)被胞吞。

3.根據(jù)實(shí)施方案1所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：

a)F2-1A6的V_H CDR1；

b)F2-1A6的V_H CDR2；和

c)F2-1A6的V_H CDR3。

4.根據(jù)實(shí)施方案1所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：

a)F2-1A6的V_L CDR1；

b)F2-1A6的V_L CDR2；和

c)F2-1A6的V_L CDR3。

5.根據(jù)實(shí)施方案1所述的分離的抗體，其中所述抗體包含：

a)F2-1A6的全長V_H；和

b)F2-1A6的全長V_L。

6.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體F2-1H9特異性結(jié)合的CD44表位或與抗體F2-1H9競爭結(jié)合CD44。

7.根據(jù)實(shí)施方案6所述的分離的單克隆抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的CD44結(jié)合時(shí)被胞吞。

8.根據(jù)實(shí)施方案6所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：

a)F2-1H9的V_H CDR1；

b)F2-1H9的V_H CDR2；和

c)F2-1H9的V_H CDR3。

9.根據(jù)實(shí)施方案6所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：

a)F2-1H9的V_L CDR1；

b)F2-1H9的V_L CDR2；和

c)F2-1H9的V_L CDR3。

10.根據(jù)實(shí)施方案6所述的分離的抗體，其中所述抗體包含：

a)F2-1H9的全長V_H；和

b)F2-1H9的全長V_L。

11.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體特異性結(jié)合的CD44表位；或與選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體競爭結(jié)合CD44。

12.根據(jù)實(shí)施方案11所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：

a)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_H CDR1；

b)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_H CDR2；和

c)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_H CDR3。

13.根據(jù)實(shí)施方案11所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：

a)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_L CDR1；

b)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_L CDR2；和

c)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_L CDR3。

14.根據(jù)實(shí)施方案11所述的分離的抗體，其中所述抗體包含：

a)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全長V_H；和

b)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全長V_L。

15.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體2D6特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體2D6競爭結(jié)合EphA2。

16.根據(jù)實(shí)施方案15所述的分離的抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。

17.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1A7特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1A7競爭結(jié)合EphA2。

18.根據(jù)實(shí)施方案17所述的分離的抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。

19.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1A9特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1A9競爭結(jié)合EphA2。

20.根據(jù)實(shí)施方案19所述的分離的抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。

21.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1B1特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1B1競爭結(jié)合EphA2。

22.根據(jù)實(shí)施方案21所述的分離的單克隆抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。

23.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體特異性結(jié)合的EphA2表位或與選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體競爭結(jié)合EphA2。

24.根據(jù)實(shí)施方案23所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：

a)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_H CDR1；

b)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_H CDR2；和

c)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_H CDR3。

25.根據(jù)實(shí)施方案23所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：

a)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_L CDR1；

b)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_L CDR2；和

c)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_L CDR3。

26.根據(jù)實(shí)施方案1-25中任一項(xiàng)所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體是單鏈Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab’)₂或(scFv’)₂。

27.根據(jù)實(shí)施方案1-25中任一項(xiàng)所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體被標(biāo)記。

28.根據(jù)實(shí)施方案1-25中任一項(xiàng)所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體與抗癌劑綴合。

29.一種包含表面和內(nèi)部空間的脂類納米粒子，所述內(nèi)部空間包含抗癌劑，其中根據(jù)實(shí)施方案1-28中任一項(xiàng)所述的分離的抗體與所述脂類納米粒子的表面連接。

30.根據(jù)實(shí)施方案29所述的脂類納米粒子，其中當(dāng)所述脂類納米粒子與表達(dá)細(xì)胞表面EphA2或細(xì)胞表面CD44的細(xì)胞接觸時(shí)，所述抗體與細(xì)胞表面EphA2或細(xì)胞表面CD44結(jié)合并且所述脂類納米粒子被胞吞。

31.一種組合物，其包含：

藥學(xué)上可接受的載體；和

根據(jù)實(shí)施方案1-28中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或根據(jù)實(shí)施方案29或?qū)嵤┓桨?0所述的脂類納米粒子。

32.根據(jù)實(shí)施方案31所述的組合物，其中所述組合物被配制用于胃腸外施用。

33.根據(jù)實(shí)施方案32所述的組合物，其中所述組合物被配制用于靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)或室內(nèi)施用或用于增強(qiáng)傳送的遞送。

34.一種治療患有癌癥的受試者的方法，其包括：

向所述受試者施用一定量的根據(jù)實(shí)施方案1-28中任一項(xiàng)所述的抗體或根據(jù)實(shí)施方案29或?qū)嵤┓桨?0所述的脂類納米粒子，其中所述量足以延緩所述癌癥的發(fā)展。

35.根據(jù)實(shí)施方案34所述的方法，其中所述抗體被內(nèi)化到癌細(xì)胞中。

36.一種檢測受試者的癌細(xì)胞的方法，其包括：

將根據(jù)實(shí)施方案1-28中任一項(xiàng)所述的抗體與疑似為癌性的所述受試者細(xì)胞接觸；和

檢測與所述細(xì)胞結(jié)合的所述抗體。

37.一種分離的核酸，其包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列：

包含克隆F2-1A6的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H；

包含克隆F2-1A6的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L；

包含克隆F2-1H9的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H；

包含克隆F2-1H9的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L；

包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H；或

包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L。

38.根據(jù)實(shí)施方案37所述的分離的核酸，其中所述核酸包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列：

包含克隆F2-1A6的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H和包含克隆F2-1A6的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L；

包含克隆F2-1H9的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H和包含克隆F2-1H9的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L；或

包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H和包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L。

39.一種分離的核酸，其包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列：

1)包含克隆2D6的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H，

2)包含克隆2D6的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L，

3)包含克隆D2-1A7的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H，

4)包含克隆D2-1A7的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L，

5)包含克隆D2-1A9的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H，

6)包含克隆D2-1A9的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L，

7)包含克隆D2-1B1的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H，

8)包含克隆D2-1B1的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L；

9)包含選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的V_H；或

10)包含選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的V_L

或；

一種分離的核酸，其包含編碼1)和2)；3)和4)；5)和6)；7)和8)；或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。

40.一種表達(dá)載體，其包含根據(jù)實(shí)施方案37、38或39所述的核酸。

41.一種重組宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)實(shí)施方案40所述的載體。

42.根據(jù)實(shí)施方案40所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)抗-EphA2抗體或抗-CD44抗體。

43.一種試劑盒，其包含根據(jù)實(shí)施方案31所述的組合物。

附圖簡述

圖1.抗原結(jié)構(gòu)域在酵母表面上的展示。圖A，受體EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)在酵母表面上展示并且被抗-EphA2抗體和重組小鼠肝配蛋白A1(R&D，Minneapolis)識別，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析來測定。圖B，CD44的連接結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1，或D1)在酵母表面上展示并且被抗-CD44兔單克隆抗體識別，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析來測定。兩種抗-EphA2和抗-CD44抗體不識別在酵母表面上展示的無關(guān)蛋白。

圖2.噬菌體抗體從酵母展示的抗原中的回收率。圖A，已知結(jié)合EphA2(2D6)的噬菌體抗體從展示EphA2ECD的酵母(Y-EphA2)中的回收率與從展示無關(guān)蛋白的酵母(Y-CON)中的回收率的比較。用酵母展示的抗原中的每一種孵育總計(jì)10¹¹個(gè)抗-EphA2噬菌體抗體2D6。圖B，洗脫緩沖液對從展示EphA2ECD的酵母的表面洗脫的EphA2噬菌體抗體的效價(jià)的影響。在洗脫之前用酵母展示的抗原蛋白質(zhì)中的每一種孵育總計(jì)10¹¹個(gè)抗-EphA2噬菌體抗體2D6。圖C，輸入噬菌體效價(jià)對洗脫的噬菌體效價(jià)的影響。用酵母展示的EphA2ECD或無關(guān)酵母展示的蛋白質(zhì)孵育指示效價(jià)的抗-EphA2噬菌體抗體2D6并且測定洗脫的噬菌體的效價(jià)。

圖3.選擇內(nèi)化抗原特異性噬菌體抗體的策略。圖A，在基底乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231上的內(nèi)化的兩輪選擇后，用無關(guān)對照酵母第一次孵育噬菌體抗體庫以除去任何酵母結(jié)合抗體，然后對展示EphA2ECD或CD44結(jié)構(gòu)域1的酵母進(jìn)行淘選。圖B，通過使用流式細(xì)胞術(shù)來測量2輪淘選后多克隆噬菌體抗體庫與EphA2ECD或CD44結(jié)構(gòu)域1的結(jié)合信號。用未選擇的噬菌體抗體文庫(R0)、第1輪(R1)和第2輪(R2)多克隆噬菌體染色無關(guān)對照酵母。圖C，對酵母展示的抗原的1輪和2輪選擇后抗原特異性噬菌體抗體的頻率。通過分析96個(gè)隨機(jī)挑選的與酵母展示的抗原結(jié)合的噬菌體抗體用流式細(xì)胞術(shù)來測定結(jié)合頻率。用未選擇的噬菌體文庫(R0)以及分別來自R1和R2的多克隆噬菌體染色所誘導(dǎo)的展示無關(guān)蛋白、EphA2-ECD或CD44結(jié)構(gòu)域1的酵母細(xì)胞。未誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞(僅酵母)、無關(guān)噬菌體抗體(噬菌體對照)和未選擇的噬菌體抗體文庫用作對照。

圖4.來自酵母抗原生物淘選的單克隆噬菌體抗體的結(jié)合特異性。圖A，通過流式細(xì)胞術(shù)測定的單克隆噬菌體抗體與酵母展示的抗原結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。用從Y-EphA2和Y-CD44D1選擇分離的單克隆噬菌體抗體染色所誘導(dǎo)的展示無關(guān)蛋白(Y-CON)、EphA2-ECD(Y-EphA2ECD)、CD44連接結(jié)構(gòu)域(Y-CD44 ECD D1)和CD44全長ECD(Y-CD44ECD)的酵母細(xì)胞。圖B顯示通過流式細(xì)胞術(shù)測定的單克隆噬菌體抗體與MDAMB231細(xì)胞的結(jié)合。圖C顯示單克隆噬菌體抗體與包括魯米那乳腺癌細(xì)胞系SUM52PE和MCF7的乳腺癌細(xì)胞系，以及基底乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231的差異結(jié)合。

圖5.通過蛋白質(zhì)印跡和流式細(xì)胞術(shù)對scFv抗體的表征。圖A，使用抗-EphA2scFv 2D6或D2-1A7和抗-CD44scFv F2-1A6來免疫沉淀來自MDAMB231細(xì)胞的其靶抗原。通過蛋白質(zhì)印跡使用抗-EphA2抗體D7(Upstate Biotech,Billerica)或抗-CD44抗體Ab-4(NeoMarkers,Fremont)來檢測抗原。圖B，EphA2抗體D2-1A7、D2-1A9和2D6與肝配蛋白A1競爭結(jié)合MDAMB231細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)來測定噬菌體抗體D2-1A7、D2-1A9和2D6在遞增濃度的EphA2配體肝配蛋白A1的存在下與MDAMB231細(xì)胞結(jié)合的能力。

圖6.對EphA2和CD44特異的噬菌體抗體被MDAMB231細(xì)胞胞吞。在37℃用無關(guān)噬菌體(圖A)、抗-EphA2噬菌體D2-1A7(圖B)和D2-1A9(圖C)、抗-CD44噬菌體F2-1A6(圖D和E)孵育經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞3小時(shí)，然后甘氨酸緩沖液洗滌。通過用抗-fd抗體檢測胞內(nèi)噬菌體、并且通過共焦顯微鏡分析來測定胞吞作用。

圖7.對來自各種克隆的CD44特異的抗體的全長V_H和V_L的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長可變區(qū)。

圖8.對來自各種克隆的EphA2特異的抗體的全長V_H和V_L的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長可變區(qū)。

圖9A和9B.來自克隆2D6的全長抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。

圖10A和10B.來自克隆D2-1A7的全長scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。

圖11A和11B.來自克隆D2-1A9的全長scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。

圖12A和12B.來自克隆D2-1B1的全長scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。

圖13A和13B.來自克隆F2-1A6的全長scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。

圖14A和14B.來自克隆F2-1H9的全長scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。

圖15A和15B.來自克隆E8H11的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:19)和編碼核酸(SEQ ID NO:20)序列。

圖16A和16B.來自克隆E8H7的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:58)和編碼核酸(SEQ ID NO:59)序列。

圖17A和17B.來自克隆E8G12的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:60)和編碼核酸(SEQ ID NO:61)序列。

圖18A和18B.來自克隆E8F11的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:63)和編碼核酸(SEQ ID NO:64)序列。

圖19A和19B.來自克隆E8C9的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:72)和編碼核酸(SEQ ID NO:73)序列。

圖20A和20B.來自克隆D6G9的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:85)和編碼核酸(SEQ ID NO:86)序列。

圖21A和21B.來自克隆D6D3的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:127)和編碼核酸(SEQ ID NO:128)序列。

圖22A和22B.來自克隆A3H9的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:129)和編碼核酸(SEQ ID NO:130)序列。

圖23A和23B.來自克隆A3G3的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:138)和編碼核酸(SEQ ID NO:139)序列。

圖24A和24B.來自克隆A3D10的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:140)和編碼核酸(SEQ ID NO:141)序列。

圖25A和25B.來自克隆A3D1的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:310)和編碼核酸(SEQ ID NO:311)序列。

圖26A和26B.來自克隆A3C8的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:312)和編碼核酸(SEQ ID NO:313)序列。

圖27A和27B.來自克隆1A3的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:314)和編碼核酸(SEQ ID NO:315)序列。

圖28A和28B.來自克隆1A5的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:316)和編碼核酸(SEQ ID NO:317)序列。

圖29A和29B.來自克隆1A8的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:318)和編碼核酸(SEQ ID NO:319)序列。

圖30A和30B.來自克隆1A12的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:320)和編碼核酸(SEQ ID NO:321)序列。

圖31A和31B.來自克隆1B2的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:322)和編碼核酸(SEQ ID NO:323)序列。

圖32A和32B.來自克隆1C2的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:324)和編碼核酸(SEQ ID NO:325)序列。

圖33A和33B.來自克隆1C7的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:326)和編碼核酸(SEQ ID NO:327)序列。

圖34A和34B.來自克隆1D8的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:328)和編碼核酸(SEQ ID NO:329)序列。

圖35A和35B.來自克隆15H11的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:330)和編碼核酸(SEQ ID NO:331)序列。

圖36A和36B.來自克隆D1C5的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:332)和編碼核酸(SEQ ID NO:333)序列。

圖37A和37B.來自克隆D1D1的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:334)和編碼核酸(SEQ ID NO:335)序列。

圖38A和38B.來自克隆H1B8(在本文也稱為“HB8”)的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:336)和編碼核酸(SEQ ID NO:337)序列。

圖39A和39B.來自克隆H1C2(在本文也稱為“HC2”)的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:338)和編碼核酸(SEQ ID NO:339)序列。

圖40A和40B.來自克隆H1C4(在本文也稱為“HC4”)的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:340)和編碼核酸(SEQ ID NO:341)序列。

圖41A和41B.來自克隆H1E3(在本文也稱為“HE3”)的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:342)和編碼核酸(SEQ ID NO:343)序列。

圖42A和42B.來自克隆H1F1(在本文也稱為“HF1”)的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:344)和編碼核酸(SEQ ID NO:345)序列。

圖43A和43B.來自克隆H1H3(在本文也稱為“HH3”)的全長scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:346)和編碼核酸(SEQ ID NO:347)序列。

圖44.對來自各種克隆的CD44特異的抗體的全長V_H和V_L的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長可變區(qū)。提供E8H11(SEQ ID NO:348)；E8H7(SEQ ID NO:349)；E8G12(SEQ ID NO:350)；E8F11(SEQ ID NO:351)；E8C9(SEQ ID NO:352)；D6G9(SEQ ID NO:353)；和D6D3(SEQ ID NO:354)的V_H序列。提供E8H11(SEQ ID NO:355)；E8H7(SEQ ID NO:356)；E8G12(SEQ ID NO:357)；E8F11(SEQ ID NO:358)；E8C9(SEQ ID NO:359)；D6G9(SEQ ID NO:360)；和D6D3(SEQ ID NO:361)的V_L序列。

圖45A和45B.對來自各種克隆的CD44特異的抗體的全長V_H和V_L的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長可變區(qū)。提供D1C5(SEQ ID NO:362)；D1D1(SEQ ID NO:363)；HB8(SEQ ID NO:364)；HC2(SEQ ID NO:365)；HC4(SEQ ID NO:366)；HE3(SEQ ID NO:367)；HF1(SEQ ID NO:368)；和HH3(SEQ ID NO:369)的V_H序列。提供D1C5(SEQ ID NO:370)；D1D1(SEQ ID NO:371)；HB8(SEQ ID NO:372)；HC2(SEQ ID NO:373)；HC4(SEQ ID NO:374)；HE3(SEQ ID NO:375)；HF1(SEQ ID NO:376)；和HH3(SEQ ID NO:377)的V_L序列。

圖46.對來自各種克隆的EphA2特異的抗體的全長V_H和V_L的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長可變區(qū)。提供A3H9(SEQ ID NO:378)；A3G3(SEQ ID NO:379)；A3D10(SEQ ID NO:380)；A3D1(SEQ ID NO:381)；和A3C8(SEQ ID NO:382)的V_H序列。提供A3H9(SEQ ID NO:383)；A3G3(SEQ ID NO:384)；A3D10(SEQ ID NO:385)；A3D1(SEQ ID NO:386)；和A3C8(SEQ ID NO:387)的V_L序列。

圖47.對來自各種克隆的EphA2特異的抗體的全長V_H和V_L的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長可變區(qū)。提供1A3(SEQ ID NO:388)；1A5(SEQ ID NO:389)；1A8(SEQ ID NO:390)；1A12(SEQ ID NO:391)；1B2(SEQ ID NO:392)；1C2(SEQ ID NO:393)；1C7(SEQ ID NO:394)；和1D8(SEQ ID NO:395)的V_H序列。提供1A3(SEQ ID NO:396)；1A5(SEQ ID NO:397)；1A8(SEQ ID NO:398)；1A12(SEQ ID NO:399)；1B2(SEQ ID NO:400)；1C2(SEQ ID NO:401)；1C7(SEQ ID NO:402)；和1D8(SEQ ID NO:403)的V_L序列。

定義

下列縮寫可在本文使用：CDR，互補(bǔ)決定區(qū)；Fab，具有可變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段；FACS，熒光活化細(xì)胞分選；IgG，免疫球蛋白G；K_D，解離平衡常數(shù)；k_on，締合速率常數(shù)；k_off，解離速率常數(shù)；mAb，單克隆抗體；MFI，平均熒光強(qiáng)度；PBS，磷酸鹽緩沖鹽水；PCR，聚合酶鏈反應(yīng)；scFv，單鏈形式的抗體可變區(qū)；V_H，重鏈可變區(qū)；V_L，輕鏈可變區(qū)；TAA，腫瘤相關(guān)抗原；EGFR，表皮生長因子受體；ECD，胞外結(jié)構(gòu)域；IMAC，固定化金屬親和色譜；IL，免疫脂質(zhì)體；IPTG，異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷；2-MEA，2-巰基乙胺；DTT，二硫蘇糖醇；TEA，三乙胺；TBS-T，Tris-緩沖鹽水Tween-20；Ni-NTA，鎳-次氮基三乙酸；PE，藻紅蛋白；HMEC，人乳腺上皮細(xì)胞，

如本文所用的，“EphA2”是指可結(jié)合肝配蛋白A配體的受體酪氨酸激酶家族的成員，并且也可被稱為“上皮細(xì)胞激酶(ECK)”。術(shù)語“EphA2”可以是指任何天然存在同種型的EphA2。EphA2的氨基酸序列是已知的并且可以作為GenBank登錄號NP_004422.2被發(fā)現(xiàn)。

如本文所用的，“CD44”是指透明質(zhì)酸(HA)的受體，并且也可以被稱為“吞噬細(xì)胞糖蛋白I”、“透明質(zhì)酸鹽受體”或“CD44抗原”。例如，術(shù)語“CD44”可以是指任何一種天然存在同種型的CD44。CD44的氨基酸序列是已知的并且最長同種型的CD44可以作為GenBank登錄號NP_000601.3被發(fā)現(xiàn)。

術(shù)語“多肽”、“肽”或“蛋白”可在本文交換地使用，指通過相鄰殘基的α-氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接到一起的一系列線性氨基酸殘基。此外，除了20個(gè)“標(biāo)準(zhǔn)”遺傳上可編碼的氨基酸之外，氨基酸還包括氨基酸類似物。而且，應(yīng)當(dāng)指出，在氨基酸殘基序列的開始或結(jié)束處的破折號，表示與一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的另一序列的肽鍵，或與羧基或羥基末端基團(tuán)的共價(jià)鍵。然而，缺少破折號不應(yīng)是指羧基或羥基末端基團(tuán)的此類肽鍵或共價(jià)鍵不存在，因?yàn)楸硎景被嵝蛄袝r(shí)省略破折號是約定俗成的。

“抗體”涵蓋組合物，其包含單獨(dú)或作為包含其多個(gè)的制備物的抗原-結(jié)合蛋白，具有一種或多種可以由免疫球蛋白基因、或免疫球蛋白基因的片段遺傳上編碼或包含獲自或源自免疫球蛋白的CDR并且結(jié)合目標(biāo)抗原的多肽。輕鏈被分為κ或λ。重鏈可被分為γ、μ、α、δ或ε，其分別定義免疫球蛋白類別，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

抗體的實(shí)例是具有由兩對多肽鏈(每對多肽鏈具有一條“輕”鏈和一條“重”鏈)組成的四聚體的結(jié)構(gòu)單元的抗體。每條鏈的N-端部分定義介導(dǎo)抗原結(jié)合的可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈(V_L)和可變重鏈(V_H)分別是指輕鏈和重鏈。

“抗體”還涵蓋含有連接在一起作為單一多肽的重鏈和輕鏈的單鏈抗體，盡管如此這種連接的重鏈或輕鏈中的每條在本文被稱為重鏈或輕鏈?？贵w還可以是指僅有重鏈的抗體例如重鏈抗體或HCAb。

如上所述，“抗體”涵蓋完整的免疫球蛋白以及抗體的抗原-結(jié)合片段。因此，本文所用的術(shù)語“抗體”還包括抗體的抗原結(jié)合部分，其可通過全抗體的修飾來制備或重新使用重組DNA方法來合成。實(shí)例包括但不限于Fab’、Fab'₂、scFv、納米抗體、單抗體(unibody)和雙鏈抗體?！凹{米抗體”是指單鏈抗體的最小抗原-結(jié)合片段，也被稱為V_HH或單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)。

“單克隆抗體”是指包含一個(gè)或多個(gè)抗體的組合物，所述抗體獲自大體上均質(zhì)的抗體的群體，即，除可以以少量存在的任何天然存在的突變之外其單獨(dú)抗體是相同的群體。單克隆抗體針對單一抗原位點(diǎn)并且一般針對抗原上的單一表位是高度特異性的。修飾詞“單克隆”是指獲自大體上均質(zhì)的抗體群體的抗體的字符，并且不要求抗體由任何特定方法產(chǎn)生或?yàn)榻M合物中的唯一抗體。

單鏈Fv(“scFv”)多肽是共價(jià)連接的V_H::V_L異二聚體，其可由包括直接連結(jié)或通過肽-編碼連接體連結(jié)的V_H-和V_L-編碼序列的核酸表達(dá)(Huston,等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883)。許多結(jié)構(gòu)可用于將來自抗體V區(qū)的多肽輕鏈和重鏈轉(zhuǎn)化成scFv分子，scFv分子將折疊成大體上類似于抗原-結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。除為雙鏈抗體外，scFvs還可以三鏈抗體或四鏈抗體存在。

應(yīng)當(dāng)指出，盡管各種抗體片段根據(jù)完整抗體的消化來定義，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解此類片段可用化學(xué)方法或通過利用重組DNA方法來重新合成。

術(shù)語“抗體”涵蓋多克隆和單克隆抗體，并且進(jìn)一步涵蓋任何類別(例如，IgM、IgG及其子類)的抗體?！翱贵w”還涵蓋雜交抗體、雙特異性抗體、異種抗體、嵌合抗體、人源化抗體和其保留抗原結(jié)合的功能片段?！半p特異性抗體”可類似單一抗體(或抗體片段)但具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))。異種抗體是指兩個(gè)或更多個(gè)連接在一起的抗體或抗體結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab)，每個(gè)抗體或片段具有不同的特異性?？贵w可與其它部分綴合，和/或可結(jié)合至支架(例如，固體支架)例如聚苯乙烯板或珠、測試條等。

免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)由被三個(gè)高可變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”)截?cái)嗟摹翱蚣堋眳^(qū)(FR)組成?？蚣軈^(qū)和CDR的范圍可基于本領(lǐng)域已知的數(shù)據(jù)庫被定義。參見，例如，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”E.Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest,第4版U.S.Dept.Health and Human Services,Public Health Services,Bethesda,MD(1987),Lefranc等人IMGT,the international ImMunoGeneTics informationNucl.Acids Res.,2005,33:D593-D597(www.imgt.org/textes/IMGTScientificChart/)和/或在vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/的V Base)。不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在物種內(nèi)相對保守。抗體的框架區(qū)(其為組成型輕鏈和重鏈的組合框架區(qū))用于定位并對齊CDR。CDR主要負(fù)責(zé)與抗原的表位結(jié)合。除非另有指示，否則由本公開提供的所有CDR和框架根據(jù)Kabat等人(同上)來定義。

“抗-EphA2抗體”或″抗-CD44抗體″是指優(yōu)選以高親和性與EphA2或CD44特異性結(jié)合的抗體。對EphA2或CD44特異的抗體未顯示相對于EphA2或CD44的結(jié)合，與EphA2或CD44無關(guān)的其他抗原相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。

術(shù)語“高親和性”當(dāng)針對抗體使用時(shí)是指特異性結(jié)合(“識別”)其靶的親和性(K_D)值小于或等于10^-6M、小于10^-7M、小于10^-8M、優(yōu)選小于10^-9M、小于10^-10M或小于10^-11M的抗體。較低K_D值對應(yīng)于較高的結(jié)合親和性(即，較強(qiáng)的結(jié)合)以使10^-7的K_D值指示比10^-6的K_D值高的結(jié)合親和性。

“抗原-結(jié)合位點(diǎn)”或“結(jié)合部分”是指參與免疫反應(yīng)性抗原結(jié)合的抗體分子的部分(例如免疫球蛋白分子或scFv的片段)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)通過重(“H”)鏈和/或輕(“L”)鏈的N-端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成。重鏈和輕鏈的V區(qū)內(nèi)的三個(gè)高度發(fā)散的延伸部分被稱為“高可變區(qū)”，其插入在稱為“框架區(qū)”或“FR”的更保守側(cè)翼延伸部分之間。因此，術(shù)語“FR”是指免疫球蛋白中天然存在于高可變區(qū)之間和與高可變區(qū)相鄰的氨基酸序列。在三聚體抗體分子中，輕鏈的三個(gè)高可變區(qū)和重鏈的三個(gè)高可變區(qū)在三維空間中相對于彼此布置以形成抗原結(jié)合“表面”。該表面介導(dǎo)靶抗原的識別和結(jié)合。重鏈和/或輕鏈中的每個(gè)鏈的三個(gè)高可變區(qū)被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”并且例如基于Kabat等人(同上)來測定。

″F2-1A6抗體”是指由克隆F2-1A6表達(dá)的抗體或以其它方式合成但是具有與由克隆F2-1A6表達(dá)的抗體相同的CDR并且任選地具有相同的框架區(qū)，并且具有大體上相同的抗原結(jié)合特異性的抗體。類似地，抗體2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、F2-1H9等(例如，抗體E8H11、E8H7、E8G12、E8F11和E8C9；抗體D6G9和D6D3；抗體D1C5和D1D1；抗體HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3；抗體A3H9、A3G3、A3D10、A3D1和A3C8；抗體1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7和1D8；以及抗體15H11)是指由相應(yīng)克隆表達(dá)的抗體和/或以其它方式合成但是具有與參考抗體相同的CDR并且任選地具有相同的框架區(qū)，并且具有大體上相同的抗原結(jié)合特異性的抗體。這些抗體的CDR通過Kabat等人(同上)來定義，如圖7、8和44-47以及下表所示。

“表位”是抗體所結(jié)合的抗原上的位點(diǎn)(例如EphA2胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)上的位點(diǎn))。表位可以由連續(xù)氨基酸或通過蛋白的折疊(例如，三級折疊)而并置的非連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位暴露于變性溶劑后通常仍保持，然而通過折疊形成的表位用變性溶劑的處理后通常喪失。在線性或空間構(gòu)象中，表位通常包括至少3個(gè)、更通常至少5或8-10個(gè)氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括，例如，x-射線結(jié)晶學(xué)和2維核磁共振。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris編輯(1996)。數(shù)個(gè)商業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供表位作圖服務(wù)。通過與膜相關(guān)抗原具有免疫反應(yīng)性的抗體結(jié)合的表位可位于細(xì)胞的表面(例如跨膜蛋白的胞外區(qū)中)，以使此類表位被認(rèn)為是細(xì)胞表面可及的，溶劑可及的和/或細(xì)胞表面暴露的。

“分離的”是指在與實(shí)體可天然出現(xiàn)的環(huán)境不同的環(huán)境中的目標(biāo)實(shí)體(例如蛋白，如抗體)?！胺蛛x的”實(shí)體從本質(zhì)上伴隨其的所有或一些組分分離并且可以是大體上富集的?！胺蛛x的”也是指從在生成(例如，化學(xué)合成、重組表達(dá)、培養(yǎng)基等)過程中伴隨其的所有或一些組分分離的實(shí)體的狀態(tài)。主題抗體可以是大體上純的。“大體上純的”可以是指其中至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或多于99％的總組合物是目標(biāo)實(shí)體(例如，主題抗體)的組合物。

當(dāng)提及抗體時(shí)，短語“特異性結(jié)合”、“對…特異”、“免疫反應(yīng)性”和“免疫反應(yīng)性”和“抗原結(jié)合特異性”是指與抗原的結(jié)合反應(yīng)，其對抗原或其片段具有高優(yōu)先性，以使在抗原的異質(zhì)群體(例如，蛋白和群體生物制品，例如在組織中)存在下確定抗原的存在。因此，在特定的免疫測定條件下，指定的抗體與特定抗原結(jié)合并且不以顯著量與存在于樣品中的其他抗原結(jié)合。在此類條件下與抗原的特異性結(jié)合可需要因其對特定抗原的特異性而被選擇的抗體。例如，抗-CD44抗體可以與CD44特異性結(jié)合，并且不展示與存在于組織樣品中的其他蛋白相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合(例如，不展示可檢測的結(jié)合)。參見Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York，用于描述可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測定形式和條件。

詳述

本文公開了與腫瘤相關(guān)抗原CD44特異性結(jié)合的抗體和與腫瘤相關(guān)抗原EphA2特異性結(jié)合的抗體，以及相關(guān)組合物及使用方法。使用方法包括癌癥治療、診斷和篩選方法。

當(dāng)抗體對CD44特異時(shí)，抗體含有克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3(例如，通過其表達(dá)而獲得)的抗體的V_H的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)CDR?？贵w還涵蓋含有克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗體的V_L的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)CDR的抗體?？贵w還涵蓋含有獨(dú)立地選自克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗體的V_L和V_H中的每個(gè)的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)CDR的抗體。可選地，抗體與克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗體(例如，結(jié)合與其相同的表位)競爭結(jié)合CD44。

當(dāng)抗體對EphA2特異時(shí)，抗體含有克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)重鏈(V_H)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？贵w還涵蓋含有克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)輕鏈(V_L)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的抗體。抗體還涵蓋含有獨(dú)立地選自克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體的V_L和V_H中的每個(gè)的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)CDR的抗體?？蛇x地，抗體與克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體(例如，結(jié)合與其相同的表位)競爭結(jié)合EphA2。

本公開的抗體也可以含有克隆F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體的所有V_HCDR和/或V_L CDR?？贵w可以含有克隆F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體的全長V_H鏈。抗體也可以或可選地含有克隆F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體的全長V_L鏈。

抗體可以是全長抗體(即，包含至少一個(gè)全長V_H序列和至少一個(gè)全長V_L序列的抗體)或片段例如單鏈Fv(scFv)、Fab、(Fab’)₂、(ScFv)₂等?？贵w可以是IgG(例如，IgG₂)或任何其他同種型，或可以是雙特異性抗體。

抗體可以例如與抗癌藥物、標(biāo)記、或與改善或提升血清半衰期(例如聚(乙二醇)(PEG))、胞吞、或另一種生物功能或特征的部分綴合?？贵w也可以在包含藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物中，例如，適用于注射的組合物(例如，在單位劑量制劑中)。本公開還提供包括一個(gè)或多個(gè)抗體的組合物，所述抗體選自本文所述的抗體和/或包含一個(gè)或多個(gè)來自這些抗體的CDR的抗體，和/或包含這些抗體的突變體或衍生物的一個(gè)或多個(gè)抗體。組合物可以包括一種或多種抗體，例如F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11。

本公開的方法包括提供以有效治療患有表達(dá)由一個(gè)或多個(gè)主題抗體特異性結(jié)合的抗原的癌癥的受試者的量施用一個(gè)或多個(gè)本文公開的主題抗體的方法。由本公開提供的抗體也可以用于診斷/預(yù)后癌癥或使癌癥成像。

本文提供的核酸編碼本文描述的一個(gè)或多個(gè)抗體。本文還提供含有此類核酸的宿主細(xì)胞，以及生成主題抗體(例如通過分泌)的宿主細(xì)胞。還提供用于制備含有主題抗體的組合物或用于進(jìn)行主題方法的試劑盒。

抗體

優(yōu)選的抗體對腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、EphA2或CD44中的一個(gè)或多個(gè)具有高親和性(例如，顯示10^-7M或更低的K_D值)，在至少一些部分的細(xì)胞周期中細(xì)胞表面暴露于癌細(xì)胞上。還設(shè)想對EphA2或CD44具有較低親和性(例如，具有10^-5M至10^-6M的K_D值)的抗體。癌細(xì)胞例如包括源自乳腺癌細(xì)胞(例如MDAMB231)等等的癌細(xì)胞。主題抗體包括在與抗原例如活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的抗原結(jié)合時(shí)，例如通過胞吞、例如受體介導(dǎo)的胞吞內(nèi)化到細(xì)胞中的那些。

主題抗體包括與克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗體競爭性結(jié)合CD44表位的那些?？贵w還涵蓋與克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體競爭性結(jié)合EphA2上的表位的抗體。特定抗體識別與另一抗體相同的表位的能力可通過一個(gè)抗體競爭性抑制第二抗體(例如，競爭性結(jié)合)與抗原的結(jié)合來測定(例如，通過競爭性結(jié)合測定例如美國專利公布No.20090291085中公開的那些來測定)。結(jié)合的競爭性抑制也可以被稱為抗體的交叉反應(yīng)性。

許多競爭性結(jié)合測定的任一種可用于測量兩個(gè)抗體對相同抗原的競爭。例如，夾心ELISA測定可以用于該目的。交叉反應(yīng)性的測定方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見，例如，Dowbenko等人(1988)J.Virol.62:4703-4711)。

如果在第一抗體存在下第二抗體與抗原的結(jié)合減少至少30％、通常至少約40％、50％、60％或75％、常常至少約90％(使用任一種用于評估競爭性結(jié)合的測定)，則抗體被認(rèn)為競爭性抑制第二抗體與抗原的結(jié)合。

這可以通過提供連接至固體支架的一個(gè)或多個(gè)分離的靶TAA、EphA2和/或CD44并且測定抗體結(jié)合靶TAA或與本文所述的抗體競爭結(jié)合靶TAA的能力(例如使用表面等離子體共振)來確定。

如上所述，主題抗體涵蓋與下列抗體中的一種或多種競爭的那些：2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11。此外，抗體對EphA2或CD44可以具有結(jié)合親和性，與約1x10^-6M相當(dāng)或大于約1x10^-6M(即，抗體可顯示低于10^-6M，例如約10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M的K_D值或甚至更高的結(jié)合親和性例如約10^-11M或10^-12M的K_D值)。

在相關(guān)實(shí)施方案中，主題抗體涵蓋結(jié)合與F2-1A6或F2-1H9相同的表位，或結(jié)合2D6、D2-1A7、D2-1A9或D2-1B1的表位，或結(jié)合E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的表位，或結(jié)合A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的表位的那些。表位作圖可使用導(dǎo)致接近飽和及至少100相對單位(RU)的所結(jié)合抗體的濃度的抗體對來執(zhí)行。測定一對中每個(gè)成員的所結(jié)合抗體的量，然后將兩個(gè)抗體混合在一起以得到等于用于測量各個(gè)抗體的濃度的最終濃度。識別不同表位的抗體顯示一起注入時(shí)所結(jié)合的RU的實(shí)質(zhì)累積增加，盡管識別相同表位的抗體僅顯示RU的最小增加。據(jù)信抗體可以是交叉反應(yīng)性的，如果當(dāng)一起“注入”時(shí)它們顯示實(shí)質(zhì)累積增加(例如增加至少約1.4倍、增加至少約1.6倍、或增加至少約1.8或2倍)。

抗體的表位也可通過許多其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見，例如，Geysen等人(1987)J.Immunol.Meth 102:259-274)來測定。該技術(shù)包括大量EphA2或CD44的重疊肽的合成。然后針對一個(gè)或多個(gè)原型抗體(例如，2D6等)篩選合成肽并且由這些抗體特異性結(jié)合的特征表位可以通過結(jié)合特異性和親和性來鑒定。由此得以鑒定的表位可適宜地用于本文所述的競爭性測定以鑒定交叉反應(yīng)抗體。

用于表位作圖的肽可適宜地使用“Multipin”肽合成技術(shù)來制備(參見，例如，Geysen等人(1987)Science 235：1184-1190)。使用一個(gè)或多個(gè)EphA2和/或CD44的已知序列，重疊多肽序列可在一個(gè)或多個(gè)96-孔顯微檢驗(yàn)板的陣列中的膠針上以相繼方式逐一合成。

抗-CD44

本公開的抗體包括特異性結(jié)合CD44的抗體。抗-CD44抗體涵蓋與F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3競爭性結(jié)合CD44的表位(例如在結(jié)構(gòu)域1中)的那些。由抗-CD44抗體結(jié)合的表位存在于來自殘基位置21-169的CD44的連續(xù)氨基酸序列，如下所列出。

QIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTSNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY(SEQ ID NO：1)

CD44的殘基位置數(shù)基于GenBank登錄號NP_000601.3或UniProt登錄號P16070中列出的序列來測定。

共享與CD44類似的表位的抗原也可以是主題抗體的結(jié)合靶。當(dāng)與CD44結(jié)合時(shí)，主題抗體可以被表達(dá)CD44蛋白的細(xì)胞內(nèi)化。

抗-CD44抗體對其具有親和性的表位在很多癌細(xì)胞上，特別在細(xì)胞質(zhì)膜上是細(xì)胞表面暴露的并且溶劑可及的。當(dāng)細(xì)胞活著時(shí)，表位對于主題抗體可以是可及的。例如，表位可以在源自乳腺癌、結(jié)腸癌、腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)、前列腺癌、胰腺癌等的癌細(xì)胞上存在?？?CD44抗體對其具有親和性的癌細(xì)胞也可以來自任何轉(zhuǎn)移性癌癥和/或具有轉(zhuǎn)移潛力。

主題抗體的附加實(shí)例涵蓋具有相同結(jié)合特異性并且包含至少兩個(gè)CDR的那些，每個(gè)CDR各自獨(dú)立地與圖7、44和45A和45B和下表中所示的抗體的V_H CDR(例如F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_H CDR1)的氨基酸序列共有至少約80％、至少約87％、至少約93％、至少約94％或最高100％氨基酸序列同一性。主題抗體還可包括來自圖7、44和45A和45B中所示的每個(gè)抗體的任何V_H CDR的所有三個(gè)CDR，以使主題抗體中的每個(gè)V_H CDR選自圖7、44和45A和45B或下表(例如，表1)中所示的單一抗體并且每個(gè)V_H CDR獨(dú)立地與圖7、44或45A和45B或下表(例如，表1)中所示的抗體的V_H CDR的氨基酸序列共有至少約80％、至少約87％、至少約93％、至少約94％或最高100％氨基酸序列同一性。例如，主題抗體的重鏈可含有F2-1A6的兩個(gè)V_H CDR或所有三個(gè)V_H CDR?？蛇x地，重鏈可含有F2-1H9的兩個(gè)V_H CDR或所有三個(gè)V_H CDR。作為進(jìn)一步的實(shí)例，主題抗體的重鏈可含有任何一種E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的兩個(gè)V_H CDR或所有三個(gè)V_H CDR。

同樣對于輕鏈，主題抗體將具有相同結(jié)合特異性并且可含有至少兩個(gè)CDR，每個(gè)CDR各自獨(dú)立地與圖7、44和45A和45B或下表中所示的每個(gè)抗體的V_L CDR(例如F2-1A6的V_LCDR1；例如，E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的V_L CDR1)的氨基酸序列具有至少約80％、至少約87％、至少約93％、至少約94％或最高100％氨基酸序列同一性。主題抗體也可以或可選地包括來自圖7、44和45A和45B或下表(例如，表2)中所示的任一種抗體的所有三個(gè)V_L CDR并且每個(gè)V_L CDR獨(dú)立地與圖7、44或45A和45B或下表中所示的抗體的V_LCDR的氨基酸序列共有至少約80％、至少約87％、至少約93％、至少約94％或最高100％氨基酸序列同一性。例如，主題抗體的輕鏈可含有F2-1A6的兩個(gè)V_L CDR或所有三個(gè)V_L CDR。可選地，輕鏈可含有F2-1H9的兩個(gè)V_L CDR或所有三個(gè)V_LCDR。作為進(jìn)一步的實(shí)例，主題抗體的輕鏈可含有E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的兩個(gè)V_L CDR或所有三個(gè)V_L CDR。

任選地，抗體可含有與圖7、44和45A和45B或下表(例如，下表1和2)中提供的重鏈或輕鏈的任一種相應(yīng)框架序列相同(即100％同一性)、類似或不同的框架序列(FR)，只要大體上維持結(jié)合特異性。在框架序列類似時(shí)，框架可以與圖7、44和45A和45B或下表(例如，下表1和2)中所示的任一種抗體的相應(yīng)框架序列具有至少約85％、至少約86％、至少約90％、至少約93％、至少約96％、至少約98％或最高100％同一性。

本公開的抗體因此可含有與圖7、44或45A和45B或下表中所示的全長V_H或V_L序列具有至少80％同一性、至少85％、至少90％、至少95％、最高100％氨基酸序列同一性的全長V_H和/或全長V_L序列。例如，主題抗體可含有F2-1A6的全長V_H和/或全長V_L?？蛇x地，主題抗體可含有F2-1H9的全長V_H和/或全長V_L。作為進(jìn)一步的實(shí)例，主題抗體可含有E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全長V_H和/或全長V_L。與CD44結(jié)合的本公開的抗體的實(shí)例列于下表(例如，表1和2)中。

表1.特異性結(jié)合CD44的抗體的重鏈FR和CDR

表2.特異性結(jié)合CD44的抗體的輕鏈FR和CDR

抗-EphA2

本公開的抗體包括特異性結(jié)合EphA2的抗體?？?EphA2抗體涵蓋與2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11競爭性結(jié)合EphA2的表位(例如在胞外結(jié)構(gòu)域上)的那些。由抗-EphA2抗體結(jié)合的表位存在于來自殘基位置25至534的EphA2的連續(xù)氨基酸序列，如下所列出。

QGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGN(SEQ ID NO：26)

EphA2的殘基位置號基于GenBank登錄號NP_004422.2或UniProt登錄號P29317中列出的序列來確定。

抗-EphA2抗體還涵蓋競爭性結(jié)合EphA2的配體結(jié)合位點(diǎn)的那些。例如，抗體2D6、D2-1A7和D2-1A9與肝配蛋白A1(EphA2的天然配體)競爭結(jié)合EphA2。因此，主題抗體也可與肝配蛋白A1競爭結(jié)合EphA2表位。

包含與EphA2的表位類似的表位的抗原也可以是主題抗體的結(jié)合靶。當(dāng)與細(xì)胞表面上的抗原(例如EphA2)結(jié)合時(shí)，某些主題抗體將被細(xì)胞內(nèi)化。

抗-EphA2抗體對其具有親和性的表位在很多癌細(xì)胞上，特別在細(xì)胞質(zhì)膜上是細(xì)胞表面暴露的并且溶劑可及的。當(dāng)細(xì)胞活著時(shí)，表位對于主題抗體可以是可及的。癌細(xì)胞可以包括源自上皮細(xì)胞組織的癌細(xì)胞。例如，表位可以在源自乳腺癌、皮膚癌(例如黑素瘤)、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和/或卵巢癌的癌細(xì)胞上存在?？?EphA2抗體對其具有親和性的其他癌細(xì)胞可以是例如肝癌、食道鱗狀細(xì)胞癌、表皮癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞癌、神經(jīng)母細(xì)胞癌和/或其他神經(jīng)癌。

主題抗體的另外實(shí)例涵蓋具有相同結(jié)合特異性并且含有至少兩個(gè)CDR的那些，每個(gè)CDR獨(dú)立地與圖8、46和47和下表中所示的抗體的V_H CDR(例如2D6的V_H CDR1；或A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_HCDR1)的氨基酸序列共有至少約80％、至少約87％、至少約93％、至少約94％或最高100％氨基酸序列同一性。主題抗體還可包括來自圖8、46和47中所示的任何抗體的任何VH的所有三個(gè)CDR，以使主題抗體中的每個(gè)V_H CDR選自圖8、46或47或下表(例如，表3)中所示的單一抗體并且每個(gè)V_HCDR獨(dú)立地與圖8、46和47或下表中所示的抗體的相應(yīng)V_H CDR的氨基酸序列共有至少約80％、至少約87％、至少約93％、至少約94％或最高100％氨基酸序列同一性。例如，主題抗體的重鏈可含有2D6的至少兩個(gè)V_H CDR或所有三個(gè)V_H CDR?？蛇x地，重鏈可含有D2-1A7的至少兩個(gè)V_H CDR或所有三個(gè)V_H CDR。其他實(shí)例包括包含D2-1A9的至少兩個(gè)V_H CDR或所有三個(gè)V_H CDR的重鏈和包含D2-1B1的至少兩個(gè)V_H CDR或所有三個(gè)V_H CDR的重鏈。作為進(jìn)一步的實(shí)例，主題抗體的重鏈可含有A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的至少兩個(gè)V_H CDR或所有三個(gè)V_H CDR。

同樣對于輕鏈，主題抗體可含有至少兩個(gè)CDR，每個(gè)CDR獨(dú)立地與圖8、46或47或下表(例如2D6的V_L CDR1；或A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的V_L CDR1)中所示的抗體的V_L CDR的氨基酸序列具有至少約80％、至少約87％、至少約93％、至少約94％或最高100％氨基酸序列同一性。主題抗體也可以或可選地包括來自圖8、46和47或下表(例如，表4)中所示的任一種抗體的所有三個(gè)V_L CDR并且每個(gè)V_L CDR獨(dú)立地與圖8、46或47或下表中所示的抗體的V_L CDR的氨基酸序列共有至少約80％、至少約87％、至少約93％、至少約94％或最高100％氨基酸序列同一性。例如，主題抗體的輕鏈可含有2D6的兩個(gè)V_L CDR或所有三個(gè)V_L CDR?？蛇x地，輕鏈可含有D2-1A7的兩個(gè)V_L CDR或所有三個(gè)V_L CDR。其他實(shí)例包括包含D2-1A9的兩個(gè)V_L CDR或所有三個(gè)V_L CDR的輕鏈和包含D2-1B1的兩個(gè)V_L CDR或所有三個(gè)V_L CDR的輕鏈。作為進(jìn)一步的實(shí)例，主題抗體的輕鏈可含有A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的兩個(gè)V_L CDR或所有三個(gè)V_L CDR。

任選地，抗體可含有與圖8、46和47或下表(例如，表3和4)中提供的重鏈或輕鏈的任一種相應(yīng)框架序列完全相同(即100％同一性)、類似或不同的框架序列(FR)。在框架序列類似時(shí)，框架可以與圖8、46和47或下表中所示的任一種抗體的相應(yīng)框架序列具有至少約85％、至少約86％、至少約90％、至少約93％、至少約96％、至少約98％或最高100％同一性。

本公開的抗體因此可含有與圖8、46或47或下表中所示的全長V_H或V_L序列具有至少80％同一性、至少85％、至少90％、至少95％、最高100％氨基酸序列同一性的全長V_H和/或全長V_L序列。例如，主題抗體可含有2D6的全長V_H和/或全長V_L?？蛇x地，主題抗體可含有D2-1A7的全長V_H和/或全長V_L。其他實(shí)例包括含有D2-1A9的全長V_H和/或全長V_L的抗體和含有D2-1B1的全長V_H和/或全長V_L的抗體。進(jìn)一步實(shí)例包括含有A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的全長V_H和/或全長V_L的抗體。與EphA2結(jié)合的本公開的抗體的實(shí)例列于下表。

表3.特異性結(jié)合EphA2的抗體的重鏈FR和CDR

表4.特異性結(jié)合EphA2的抗體的輕鏈FR和CDR

應(yīng)理解，CDR的氨基酸序列也可使用備選系統(tǒng)來定義，該備選系統(tǒng)將對于普通技術(shù)人員是顯而易見的并且由普通技術(shù)人員應(yīng)用(參見，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”E.Kabat等人，U.S.Department of Health and Human Services,(1991和Lefranc等人IMGT,the international ImMunoGeneTics information system.Nucl.Acids Res.,2005,33,D593-D597))。在萬維網(wǎng)(World Wide Web)的www(dot)imgt.cines.fr/textes/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTnumberingsTable.html提供IMGTS系統(tǒng)的詳細(xì)論述(包括如何闡述IMGTS系統(tǒng)和如何將其與其他系統(tǒng)比較)。除非另有指出，否則本公開中CDR的所有氨基酸序列根據(jù)Kabat等人(同上)來定義。

本文公開的可變鏈可直接或通過連接體(例如，(Gly₄Ser)₃,SEQ ID NO:1)連結(jié)以形成單鏈抗體。下面隨后論述關(guān)于連接體的細(xì)節(jié)。

抗體生成的方法

使用本文提供的信息，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備本公開的抗-CD44和抗-EphA2抗體。

例如，圖9A和9B中提供的核酸序列可用于表達(dá)主題抗體?？蛇x地，本文提供的多肽序列(參見，例如上表和/或圖7、8、9A和9B和44-47)可用于確定編碼抗體的適當(dāng)核酸序列并且核酸序列然后用于表達(dá)一個(gè)或多個(gè)對EphA2或CD44特異的抗體?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法最優(yōu)化核酸序列，以反映各種表達(dá)系統(tǒng)的特定密碼子“偏好性”。

使用提供的序列信息，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多標(biāo)準(zhǔn)方法來合成核酸。寡核苷酸合成優(yōu)選在市售可得的固相寡核苷酸合成儀上進(jìn)行(Needham-VanDevanter等人(1984)Nucleic Acids Res.12:6159-6168)或使用例如由Beaucage等人(1981)Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862所述的固相亞磷酰胺三酯方法來手動(dòng)合成。

一旦合成了編碼主題抗體的核酸，其就可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法來擴(kuò)增和/或克隆。實(shí)現(xiàn)這些目的的分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。適用于構(gòu)建重組核酸的多種克隆和體外擴(kuò)增方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的并且為許多教科書和實(shí)驗(yàn)室手冊的主題。

編碼本公開的抗體的天然或合成核酸的表達(dá)可通過將編碼抗體的核酸可操作地連接到啟動(dòng)子(其為組成型或可誘導(dǎo)型)并且將構(gòu)建體整合到表達(dá)載體中以產(chǎn)生重組表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)。載體可適用于原核生物、真核生物或兩者生物中的復(fù)制和整合。典型克隆載體含有功能上適當(dāng)取向的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、初始序列和用于調(diào)節(jié)編碼抗體的核酸的表達(dá)的啟動(dòng)子。載體任選地含有基因表達(dá)盒，其含有至少一個(gè)獨(dú)立終止子序列、允許該表達(dá)盒在真核生物和原核生物中的復(fù)制(例如，如在穿梭載體中發(fā)現(xiàn)的)的序列，以及原核生物和真核生物系統(tǒng)兩者的選擇標(biāo)記。

為了獲得高水平的克隆核酸的表達(dá)，通常構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，而質(zhì)粒通常含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子，每個(gè)彼此以及與蛋白編碼序列進(jìn)行功能取向。大腸桿菌中適用于該目的的調(diào)節(jié)區(qū)的實(shí)例是，大腸桿菌色氨酸生物合成途徑的啟動(dòng)子和操縱基因區(qū)、噬菌體λ(P_L)的左側(cè)啟動(dòng)子和L-阿拉伯糖(araBAD)操縱子。在轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中的DNA載體中包含選擇標(biāo)記，也是有用的。此類標(biāo)記的實(shí)例包括賦予對氨芐青霉素、四環(huán)素或氯霉素的抗性的基因。使用例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和沙門菌屬(Salmonella)可以得到用于表達(dá)抗體的表達(dá)系統(tǒng)，也可以使用大腸桿菌系統(tǒng)。

抗體基因也可以被亞克隆進(jìn)表達(dá)載體中，從而允許在抗體(例如scFv)的C-末端或N-末端添加標(biāo)簽(例如，F(xiàn)LAG、六聚組氨酸等)以促進(jìn)純化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染和表達(dá)基因的方法在本領(lǐng)域是已知的。用核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可包括，例如，用細(xì)胞孵育含有核酸的脂類微?；蛴迷谳d體的宿主范圍之內(nèi)的細(xì)胞孵育含有核酸的病毒載體。用于本公開的細(xì)胞的培養(yǎng)物(包括來自組織(例如，腫瘤)或血樣的細(xì)胞系和培養(yǎng)的細(xì)胞)在本領(lǐng)域是已知的。

一旦分離和克隆編碼主題抗體的核酸，就可在多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組工程化細(xì)胞中表達(dá)核酸。此類細(xì)胞的實(shí)例包括細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、昆蟲(例如采用桿狀病毒屬載體的那些)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

主題抗體的分離和純化可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來實(shí)現(xiàn)。例如，蛋白可以通過免疫親和性純化(或使用Protein L或A來純化)從經(jīng)基因修飾以組成性表達(dá)蛋白的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物和/或在誘導(dǎo)時(shí)，或從合成反應(yīng)混合物分離，洗滌以除去非-特異性結(jié)合材料并且洗脫特異性結(jié)合的抗體。分離的抗體可以通過透析和通常用于蛋白純化的方法的其他方法來進(jìn)一步純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可使用金屬螯合物色譜方法來分離。本公開的抗體可以含有修飾以促進(jìn)分離，如上論述。

主題抗體可以基本上以純的或分離的形式(例如，不含其他多肽)制備。蛋白質(zhì)可存在于相對于可存在的其他組分(例如，其他多肽或其他宿主細(xì)胞組分)富集多肽的組合物中?？梢蕴峁┘兓贵w以使抗體存在于基本上不含其他表達(dá)蛋白的組合物中，例如少于90％、通常少于60％且更通常少于50％的組合物由其他表達(dá)蛋白構(gòu)成。

由原核細(xì)胞生成的抗體可需要暴露于離液劑以用于適當(dāng)折疊。在從大腸桿菌純化的過程中，例如，可任選地使表達(dá)蛋白變性，然后復(fù)性。這可以例如通過在離液劑例如鹽酸胍中增溶由細(xì)菌生成的抗體來實(shí)現(xiàn)。然后通過緩慢透析或通過凝膠過濾使抗體復(fù)性?？蛇x地，編碼抗體的核酸可操作地連接至分泌信號序列例如pelB以使抗體以正確折疊的形式分泌進(jìn)周質(zhì)中。

本公開還提供了生成主題抗體的細(xì)胞，其中適合的細(xì)胞包括真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以是雜交細(xì)胞或“雜交瘤”，其能夠體外再生成抗體(例如單克隆抗體，如IgG)。例如，本公開提供了重組宿主細(xì)胞(在本文也稱為“基因修飾的宿主細(xì)胞”)，其用一個(gè)或多個(gè)包含編碼主題抗體的核苷酸序列的核酸進(jìn)行基因修飾。

本文還涵蓋用于創(chuàng)立抗體分子的抗原-結(jié)合區(qū)的重組DNA形式的技術(shù)(其繞過雜交瘤的產(chǎn)生)。例如將DNA克隆進(jìn)細(xì)菌(例如，噬菌體)、酵母(例如酵母菌屬或畢赤酵母屬)昆蟲或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。適合的技術(shù)的一個(gè)實(shí)例使用具有前導(dǎo)序列的細(xì)菌噬菌體λ載體系統(tǒng)，其引起表達(dá)抗體(例如Fab或scFv)遷移至周質(zhì)間隔(在細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間)或待分泌。可快速產(chǎn)生結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的大量功能片段(例如scFv)。

修飾

本公開涵蓋抗體和核酸，它們經(jīng)修飾以提供所需特征，例如，促進(jìn)向受試者中特定類型的組織和/或細(xì)胞的遞送，增加血清半衰期，補(bǔ)充抗癌活性等。本公開的抗體可以提供有或沒有修飾，并且包括人抗體人源化抗體和嵌合抗體。修飾主題抗體的一種方法是在N-和/或C-末端綴合(例如連接)一個(gè)或多個(gè)額外元件或綴合抗體的任何氨基酸(包括內(nèi)在氨基酸)，其中此類額外元件包括例如，另一種蛋白和/或藥物或載體分子。

用一個(gè)或多個(gè)額外元件修飾的主題抗體保留所需的結(jié)合特異性，同時(shí)利用一個(gè)或多個(gè)額外元件的性質(zhì)賦予額外的所需特征。例如，主題抗體可與第二分子綴合，第二分子在以下方面有幫助：溶解度、貯存或其他處理性質(zhì)、細(xì)胞滲透率、半衰期、免疫原性減少、控制釋放和/或分布(例如通過靶向特定細(xì)胞(例如，神經(jīng)元、白血球、腫瘤細(xì)胞等)或細(xì)胞位置(例如，溶酶體、核內(nèi)體、線粒體等)、組織或其他身體位置(例如，血液、神經(jīng)組織、特定器官等))。其他實(shí)例包括染料、熒光團(tuán)或其他用于測定、追蹤、成像等的可檢測標(biāo)記或報(bào)導(dǎo)分子。更具體來說，主題抗體可綴合于第二分子例如肽、多肽、染料、熒光團(tuán)、核酸、碳水化合物、抗癌劑、脂質(zhì)、放射性核素等(例如，在還原端或非還原端)，例如脂質(zhì)部分的連接，包括N-脂肪酰基例如N-月桂?；-油?；⒅景防缭鹿鸹?、油?；返?。

例如，對于可內(nèi)化到細(xì)胞中的抗體，本公開的抗體或核酸可進(jìn)一步被修飾以增加或減少進(jìn)入細(xì)胞的遞送效率。本文也可涵蓋基因遞送方法來遞送指導(dǎo)蛋白(例如，主題抗體或其他蛋白)在細(xì)胞中表達(dá)的核酸?？贵w的細(xì)胞攝取(例如胞吞)的效率可以通過連接于肽或蛋白而增加或減少。例如，給定抗體可以連接于更易通過胞吞機(jī)理被吞沒的靶受體或大分子(例如另一抗體)的配體，其中此類抗體為“抗體綴合物”。當(dāng)胞吞小泡與溶酶體融合時(shí)，綴合物有效載荷(例如，配體)也可被酸水解或酶活性釋放。為了改變細(xì)胞攝取，綴合物可包括在細(xì)胞表面上保留抗體的配體，其可用作(例如，為了減少)細(xì)胞攝取的控制(例如，為了減少)，或在一些實(shí)例下減少在一種細(xì)胞類型中的攝取同時(shí)增加其在其他細(xì)胞類型中的攝取。

當(dāng)抗體連接于另一抗體時(shí)，抗體可以是雙特異性的。如上所述，雙特異性抗體是指對可能是或可能不是相同抗原的兩個(gè)不同表位特異的抗體。

綴合抗體的其他特征可以包括其中綴合物相對于未綴合抗體而減少毒性的特征。另一特征為綴合物可以比未綴合抗體更有效地靶向細(xì)胞或器官的類型(例如癌細(xì)胞或癌組織)。

另外實(shí)例包括與一個(gè)或多個(gè)分子綴合的抗體，所述分子補(bǔ)充、增強(qiáng)、增加與抗體的連接或可另外協(xié)同運(yùn)作?？贵w可具有連接的抗癌藥物，例如，用于遞送至癌癥位點(diǎn)以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞死亡或清除，例如抗增殖部分(例如，VEGF拮抗物，如抗-VEGF抗體)、毒素(例如，蓖麻毒素、假單胞菌外毒素A等)、放射性核素(例如用于硼中子捕獲的⁹⁰Y、¹³¹I、¹⁷⁷L、¹⁰B等)、抗癌劑(參見下表5)和/或寡核苷酸(例如siRNA)。

例如，抗體可以通過共價(jià)或非共價(jià)修飾而配制于脂類納米粒子(例如，脂質(zhì)體)中。例如，抗體可經(jīng)由Fc區(qū)直接連接于脂類納米粒子的表面。抗體也可經(jīng)由連接體共價(jià)連接于移植在或插入到脂類納米粒子的表面的聚合物的末端。此類綴合的脂類納米粒子可在本文稱為“免疫脂質(zhì)體”。免疫脂質(zhì)體中的主題抗體可充當(dāng)能使免疫脂質(zhì)體與癌細(xì)胞表面上的CD44和/或EphA2特異性結(jié)合的靶向部分。免疫脂質(zhì)體可載荷有一種或多種抗癌劑，例如小分子、肽和/或核酸(例如siRNA)或下表5中所列出的那些。制備和載荷脂類納米粒子例如脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體的方法在本領(lǐng)域是已知的，例如US 20100068255、US 20100008978、US 20090171077、US 20090155272、US 20070116753、US 20070110798、US 20070031484、US 20060147513、US 20050112065、US 20040037874、US 20040209366、US 20030003143、US 7,135,177、US 7,022,336、US 6,803,053、US 6,528,087、US 6,214,388、US 6,210,707、US 6,110,491、US 5,980,935、US 5,380,531、US 7,507,407、US 7,479,276和US 7,462,603。

下表列出可用于修飾主題抗體(例如通過將藥物與抗體共價(jià)或非共價(jià)地連接)的抗癌劑的一些實(shí)例。如下文論述，下面列出的任何藥物也可與主題抗體配制于組合物或在主題方法中以組合療法施用。

表5：抗癌劑

本公開的抗體可任選地被修飾以提供改善的藥動(dòng)學(xué)特征(例如，通過聚乙二醇化、高糖基化等)?？稍鰪?qiáng)血清半衰期的修飾是所關(guān)注的。主題抗體可以被“聚乙二醇化”，如含有一個(gè)或多個(gè)聚(乙二醇)(PEG)部分。適用于蛋白質(zhì)的聚乙二醇化的方法和試劑在本領(lǐng)域中是熟知的并且可以在美國專利No.5,849,860中發(fā)現(xiàn)。適用于綴合于蛋白的PEG通常在室溫下可溶于水，并且具有與通式R(O-CH₂-CH₂)_nO-R，其中R是氫或保護(hù)基例如烷基或烷醇基團(tuán)，并且其中n是1至1000的整數(shù)。其中R是保護(hù)基，其通常具有1至8個(gè)碳。

與主題蛋白綴合的PEG可以是直鏈的。與主題蛋白綴合的PEG也可以是支鏈的。支鏈PEG衍生物例如在美國專利No.5,643,575中描述的那些(“星形-PEG”)和多臂PEG例如在Shearwater Polymers,Inc.目錄“Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998”中描述的那些。星形PEG在本領(lǐng)域(包括例如，在美國專利No.6,046,305)中描述。

當(dāng)主題抗體從來源中待分離時(shí)，主題蛋白可與促進(jìn)純化的部分，例如特異性結(jié)合對的成員，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結(jié)合對的成員)、凝集素等綴合。主題蛋白也可以結(jié)合于(例如，固定于其上)固體支架，包括但不限于聚苯乙烯板或珠、磁珠、測試條、膜等。

當(dāng)在測定中待檢測抗體時(shí)，主題蛋白也可以含有可檢測標(biāo)記，例如放射性同位素(例如，¹²⁵I；³⁵S等)、產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶(例如，熒光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、熒光蛋白、發(fā)色蛋白、染料(例如，異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白等)；通過金屬螯合基團(tuán)例如EDTA連接于蛋白的熒光發(fā)射金屬，例如¹⁵²Eu或其他鑭系元素；化學(xué)發(fā)光化合物，例如魯米諾、異魯米諾(isoluminol)、吖啶鹽等；生物發(fā)光化合物，例如熒光素；熒光蛋白質(zhì)等。間接標(biāo)記包括對主題蛋白特異的抗體，其中抗體可通過第二抗體；和特異性結(jié)合對的成員，例如生物素-抗生物素蛋白等來檢測。

用于修飾主題抗體的任何上述元件可經(jīng)由連接體(例如撓性連接體)連接于抗體。如果存在，則連接體分子通常具有足以允許抗體和連接載體在抗體與載體之間的一些撓性運(yùn)動(dòng)的長度。連接體分子通常為約6-50個(gè)原子長度。連接體分子也可以是例如，芳基乙炔、含有2-10個(gè)單體單元的乙二醇寡聚體、二胺、二酸、氨基酸或其組合。

當(dāng)連接體為肽時(shí)，連接體可以具有任一種適合的不同長度，例如1個(gè)氨基酸(例如，Gly)至20或更多個(gè)氨基酸、2個(gè)氨基酸至15個(gè)氨基酸、3個(gè)氨基酸至12個(gè)氨基酸，包括4個(gè)氨基酸至10個(gè)氨基酸、5個(gè)氨基酸至9個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸至8個(gè)氨基酸、或7個(gè)氨基酸至8個(gè)氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7個(gè)氨基酸。

撓性連接體包括甘氨酸聚合物(G)_n、甘氨酸-絲氨酸聚合物(包括，例如(GS)_n、GSGGS_n(SEQ ID NO:2)和GGGS_n(SEQ ID NO:3)，其中n是至少為1的整數(shù))、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物和本領(lǐng)域已知的其它撓性連接體?？梢允褂酶拾彼岷透拾彼?絲氨酸聚合物，其中相對未構(gòu)建的氨基酸是所關(guān)注的，并且可以用作組分之間的天然系鏈。撓性連接體的實(shí)例包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:4)、GGSGG(SEQ ID NO:5)、GSGSG(SEQ ID NO:6)、GSGGG(SEQ ID NO:7)、GGGSG(SEQ ID NO:8)、GSSSG(SEQ ID NO:9)等。普通技術(shù)人員會識別，對與上文所述的任何元件綴合的肽的設(shè)計(jì)可以包括全部或部分撓性的連接體，以使連接體可以包括撓性連接體以及一個(gè)或多個(gè)提供較低撓性的結(jié)構(gòu)的部分。

人工程化抗體

當(dāng)結(jié)合CD44或EphA2的本公開的抗體不是人的時(shí)，抗體可以被人源化。如本文所用的，人源化抗體是源自非人(例如，嚙齒類動(dòng)物)抗體并且已經(jīng)被修飾以含有人抗體的框架和/或恒定區(qū)的至少一部分的重組多肽。

人源化抗體還涵蓋其中各個(gè)區(qū)域可源自不同種類的嵌合抗體和CDR-移植抗體。嵌合抗體可以是包括來自與人恒定區(qū)連接的任何來源的可變區(qū)的抗體。因此，在嵌合抗體中，可變區(qū)可以是非人的，并且恒定區(qū)是人的。CDR-移植抗體是包括來自與人“受體”抗體的框架區(qū)連接的非人“供體”抗體的CDR的抗體。例如，scFV形式的本公開的抗體可以連接于人恒定區(qū)(例如Fc區(qū))而變成人免疫球蛋白。

Fc區(qū)

結(jié)合CD44或EphA2的本公開的抗體可以含有Fc區(qū)。Fc區(qū)可以是在人或其他動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的天然存在的同種型(例如源自任何類或子類的免疫球蛋白)中的任一種并且可以任選地被進(jìn)一步修飾具有改變的功能。例如，F(xiàn)c區(qū)可以在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基位置被修飾以具有增加的效應(yīng)子功能，例如引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或激活補(bǔ)體活性(例如C1q結(jié)合或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)、下調(diào)細(xì)胞表面受體等?？捎米鞅竟_的抗體的Fc變體的細(xì)節(jié)可以發(fā)現(xiàn)于例如，US7,416,727、US7,371,826、US7,335,742、US7,355,008、US7,521,542和US7,632,497中。

組合物

主題組合物提供抗體和/或編碼其的核酸，其中抗體結(jié)合癌細(xì)胞并且被癌細(xì)胞內(nèi)化。本公開的組合物可用于治療患有癌癥的受試者(例如，人)，并且可適用于在該疾病任何階段的治療。含有一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)不同抗體的組合物可以藥物組合物形式提供并且向需要其的哺乳動(dòng)物(例如，向人)施用。

本文涵蓋的組合物可以含有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)不同的本公開抗體(和/或編碼其的核酸)。例如，組合物可含有下列中的一個(gè)或多個(gè)：F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11。組合物可任選地進(jìn)一步包括含有一個(gè)或多個(gè)來自這些抗體的CDR的抗體，和/或一個(gè)或多個(gè)含有這些抗體的突變體或衍生物的抗體。

本公開的組合物的實(shí)例可以包括任一種上述的組合或者圖7、8或9A和9B或圖44-47中公開的一個(gè)或多個(gè)抗體。當(dāng)組合物包含兩個(gè)或更多個(gè)抗體時(shí)，每個(gè)抗體可以對相同或不同表位或不同抗原上的表位具有特異性。例如，組合物可以含有至少一個(gè)對CD44或EphA2的表位特異的抗體和另一個(gè)對另一個(gè)細(xì)胞表面抗原例如EGFR特異的抗體。組合物也可以含有雙重特異性、多特異性抗體或編碼其的核酸。

本公開的抗體可單獨(dú)使用和/或彼此組合(例如以形成雙特異性或多特異性抗體)、和/或與其他已知的抗癌劑(例如用于癌癥治療的抗體)組合使用。例如，組合物如脂質(zhì)體可以包含兩個(gè)或更多個(gè)抗體，其中至少一個(gè)抗體為本公開的抗體。如上述，脂質(zhì)體可以含有一個(gè)或多個(gè)與主題抗體不同的抗體。此類脂質(zhì)體可以是雙重特異性、多特異性等，以使脂質(zhì)體對除主題抗體的表位之外的另外表位(例如EGFR或HER2中的表位)特異。

組合可以在單一制劑中提供或可以單獨(dú)制劑形式在試劑盒中提供，其中單獨(dú)制劑可以含有單一抗體或兩個(gè)抗體。試劑盒的此類單獨(dú)制劑可在施用之前組合或通過單獨(dú)注射來施用。

主題藥物組合物可以在藥學(xué)上可接受的賦形劑中提供，其可以是溶液例如水溶液，例如鹽水溶液，或可以以粉末形式提供。主題組合物可以包含其他組分，例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、鎂、碳酸鹽等。組合物可以含有按需要接近生理?xiàng)l件的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。

主題抗體(例如呈藥學(xué)上可接受的鹽的形式)可以配制成用于隨后下文所述的方法的口服、局部或胃腸外施用形式。在某些實(shí)施方案中，例如當(dāng)抗體以可注射(例如，適用于靜脈內(nèi)注射)液體形式施用時(shí)，抗體制劑可以是包含鹽(例如，以調(diào)節(jié)張度)緩沖劑、防腐劑、氨基酸和其他藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑的無菌、非熱源水溶液，并且可以作為即用型劑型或作為由藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑組成的可重建的貯藏穩(wěn)定的粉末或液體提供。增強(qiáng)傳送的遞送的制劑可以在例如US 20090208422中描述。

本公開的組合物可以包括治療有效量的主題抗體，以及(如需要)任何其他相容組分。所謂“治療有效量”是指以單一劑量、作為一系列相同或不同的抗體或組合物的部分向個(gè)體施用的量有效減少癌細(xì)胞在受試者中的增殖和/或轉(zhuǎn)移或者有效提供任何其他可檢測的治療益處。此類治療有效量的抗體及其對細(xì)胞生長的影響包括與一種或多種其他療法(例如，免疫療法、化療、放射療法等)結(jié)合的協(xié)作和/或協(xié)同性抑制細(xì)胞生長。如下所示，可結(jié)合給藥方案和對受試者疾患的診斷分析(例如，使用對CD44和/或EphA2特異的抗體來監(jiān)測細(xì)胞表面表位是否存在)等來調(diào)節(jié)治療有效量。

量和劑量

精確劑量將可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。劑量可取決于多種因素，包括所用特定化合物的強(qiáng)度、受試者的疾患和受試者的體重，以及疾病的嚴(yán)重程度和疾病的階段。劑量的大小也將通過可能伴隨特定化合物的施用的任何不良副作用的存在、性質(zhì)和程度來確定。如本領(lǐng)域所知，基于年齡、體重、性別、飲食、施用時(shí)間、藥物相互作用和疾患嚴(yán)重程度的調(diào)節(jié)可以是必要的并且將可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在常規(guī)實(shí)驗(yàn)下確定。治療有效量也可以是其中抗體或抗體片段的在治療上有益的效應(yīng)勝過任何毒性或有害的效應(yīng)的量。

在本公開的上下文中向受試者例如人施用的組合物的量應(yīng)該足以在合理的時(shí)幀內(nèi)引起動(dòng)物的預(yù)防性或治療性響應(yīng)，并且隨施用目的、待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、所需的解決程度、抗體組合物的制劑、治療臨床醫(yī)生對醫(yī)療局勢的評估以及其他相關(guān)因素而變化。因此希望該量在相對寬的范圍之內(nèi)，但是可以通過受試者的各種特征(例如上述的)來常規(guī)確定。

作為一個(gè)實(shí)例，治療或預(yù)防有效量的主題抗體的非限制性范圍為約0.1mg/kg至約20mg/kg，例如約1mg/kg至約10mg/kg。

抗體在藥物制劑中的濃度可按重量計(jì)低于約0.1％、通常為或至少約2％至高達(dá)20％至50％或以上變化，并且將根據(jù)所選的特定施用模式和患者的需要，主要通過考慮流體體積、粘度等來選擇。所得的組合物可以呈溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、凝膠、霜?jiǎng)?、洗劑、軟膏劑、氣溶膠等的形式。

此外，適合的劑量和劑量方案可通過比較已知影響所需生長抑制性或免疫抑制性響應(yīng)的抗癌劑或免疫抑制劑來確定。此類劑量包括導(dǎo)致細(xì)胞生長的低劑量抑制而無顯著副作用的劑量。在適當(dāng)劑量中和在適合施用某些化合物的情況下，本公開的化合物可提供寬范圍的胞內(nèi)效應(yīng)，例如從部分抑制細(xì)胞生長到基本上完全抑制細(xì)胞生長。劑量治療可以是單一劑量時(shí)間表或多個(gè)劑量時(shí)間表(例如，包括斜升和維持劑量)。如下所示，主題組合物可以與其它藥物結(jié)合施用，并且因此劑量和方案在本上下文中也可變化以適應(yīng)受試者的需要。

組合療法

多種癌癥療法中的任一種療法可與主題抗體在組合物中組合。例如，化療治療或生物響應(yīng)修飾劑治療中所用的藥物可存在于包含抗體的藥物組合物例如免疫脂質(zhì)體中?？捎糜谂c主題抗體組合的某些藥物在上面表5中提供和/或在下文簡短論述。

化療劑是減少癌細(xì)胞增殖的非蛋白化合物，并且涵蓋細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞抑制劑?；焺┑姆窍拗菩詫?shí)例包括烷化劑、亞硝基脲、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物(例如，長春花)生物堿、核酸例如抑制核酸(例如siRNA)和甾類激素。

例如，抗代謝藥包括葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物和腺苷脫氨酶抑制劑。

適合的天然產(chǎn)物及其衍生物(例如，長春花生物堿、抗腫瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)可用作抗癌劑。例如，紫杉烷如紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物例如多西他賽、或紫杉烷前藥例如為2'-(2-(N,N'-二乙基氨基)丙?；?-紫杉醇、7-(2-(N,N'-二乙基氨基)丙?；?-紫杉醇、2'-(2-(N,N'-二乙基氨基)丙酰基)-多西他賽或7-(2-(N,N'-二乙基氨基)丙?；?-多西他賽是適合的。

其他抗增殖細(xì)胞毒性劑是諾維本(navelbene)、CPT-11(伊立替康)、阿那曲唑、來曲唑、卡培他濱、雷洛昔芬(reloxafine)、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺和droloxafine。具有抗增殖活性的微管影響劑也適于應(yīng)用。激素調(diào)節(jié)劑和甾類(包括合成類似物)適于應(yīng)用。

診斷方法

本公開提供在受試者的生物樣品或從受試者分離的樣品中檢測腫瘤相關(guān)抗原(例如CD44或EphA2)的方法。該方法可用于診斷和預(yù)后目的。主題方法一般包括將含有細(xì)胞的樣品與本公開的抗體接觸；和檢測抗體與樣品中的細(xì)胞的結(jié)合。該細(xì)胞可以在體外，其中細(xì)胞在從疑似具有癌細(xì)胞的受試者、正經(jīng)受癌癥治療的受試者或正測試對治療的敏感性的受試者中獲得的生物樣品中。細(xì)胞可以在體內(nèi)，例如細(xì)胞在疑似具有癌細(xì)胞的受試者、正經(jīng)受癌癥治療的受試者或正測試對治療的敏感性的受試者中。

可通過免疫診斷技術(shù)、使用抗體在具有或疑似具有癌細(xì)胞的受試者的生物樣品中檢測表達(dá)CD44和/或EphA2的細(xì)胞。此類診斷可用于鑒定適于下文隨后描述的療法的患者，和/或用于監(jiān)測對療法的響應(yīng)。

適當(dāng)?shù)拿庖咴\斷技術(shù)包括但不一定限于，體外和體內(nèi)(成像)方法。例如，抗-CD44或抗-EphA2抗體可以被可檢測標(biāo)記，向疑似具有特征在于CD44或EphA2的細(xì)胞表面表達(dá)的癌癥的受試者施用，并且結(jié)合使用本領(lǐng)域可得的成像方法檢測的可檢測標(biāo)記的抗體。

本文所用的短語“體內(nèi)成像”是指檢測抗體(例如可檢測標(biāo)記的2D6)在整個(gè)活哺乳動(dòng)物中的存在的方法。任選可檢測的蛋白例如熒光抗體和熒光素酶-綴合的抗體可通過體內(nèi)成像來檢測。用于使用熒光素酶對熒光素酶表達(dá)在活哺乳動(dòng)物中的實(shí)時(shí)成像的方法可容易適于在本文公開的主題方法中使用(例如，Greer LF等人，Luminescence 2002,17:43-74)。熒光蛋白在活哺乳動(dòng)物中的體內(nèi)成像描述于例如Hoffman,Cell Death and Differentiation 2002,9:786-789中。體內(nèi)成像可用于提供哺乳動(dòng)物的2-D以及3-D圖像。放射性標(biāo)記的抗體例如可向受試者施用并且該受試者用γ照相機(jī)成像。電荷偶聯(lián)器件照相機(jī)、CMOS或3D斷層攝影術(shù)可用于進(jìn)行體內(nèi)成像。例如，Burdette JE Journal of Mol.Endocrin.,40:253-261,2008綜述了利用計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)、磁共振成像、超聲波檢查、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(SPECT)等。來自很多體內(nèi)成像方法的信息如上述的那些可提供關(guān)于受試者的癌細(xì)胞的信息。

當(dāng)該方法在體外時(shí)，生物樣品可以是其中可存在癌細(xì)胞的任何樣品，包括但不限于血樣(包括全血、血清等)、組織、全細(xì)胞(例如，完整細(xì)胞)、和組織或細(xì)胞提取物。例如，測定可包括檢測活細(xì)胞或組織學(xué)組織樣品中的細(xì)胞上的CD44和/或EphA2。特別地，可以在活細(xì)胞的胞外表面上評估檢測。例如，組織樣品可被固定(例如，通過福爾馬林處理)并且可埋入在支架(例如，石蠟)中或冷凍在未固定組織中而提供。

測定可采用多種形式，例如競爭、直接反應(yīng)或夾心型測定。測定的實(shí)例包括蛋白質(zhì)印跡；凝集試驗(yàn)；酶標(biāo)記的和介導(dǎo)的免疫測定，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)；生物素/抗生物素蛋白型測定；放射免疫測定；免疫電泳；免疫沉淀等。反應(yīng)一般包括與抗體綴合的可檢測標(biāo)記。標(biāo)記包括為熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記和/或染料分子標(biāo)記，或用于檢測樣品中的抗原與抗體或隨其反應(yīng)的抗體之間的復(fù)合物的形成的其他方法。

當(dāng)使用固體支架時(shí)，固體支架通常在適合結(jié)合條件下首先與固相組分反應(yīng)以使抗體充分地固定于支架。有時(shí)，固定于支架可通過首先將抗體與具有較好結(jié)合性質(zhì)的蛋白偶聯(lián)而得到增強(qiáng)，或者提供抗體在支架上的固定而沒有抗體結(jié)合活性或特異性的顯著損失。適合的偶聯(lián)蛋白包括但不限于，大分子例如血清白蛋白(包括牛血清白蛋白(BSA))、匙孔戚血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他蛋白?？捎糜趯⒖贵w結(jié)合至支架的其他分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物等，附加條件是用于固定抗體的分子未不利地影響抗體特異性結(jié)合抗原的能力。此類分子和將這些分子與抗體偶聯(lián)的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。

可以使用ELISA方法，其中微量滴定板的孔涂敷有主題抗體。然后將含有或疑似含有CD44和/或EphA2的生物樣品加至涂敷的孔。在足以允許抗體結(jié)合的孵育期后，可以洗滌板以除去未結(jié)合部分并且加入可檢測標(biāo)記的第二結(jié)合分子。允許第二結(jié)合分子與任何捕獲的抗原反應(yīng)，洗滌板并且使用本領(lǐng)域熟知的方法來檢測第二結(jié)合分子的存在與否。

如有需要，來自生物樣品的結(jié)合的CD44和/或EphA2的存在與否可容易地使用包含直接針對抗體配體的抗體的第二結(jié)合劑來檢測。例如，許多抗-牛免疫球蛋白(Ig)分子在本領(lǐng)域中是已知的，其可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法容易地與可檢測的酶標(biāo)記例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或脲酶綴合。然后將適當(dāng)?shù)拿傅孜镉糜诋a(chǎn)生可檢測信號。在其他相關(guān)實(shí)施方案中，競爭型ELISA技術(shù)可以使用本領(lǐng)技術(shù)人員已知的方法來實(shí)踐。

測定也可以在溶液中進(jìn)行，以使在沉淀?xiàng)l件下抗體和抗原形成復(fù)合物。抗體涂敷的顆?？稍谶m合的結(jié)合條件下與疑似含有靶抗原的生物樣品接觸以提供顆粒-抗體-抗原復(fù)合聚集物的形成，該聚集物可以利用洗滌和/或離心從樣品中沉淀并分離?？梢允褂枚喾N標(biāo)準(zhǔn)方法中的任一種例如上述的那些免疫診斷方法來分析反應(yīng)混合物以確定抗體-抗原復(fù)合物的存在與否。

可選地，活細(xì)胞中的細(xì)胞攝取的測定可以是積極鑒定癌細(xì)胞的另一種診斷技術(shù)。因?yàn)橹黝}抗體被表達(dá)CD44和/或EphA2的細(xì)胞特異性內(nèi)化，所以可允許細(xì)胞內(nèi)化抗體并且洗滌掉未被內(nèi)化的任何抗體(例如酸洗)。內(nèi)化抗體可以經(jīng)由其包含在細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記來檢測(例如FACS、光譜儀、放射性同位素計(jì)數(shù)儀等)。如US7,045,283中所述，也可以選擇內(nèi)化抗體。

利用基于抗體的療法，本文所述的診斷測定可用于確定或多或少適于療法的受試者是否患有癌癥，以及監(jiān)測受試者中治療的進(jìn)展。其也可以用于評估其他組合療法的進(jìn)程。因此，診斷測定可由臨床醫(yī)生告知對療法和治療方案的選擇。

上述測定試劑(包括本公開的抗體)可與適合的說明書和其他必要試劑在試劑盒中提供，以便進(jìn)行如上所述的免疫測定。取決于所用的特定免疫測定，試劑盒也可含有適合的標(biāo)記和其他包裝的試劑和材料(即洗滌緩沖液等)。標(biāo)準(zhǔn)免疫測定例如上述的那些可以使用這些試劑盒來進(jìn)行。

治療方法

主題抗體發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中具有治療用途。涵蓋患有、疑似患有或處于罹患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者用于本文所述的療法和診斷。

所謂“治療”是指至少實(shí)現(xiàn)與折磨宿主的疾患相關(guān)的癥狀的改善，其中改善在寬泛意義上用于是指至少參數(shù)(例如與待治療的疾患相關(guān)的癥狀)的量值減少。因此，治療也包括其中病理狀態(tài)、或至少與其相關(guān)的癥狀被完全抑制，例如防止其發(fā)生，或被完全停止，例如終止，以使宿主不再遭受疾患，或至少表征該疾患的癥狀。因此治療包括：(i)防止，也就是說，降低臨床癥狀發(fā)展的危險(xiǎn)，包括導(dǎo)致臨床癥狀不發(fā)展，例如防止疾病進(jìn)展至有害狀態(tài)；(ii)抑制，也就是說，阻止臨床癥狀的發(fā)展或進(jìn)一步發(fā)展，例如減輕或完全抑制活動(dòng)性疾病，例如以便減少腫瘤載荷，其減少可以包括消除可檢測的癌細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞)；和/或(iii)解除，也就是說，導(dǎo)致臨床癥狀的消退。

多種受試者可根據(jù)本方法來治療。通常，此類受試者為″哺乳類″或″哺乳動(dòng)物″，其中這些術(shù)語在廣泛地用于描述在哺乳類動(dòng)物內(nèi)的生物，包括食肉目動(dòng)物(例如，狗和貓)、嚙齒目動(dòng)物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和靈長目動(dòng)物(例如，人、黑猩猩和猴)。在很多實(shí)施方案中，受試者將為人。

在相關(guān)實(shí)施方案中，待治療的受試者具有表達(dá)(例如過表達(dá))腫瘤相關(guān)抗原、CD44和/或EphA2的細(xì)胞。抗原在癌細(xì)胞表面上表達(dá)并且經(jīng)常以比相應(yīng)的非癌細(xì)胞高的水平存在。這個(gè)方面可以在本公開的方法的上下文中是有益的，因?yàn)楸磉_(dá)或呈現(xiàn)CD44和/或EphA2的細(xì)胞可適于利用本公開的抗體治療?？贵w可以向受試者施用，例如，其中在抗原的存在是不可檢測的點(diǎn)引發(fā)療法，并且因此不意在是限制性的。在疾病癥狀的第一預(yù)兆之前、在可能疾病的第一預(yù)兆時(shí)或者在診斷疾病之前或之后引發(fā)抗體療法也是可能的。

也在本文所述的方法中涵蓋本公開的抗體組合物的前藥。此類前藥一般是化合物的功能衍生物，其容易在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成所需化合物。因此，在本公開的方法中，術(shù)語“施用”涵蓋施用明確公開的化合物或施用可能未明確公開、但在向需要其的受試者施用后體內(nèi)轉(zhuǎn)化成指定化合物的化合物。用于選擇和制備適合的前藥衍生物的常規(guī)方法描述于例如Wermuth,“Designing Prodrugs and Bioprecursors”中，Wermuth編輯The Practice of Medicinal Chemistry，第2版，第561-586頁(Academic Press 2003)。

癌癥

抗體組合物可以有利地用于抗癌療法，特別是在癌細(xì)胞呈遞胞外可及的細(xì)胞表面上的EphA2和/或CD44時(shí)。一個(gè)實(shí)例為呈遞由F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11結(jié)合的表位的癌癥。

本文所述的抗體組合物可以向受試者(例如人患者)施用以減少癌細(xì)胞的增殖，例如以減少腫瘤大小、減少癌癥載荷、減少轉(zhuǎn)移和/或改善患者中的臨床結(jié)果。例如，抗體組合物可用于中斷癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，并且促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡。與本文涵蓋的癌癥有關(guān)的方法包括，例如應(yīng)用單獨(dú)或與抗癌疫苗或療法組合的抗體療法。

特別適于抗體療法的癌癥可以通過與上述的診斷方法類似的方法和本領(lǐng)域已知的其他方法來鑒定。

癌癥的類型

當(dāng)抗癌療法包括施用前述的抗體組合物時(shí)，抗癌療法可以特別地定向表達(dá)細(xì)胞表面可及的和/或溶劑暴露的由主題抗體結(jié)合的表位的癌細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)移性癌癥。

可通過主題方法治療的呈遞CD44的表位的癌癥的實(shí)例包括乳腺癌(例如基底細(xì)胞乳腺癌)、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌等以及腺癌和頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)。適于治療的其他癌癥也可以是為轉(zhuǎn)移性和/或具有轉(zhuǎn)移潛力的任何癌癥。

呈遞EphA2的表位的癌癥的實(shí)例包括但不限于上皮來源的癌細(xì)胞。例如，癌細(xì)胞可源自乳腺癌(例如基底細(xì)胞乳腺癌)、皮膚癌(例如黑素瘤)、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和/或卵巢癌。例如，抗-EphA2抗體對其具有親和性的其他癌細(xì)胞可以是肝癌、食道鱗狀細(xì)胞癌、表皮癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和/或其他神經(jīng)癌。

應(yīng)當(dāng)指出，盡管EphA2或CD44可以在癌細(xì)胞上以比非癌細(xì)胞高的水平表達(dá)，但是并不是對本文公開的療法的限制。

可通過本文公開的方法適于療法的癌包括但不限于食道癌、肝細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌(皮膚癌形式)、鱗狀細(xì)胞癌(各種組織)、膀胱癌(包括移行細(xì)胞癌(膀胱的惡性腫瘤)、支氣管癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌(包括肺的小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌)、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、腎細(xì)胞癌、原位導(dǎo)管癌或膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞癌、胚胎性癌、胚胎性癌肉瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、成骨性癌、上皮癌和鼻咽癌。

可通過本文公開的方法適于療法的肉瘤包括但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、間皮瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤和其他軟組織肉瘤。

可通過本文公開的方法適于療法的實(shí)體瘤包括但不限于膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。

可通過本文公開的方法適于療法的白血病包括但不限于a)慢性骨髓增殖性綜合征(多潛能造血干細(xì)胞的腫瘤病癥)；b)急性髓細(xì)胞性白血病(多潛能造血干細(xì)胞或有限譜系潛能造血細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)化)；c)慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL；免疫不成熟和功能不勝任的小淋巴細(xì)胞的克隆增殖)，包括B-細(xì)胞CLL、T-細(xì)胞CLL幼淋巴細(xì)胞白血病和多毛細(xì)胞白血病；和d)急性淋巴細(xì)胞性白血病(特征在于淋巴母細(xì)胞的蓄積)?？赏ㄟ^本文公開的方法治療的淋巴瘤包括但不限于B-細(xì)胞淋巴瘤(例如，伯基特淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等。

可根據(jù)本文公開的方法適于治療的其他癌癥包括非典型腦膜瘤(腦)、胰島細(xì)胞癌(胰臟)、髓樣癌(甲狀腺)、間葉瘤(腸)、肝細(xì)胞瘤(肝)、肝母細(xì)胞瘤(肝)、透明細(xì)胞癌(腎)和縱隔神經(jīng)纖維瘤。

可使用本文公開的方法適于治療的癌的其他實(shí)例包括但不限于上皮和神經(jīng)外胚層來源的癌。上皮來源的實(shí)例包括但不限于小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、晶狀體癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、卵巢癌和支氣管上皮癌。本公開的方法可用于治療已知過表達(dá)CD44和/或EphA2的癌細(xì)胞。

神經(jīng)外胚層來源的癌癥的實(shí)例包括但不限于尤文肉瘤、脊髓腫瘤、腦腫瘤、嬰兒幕上原初神經(jīng)外胚層腫瘤、腎管狀囊性癌、腎黏液樣管狀和梭形細(xì)胞癌、腎腫瘤、縱隔腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤，以及青少年和年輕成人的肉瘤。

與其他癌癥療法的組合

如上所述，該方法的另一特征是抗體可以與一種或多種其他療法組合向受試者施用。此類療法可以在組合物中組合或與主題抗體綴合。除與本文公開的抗體物理組合(例如，作為綴合物或以脂質(zhì)體或其他脂類納米粒子)之外，一種或多種抗癌劑例如上面表5中列出的那些可在施用本文公開的抗體同時(shí)或者之前或之后聯(lián)合施用。

除施用抗體組合物之外的療法或治療可在同時(shí)至施用主題抗體之前或之后多達(dá)5小時(shí)或以上，例如10小時(shí)、15小時(shí)、20小時(shí)或以上的任何一點(diǎn)施用。相繼施用或應(yīng)用主題抗體和其他治療干預(yù)，例如其中主題抗體在另一治療性治療之前或之后施用。主題抗體和其他療法同時(shí)施用，例如其中主題抗體與第二療法在同一時(shí)間施用，例如當(dāng)?shù)诙煼樗幬飼r(shí)其可與主題抗體一起作為兩個(gè)單獨(dú)制劑施用或組合到向受試者施用的單一組合物中。不管是否相繼或同時(shí)施用，如上所闡述，出于本公開的目的，治療被認(rèn)為一起或組合施用。

可以或不可以與主題抗體聯(lián)合施用的另外的標(biāo)準(zhǔn)抗癌治療包括但不限于免疫療法、化療劑和手術(shù)(例如，如下文進(jìn)一步所述的那些)。此外，主題抗體的治療性施用也可以是利用抗癌療法的受試者的后治療性治療，其中抗癌療法是，例如手術(shù)、放射療法、施用化療劑等。也可以使用靶細(xì)胞的除本文公開的那些抗體之外的抗體，特別是可以提供補(bǔ)體介導(dǎo)的殺死，和/或抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性介導(dǎo)的殺死的單克隆抗體。

例如，主題抗體可與一種或多種化療劑(例如，環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松(CHOP))組合、和/或與放射治療組合和/或與手術(shù)干預(yù)(例如，手術(shù)前或手術(shù)后以除去腫瘤)、放射療法、骨髓移植、生物響應(yīng)修飾劑治療和前述的某一組合組合施用。放射療法包括但不限于源自外部施加的來源例如波束或通過植入小放射源的X-射線或γ射線。

施用途徑

在實(shí)踐方法中，施用途徑(將主題抗體帶入受試者中的路徑)可變化，其中在下文更詳細(xì)地描述主題抗體的代表性施用途徑。單獨(dú)或以上述組合的主題抗體可以全身(例如，通過胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、室內(nèi)或皮下施用)或局部(例如，在局部腫瘤位點(diǎn)，例如通過腫瘤內(nèi)施用(例如，施用到實(shí)體瘤中，施用到淋巴瘤或白血病中的有關(guān)淋巴結(jié)中，或通過增強(qiáng)傳送的遞送，例如施用到腦中，例如，如US 20090209937中公開的)，施用到補(bǔ)給實(shí)體瘤的血管中等)施用到體腔或內(nèi)腔，或施用到器官中。這些不同的施用途徑可通過注射或輸注來進(jìn)行。

適用于胃腸外施用的制劑包括水性和非水性等滲無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和賦予制劑與預(yù)期受者血液等滲的溶質(zhì)，以及水性和非水性無菌懸液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。制劑可以在單位劑量或多劑量密封容器如安瓿和小瓶中提供，并且可以貯存于凍干(冷凍干燥的)條件下，僅需要在使用前即刻添加用于注射的無菌液體賦形劑，例如水。臨時(shí)注射溶液和懸液可由前述種類的無菌粉末、顆粒和片劑制備。用于制備胃腸外可施用的組合物的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知或明顯的，并且在出版物如Remington's Pharmaceutical Science,第15版，Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(1980)中更詳細(xì)地描述。

適用于口服施用的制劑可包括：(a)液體溶液，例如有效量的溶于稀釋劑例如水、鹽水或橙汁中的化合物；(b)膠囊、小袋(sachet)或片劑，各自含有預(yù)定量的活性成分，作為固體或顆粒；(c)于適當(dāng)液體中的懸液；和(d)適合的乳液。片劑形式可以包括乳糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、膠體二氧化硅、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸和其他賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑、調(diào)味劑和藥學(xué)上相容的賦形劑。錠劑形式可包含于調(diào)味劑(通常蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)中的活性成分，以及包含在惰性基質(zhì)(例如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠)中的活性成分的軟錠劑(pastille)、乳液、凝膠等，除活性成分之外還含有本領(lǐng)域已知的賦形劑。

本公開的制劑可制成通過吸入施用的氣溶膠制劑。這些氣溶膠制劑可被置于可接受的加壓推進(jìn)劑例如二氟二氯甲烷、丙烷、氮等中。它們也可以被配制成用于非加壓制備例如在噴霧器或霧化器中使用的藥物。

適用于局部施用的制劑可呈現(xiàn)為透皮組合物或透皮遞送裝置(“貼片”)、霜?jiǎng)?、凝膠、糊劑或泡沫劑，其除活性成分之外還含有如本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)妮d體。

栓劑制劑也可以通過與多種基質(zhì)例如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)混合而提供。適用于陰道施用的制劑可呈現(xiàn)為陰道栓劑、棉塞、霜?jiǎng)?、凝膠、糊劑、泡沫劑。

口服或直腸施用的單位劑型例如糖漿劑、酏劑和懸液可被提供，其中每個(gè)劑量單位例如一茶匙、一大湯匙、片劑或栓劑包含預(yù)定量的含有抗體組合物的組合物。同樣地，用于注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑量可包含組合物(如在無菌水、生理鹽水或另一藥學(xué)上可接受的載體中的溶液)中的抗體。

療法的施用可在所需周期內(nèi)重復(fù)，例如在約1天至約5天的周期內(nèi)重復(fù)或在約1個(gè)月、約2個(gè)月內(nèi)每數(shù)天例如約五天一次。其也可以在其他治療干預(yù)例如手術(shù)干預(yù)之前、同時(shí)或之后施用以除去癌細(xì)胞?？贵w也可以作為組合療法的一部分施用，其中向受試者施用免疫療法、癌癥化學(xué)療法或放射療法中的至少一種(如上文更詳細(xì)描述)。

篩選方法

本公開還提供篩選對在細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原(例如腫瘤相關(guān)抗原)特異以及在結(jié)合細(xì)胞表面抗原時(shí)內(nèi)化到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的抗體的方法。一些此類方法是熟知的，參見，例如US 6,794,128和US 7,045,283。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于篩選結(jié)合特定抗原并且在抗原結(jié)合時(shí)內(nèi)化到細(xì)胞中的抗體的抗體文庫(例如，噬菌體展示文庫)的方法。例如，抗體可因其與目標(biāo)TAA(例如CD44和/或EphA2)和/或癌細(xì)胞的結(jié)合而進(jìn)行選擇。本方法包括通過若干迭代輪的文庫篩選的初始內(nèi)化抗體選擇，包含在至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系上的內(nèi)化的選擇。接下來,針對一個(gè)或多個(gè)抗原(例如，酵母展示的抗原，例如已知與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型相關(guān)的抗原)選擇表達(dá)內(nèi)化抗體的噬菌體的集合以分離展示針對所需抗原的抗體的噬菌體。本方法可以根據(jù)下面實(shí)施例中描述的噬菌體展示、酵母展示和內(nèi)化選擇方法來執(zhí)行。

簡言之，用對照細(xì)胞任選地耗竭非免疫人scFv噬菌體文庫，所述對照細(xì)胞不表達(dá)(例如，不明顯表達(dá))針對其選擇的抗原以除去可與癌細(xì)胞非特異性相互作用的抗體。任選耗竭的文庫用目標(biāo)活癌細(xì)胞孵育。癌細(xì)胞可源自已知來源或未知來源。癌細(xì)胞也可以專有地源自一個(gè)細(xì)胞系或一個(gè)腫瘤或源自多個(gè)不同的細(xì)胞系或多個(gè)不同腫瘤。該方法選擇通過允許細(xì)胞胞吞抗體并且將細(xì)胞從表面結(jié)合抗體剝離、然后從細(xì)胞回收噬菌體而內(nèi)化到細(xì)胞中的抗體。在淘選和選擇期間，內(nèi)化噬菌體從細(xì)胞溶解產(chǎn)物回收并且擴(kuò)增。多個(gè)連續(xù)選擇輪次(例如兩個(gè)或更多個(gè))確保選擇展示充當(dāng)對目標(biāo)癌癥特異的內(nèi)化抗體的多肽的噬菌體。

任選地在用酵母文庫孵育之前，可以用對照酵母(例如不表達(dá)目標(biāo)抗原和/或表達(dá)無關(guān)蛋白的酵母)耗竭所選噬菌體。然后用展示一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)TAA(例如EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域)的酵母孵育先前選擇癌細(xì)胞內(nèi)化的噬菌體。用于進(jìn)一步選擇的用噬菌體孵育的酵母可表達(dá)多個(gè)TAA，每個(gè)TAA為相同全長蛋白的不同肽片段和/或每個(gè)源自不同的TAA。當(dāng)酵母展示多個(gè)TAA時(shí)，可以平行選擇對不同TAA特異的抗體。TAA還可以涵蓋已知的腫瘤相關(guān)抗原和/或其癌癥關(guān)聯(lián)仍待確定(例如疑似與癌癥相關(guān))的抗原。孵育后，洗脫與展示目標(biāo)TAA的酵母結(jié)合的噬菌體。可以針對酵母文庫進(jìn)行多個(gè)連續(xù)輪次(例如兩個(gè)或更多個(gè))。

經(jīng)過每個(gè)連續(xù)輪次(例如兩個(gè)或更多個(gè))，針對酵母文庫的選擇的嚴(yán)格性可增加?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域熟知的很多技術(shù)以增加回收噬菌體的特異性。實(shí)例包括增加的洗滌時(shí)間、增加的清潔劑濃度、增加的鹽濃度、和包含已知大分子抑制劑(例如BPTI、Ecotin和/或先前鑒定的抗體抑制劑)?？贵w的表征可以包括ELISA和抑制測定。關(guān)于在用于選擇和分離可以充當(dāng)抗-TAA劑的多肽的方法中進(jìn)行的測定的詳細(xì)信息在本領(lǐng)域中是已知的。

與噬菌體展示抗原的應(yīng)用相比，用于抗原展示的單一真核生物例如酵母的應(yīng)用可產(chǎn)生更高比例的以其適當(dāng)構(gòu)象展示的抗原。

試劑盒和系統(tǒng)

還提供了用于實(shí)施上文所述的方法的試劑盒和系統(tǒng)。例如，試劑盒和系統(tǒng)可以包括一種或多種本文所述的組合物，例如抗-CD44和/或抗-EphA2抗體(例如2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11；或F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3)、編碼它們的核酸(尤其編碼任何上述主題抗體的重鏈和/或輕鏈的CDR的核酸)、或含有它們的細(xì)胞。試劑盒的其它任選組分包括：用于施用主題抗體和/或用于進(jìn)行診斷測定的緩沖劑等。試劑盒的重組核酸也可具有限制位點(diǎn)、多個(gè)克隆位點(diǎn)、引物位點(diǎn)等以促進(jìn)其與核酸恒定區(qū)的連接。試劑盒的各種組分可以在單獨(dú)容器中提供或某些相容組分按需要可預(yù)先組合到單一容器中。

用于實(shí)施本方法的試劑盒和系統(tǒng)可以包括一種或多種包括本文所述的抗體組合物的藥物制劑。因此，試劑盒可以包括以一個(gè)或多個(gè)單位劑量呈示的單一藥物組合物。試劑盒也可包括兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)的藥物組合物。

除上述組分之外，試劑盒還可進(jìn)一步包括用于實(shí)施方法的說明書。這些說明書可以多種形式在試劑盒中呈現(xiàn)，所述形式的一種或多種可以呈現(xiàn)在試劑盒中或上。這些說明書可能存在的一種形式是作為印刷的信息在適合的介質(zhì)或基底上，例如信息印刷在其上的一頁或多頁紙，在試劑盒的包裝中或上，在包裝插入頁中等。又一種手段將是計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，例如磁盤、CD等，在其上已經(jīng)記錄信息。可存在的又一種手段是網(wǎng)站地址，其可以通過因特網(wǎng)用于在遠(yuǎn)離的位點(diǎn)訪問信息。任何便利的手段可存在于試劑盒中。

可以提供試劑盒來用于治療患有細(xì)胞增殖性疾病的宿主。試劑盒包括包含對EphA2或CD44特異的抗體的藥物組合物，以及在通過抑制受試者中癌細(xì)胞的生長治療患有癌癥疾患的宿主的方法中有效利用藥物組合物的說明書。此類說明書可以不僅包括適當(dāng)?shù)奶幚硇再|(zhì)、給藥方案和施用方法等，而且可進(jìn)一步包括任選地篩選受試者的CD44-和/或EphA2-相關(guān)疾病的說明書。這方面可幫助試劑盒的從業(yè)者計(jì)量受試者對用本公開的抗體的治療的潛在響應(yīng)性，包括與癌癥的類型和生長階段有關(guān)的治療的時(shí)間安排和持續(xù)時(shí)間。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還可進(jìn)一步包括用于檢測癌細(xì)胞的胞外可及表面上的EphA2或CD44的表位的抗體或其他試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括包含與可檢測標(biāo)記例如熒光團(tuán)綴合的抗體。

本文所用的術(shù)語″系統(tǒng)″是指存在于單一或完全不同的組合物中并一起用于實(shí)施本方法的目的的本文所述的抗體和一種或多種第二治療劑的集合。例如，單獨(dú)獲得的對TAA特異的抗體以及放在一起并向受試者共施用的化療劑型是根據(jù)本公開的系統(tǒng)。

實(shí)施例

提供下列實(shí)施例以舉例說明，但不限于由本公開提供的任何實(shí)施方案。

在本實(shí)施例中使用下列方法和材料。

方法和材料

細(xì)胞系、介質(zhì)、抗體和全長cDNA克隆。乳腺癌細(xì)胞系MCF7、T47D、MDAMB453、MDAMB231、人乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)和SUM52PE獲自ATCC和Clontech(HMEC)，或獲自Dr.Steve Ethier實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)的集合(SUM52PE)。使用先前描述的條件培養(yǎng)細(xì)胞系(Neve RM等人(2006)Cancer Cell 10:515-27)。酵母菌株EBY100在YPD培養(yǎng)基中生長(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,第13.1.2章)。在SD-CAA培養(yǎng)基上選擇用表達(dá)載體pYD2轉(zhuǎn)染的EBY100(Razai A等人(2005)J Mol Biol 351:158-69)(Current Protocols,第13章)。通過如前所述于20℃在SG-CAA培養(yǎng)基(與SD-CAA培養(yǎng)基相同，除了用半乳糖替換葡萄糖之外)中誘導(dǎo)24～48小時(shí)，在酵母表面上表達(dá)Aga2p抗原融合物(Feldhaus MJ等人(2003)Nat Biotechnol 21:163-70)。菌株大腸桿菌DH5α和TG1分別用于制備質(zhì)粒DNA和表達(dá)可溶性scFv抗體。SV5抗體使用Protein G從雜交瘤上清液純化并且利用由生產(chǎn)廠商(Invitrogen；Carlsbad,CA)提供的試劑盒用Alexa-488或Alexa-647直接標(biāo)記。生物素綴合的兔抗-fd噬菌體購自Sigma并且用于檢測噬菌體抗體。針對EphA2ECD的單克隆抗體D7購自Upstate Biotech，具有人Fc融合蛋白的多克隆山羊抗-EphA2和重組小鼠肝配蛋白A1購自R&D Systems，蛋白質(zhì)印跡的抗-CD44抗體購自NeoMarkers，并且識別連接結(jié)構(gòu)域的單克隆抗-CD44購自Abcam。EphA2和CD44的全長cDNA獲自ATCC。

用于下面實(shí)施例的噬菌體文庫包含非免疫人單鏈Fv抗體(scFv)。簡言之，通過首先由人脾細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的RNA構(gòu)建cDNA文庫而產(chǎn)生文庫。將重鏈和輕鏈譜系連結(jié)以形成scFV基因譜系。將來自天然噬菌粒抗體文庫的單鏈Fv(scFv)基因譜系亞克隆到真實(shí)噬菌體載體中以產(chǎn)生多價(jià)展示的scFv噬菌體文庫。對于詳細(xì)信息，參見Sheets MD等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:6157-62和O'Connell D等人(2002)J Mol Biol 321:49-56。

在酵母表面上展示的抗原和抗原結(jié)構(gòu)域。通過PCR使用Pfu聚合酶，將與抗原cDNA退火并且具有含有pYD2/NcoI-NotI-消化載體的25-mer重疊序列的引物設(shè)計(jì)用來擴(kuò)增抗原結(jié)構(gòu)域。在凝膠純化后，通過缺口修復(fù)使用擴(kuò)增的抗原片段和NcoI-NotI消化的pYD2載體來轉(zhuǎn)化LiAc處理的EBY100細(xì)胞(Gietz RD等人(1991)Yeast 7:253-63；Orr-Weaver TL等人(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80:4417-21)。將轉(zhuǎn)化混合物在SD-CAA中培養(yǎng)并傳代培養(yǎng)，并且通過于18℃在SG-CAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48小時(shí)來誘導(dǎo)。為了驗(yàn)證抗原展示，通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗-EphA2(R&D)和重組小鼠肝配蛋白A1(R&D)與酵母展示的EphA2ECD的結(jié)合，并且分析抗-CD44抗體(Abcam)與CD44結(jié)構(gòu)域1的結(jié)合。簡言之，在4℃用單克隆或多克隆抗體(1μg/ml)孵育被誘導(dǎo)的具有展示的特有抗原結(jié)構(gòu)域的酵母細(xì)胞(10⁶個(gè)細(xì)胞)1小時(shí)，分別使用抗-EphA2的抗-山羊PE綴合物、rEphrinA1-人Fc融合蛋白的抗-人(Fc特異性)和抗-CD44的抗-兔PE來檢測，并且用SV5-Alexa-647共染色。

優(yōu)化洗脫緩沖液以用于噬菌體抗體選擇。評價(jià)包括磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4(PBS)、40mM 2-巰基乙胺(2-MEA)、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、100mM三乙胺(TEA)和100mM甘氨酸/150mM NaCl/0.1％BSA/0.5％Tween 20的不同洗脫緩沖液從酵母表面洗脫結(jié)合的噬菌體的能力。在37℃時(shí)PBS、2-MEA和DTT的洗脫時(shí)間為1小時(shí)并且在RT時(shí)TEA和甘氨酸的洗脫時(shí)間為2分鐘。對于2-MEA和DTT洗脫用10mM半胱氨酸中和，而對于TEA和甘氨酸洗脫用1/2體積的1M Tris-HCl(pH 7.4)中和后，將洗脫的混合物用于感染指數(shù)生長型大腸桿菌TG1細(xì)胞，并且噬菌體的效價(jià)通過系列稀釋及涂鋪于四環(huán)素抗性培養(yǎng)基上來測定。

選擇對酵母展示的抗原結(jié)構(gòu)域特異的噬菌體抗體。通過在4℃用10⁸個(gè)細(xì)胞孵育10¹²個(gè)噬菌體顆粒(Sheets MD等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:6157-62；Huie MA等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:2682-7)4小時(shí)，將人乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)、魯米那乳腺癌細(xì)胞系SUM52PE、T47D和MDAMB453用于耗竭非特異性結(jié)合劑的噬菌體文庫。然后在4℃用5x10⁶個(gè)基底乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231細(xì)胞孵育耗竭的噬菌體文庫1小時(shí)，接著用冷PBS洗滌并在37℃用37℃-預(yù)溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基/10％FBS孵育30分鐘以實(shí)現(xiàn)噬菌體顆粒的受體介導(dǎo)的胞吞作用。細(xì)胞表面通過用4ml甘氨酸緩沖液(150mMNaCl,0.1M甘氨酸,pH 2.5)進(jìn)行三次5分鐘的孵育而被剝離。然后使細(xì)胞胰蛋白酶化，用PBS洗滌，在4℃用1ml 100mM TEA溶解4分鐘并且用0.5ml 1M Tris(pH 7.4)中和。擴(kuò)增經(jīng)內(nèi)化的噬菌體(TEA溶解產(chǎn)物)用于進(jìn)一步選擇。

兩輪對MDAMB231細(xì)胞的選擇后，將多克隆噬菌體抗體用于選擇對酵母展示的抗原EphA2(Y-EphA2)和CD44連接結(jié)構(gòu)域(Y-CD44D1)特異的噬菌體抗體。通過在4℃用10⁹個(gè)酵母細(xì)胞孵育2.5×10¹¹個(gè)噬菌體顆粒2小時(shí)，將經(jīng)誘導(dǎo)的展示無關(guān)蛋白的酵母細(xì)胞用于耗竭非特異性結(jié)合劑。然后在4℃將含有耗竭的噬菌體文庫的經(jīng)過濾的上清液用2×10⁷個(gè)展示特異性抗原結(jié)構(gòu)域的酵母細(xì)胞孵育1小時(shí)。酵母細(xì)胞用冷PBS洗滌10次并且通過離心沉淀。結(jié)合的噬菌體抗體通過用1ml 100mM甘氨酸/150mM NaCl/0.1％BSA/0.5％Tween 20孵育酵母細(xì)胞來洗脫，用0.5ml 1M Tris-HCl(pH 7.4)中和，并且擴(kuò)增用于另一輪選擇。在第二輪選擇中，將2×10⁷個(gè)酵母細(xì)胞用于兩種抗原，同時(shí)將來自第一輪選擇的2.1×10¹²個(gè)噬菌體顆粒用于CD44結(jié)構(gòu)域1，比較之下將3.4×10¹¹個(gè)噬菌體顆粒用于EphA2。進(jìn)行兩輪選擇。

噬菌體抗體的表征。兩輪選擇后，單個(gè)噬菌體抗體通過使單一集落在所述的96-孔微量滴定板中生長來制備(O'Connell D等人(2002)J Mol Biol 321:49-56)。通過在圓錐96-孔微量滴定板中于4℃用稀釋于FACS緩沖液(含有1mM MgCl₂、0.1mM CaCl₂和0.3％BSA的PBS)中的100μl噬菌體上清液孵育10⁵個(gè)酵母細(xì)胞2小時(shí)，然后用生物素化抗-fd抗體和鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物(PE)(Jackson)孵育，并且使用FACS LSRII(Becton Dickinson)分析，測定每種噬菌體抗體與酵母展示的抗原的結(jié)合。獨(dú)特的噬菌體抗體的數(shù)量通過經(jīng)PCR從噬菌體感染的細(xì)菌擴(kuò)增的18個(gè)scFv基因的BstNI消化的模式來測定(Marks,JD等人(1991)J Mol Biol 222:581-97)并且通過DNA測序證實(shí)。

對于與乳腺癌細(xì)胞結(jié)合和肝配蛋白A1競爭實(shí)驗(yàn)，于4℃在0至1000ng/ml的濃度的重組小鼠肝配蛋白A1(R&D)存在下用10⁸個(gè)噬菌體抗體孵育5×10⁴個(gè)MDAMB231細(xì)胞2小時(shí)。通過在4℃用生物素綴合的抗-fd抗體(1μg/ml)(Sigma)和鏈霉親和素-PE(Jackson)孵育30分鐘，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析來檢測結(jié)合的噬菌體抗體。

使用scFv抗體的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡。每個(gè)T75培養(yǎng)瓶使用含有0.5％NP40、50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、2mM DTT和蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的1ml裂解緩沖液，制備MDAMB231細(xì)胞提取物。通過將scFv基因從噬菌體載體亞克隆到表達(dá)載體pUC119mycHis(Schier R等人(1995)Immunotechnology 1:73-81)中，然后通過IMAC⁵¹使用Ni-NTA柱(Qiagen)和凝膠過濾從大腸桿菌TG1的周質(zhì)部分純化(Schier R等人(1996)J Mol Biol 255:28-43)，產(chǎn)生在C-端具有(His)₆標(biāo)簽的可溶性scFv抗體。在4℃用26μg/ml的scFv孵育細(xì)胞提取物2小時(shí)，然后在Ni-NTA瓊脂糖上捕獲免疫復(fù)合物。然后將瓊脂糖捕獲的免疫復(fù)合物在裂解緩沖液中洗滌5次并且在非還原蛋白載荷緩沖液中加熱至94℃持續(xù)4分鐘。免疫沉淀通過SDS-PAGE來離析并且通過蛋白質(zhì)印跡使用抗-EphA2(Upstate)和抗-CD44(NeoMarkers)抗體來分析。

免疫熒光。將MDAMB231細(xì)胞生長在蓋玻片上以在12孔板中達(dá)到70％匯合并且在37℃用10¹¹個(gè)噬菌體抗體孵育3小時(shí)。蓋玻片用PBS洗滌1次，用甘氨酸緩沖液(50mM甘氨酸(pH 2.5)、150mM NaCl)進(jìn)行三次5分鐘的洗滌，用PEM(80mM Potassium PIPES(pH 6.8)、5mM EGTA(pH 7)、2mM MgCl₂)中和，并用含有4％(W/V)多聚甲醛的PEM固定在冰上達(dá)30分鐘。細(xì)胞用0.1M NH₄Cl淬滅，用0.5％Triton X-100滲透，并且在4℃用TBS-T緩沖液中的5％脫脂奶粉封閉過夜。用抗生物素蛋白-生物素試劑盒(Lab Vision)封閉內(nèi)源性生物素后，用生物素化抗-fd多克隆抗體(Sigma)和鏈霉親和素Texas Red(Amersham)檢測胞內(nèi)噬菌體。將蓋玻片反轉(zhuǎn)在具有封固劑的載玻片上并且用Zeiss LSM 510激光掃描顯微鏡(Zeiss,Germany)拍攝顯微圖像。

實(shí)施例1：腫瘤相關(guān)抗原在酵母表面上的展示

兩種TAA(CD44和EphA2)在基底乳腺癌中過表達(dá)(Hamilton SR等人(2007)J Biol Chem 282:16667-80)并且被選擇在釀酒酵母(Sachromyces cerevisiae)的表面上展示。對于酵母表面展示，將EphA2(aa 1-510)的全長胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)和CD44(aa 1-149)的連接結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1)克隆到酵母展示載體pYD2中用于(C-端)與Aga2融合(Razai A等人(2005)J Mol Biol 351:158-69)。將載體DNA用于轉(zhuǎn)化EBY100，并且誘導(dǎo)細(xì)胞表面展示。將CD44和EphA2的兩個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域在酵母表面上充分展示，如通過C-端表位標(biāo)簽的單克隆抗體來量化(圖1)。與酵母展示的EphA2天然配體肝配蛋白A1的EphA2和CD44胞外結(jié)構(gòu)域、以及EphA2和CD44的抗體的特異性結(jié)合表明結(jié)構(gòu)域不僅可展示并且以可結(jié)合配體的形式展示，并且可被抗體特異性識別(圖1)。

實(shí)施例2：抗原特異性噬菌體抗體從酵母細(xì)胞表面展示的抗原中的有效回收率

將特異性結(jié)合EphA2的scFv噬菌體抗體用于研究針對酵母展示的抗原選擇噬菌體抗體的能力。用10⁸個(gè)展示靶抗原EphA2ECD的酵母細(xì)胞(Y-EphA2)孵育展示抗-EphA2人scFv 2D6的約10¹¹個(gè)噬菌體顆粒。作為對照，用10⁸個(gè)展示無關(guān)scFv的酵母細(xì)胞(Y-CON)孵育相同數(shù)量的抗-EphA2噬菌體抗體?？?EphA2噬菌體抗體從展示EphA2ECD的酵母中的回收率比抗-EphA2噬菌體抗體從展示scFv的酵母中的回收率高超過10⁴倍(圖2，圖A)。為了確定從酵母表面洗脫噬菌體抗體的最佳緩沖液，評價(jià)不同緩沖液(PBS、2-MEA、DTT、三乙胺(TEA)和甘氨酸)。盡管TAA的酵母表面展示因酵母表面上的Aga2與Aga1蛋白之間的二硫鍵引起，還原劑(包括2-MEA和DTT)通過在PBS中孵育而導(dǎo)致存活噬菌體抗體的回收率低于噬菌體的自發(fā)解離率(圖2，圖B)。相比之下，用高pH TEA緩沖液或低pH甘氨酸緩沖液的洗脫使回收的存活噬菌體的數(shù)量增加約2倍，低pH甘氨酸為那些所研究的最佳洗脫緩沖液。將這種洗脫緩沖液用于隨后研究。

為了確定在可被富集且選擇的文庫內(nèi)的特異性抗體的最低頻率，噬菌體展示的抗-EphA2抗體從10⁹至10⁰cfu進(jìn)行系列稀釋，然后與10⁹個(gè)輔助噬菌體VCSM13混合。用10⁷個(gè)展示EphA2ECD的酵母細(xì)胞或用展示CD44結(jié)構(gòu)域1的酵母孵育噬菌體混合物，然后洗滌，洗脫，并滴定回收的噬菌體。在輸入10²個(gè)特異噬菌體顆粒的情況下，從展示EphA2的酵母細(xì)胞中回收約12個(gè)噬菌體，同時(shí)針對CD44選擇時(shí)，在噬菌體存在于輸入中之前需要輸入至少10⁵個(gè)噬菌體(圖2，圖C)。對于特異性抗原-抗體對，噬菌體抗體的平均回收率為6.5x10^-2，而對于錯(cuò)配對，平均回收率為6.5x10^-5(表6)。與非特異性噬菌體相比，特異性噬菌體的這種高回收率表明針對酵母展示的抗原富集和選擇噬菌體抗體是可能的。

表6.特異性噬菌體抗體從酵母展示的抗原中的回收率

用10⁹個(gè)噬菌體孵育所示的酵母展示的抗原并且測定結(jié)合的噬菌體的效價(jià)。結(jié)果被表示為輸出/輸入噬菌體的比率。Y＝酵母展示的抗原；PhAb＝噬菌體展示的抗體。

實(shí)施例3：在展示腫瘤抗原的酵母細(xì)胞上選擇抗原特異性噬菌體抗體

用于選擇特異性腫瘤抗原的內(nèi)化噬菌體抗體的策略示于圖3中。為了確保噬菌體抗體結(jié)合的腫瘤抗原在人腫瘤細(xì)胞的表面上呈遞并且可以在抗原結(jié)合時(shí)被內(nèi)化，使用起始噬菌體文庫。非免疫人scFv噬菌體文庫的第二輪選擇后的多克隆噬菌體輸出(O'Connell D等人(2002)J Mol Biol 321:49-56)被選擇胞吞進(jìn)入MDAMB231腫瘤細(xì)胞中?；谶@樣的事實(shí)，即基底亞型乳腺癌細(xì)胞過表達(dá)EphA2(Neve RM等人(2006)Cancer Cell 10:515-27)和CD44(Hamilton SR等人(2007)J Biol Chem 282:16667-80)，針對基底亞型乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231的選擇的噬菌體輸出獨(dú)立地針對酵母展示的EphA2ECD(aa 25-534)和CD44結(jié)構(gòu)域1(aa 21-169)被選擇。為了除去與在酵母表面上的無關(guān)蛋白結(jié)合的噬菌體抗體，首先用1x10⁹個(gè)展示scFv 4E17的酵母細(xì)胞(Y-CON)孵育來自MDAMB231選擇的第二輪輸出的2.5x10¹¹個(gè)噬菌體。然后，用2x10⁷個(gè)展示相關(guān)抗原(Y-Ag)的酵母細(xì)胞孵育耗竭的噬菌體文庫(圖3，圖A)，

對于EphA2ECD和CD44結(jié)構(gòu)域1選擇兩者，第二輪選擇中從每個(gè)酵母細(xì)胞回收的噬菌體的數(shù)量與第一輪相比增加超過40倍(表7)，表明結(jié)合酵母展示的腫瘤抗原的噬菌體的富集。這通過使用多克隆噬菌體染色酵母展示的抗原來驗(yàn)證。根據(jù)第一輪和第二輪的選擇，多克隆噬菌體抗體顯示與被用于選擇的抗原結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合，其中在第二輪選擇后染色具有較強(qiáng)染色(圖3，圖B)。相比之下，在選擇之前，輸入噬菌體抗體文庫在展示EphA2或CD44的酵母細(xì)胞上沒有產(chǎn)生高于背景的信號。結(jié)合對酵母展示的抗原特異，因?yàn)槎嗫寺∈删w不結(jié)合展示無關(guān)蛋白(scFv 4E17)的酵母細(xì)胞(圖3，圖B)。為了確定結(jié)合噬菌體抗體的頻率，挑選96個(gè)單獨(dú)克隆，生成噬菌體，分析噬菌體與酵母展示的腫瘤抗原的結(jié)合。第一輪和第二輪的選擇后，來自EphA2選擇的31/96(32.2％)和39/96(40.6％)的克隆結(jié)合展示EphA2ECD的酵母細(xì)胞，而來自CD44選擇11/96(11.7％)和21/96(21.9％)的克隆結(jié)合酵母展示的CD44(圖3，圖C)。

表7.針對酵母展示的抗原的噬菌體展示scFv抗體選擇。

針對酵母展示的抗原的第一輪和第二輪選擇期間的噬菌體輸入和輸出比率

實(shí)施例4：噬菌體抗體的鑒定和表征

通過scFv基因的PCR指紋法和DNA測序分析來自第二輪選擇的結(jié)合酵母展示的腫瘤抗原的單獨(dú)噬菌體抗體。結(jié)果示于圖9A和9B中，其中示出每個(gè)分離克隆的核酸和氨基酸序列。有義鏈?zhǔn)緸閳D9A和9B中核酸序列的上游鏈。根據(jù)每個(gè)抗體的Kabat數(shù)據(jù)鑒定CDR和框架區(qū)，如示于圖7和8中。

鑒定了與EphA2結(jié)合的三個(gè)獨(dú)特的人scFv抗體(D2-1A7、D2-1A9和D2-1B1)，并且鑒定了與CD44ECD結(jié)構(gòu)域1結(jié)合的兩個(gè)獨(dú)特的scFv(F2-1A6和F2-1H9)。這些scFv中的每一個(gè)在酵母展示的EphA2-ECD(Y-EphA2 ECD)、CD44 ECD結(jié)構(gòu)域1(Y-CD44 ECD D1)和全長ECD(Y-CD44 ECD)，以及scFv 4E17(Y-CON)中的表征顯示每個(gè)scFv對其靶抗原特異(圖4，圖A)。還通過流式細(xì)胞術(shù)分析每個(gè)獨(dú)特的噬菌體抗體結(jié)合原始選擇腫瘤細(xì)胞系MDAMB231的能力。每個(gè)噬菌體抗體高度染色MDAMB231細(xì)胞(圖4，圖B)。由于用于靶向?qū)讈喰腿橄侔┘?xì)胞特異的細(xì)胞表面受體的噬菌體抗體文庫的初始選擇，測定了所選mAb與基底和魯米那乳腺癌細(xì)胞系的結(jié)合。與魯米那乳腺癌細(xì)胞系相比，每個(gè)mAb對基底乳腺癌細(xì)胞系相對特異(圖4，圖C)。

實(shí)施例5：噬菌體抗體的結(jié)合特異性

通過從MDAMB231細(xì)胞的細(xì)胞提取物中免疫沉淀受體，隨后用對EphA2和CD44特異的鼠單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，也證實(shí)了經(jīng)鑒定的EphA2和CD44抗體與天然抗原的結(jié)合(圖5，圖A)。進(jìn)一步研究了EphA2mAb的特異性。評價(jià)每個(gè)EphA2mAb與天然配體肝配蛋白A1在MDAMB231細(xì)胞表面上競爭結(jié)合EphA2的能力。盡管在給定濃度下噬菌體抗體D2-1A7和D2-1A9的肝配蛋白A1的IC50相差9倍，但是1μg/ml肝配蛋白A1可完全阻斷D2-1A7和D2-1A9噬菌體抗體兩者的細(xì)胞結(jié)合(圖5，圖B)，表明這兩個(gè)抗體結(jié)合與肝配蛋白A1重疊的表位。

實(shí)施例6：噬菌體抗體被MDAMB231細(xì)胞內(nèi)化

由于最初針對被胞吞到MDAMB231細(xì)胞中的能力選擇由酵母展示抗原生物淘選鑒定的噬菌體抗體(圖3，圖A)，所以預(yù)期它們將被有效地內(nèi)化。為了確定D2-1A7、D2-1A9和F2-1A6噬菌體抗體是否被胞吞，在37℃用MDAMB231細(xì)胞孵育噬菌體抗體以允許受體介導(dǎo)的胞吞，通過用低pH緩沖液剝離而除去表面結(jié)合的噬菌體，并且內(nèi)化的噬菌體用抗-fd抗體染色，然后使用共焦顯微鏡來觀察(圖6)。D2-1A7和D2-1A9抗-EphA2抗體兩者給予高度胞內(nèi)染色，對照噬菌體未得以染色，而F2-1A6抗-CD44抗體給予與抗-EphA2噬菌體不同的染色模式。

實(shí)施例7：對CD44或EPHA2特異的F_D噬菌體和噬菌粒抗體

為了選擇抗原特異性抗體而不使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，用酵母展示的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)孵育非免疫人scFv噬菌體文庫(Sheets,1998；Huie,2001)，而沒有對癌細(xì)胞進(jìn)行先驗(yàn)選擇。具體來說，在4℃用10¹⁰個(gè)展示無關(guān)蛋白的酵母細(xì)胞孵育10¹²個(gè)fd-噬菌體顆粒(Huie等人(2001)同上)或10¹³個(gè)噬菌粒-噬菌體顆粒(Sheets等人(1998)同上)2小時(shí)以除去結(jié)合常見酵母蛋白的噬菌體抗體。然后在4℃用10⁸個(gè)展示特異性抗原結(jié)構(gòu)域的酵母細(xì)胞孵育耗竭的噬菌體文庫2小時(shí)(例如EphA2或CD44)。用冷PBS洗滌酵母細(xì)胞10次，并且通過離心沉淀。結(jié)合的噬菌體抗體通過用1ml 100mM甘氨酸/150mM NaCl/0.1％BSA/0.5％Tween 20孵育酵母細(xì)胞來洗脫，用0.5ml 1M Tris-HCl(pH 7.4)中和，并且擴(kuò)增用于另一輪選擇。在第二輪選擇中，將2×10⁷個(gè)酵母細(xì)胞用于兩種抗原，同時(shí)將來自第一輪選擇的噬菌體顆粒用作輸入噬菌體文庫，對于fd文庫為10¹¹個(gè)噬菌體，對于噬菌粒文庫為10¹²個(gè)噬菌體。進(jìn)行兩輪選擇以富集對用于選擇的TAA特異的噬菌體抗體。如果兩輪選擇未富集TAA特異性抗體，則進(jìn)行第三輪選擇，緊跟與第二輪選擇相同的方案。

用于篩選和表征單克隆噬菌體抗體的方法與實(shí)施例4和5中所述的方法相同。

將5個(gè)fd噬菌體抗體(稱為E8H11、E8H7、E8G12、E8F11和E8C9)培養(yǎng)至CD44連接結(jié)構(gòu)域并且對CD44連接結(jié)構(gòu)域特異。將2個(gè)fd噬菌體抗體(稱為D6G9和D6D3)培養(yǎng)至CD44(標(biāo)準(zhǔn)形式)，并且對CD44特異。

將2個(gè)噬菌?？贵w(稱為D1C5和D1D1)培養(yǎng)至CD44連接結(jié)構(gòu)域，并且對CD44連接結(jié)構(gòu)域特異。將6個(gè)噬菌粒抗體(稱為HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3)培養(yǎng)至CD44，并且對CD44特異。

將5個(gè)fd噬菌體抗體(稱為A3H9、A3G3、A3D10、A3D1和A3C)培養(yǎng)至EphA2并且對EphA2特異。將8個(gè)噬菌?？贵w(稱為1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7和1D8)培養(yǎng)至EphA2并且對EphA2特異。

將另一fd噬菌體抗體(稱為15H11)培養(yǎng)至EphA2并且對EphA2特異。

應(yīng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅為了舉例說明的目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到根據(jù)本發(fā)明的各種修正或變化，這些均包括在本申請的精神和權(quán)限以及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請為了所有目的據(jù)此通過引用整體并入。盡管已參考其優(yōu)選實(shí)施方案特別示出和描述主題抗體、方法和組合物，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不背離由所附權(quán)利要求涵蓋的本發(fā)明范圍下可在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化。