本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)、分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種全人源的單克隆抗體，尤其涉及一種全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體。另外，本發(fā)明還涉及該中和抗體的制備方法和用途。

背景技術(shù)：

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)建議，對(duì)于嚴(yán)重暴露者應(yīng)同時(shí)進(jìn)行主動(dòng)和被動(dòng)免疫治療，以獲得快速有效的保護(hù)作用?？袢∫呙缡菧p毒后的對(duì)人體無(wú)害的狂犬病病毒(也就是無(wú)害抗原)，需要15～20天才產(chǎn)生足夠抗體刺激機(jī)體產(chǎn)生抗狂犬病毒的主動(dòng)免疫作用。被動(dòng)免疫制劑是含有特異性抗體的免疫血清或細(xì)胞因子，能夠立即特異地中和狂犬病病毒，短期內(nèi)起到治療或緊急預(yù)防狂犬病的作用。

隨著對(duì)狂犬病毒及其單克隆抗體不斷深入的研究，如何用單克隆抗體取代現(xiàn)有被動(dòng)免疫制劑的思路越來(lái)越清晰。應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)開發(fā)抗狂犬病毒單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)防治狂犬病可以克服多抗血清的眾多弊端，應(yīng)用前景廣闊。

1975年創(chuàng)立體外雜交瘤技術(shù)得到了鼠源性單克隆抗體(Kohler et al.，1975)，開始了多克隆抗體走向單克隆抗體的新時(shí)代。與多克隆抗體相比，mAb具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性，它具有特異性高、效價(jià)高、純度高、理化性狀均一、重復(fù)性強(qiáng)、成本低并可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。在目前生產(chǎn)的單抗中，鼠源性單抗仍占其中較大比重。鼠源性單抗應(yīng)用于人類有較強(qiáng)的免疫原性，但主要缺陷是誘發(fā)人抗鼠抗體(human anti mouseantibody，HAMA)反應(yīng)，其次是鼠單抗不能有效地激活人體的生物效應(yīng)功能，因此限制了其臨床應(yīng)用(Dhar et al.，2004)。因此，在保持對(duì)特異性抗原表位高親和力的基礎(chǔ)上進(jìn)行人源化改造，減少異源抗體的免疫原性，成為mAb研究的重點(diǎn)。隨著對(duì)各類抗體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列及其變異的種屬和功能之間關(guān)系的深入了解，能夠利用抗體工程技術(shù)對(duì)抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。

目前，抗體的應(yīng)用經(jīng)歷了從非人源抗體到人鼠嵌合抗體、人源化抗體，最終到制備全人源單抗的轉(zhuǎn)基因小鼠和噬菌體展示文庫(kù)等不同的階段。人鼠嵌合抗體的實(shí)質(zhì)是將鼠源性單抗的抗原結(jié)合活性保留下來(lái)，并在此基礎(chǔ)上盡可能地消除鼠源化部分并用人源化片斷取而代之；降低了免疫原性，減輕單抗異源性產(chǎn)生的排斥反應(yīng)，又能同時(shí)維持親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。但是人鼠嵌合抗體的鼠源性仍然高達(dá)30％左右，還是容易引HAMA反應(yīng)。為減少鼠源成分，人們進(jìn)一步用人的FR替代鼠FR，形成更為完全的人源化抗體，即除了3個(gè)CDR是鼠源的外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，又稱CDR移植抗體(CDR grafted antibody)或改型抗體(reshaped antibody)。由于人源化抗體(CDR移植抗體)內(nèi)還含有10％以上的鼠源蛋白，因而在臨床應(yīng)用時(shí)，仍然存在一些免疫排斥反應(yīng),沒(méi)有達(dá)到治療性抗體發(fā)展的最終目標(biāo)——抗體完全人源化。

從鼠源到全人源，單抗在患者體內(nèi)人抗鼠免疫反應(yīng)發(fā)生概率逐步降低，治療效果和安全性逐步提高，因此全人源單抗是單抗發(fā)展的趨勢(shì)。目前有部分抗狂犬病病毒特異性的mAbs進(jìn)入臨床研究階段的報(bào)道，但至今仍沒(méi)有此類藥物被批準(zhǔn)上市。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)具有高親和力的完全人源化的抗狂犬病病毒抗體，用于替代血清制品，以滿足對(duì)于嚴(yán)重暴露者進(jìn)行被動(dòng)免疫治療的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于診斷和/或治療的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體，該抗體具有降低患者免疫反應(yīng)的可能性，并且具有利于治療目的的藥理學(xué)性質(zhì)，具有高效和安全的特點(diǎn)。

本發(fā)明的目的之二在于提供上述抗體的重鏈、輕鏈或其片段。

本發(fā)明的目的之三在于提供編碼上述抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸分子或其片段，以及并入這些核酸分子以用于重組表達(dá)上述抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。

本發(fā)明的目的之四在于提供上述抗體的制備方法和用途。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、輕鏈CDR3、重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3；

重鏈CDR1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

重鏈CDR2具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

重鏈CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

輕鏈CDR1具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

輕鏈CDR2具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

輕鏈CDR3具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

優(yōu)選地，重鏈CDR1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；重鏈CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；重鏈CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；輕鏈CDR1具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；輕鏈CDR2具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；輕鏈CDR3具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

具有上述優(yōu)選序列的本發(fā)明的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體命名為TRN073。

進(jìn)一步，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

優(yōu)選地，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

包括優(yōu)選抗體氨基酸序列的保守序列變體的抗體也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。保守氨基酸序列變體包括不顯著改變本發(fā)明的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體結(jié)合性質(zhì)和中和性質(zhì)的氨基酸序列的修飾，如源于本領(lǐng)域熟知的相似氨基酸替代的變體，氨基酸的缺失、增加導(dǎo)致的變體。

本發(fā)明的抗體還包括人源與非人源抗體，以及具有與TRN073抗體相同功能或改造及優(yōu)化的一切抗體。

進(jìn)一步，所述抗體的抗原結(jié)合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或單鏈抗體。

Fab是指含有一條輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)和一條重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)經(jīng)二硫鍵結(jié)合起來(lái)的抗體分子的一部分。

Fab’是指包含了部分鉸鏈區(qū)的Fab片段。

F(ab’)2指的是Fab’的二聚體。

Fv指的是含有抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)并具有全部抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。

單鏈抗體指的是由輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)直接相連或通過(guò)一個(gè)肽鏈連接而成的工程抗體。

本發(fā)明的公開的抗體可以在重鏈和輕鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，如本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，在可變區(qū)中存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)可以導(dǎo)致增強(qiáng)的抗體免疫原性，或者由于改變了抗原結(jié)合而改變抗體的藥物動(dòng)力學(xué)。

本發(fā)明的抗體可以被設(shè)計(jì)為在Fc區(qū)域內(nèi)包含修改，通常是改變抗體的1個(gè)或多個(gè)功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié)合、Fc受體結(jié)合、和/或抗原依賴的細(xì)胞毒性。此外，本發(fā)明的抗體可以被化學(xué)修飾(如，可以將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)連接于抗體)，或被修飾以改變其糖基化，從而再改變抗體的一個(gè)或多個(gè)功能特性。

發(fā)明還提供了編碼前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸分子，所述核酸分子包括編碼抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列或編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

本發(fā)明的編碼前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸分子包括具有上述優(yōu)選的核苷酸序列的保守核苷酸序列變體的核酸分子。所謂的保守核苷酸序列變體源于遺傳密碼簡(jiǎn)并和沉默的變體，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在內(nèi)。

本發(fā)明還提供了前面所述的核酸分子的DNA片段。所述DNA片段編碼前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的功能性片段。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括前面所述的核酸分子，此外，還包括與所述核酸分子序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。

本發(fā)明中“載體”一詞指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，載體包括：質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或P1來(lái)源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動(dòng)物病毒等。用作載體的動(dòng)物病毒種類有逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達(dá)的元件，包括啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。載體還有可能包括協(xié)助其進(jìn)入細(xì)胞的成分，如病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質(zhì)。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述載體是pCDNA3.3。

本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞內(nèi)含有前面所述的核酸分子或前面所述的表達(dá)載體。

本發(fā)明中“宿主細(xì)胞”一詞指的是導(dǎo)入核酸分子或載體的細(xì)胞，包括如下許多細(xì)胞類型，如大腸桿菌或枯草菌等原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等真菌細(xì)胞，如S2果蠅細(xì)胞或Sf9等昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK 293細(xì)胞或人細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選293細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種狂犬病毒檢測(cè)產(chǎn)品，所述檢測(cè)產(chǎn)品包括本發(fā)明的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體或其抗原結(jié)合片段。

所述檢測(cè)產(chǎn)品包括但不限于檢測(cè)試劑、試劑盒、芯片或試紙。凡是能夠檢測(cè)出狂犬病毒的檢測(cè)產(chǎn)品均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段。

進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括可藥用載體或稀釋劑?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)乃幱幂d體施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于治療。

本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的檢測(cè)狂犬病毒水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)獲得狂犬病毒的樣品；

(2)將步驟(1)獲取的樣品與前面所述的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體或其抗原結(jié)合片段的接觸；

(3)檢測(cè)樣品與抗體或其抗原結(jié)合片段的免疫反應(yīng)。

本發(fā)明還提供了一種前面所述的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體的制備方法，所述方法包括如下步驟：

(1)分離注射狂犬疫苗的人靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞，之后利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分選，PBMC分選獲得具有CD3－，CD14－，CD16－，CD19+，CD27+的單個(gè)B細(xì)胞；

(2)利用單細(xì)胞RT^－PCR擴(kuò)增步驟(1)獲得的單個(gè)B細(xì)胞中的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸片段；

(3)將步驟(2)獲得的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸片段融合到含有人類抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中形成重組表達(dá)載體，之后導(dǎo)入宿主細(xì)胞表達(dá)；

(4)抗體篩選平臺(tái)篩選獲得具有結(jié)合活性和中和活性的本發(fā)明的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體。

本發(fā)明還提供了前面所述的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體或其抗原結(jié)合片段在制備狂犬病毒檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

所述檢測(cè)產(chǎn)品包括但不限于檢測(cè)試劑、試劑盒、芯片或試紙。凡是包括前面所述的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體或其抗原結(jié)合片段在制備狂犬病毒檢測(cè)產(chǎn)品均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了前面所述的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體或其抗原結(jié)合片段在制備抑制狂犬病毒的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了前面所述的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體或其抗原結(jié)合片段在制備治療由狂犬病毒感染引起的疾病的藥物制劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述疾病是狂犬病。

本發(fā)明的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體或其抗原結(jié)合片段可以以化學(xué)方法或者通過(guò)基因工程與其他因子綴合。這些因子提供將抗體靶向所需功能位點(diǎn)的作用或者為抗體提高或提供其他性能。

根據(jù)本發(fā)明的全人源抗狂犬病毒的抗體可以以化學(xué)方法或者通過(guò)基因工程標(biāo)記，以提供可檢測(cè)的抗體。

本發(fā)明的“治療”意在包括為受治療者施用全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體，其目的包括預(yù)防、改善、治療狂犬病毒介導(dǎo)的疾病。

本發(fā)明的“治療有效量”是指對(duì)狂犬病毒介導(dǎo)事件的有害影響至少有所改善的水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易地確定該全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體的給藥量和方案。

利用RT^-PCR與抗體篩平臺(tái)制備的全人源抗狂犬病毒中和抗體，可以高效中和狂犬病毒，具有抗感染作用，起到緊急預(yù)防和治療的作用。

本發(fā)明的抗體還可用于制備狂犬病毒檢測(cè)試劑，發(fā)現(xiàn)有效中和抗原表位及開發(fā)狂犬病毒重組蛋白及亞單位疫苗。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用流式細(xì)胞儀分選獲得單個(gè)的B細(xì)胞；

圖2顯示利用SDS^-PAGE鑒定表達(dá)純化后的TRN073抗體；

圖3顯示利用ELISA檢測(cè)TRN073抗體的結(jié)合活性。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體TRN073的制備

1.記憶性B細(xì)胞分選

選取2名健康志愿者注射狂犬疫苗(諾華，批號(hào)：1928)，全程免疫后的第7d(第28d)均空腹抽血100mL，并用ELISA檢測(cè)其狂犬病毒抗體IgG為陽(yáng)性結(jié)果。然后將抗凝全血樣本用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離得人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，利用BD FACSria流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,San Jose，CA)從PBMC分選獲得具有CD3－，CD14－，CD16－，CD19+，CD27+的單個(gè)B細(xì)胞，結(jié)果如圖1所示。將分選獲得單個(gè)B細(xì)胞置于含有RT反應(yīng)體系的96孔PCR板中，使每個(gè)孔含有一個(gè)記憶性B細(xì)胞，PCR板-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈

在計(jì)數(shù)有單個(gè)細(xì)胞的微孔中每孔加入0.5μM的各亞型重鏈與輕鏈的恒定區(qū)引物與SuprescriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，37℃孵育60min，產(chǎn)物cDNA^-20℃保存。完成反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。

3.PCR分離擴(kuò)增抗體基因

采用巢式PCR方法，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)為模板，加入HotStarTaq Plus酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、dNTPs及0.5μM的各亞型重鏈與輕鏈抗體的特異性引物，PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5min；95℃×30s，55℃×60s，72℃×90s，35次循環(huán)；72℃延伸7min。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

4.重組抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建

用特異性引物獲取ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的抗體重鏈與輕鏈基因片段(包括可變區(qū)和恒定區(qū))，利用TA克隆的方法分別將重鏈和輕鏈基因鏈接到pcDNA3.3載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上37℃、5％CO₂培養(yǎng)過(guò)夜，隨即挑取單菌落用特異性引物進(jìn)行PCR鑒定(PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s，28個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5min)，取2μLPCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)后，選取PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落進(jìn)行基因測(cè)序，在陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中鑒定出了含有抗體重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)化子。

5.直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)目的基因的表達(dá)

采用脂質(zhì)體法將配對(duì)的重鏈與輕鏈基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，操作步驟按PolyFect(Qiagen，Valencia，CA)轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。細(xì)胞上清采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)目的基因表達(dá)的抗體。步驟如下：以狂犬疫苗為抗原，并用包被液將抗原10倍稀釋后包被96孔ELISA板，每孔100μL，4℃過(guò)夜包被，用封閉液常溫封閉2個(gè)小時(shí)。將100μl的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上清作為一抗常溫孵育2個(gè)小時(shí)，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG(1:2000稀釋)作為二抗常溫孵育1個(gè)小時(shí)，加入底物顯色液100μl/孔，常溫避光放置5min后，用2M硫酸鈉中止反應(yīng)，用450nm/630nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色。

6.抗體中和實(shí)驗(yàn)(快速熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)法，RFFIT)

用WHO推薦的快速熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)法(RFFIT)檢測(cè)篩選到有活性的抗體與狂犬病毒的中和活性，陽(yáng)性對(duì)照為商業(yè)化抗狂犬病毒血清標(biāo)準(zhǔn)品(240IU/ml)。將系列稀釋的抗體及抗病毒血清標(biāo)準(zhǔn)品與100TCID₅₀狂犬病毒(CVS株)于96孔培養(yǎng)板中混均，37℃孵育1小時(shí)，然后加入BSR細(xì)胞，放37℃培養(yǎng)24小時(shí)，于48小時(shí)進(jìn)行染色觀察。PBS洗兩次，加入80％丙酮，4℃孵育15min后，PBS洗一次晾干后，每孔加入100μlFITC標(biāo)記的抗體。37℃孵育1h，PBS洗2次，熒光顯微鏡藍(lán)色激光激發(fā)觀察。將具有中和活性的抗體命名為TRN073。

7.抗體大量表達(dá)與純化

將含有TRN073抗體重鏈可變區(qū)核苷酸序列的表達(dá)載體(重鏈可變區(qū)核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)和含有TRN073抗體輕鏈可變區(qū)核苷酸序列的表達(dá)載體(抗體輕鏈可變區(qū)核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)在大腸桿菌DH5α中大量擴(kuò)增，將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入在175cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后6^-8小時(shí)換含有2％FCS新鮮培養(yǎng)基，并在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。收集轉(zhuǎn)染上清，4000rpm離心1小時(shí)，利用蛋白(Protein)A親和層析法進(jìn)行純化。利用SDS^-PAGE檢驗(yàn)抗體TRN073的表達(dá)及純化情況，結(jié)果見圖2，證實(shí)得到較純蛋白，可清晰觀察到解鏈后的抗體輕、重鏈。

實(shí)施例2TRN073抗體結(jié)合活性檢測(cè)

用前文提到的相同的ELISA方法對(duì)表達(dá)純化的抗體的結(jié)合活性進(jìn)行檢測(cè)：以狂犬疫苗為抗原，并用包被液將抗原10倍稀釋后包被ELISA 96孔板，每孔100μL4℃過(guò)夜包被，并用封閉液常溫封閉2個(gè)小時(shí)。將起始濃度為100μg/ml TRN073抗體上清稀釋10倍后作為一抗進(jìn)行系列稀釋，加一抗常溫孵育2個(gè)小時(shí)，同時(shí)用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清作為陰性抗體對(duì)照，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG(1:2000稀釋)作為二抗常溫孵育1個(gè)小時(shí)，加入底物顯色液100μl/孔，常溫避光放置5min后，用2M硫酸鈉中止反應(yīng)，用450nm/630nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色，

結(jié)果如圖3顯示，把表達(dá)純化的抗體TRN073進(jìn)行大于50，000倍稀釋后(抗體濃度約為：0.0025μg/ml)，TRN073抗體依然可以與抗原有結(jié)合。

實(shí)施例3TRN073抗體結(jié)合特異性檢測(cè)

(1)與狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein，RVG)的結(jié)合

步驟：是狂犬病毒的主要保護(hù)性抗原，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，將RVG的基因片段克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，用PolyFect(Qiagen，Valencia，CA)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，取1×10⁵轉(zhuǎn)染后48～72小時(shí)的293T細(xì)胞，300×g離心10min，去上清，加入10μL商業(yè)化人抗狂犬病毒血清或抗體TRN073，并用表達(dá)的其他人源單克隆抗體作為陰性對(duì)照，4℃染色孵育45min后用PBS洗兩次，然后加入FITC標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，4℃染色孵育30min后PBS洗兩次，用BD FACSria流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

結(jié)果說(shuō)明抗體TRN073是狂犬病毒G蛋白特異性的有功能的抗體。

(2)與滅活狂犬病病毒CVS株的結(jié)合

步驟：用前文提到的相同的斑點(diǎn)雜交方法對(duì)表達(dá)純化的抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè)：PVDF膜用甲醇活化后，分別滴加2μL滅活的TCID50狂犬病毒(CVS株)、293T細(xì)胞裂解物，室溫干燥后封閉液封閉1h；分別與1：2000稀釋的單抗以及293T上清、封閉液孵育2h；洗滌后加入1：2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體孵育1h；DAB顯色。

結(jié)果表明TRN073能100％與滅活狂犬病病毒CVS株特異性結(jié)合，而與培養(yǎng)該抗體的293T細(xì)胞裂解物無(wú)反應(yīng)，相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)照均成立。

實(shí)施例4TRN073抗體中和活性檢測(cè)

步驟：用前文提到的WHO推薦的快速熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)法(RFFIT)對(duì)表達(dá)純化的抗體的中和病毒活性進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)Reed&Muench法計(jì)算抗體保護(hù)效價(jià)(單位為IU/ml)。

結(jié)果：抗體TRN073(3.8mg/ml)其保護(hù)效價(jià)約為1700IU/ml，說(shuō)明表達(dá)的重組抗體TRN073是高純度的具有狂犬病毒中和活性的全人源單克隆抗體。

雖然以上僅描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式范例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對(duì)這些實(shí)施方式做出多種變更或修改，但這些變更或修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州泰諾迪生物科技有限公司；暨南大學(xué)；珠海泰諾麥博生物技術(shù)有限公司

<120> 全人源抗狂犬病毒中和抗體及其用途

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人源

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Thr

20 25 30

Ile Tyr Tyr Trp Val Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg His Gly Thr Val Ala Ala Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人源

<400> 3

Ile Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人源

<400> 4

Ala Arg His Gly Thr Val Ala Ala Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源

<400> 5

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人源

<400> 6

Gln Ser Val Ser Ser Asn

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人源

<400> 7

Gly Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人源

<400> 8

Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Tyr Thr

1 5