本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種沼水蛙皮膚絲氨酸蛋白酶抑制肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,serpin)的最基本功能是防止蛋白質(zhì)水解，調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的水解平衡。通過對絲氨酸蛋白酶的調(diào)節(jié)，絲氨酸蛋白酶抑制劑對生物體內(nèi)的生理生化功能都有重要的影響。如，它們在血液凝固、補(bǔ)體形成、纖溶、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)重建、激素形成及轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解、血壓調(diào)節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等方面都有重要作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)如此眾多的生理過程導(dǎo)致它們有廣泛的臨床應(yīng)用價值，如，抑酶肽aprotinin除在臨床上廣泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治療外，也在胸外科手術(shù)中用于抗纖溶、抑制接觸性激活、抗炎癥等(Br J Anaesth.2013,110(5):675-8)。絲氨酸蛋白酶類似物如Kallikrein、tryptase在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及鼻炎、結(jié)膜炎、哮喘、胃腸炎、心血管系統(tǒng)炎癥等炎癥發(fā)生中起著重要的作用(Biol Chem.2004,385(11):989-96)。因此，絲氨酸蛋白酶抑制劑已成為國際研究的熱點，其研究與開發(fā)則蘊(yùn)含著巨大的臨床治療藥物的制備價值。

兩棲動物一直以來都是傳統(tǒng)藥物的源泉。中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylax nigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等兩棲類動物被作為中國的傳統(tǒng)中藥材而被廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)代研究表明：這些兩棲動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性，如，廣譜抗菌作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、對心血管系統(tǒng)的作用等(Dongwuxue Yanjiu,2015,36(4):183-222)。傳統(tǒng)中藥藥物成分的復(fù)雜性及其炮制方法的局限性造成藥物活性成分不能更好發(fā)揮作用，從這些傳統(tǒng)藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已經(jīng)成為新藥發(fā)明的熱點。目前有許多分子量小于10kDa的蛋白酶抑制劑多肽已經(jīng)從兩棲動物皮膚中被鑒定。這些兩棲動物皮膚的蛋白酶抑制劑除在前體蛋白的加工和降解過程中有作用外，還在抗微生物感染中有功能，因此許多來自兩棲動物的蛋白酶抑制劑同時具有抗菌和蛋白酶抑制劑活性，這些多肽包括ranacyclin-B、KPHTI、HV-BBI、HJTI、hylaserpin S2、OGTI、PYR、PSKP-1、PSKP-2、BOTI、BVTI、BMTI、BPTI、pLR和BSTI等(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。

腫瘤是危害人類健康的一類主要疾病，而且治療藥物匱乏。據(jù)報道，惡性腫瘤僅在我國每年就新增加160萬病例，而且患病年齡逐漸年輕化。目前在化療中所使用的藥物，如阿霉素、環(huán)磷酰胺、腫瘤壞死因子等均具有較大的人體毒性，副作用非常大，因而腫瘤治療藥物的開發(fā)是藥物研制的熱點。目前從兩棲動物皮膚中發(fā)現(xiàn)一些帶有抗腫瘤活性的多肽，這些多肽大部分是抗菌肽，如，magainins、aureins、citropins、brevinin-1、ranatuerin-2、temporin和dermaseptin等(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。絲氨酸蛋白酶除直接殺死腫瘤細(xì)胞外，還能通過其他機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，如絲氨酸蛋白酶抑制劑maspin在體內(nèi)和體外對腫瘤都有明顯的抑制作用，其作用機(jī)理在于抑制腫瘤細(xì)胞浸潤和血管形成(Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets.2013,13(2):123-32)。

我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對其皮膚活性肽類物質(zhì)研究不多。沼水蛙(hylarana guentherip)主要分布于我國中南部各省、臺灣、海南島和香港，是我國特色資源動物之一。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，基因組學(xué)的飛速發(fā)展及合成生物學(xué)的興起大大促進(jìn)了天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能研究；本發(fā)明利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法和藥理學(xué)研究獲得沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是基于上述技術(shù)背景，提供種新的具有廣譜抗微生物、絲氨酸蛋白酶抑制活性和促胰島素分泌作用的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽及其基因和它作為制備病原微生物感染性疾病、糖尿病和腫瘤性疾病治療藥物的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽，所述的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽由24個氨基酸組成的環(huán)肽，分子量2725.12道爾頓，等電點10.232，其氨基酸序列為：Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKVKAILQKL)(SEQ ID NO.1)，上述多肽第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子內(nèi)二硫鍵。

所述沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的編碼基因由438個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為其序列為(SEQ ID NO.4)：

序列中第364-435位核苷酸編碼具有功能的成熟沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽。

所述沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽可在制備病原微生物感染性疾病、糖尿病和腫瘤性疾病治療藥物應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于:

由沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽具有顯著的抑制細(xì)菌、真菌，絲氨酸蛋白酶抑制劑活性和促胰島素分泌作用。該沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、功能多樣的有益特點。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽HPLC純化鑒定結(jié)果；

圖2為本發(fā)明沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果；

圖3為本發(fā)明沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的抑制絲氨酸蛋白酶活性結(jié)果；

圖4為本發(fā)明沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽促胰島素釋放活性結(jié)果。

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：

本發(fā)明的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽，所述的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽由24個氨基酸組成的環(huán)肽，分子量2725.12道爾頓，等電點10.232，其氨基酸序列為：Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKVKAILQKL)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子內(nèi)二硫鍵。

所述沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的基因序列SEQ ID NO.4的第364-435位核苷酸編碼。本發(fā)明的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽及其基因的制備過程包括如下步驟：

實施例1，沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽基因克?。?/p>

I、沼水蛙皮膚總RNA提?。夯铙w沼水蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4h，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10m1總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20m1玻璃勻漿器中勻漿30min。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，棄除沉淀。向上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即為沼水蛙皮膚總RNA。

II、沼水蛙皮膚mRNA的純化：沼水蛙皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。具體如下：取沼水蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30S，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述試管，則上清中為純化的沼水蛙皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到沼水蛙皮膚mRNA。

III、沼水蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建：采用CLONTECH公司Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。

A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：在0.5ml無菌的離心管加入1μl沼水蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15sec，72℃保溫2min。將離心管在冰上孵育2min。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶?；旌想x心管中試劑并以12000rpm離心15sec，在42℃保溫1h。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

B.采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈：95℃預(yù)熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。

C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟上述步驟。12000rpm離心5min。將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5min。以12000rpm離心30sec，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。

D.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl沼水蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl的連接酶緩沖混合物。16℃反應(yīng)2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。42℃加熱90Sec后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃孵育過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16h，形成單菌落。每個LB平皿用5m1LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×10⁶個單獨克隆。

Ⅳ、沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽基因克隆篩選：擴(kuò)增引物長度為25個核苷酸，其序列為5’ATGAAGACCTGGCAGTGTGTGCTATGG 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行：94℃30sec，50℃45sec和72℃2.5min，35個循環(huán)。

首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個細(xì)菌/毫升和30個細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μ1),37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。

Ⅴ、沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽基因序列測定和結(jié)果：提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystems 373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO.6)。基因測序結(jié)果自5’端至3’端序列為(SEQ ID NO.4):

沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽基因核苷酸的序列表為：序列長度為438個堿基；序列類型：核酸；鏈數(shù)：單鏈；拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀；序列種類：cDNA；來源：沼水蛙皮膚。

根據(jù)沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的基因推斷編碼由功能的成熟活絲氨酸蛋白酶抑制肽為第364-435位核苷酸，氨基酸序列為：Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKV KAILQKL)(SEQ ID NO.1)

實施例2，沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的制備：

Ⅰ、沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的制備方法：根據(jù)沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的基因推斷編碼有功能的成熟絲氨酸蛋白酶抑制肽氨基酸序列后用自動多肽合成儀合成多肽。二硫鍵的形成采用空氣氧化法，具體為在燒瓶中將多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氫氧化銨滴定成pH 7.8,然后室溫攪拌過夜。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。純化時A液體為0.05％TFA+2％CH₃CN，B液為0.05％TFA+90％CH₃CN，B液濃度梯度為25min15-40％，檢測波長為220nm，多肽出現(xiàn)在第20分鐘。

Ⅱ、分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(1:1:l，V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。

Ⅲ、純化的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽是中國兩棲類動物沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量2725.12道爾頓，等電點10.232，其氨基酸序列為：Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKVKAILQKL)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵使分子成環(huán)。

實施例3，沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的活性實驗：

Ⅰ、抑制細(xì)菌生長能力測定

抗菌活性檢測采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20m1于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5m1菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個。第一個鋼杯加入0.1-0.3mg/ml濃度的待測多肽溶液0.l ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈l0mm以上的作為最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。細(xì)菌菌株來源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此試驗重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1所示，合成的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽能顯著的抑制細(xì)菌生長。

表1.沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽抑制細(xì)菌生長活性

Ⅱ、抑制真菌生長能力測定

抗真菌活性檢測采用杯碟法，培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯5個。第一個鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測多肽溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h-48h后測量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(MIC)。細(xì)菌菌株來源于云南大學(xué)微生物研究所，此實驗做三個平行，取幾何平均值，結(jié)果如表2所示，合成的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽能顯著的抑制真菌生長。

表2.沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽抑制真菌生長活性

Ⅲ、絲氨酸蛋白酶抑制劑活性測定

不同量的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽溶解于0.05M Tris-HCl緩沖液與一定量的胰蛋白酶(最終濃度為40μg/ml)于0.05M Tris-HCl緩沖液于室溫下保溫2min，最后加入發(fā)色底物S-2238(終濃度為40μg/ml)啟動反應(yīng)，應(yīng)用PERKIN ELMER(美國)公司生產(chǎn)的分光光度計于處監(jiān)測吸收值變化2min,加入同樣體積的0.05M Tris-HCl緩沖液與空白對照,抑制常數(shù)Ki＝[I]/(V0/VI+1)計算。[I]為沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的摩爾濃度，V0為空白對照是胰蛋白酶與發(fā)色底物的反應(yīng)速度，V1為加入沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽后胰蛋白酶與發(fā)色底物的反應(yīng)速度。此試驗重復(fù)六次，取平均值。

結(jié)果如圖3所示，沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽能很有效地抑制胰蛋白酶的活性，在上述試驗條件下抑制半數(shù)胰蛋白酶活性所需要的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽濃度為1.965μM,對胰蛋白酶的抑制常數(shù)Ki是8×10^-6M。絲氨酸蛋白酶抑制劑對生物體內(nèi)的生理生化功能都有重要的影響。如，它們在血液凝固、補(bǔ)體形成、纖溶、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)重建、激素形成及轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解、血壓調(diào)節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等方面都有重要作用。沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽能很有效地抑制胰蛋白酶，證實其能在體內(nèi)調(diào)節(jié)眾多的生理過程和有廣泛的臨床應(yīng)用價值。胃炎、胰腺炎的發(fā)病過程涉及許多絲氨酸蛋白水解作用，因此抑制這些酶的水解能防止疾病的發(fā)生和減低隨后的炎癥因子對機(jī)體造成的損害。具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽能應(yīng)用與炎癥相關(guān)的胃炎、胰腺炎中。

Ⅳ、抑制腫瘤生長活性測定

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測樣品用完全培養(yǎng)基進(jìn)行5倍或2倍倍比稀釋，共六個稀釋度，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)孔，每孔100μl，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照。每孔滴加3×10⁵個/ml的NCI-h460、MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞100μl。置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48小時后用MTT法測定待測化合物對細(xì)胞的毒性作用。EC₅₀是對50％宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用時的濃度。

表1沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用

由表1可見，沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽能顯著抑制肺癌細(xì)胞系(NCI-h460)和兩種乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7和MDA-MB-231)的生長，這表明沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽具有很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用，同時還具有序列簡單、合成方便等優(yōu)點?？勺鳛橹苽渲委熌[瘤、胃炎、胰腺炎藥物的應(yīng)用。

Ⅴ、促胰島素釋放活性測定

沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽的促進(jìn)胰島素釋放活性采用葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放活性檢測方法(GSIS，Glucose-stimulated insulin secretion)測定。具體步驟如下：大鼠胰島細(xì)胞瘤INS-1細(xì)胞用含100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、10％胎牛血清和11.1mM葡萄糖的RPMI-1640 37℃5％CO₂在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞形成單層后用pH 7.4，含5.6或16.8mM葡萄糖、0.1％牛血清白蛋白的Krebs–Ringer bicarbonate緩沖液中37℃預(yù)孵育40min，吸去上清，細(xì)胞同含樣品的同樣緩沖液37℃預(yù)孵育20min，吸去上清，1000rpm離心10min，上清液用于胰島素含量檢測，每個樣品4個重復(fù)。胰島素含量用上海酶研公司生產(chǎn)的胰島素ELISA檢測試劑盒按照說明書檢測。結(jié)果見說明書附圖4。由說明書附圖4可見，沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽具有顯著的促進(jìn)胰島素釋放的作用，INS-1細(xì)胞釋放出的胰島素隨著沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢。因此，沼水蛙絲氨酸蛋白酶抑制肽具有降低血糖的生物活性，可作為制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)

<120> 沼水蛙皮膚絲氨酸蛋白酶抑制肽及其基因和制藥應(yīng)用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> Hylarana guentherip

<400> 1

Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys

1 5 10 15

Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu

20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaagacct ggcagtgtgt gctatgg 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attctagagg ccgaggcggc cgacatg 27

<210> 4

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaagacct ggcagtgtgt gctatggctc tgcgccgtca cattggaggt cgctcactct 60

cagtctctgg atcaggaaga attgatcaaa gaagctctgg atctctacaa ccagagggaa 120

gatggagagt tcctctttaa gttcctgtct gagctcccca accccctccc aaagggggag 180

ggagactctc cagcaatcac ttttttgatc aaggagacgg actgtcccaa atctgaagac 240

aatgacttgg agccatgtga ctacaaggag gacggggagg tgaaggtctg cgctctggag 300

gacgaggatg tgaaatgcgc cagtctgtcc gagaattacc gaaccaagag atccaatgga 360

aacggaaagt gcaacttact ctgcaaagtg aaaaataaga taaaaaataa ggtcaaggct 420

atcctgcaaa aattataa 438

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagcggataa caatttcaca cagg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24