本發(fā)明涉及豬帶絳蟲TsEP45重組蛋白及其應用，尤其涉及TsEP45重組蛋白作為豬囊尾蚴病特異性檢測抗原的應用和在基于TsEP45重組蛋白的豬囊尾蚴病間接ELISA（iELISA）鑒別診斷試劑盒中的應用。

背景技術：

囊蟲病（Cysticercosis）是由豬帶絳蟲（Taeniasolium）幼蟲寄生在人和豬的皮下、肌肉和腦等部位引起的一種食源性的人獸共患寄生蟲病。該病不但對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，而且嚴重威脅著食品安全和人類健康。由于豬感染囊尾蚴后，無明顯臨床癥狀，因而該病生前的血清學診斷就顯得尤為重要。目前，用于人囊尾蚴病和豬囊尾蚴病血清學診斷的抗原有不少，但無論是蟲體抗原還是重組抗原，都與其他寄生蟲存在明顯交叉反應，尤其是與其親緣關系很近的豬細頸囊尾蚴病存在嚴重的交叉反應，導致臨床檢測常常出現(xiàn)假陽性。因此，尋找與豬細頸囊尾蚴無交叉反應的豬囊尾蚴特異性診斷抗原，是該病診斷和綜合防控中的首要問題。

研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶抑制劑在蠕蟲寄生宿主免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要角色，病原體的絲氨酸蛋白酶抑制劑通過干擾宿主免疫調(diào)節(jié)信號來抑制宿主免疫系統(tǒng)的激活。因此，研究豬帶絳蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的免疫調(diào)節(jié)功能，無疑將為闡明豬帶絳蟲在感染宿主過程中的免疫逃避機制和探索新的診斷和疫苗抗原具有指導意義。絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpin）是一類重要的結構相似、功能多樣的球狀蛋白酶抑制劑超家族，真核生物、細菌、病毒、古細菌中都發(fā)現(xiàn)存在serpin基因。寄生蠕蟲的Serpins通過抑制宿主絲氨酸蛋白酶活性，使其免受宿主體內(nèi)蛋白水解酶類的降解，從而逃避宿主的免疫攻擊。已有研究表明，從蛔蟲、鉤蟲等寄生蟲分離的絲氨酸蛋白酶抑制劑可抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶等腸道消化酶活性。埃及血吸蟲通過蟲體表面絲氨酸蛋白酶抑制劑因子與人的胰蛋白酶相結合來降低自身的免疫原性，從而逃脫宿主的免疫攻擊。此外，血吸蟲的絲氨酸蛋白酶抑制劑還可作為種特異性抗原，鑒別診斷埃及血吸蟲和曼氏血吸蟲。因此，Serpin有望成為重要的豬囊尾蚴病診斷和疫苗抗原候選分子，用于該病新型診斷制劑和方法以及新型疫苗的研究。我們的研究已表明，在豬帶絳蟲的5個serpin基因的表達產(chǎn)物中，無論是特異性還是敏感性TsEP45都明顯優(yōu)于其他serpin和已知的一些診斷抗原，尤其是與豬細頸囊尾蚴幾乎不存在任何交叉反應，顯示了良好的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有豬囊尾蚴病診斷抗原存在的交叉反應問題，本發(fā)明提供了豬帶絳蟲TsEP45重組蛋白及其應用，尤其涉及TsEP45重組蛋白作為豬病囊尾蚴特異性檢測抗原的應用和TsEP45重組蛋白在制備豬囊尾蚴病iELISA檢測試劑盒中的應用。

本發(fā)明的第一個目的是提供豬帶絳蟲TsEP45重組蛋白，所述重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。

本發(fā)明的第二個目的是提供豬帶絳蟲TsEP45重組蛋白作為豬帶絳蟲/囊尾蚴檢測抗原的應用；所述豬帶絳蟲TsEP45重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。

本發(fā)明的第三個目的是提供豬帶絳蟲TsEP45重組蛋白在制備豬囊尾蚴病檢測試劑盒中的應用；所述重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種豬囊尾蚴病iELISA檢測試劑盒，所述試劑盒中包被抗原為豬帶絳蟲TsEP45重組蛋白，所述重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。

作為優(yōu)選，所述包被抗原的濃度為10μg/ml。

作為優(yōu)選，所述試劑盒中還包括HRP標記的兔抗豬IgG。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括包被緩沖液，所述包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括封閉液，所述封閉液為1%BSA。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種豬囊尾蚴iELISA檢測方法，所述方法不以專利法規(guī)定的疾病的診斷和治療為目的，以純化的TsEP45重組蛋白 1μg于37℃包被酶標反應板1h，封閉液為1%BSA，用PBST充分洗滌后分別加入待測樣品和豬陽性血清、豬陰性血清，37℃孵育1h，PBST洗滌三次后，加入1:10000倍稀釋的HRP標記的兔抗豬IgG，充分洗滌后顯色，終止反應后測定吸光度，P(陽性)/N（陰性）>2時，為陽性血清，反之，為陰性血清。

本發(fā)明利用豬帶絳蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設計TsEP45特異引物，以豬囊尾蚴總RNA為模板，RT-PCR擴增TsEP45基因，并通過生物信息學分析進行鑒定。構建pET-30a-TsEP45重組表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達。純化的目的蛋白進行SDS-PAGE和Western-blotting分析。結果表明，TsEP45的ORF由1350個核苷酸組成，編碼449個氨基酸殘基；其編碼氨基酸具有Serpins較為保守的反應中心環(huán)（RCL）和特征性結構域，并且存在13個潛在的線性B淋巴細胞抗原表位。TsEP45的表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，且可與豬囊尾蚴陽性血清發(fā)生反應，在55kDa處產(chǎn)生特異條帶。以純化的TsEP45重組蛋白 1μg作為間接ELISA的診斷抗原，可特異性檢測豬囊尾蚴陽性血清，而與豬細頸囊尾蚴、豬旋毛蟲、弓形蟲無任何交叉反應。結論：所克隆的片段即為TsEP45，其表達產(chǎn)物可作為豬囊尾蚴病iELISA診斷的特異性抗原。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為豬囊尾蚴的TsEP45基因的PCR擴增結果；其中，M: DNA分子質(zhì)量標準；1：TsEP45；

圖2為TsEP45的三級結構預測；

圖3為TsEP45部分序列與其他寄生蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的序列對比；

圖4為不同物種TsEP45 的系統(tǒng)進化分析；

圖5為TsEP45融合蛋白純化結果；其中，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1：TsEP45；

圖6為TsEP45融合蛋白Western-blotting結果，其中，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:豬陽性血清；2：豬陰性血清；

圖7為基于Tsserpins的豬囊尾蚴病特異性檢測；

圖8為基于TsEP45抗原的ELISA檢測方法的敏感性和特異性。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

實施例1

1材料與方法

1.1蟲株與血清

豬囊尾蚴、豬囊尾蚴陽性和陰性血清、豬細頸囊尾蚴血清、豬旋毛蟲血清和豬弓形蟲血清均由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所蠕蟲病課題組保存。

質(zhì)粒小量提取試劑盒、TRIzol Reagent、DNA膠回收試劑盒、pMD-T-19(simple)Vector、限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind III、T4 DNA連接酶、均購自Takara公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、Prestained Protein Ladder均購自Thermo公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞、pET-30a、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、X-Gal、5×蛋白上樣緩沖液均購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗豬IgG（HRP）購自Sigma公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow蛋白純化試劑盒購自GE公司。

用TRIzol法提取豬帶絳蟲囊尾蚴的總RNA，以Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。

根據(jù)本申請人完成的豬帶絳蟲全基因組測序注釋信息及轉(zhuǎn)錄組分析，并結合GeneDB數(shù)據(jù)庫公布的豬帶絳蟲EP45的開放閱讀框序列，利用軟件Primer 5.0設計一對特異性引物，上游引物加入Sac I酶切位點，其序列為：5'-CGAGCTCATGATTTCTCTACGTATGAGAGAC-3'；下游引物加入Hind III酶切位點，其序列為：5'-CCCAAGCTTGCTAGTGGCAGAGTGTGGAG-3'。引物送至江蘇金唯智生物技術有限公司合成。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用TsEP45基因特異性引物進行PCR擴增。PCR反應體系為：cDNA0.5μL，5×PS Buffer 10μL，dNTP Mix 4μL，上下游引物各1μL，Easy Taq酶 1μL，補水至50μL。PCR擴增程序如下：95℃ 5min；94℃ 40s，67℃ 40s，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物純化后克隆入pMD-T-19 simple載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。選擇單克隆菌株進行PCR和酶切鑒定，陽性克隆送江蘇金唯智生物技術有限公司測序。該擴增產(chǎn)物的核苷酸序列為：ATGATTTCTCTACGTATGAGAGACAAAGGAAAGGCAGCTGCATCTGAGCCTGAGAGACCCAAGTCTACTTTTTCGAAAAGCGTCAAAGTCAATCCGGTCGACTATCTGAAGCACAGGGACTTCAACAACAAATATTGCTTCGGTGTTCATGCCATTAATGACATCACCAAGAAGTCGGGTCACTCGCCAACAACGATACGCTTCCTCCTGACAGTGTTGGTGGGCTCGAAGGCGGCACGGGGCACTAGTGCGGACCAGATCACACAGGCACTCAGCACCACGAACTCACGTGACGTGGGCACCGAATGCACCAGCCTCGTGGACAGCGCGCTTGACGAGTGGGCTCTGCTCTCTACTGCGGGTCTAAGCGATATACCACTCGATCGCATTGAGGAAGGGCGCCTCTGTCGCTTTCAGTCTGCTATCTTCGTCCCCATGGATGATCTCACCTTCAAGGCCGAGTTCCAGTGGTTGATCACCAACCGCATGGGTGTCGTCTGGACTCAGACTTCGAGAAAGGATTTCGCCCATGCTCAGAAGTGGTTATCCAAAGTGTCAAAAGGTTTATTCACTCACCACTTTCCAAAACAATGTGCCAACTCTATTGTACTTGCCACAGCATTACAATTTAAAGGCAGGTGGACTCAACCTTTGGAACTCTACGGTAGTTCCAAGGGATCATTCGAAGTGTCACCCCACTCGAAGATCGATGTTCCTATGCTAAAAATTTCAACAAAGGTTATTTACTATAAGGATACCAAAAAAGGCTTCCATTTGGTTGGAATTCCACTTAAGGATGCGCGGTTCGCAATCGCATTTCTATTACCCTTGGTGCCGCACAAGTTCGTAGAGGTGGAGCATCGCTTTACAGAGGGTTTGAACTACGGTCTCTTCAACAGCTCGCGACTGCATTTCTGCAGCATGCACGTGGTCATTCCTATGTTCCGAGTGCAAACGGAGGTGGACCTCTGTAAGGCCTTGCCCTTCCTCGGCATGAGCAATCCATTCGATTCTGATCGGGCAGACTTCTCCGGTATCAGCGATGTAGAGAATCTGCATATCAACAGCGGCAAGGAGTCGGCCTTTCTGCAGGTCTCCAGAAGCGGGATCCGACTGCTCTCAGTGGGTACTCTCAATCTGGAGACGAACCAGCACCAGTTTAGGCATCCTGACCTCTTTGAGGTGCCAACCCTCGAGGCACCCGGGGACGTGGACCCAAAGGGGTTGCACTCTTTCTTAGTGAATCAGCCCTTTGCTGTCATCCTCATTGATCGCGAGTCCGGCTGCGTCCTATACCAAGCCAGAATCAAGGTGCCTGAGCCCCCCCCCAACTCCACACTCTGCCACTAA。

利用在線軟件預測并分析蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、氨基酸組成、信號肽、二級和三級結構、B細胞抗原表位、結構域等。

用BlastP軟件將TsEP45的氨基酸序列與GenBank中的其他物種氨基酸序列進行比對，利用MEGA 6.0 軟件中Test Maximum Likelihood Tree方法對選擇的序列構建進化樹并分析。

將鑒定正確的pMD19-T-TsEP45及原核表達載體pET-30a質(zhì)粒分別用BamH I+XhoI進行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，對目的片段進行純化回收。利用T4 DNA連接酶將目的片段與pET-30a連接，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒進行PCR及酶切鑒定，陽性克隆進行測序驗證。

取測序正確的陽性克隆菌液1:100接種于100mL LB(卡那抗性100mg/mL)液體培養(yǎng)基中，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD_600nm=0.6~0.8時，加入100μL 500mmol/L的IPTG，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)6h。收集誘導表達的菌液進行SDS-PAGE分析。同時設置誘導前和pET-30a轉(zhuǎn)化菌液的誘導表達產(chǎn)物作為對照。

取50mL誘導表達的菌液，8000r/min離心15min,棄上清，加等體積的PBS重懸菌體沉淀后，反復凍融3次。利用超聲破碎儀處理菌體懸液20min，直至溶液澄清透亮。4℃，12000r/min離心10min，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析。利用鎳NTA瓊脂糖凝膠FF在不同咪唑梯度下對目的蛋白進行純化。純化后的蛋白用豬囊尾蚴陽性血清進行Western-blotting檢測。該純化后的重組蛋白的氨基酸序列為：

MISLRMRDKGKAAASEPERPKSTFSKSVKVNPVDYLKHRDFNNKYCFGVHAINDITKKSGHSPTTIRFLLTVLVGSKAARGTSADQITQALSTTNSRDVGTECTSLVDSALDEWALLSTAGLSDIPLDRIEEGRLCRFQSAIFVPMDDLTFKAEFQWLITNRMGVVWTQTSRKDFAHAQKWLSKVSKGLFTHHFPKQCANSIVLATALQFKGRWTQPLELYGSSKGSFEVSPHSKIDVPMLKISTKVIYYKDTKKGFHLVGIPLKDARFAIAFLLPLVPHKFVEVEHRFTEGLNYGLFNSSRLHFCSMHVVIPMFRVQTEVDLCKALPFLGMSNPFDSDRADFSGISDVENLHINSGKESAFLQVSRSGIRLLSVGTLNLETNQHQFRHPDLFEVPTLEAPGDVDPKGLHSFLVNQPFAVILIDRESGCVLYQARIKVPEPPPNSTLCH

2結果

2.1 TsEP45基因的擴增及生物信息學分析

以豬囊尾蚴的cDNA為模板，通過PCR擴增，獲得大小為1350bp左右的片段，與預期結果一致（圖1）。

TsEP45cDNA序列含有一個由1350bp的開放閱讀框，編碼由449個氨基酸殘基組成的多肽。綜合分析表明，TsEP45蛋白的抗原表位可能主要位于氨基酸序列的第2-10、12-25、52-62、77-83、89-98、165-173、180-186、218-227、248-254、334-340、352-359、361-369、421-427位。MotifScan分析表明，TsEP45可能存在1個潛在的cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點、9個潛在的酪蛋白激酶磷酸化位點、5個潛在的N-豆蔻?；稽c、13個潛在的蛋白激酶C磷酸化位點和1個潛在的酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點。SMART分析顯示，TsEP45氨基酸序列中60-434位為serpin結構域，具有Serpin蛋白的保守序列FXVDHPFLFFI。TsEP45三級結構預測顯示，該蛋白有11個α螺旋，15個β折疊，其余為無規(guī)卷曲（圖2），與二級結果預測相符。

通過同源序列相似性比較發(fā)現(xiàn)，TsEP45與其他物種的Serpins擁有共同的活性位點即Serpins反應中心環(huán)（RCL），具有絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員的特征性保守結構：FXVDHPFLFFI（圖3）。

在圖3中，紅色下劃線表示serpins特征性保守區(qū)序列，黑色方框表示serpins較為保守的反應中心環(huán)。Sh(Schistosomahaematobium)，Em (Echinococcusmultilocularis)，Eg (Echinococcusgranulosus)，Sj (Schistosomajaponicum)，Sm (Schistosomamansoni)，Cs(Clonorchissinensis)，Pw(Paragonimuswestermani)，Hc (Haemonchuscontortus)，Tv (Trichostrongylusvitrinus)，Bm1and Bm2 (Brugiamalayi), Ta(Taeniaasiatica), Ts (Taeniasaginata)。

利用MEGA 6.0 軟件中Test Maximum Likelihood Tree方法構建系統(tǒng)進化樹。結果表明，TsEP45與細粒棘球絳蟲的Serpin位于同一分支，親緣關系最近，而與其他物種的親緣關系較遠。結果如圖4。

重組質(zhì)粒pET-30a-TsEP45經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定均得到約1350bp的片段，說明成功構建了攜帶TsEP45基因的原核表達載體。用IPTG對pET-30a-TsEP45重組菌誘導表達，并經(jīng)SDS-PAGE檢測分析，在預期的55kDa附近出現(xiàn)蛋白目的條帶，經(jīng)超聲破碎后菌體SDS-PAGE分析結果表明，目的蛋白主要以包涵體形式存在。

8M尿素溶解包涵體沉淀，用Ni-NTA Purification System進行純化。SDS-PAGE分析表明，目的蛋白獲得較好的純化效果（結果如圖5）。以純化的TsEP45重組蛋白為抗原，進行Western-blot分析。結果顯示，TsEP45蛋白可與豬囊尾蚴陽性血清特異性反應，說明TsEP45蛋白具有良好的免疫反應性(圖6)。

絲氨酸蛋白酶抑制劑呈現(xiàn)構象多態(tài)性，功能多樣性，它們大多數(shù)都屬于非經(jīng)典類Kazal抑制劑家族。絲氨酸蛋白酶抑制劑大多數(shù)為單鏈的糖蛋白，核心結構含有8-9個α-螺旋和3個β折疊，主要標志性的結構是較為保守的反應中心環(huán)（reactive center loop, RCL）。RCL結構是絲氨酸蛋白酶識別絲氨酸蛋白酶抑制的靶點，當RCL被絲氨酸蛋白酶識別并被切開后,絲氨酸蛋白酶抑制劑的構象發(fā)生改變，從而引起絲氨酸蛋白酶的構象也發(fā)生改變，導致酶的活性中心破壞，發(fā)揮抑制作用。同源序列比對顯示，TsEP45具有絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員的特征性保守結構：FXVDHPFLFFI。系統(tǒng)進行分析也表明所獲得的序列與棘球絳蟲Serpin親緣關系較近，說明本發(fā)明獲得的序列即為豬帶絳蟲TsEP45基因。

本發(fā)明利用生物信息學分析對TsEP45蛋白進行預測，表明該蛋白N端不含信號肽序列，可能為非分泌型蛋白。已有研究表明，Serpin基因家族成員既可胞內(nèi)表達，也可分泌到胞外。但僅僅根據(jù)TsEP45缺乏信號肽序列就判定其為非分泌性蛋白可能不太準確。因為已有研究表明，絳蟲許多蛋白序列雖然缺乏信號肽序列，但在其囊液中都能檢測到該蛋白組分，說明這些蛋白即使沒有信號肽仍然可分泌到細胞外。本發(fā)明在原核表達系統(tǒng)中高效表達的TsEP45蛋白，雖然主要以包涵體形式存在，但可與豬囊尾蚴陽性血清發(fā)生特異性反應，說明重組TsEP45具有良好的免疫反應性，而且該蛋白可能為分泌性蛋白，可分泌到蟲體外刺激宿主產(chǎn)生針對該組分的特異性抗體。以上結果表明TsEP45具有作為豬囊蟲病血清學診斷候選分子的潛力。此外，通過對TsEP45蛋白B淋巴細胞抗原表位的預測，表明該蛋白具有13個潛在的線性B細胞表位，說明TsEP45還可能成為新型疫苗研發(fā)的候選分子。

現(xiàn)已研究證實，在蠕蟲、原生動物和其他寄生蟲中都存在絲氨酸蛋白酶抑制劑，Serpins在寄生蟲-宿主相互作用過程中起著十分重要的作用，通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白酶和外源性蛋白酶的作用，使寄生蟲成功逃避宿主的防御機制。寄生蟲在感染宿主的過程中，其絲氨酸蛋白酶抑制劑可通過抑制宿主絲氨酸蛋白酶的活性，從而使自身的蛋白酶免遭宿主降解，逃避宿主免疫攻擊。因此，進一步研究豬帶絳蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑在蟲體入侵及寄生過程中的功能和作用，將為闡明豬帶絳蟲入侵和免疫逃避機制，以及豬帶絳蟲新型疫苗和生物藥物的研發(fā)提供理論基礎。

實施例2基于重組抗原TsEP45的ELISA試劑盒

本發(fā)明的ELISA試劑盒包括：

用包被緩沖液稀釋的純化的TsEP45重組蛋白，包被抗原濃度為10μg/ml，每孔100 μl，包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液；

封閉液：1%BSA，每孔100 μl；

豬陽性血清，1:200稀釋，每孔100 μl；

豬陰性血清，1:200稀釋，每孔100 μl；

HRP標記的兔抗豬IgG，1:10000稀釋，每孔100 μl；

顯色劑：TMB，每孔50 μl；

終止液：濃硫酸，每孔20 μl。

實施例3 基于重組抗原TsEP45的ELISA對豬囊尾蚴病的特異性檢測

以純化的TsEP45重組蛋白 1μg于37℃包被酶標反應板1h，包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液，包被抗原濃度為10μg/ml，封閉液為1%BSA，用PBST充分洗滌后分別加入倍比稀釋的豬陰性血清及豬囊尾蚴、豬細頸囊尾蚴、豬旋毛蟲和豬弓形蟲陽性血清，37℃孵育1h，PBST洗滌三次后，加入1:10000倍稀釋的HRP標記的兔抗豬IgG，充分洗滌后再加入TMB顯色，用濃硫酸終止反應后測定吸光度。檢測結果如表1所示。

表1 以重組TsEP45(1μg)為抗原的ELISA檢測結果

從表1可以看出，TsEP45抗原與200倍稀釋的豬囊尾蚴陽性血清反應的平均OD值達1.36，而與同樣倍數(shù)稀釋的豬陰性血清、豬細頸囊尾蚴陽性血清、豬旋毛蟲陽性血清、豬弓形蟲陽性血清反應的OD值均在0.4以下，即P(陽性)/N（陰性）=5.91>2（圖7所示）。說明以TsEP45為抗原的ELISA方法，具有很好的檢測特異性，克服了現(xiàn)有血清學檢測方法易與豬細頸囊尾蚴病等存在交叉反應的缺點，是理想的豬囊尾蚴病特異性檢測抗原。

實施例4 基于Tsserpins的豬囊尾蚴病的特異性檢測

基于Tsserpins建立間接ELISA方法：樣品為豬囊尾蚴陽性血清30份（T.solium cysticercus ,Ts, n=30)）；豬細頸囊尾蚴陽性血清6份（Cysticercus tenuicollis ,Ct, n=6)）；豬旋毛蟲陽性血清6份（Trichinellaspiralis ,Tr, n=6)）；豬弓形蟲陽性血清6份（Toxoplasma gondii,Tg, n=6)）；陰性(control)血清51份。以實施例3中的ELISA方法進行檢測，每個檢測點重復三次，統(tǒng)計顯著性為p<0.05（*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001）。

圖7為基于Tsserpins的豬囊尾蚴病特異性檢測。其中，

圖A為不同Tsserpins與豬囊尾蚴陽性血清反應性檢測；

圖B為基于Ts570的豬囊尾蚴病特異性檢測；

圖C為基于TsEP45的豬囊尾蚴病特異性檢測；

圖D為基于TsB6的豬囊尾蚴病特異性檢測；

圖E為基于Ts4848的豬囊尾蚴病特異性檢測；

圖F為基于Ts12383的豬囊尾蚴病特異性檢測；

圖中，Ts：豬囊尾蚴血清；Ct：豬細頸囊尾蚴血清；Tr：豬旋毛蟲陽性血清；Tg,：豬弓形蟲陽性血清；Control:陰性血清。

實施例5基于重組抗原TsEP45的ELISA方法的特異性和敏感性

應用實施例2和3中的試劑盒及檢測方法對51份陰性血清和30份豬囊尾蚴陽性血清進行檢測和分析，繪制ROC曲線。從該曲線可以得出，基于TsEP45抗原的ELISA檢測方法的敏感性和特異性分別達到93.33%和94.12%（圖8和表2所示）。說明基于該抗原的ELISA方法具有很高的敏感性和特異性。

表2 ROC曲線分析

注：曲線下面積（AUC）、似然比（LR）、敏感性、特異性作為基于TsEP45、TsB6 和 Ts570的間接ELISA方法的評價指標。比較顯示，TsEP45的診斷價值優(yōu)于TsB6 和 Ts570。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所

<120> 豬帶絳蟲TsEP45重組蛋白及其應用

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatttctc tacgtatgag agacaaagga aaggcagctg catctgagcc tgagagaccc 60

aagtctactt tttcgaaaag cgtcaaagtc aatccggtcg actatctgaa gcacagggac 120

ttcaacaaca aatattgctt cggtgttcat gccattaatg acatcaccaa gaagtcgggt 180

cactcgccaa caacgatacg cttcctcctg acagtgttgg tgggctcgaa ggcggcacgg 240

ggcactagtg cggaccagat cacacaggca ctcagcacca cgaactcacg tgacgtgggc 300

accgaatgca ccagcctcgt ggacagcgcg cttgacgagt gggctctgct ctctactgcg 360

ggtctaagcg atataccact cgatcgcatt gaggaagggc gcctctgtcg ctttcagtct 420

gctatcttcg tccccatgga tgatctcacc ttcaaggccg agttccagtg gttgatcacc 480

aaccgcatgg gtgtcgtctg gactcagact tcgagaaagg atttcgccca tgctcagaag 540

tggttatcca aagtgtcaaa aggtttattc actcaccact ttccaaaaca atgtgccaac 600

tctattgtac ttgccacagc attacaattt aaaggcaggt ggactcaacc tttggaactc 660

tacggtagtt ccaagggatc attcgaagtg tcaccccact cgaagatcga tgttcctatg 720

ctaaaaattt caacaaaggt tatttactat aaggatacca aaaaaggctt ccatttggtt 780

ggaattccac ttaaggatgc gcggttcgca atcgcatttc tattaccctt ggtgccgcac 840

aagttcgtag aggtggagca tcgctttaca gagggtttga actacggtct cttcaacagc 900

tcgcgactgc atttctgcag catgcacgtg gtcattccta tgttccgagt gcaaacggag 960

gtggacctct gtaaggcctt gcccttcctc ggcatgagca atccattcga ttctgatcgg 1020

gcagacttct ccggtatcag cgatgtagag aatctgcata tcaacagcgg caaggagtcg 1080

gcctttctgc aggtctccag aagcgggatc cgactgctct cagtgggtac tctcaatctg 1140

gagacgaacc agcaccagtt taggcatcct gacctctttg aggtgccaac cctcgaggca 1200

cccggggacg tggacccaaa ggggttgcac tctttcttag tgaatcagcc ctttgctgtc 1260

atcctcattg atcgcgagtc cggctgcgtc ctataccaag ccagaatcaa ggtgcctgag 1320

ccccccccca actccacact ctgccactaa 1350

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 2

Met Ile Ser Leu Arg Met Arg Asp Lys Gly Lys Ala Ala Ala Ser Glu

1 5 10 15

Pro Glu Arg Pro Lys Ser Thr Phe Ser Lys Ser Val Lys Val Asn Pro

20 25 30

Val Asp Tyr Leu Lys His Arg Asp Phe Asn Asn Lys Tyr Cys Phe Gly

35 40 45

Val His Ala Ile Asn Asp Ile Thr Lys Lys Ser Gly His Ser Pro Thr

50 55 60

Thr Ile Arg Phe Leu Leu Thr Val Leu Val Gly Ser Lys Ala Ala Arg

65 70 75 80

Gly Thr Ser Ala Asp Gln Ile Thr Gln Ala Leu Ser Thr Thr Asn Ser

85 90 95

Arg Asp Val Gly Thr Glu Cys Thr Ser Leu Val Asp Ser Ala Leu Asp

100 105 110

Glu Trp Ala Leu Leu Ser Thr Ala Gly Leu Ser Asp Ile Pro Leu Asp

115 120 125

Arg Ile Glu Glu Gly Arg Leu Cys Arg Phe Gln Ser Ala Ile Phe Val

130 135 140

Pro Met Asp Asp Leu Thr Phe Lys Ala Glu Phe Gln Trp Leu Ile Thr

145 150 155 160

Asn Arg Met Gly Val Val Trp Thr Gln Thr Ser Arg Lys Asp Phe Ala

165 170 175

His Ala Gln Lys Trp Leu Ser Lys Val Ser Lys Gly Leu Phe Thr His

180 185 190

His Phe Pro Lys Gln Cys Ala Asn Ser Ile Val Leu Ala Thr Ala Leu

195 200 205

Gln Phe Lys Gly Arg Trp Thr Gln Pro Leu Glu Leu Tyr Gly Ser Ser

210 215 220

Lys Gly Ser Phe Glu Val Ser Pro His Ser Lys Ile Asp Val Pro Met

225 230 235 240

Leu Lys Ile Ser Thr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Thr Lys Lys Gly

245 250 255

Phe His Leu Val Gly Ile Pro Leu Lys Asp Ala Arg Phe Ala Ile Ala

260 265 270

Phe Leu Leu Pro Leu Val Pro His Lys Phe Val Glu Val Glu His Arg

275 280 285

Phe Thr Glu Gly Leu Asn Tyr Gly Leu Phe Asn Ser Ser Arg Leu His

290 295 300

Phe Cys Ser Met His Val Val Ile Pro Met Phe Arg Val Gln Thr Glu

305 310 315 320

Val Asp Leu Cys Lys Ala Leu Pro Phe Leu Gly Met Ser Asn Pro Phe

325 330 335

Asp Ser Asp Arg Ala Asp Phe Ser Gly Ile Ser Asp Val Glu Asn Leu

340 345 350

His Ile Asn Ser Gly Lys Glu Ser Ala Phe Leu Gln Val Ser Arg Ser

355 360 365

Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Gly Thr Leu Asn Leu Glu Thr Asn Gln

370 375 380

His Gln Phe Arg His Pro Asp Leu Phe Glu Val Pro Thr Leu Glu Ala

385 390 395 400

Pro Gly Asp Val Asp Pro Lys Gly Leu His Ser Phe Leu Val Asn Gln

405 410 415

Pro Phe Ala Val Ile Leu Ile Asp Arg Glu Ser Gly Cys Val Leu Tyr

420 425 430

Gln Ala Arg Ile Lys Val Pro Glu Pro Pro Pro Asn Ser Thr Leu Cys

435 440 445

His