本發(fā)明涉及一種便捷高效地粗提葛仙米藻膽蛋白的方法。

背景技術(shù)：

葛仙米學(xué)名擬球狀念珠藻(Nostoc sphaeroides Kutzing)，又稱天仙米、天仙菜，是一種可以食用的固氮藍(lán)藻，是一種群體態(tài)藻。其藻體含有豐富的蛋白質(zhì)、8種人體所需氨基酸、藻類淀粉、葉酸、可溶性纖維，多種維生素及15種礦物質(zhì)，最豐富的有磷、硫、鈣、鉀、鐵等，微量元素有鋅、銅、錳、硒，其含鈣量之高在蔬菜中極為少見，是一種高鈣低脂肪營養(yǎng)均衡的食品。據(jù)《本草綱目》和《本草綱目拾遺》等記載，葛仙米可治療夜盲癥、脫肛、燒燙傷等。此外，據(jù)《全國中草藥匯編》介紹，葛仙米性寒、味淡，具有清熱、收斂、益氣、明目等藥用保健功效。綜上所述葛仙米具有可觀的食用、藥用價值和保健功能。

藻膽蛋白是藻類特有的捕光色素蛋白，是一種重要的生物活性物質(zhì)。已知藻膽蛋白主要包含藻紅蛋白(PE)，藻藍(lán)蛋白(PC)，藻紅藍(lán)蛋白(PEC)，別藻藍(lán)蛋白(APC)，它可作為天然的食品色素，不但色彩亮麗，而且具有抗輻射、消炎、促進(jìn)傷口愈合、調(diào)節(jié)免疫力、促進(jìn)造血、抗癌等功效。目前藻膽蛋白用于化妝品、染料、臨床醫(yī)學(xué)診斷和免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域中，還可以制成食品和藥品用于醫(yī)療保健上。

有研究表明葛仙米中的藻膽蛋白包含色素蛋白種類全(PC、PE、PEC和APC)，其中藻紅蛋白(PE)、藻藍(lán)蛋白(PC)和藻紅藍(lán)蛋白(PEC)含量最多，這點優(yōu)于其他單細(xì)胞藻類和群體態(tài)藻類，比如發(fā)菜、螺旋藻及紫菜等。因此用葛仙米提取藻膽蛋白是藻類植物中最具有開發(fā)價值和潛力的研究。

現(xiàn)有針對葛仙米藻膽蛋白提取的技術(shù)多采用葛仙米干粉細(xì)粉(100目)低溫反復(fù)凍融，超聲破壁，磷酸鹽緩沖液浸提的方法。這種方法雖然能夠提取到藻膽蛋白，但得率比較低，僅在7％左右，而且使用過程中添加了有機(jī)試劑，不能保證最終成品的安全性；常用提取方法在提取過程中進(jìn)行研究使用到儀器設(shè)備較多，操作繁瑣，未考慮在實際企業(yè)生產(chǎn)過程中會消耗大量人力、物力及能耗；并且大多數(shù)研究都集中在怎么將藻藍(lán)蛋白從葛仙米藻膽蛋白中提取分離出來，而沒有考慮富含多種營養(yǎng)物質(zhì)的藻膽蛋白更具食用價值。鑒于此，有必要開發(fā)一種快捷高效的從葛仙米中提取藻膽蛋白的方法利于企業(yè)大生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快捷高效地粗提葛仙米藻膽蛋白的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種葛仙米藻膽蛋白的提取方法，包括將干燥的葛仙米粉碎至20-80目，加入40-60倍重量的純化水提取4-8h，過濾，制得富含藻膽蛋白的粗提液，冷凍干燥，即得葛仙米藻膽蛋白粗提物。

優(yōu)選地，所述葛仙米粒徑為60-80目，進(jìn)一步優(yōu)選為60目或80目；較佳為60目。

優(yōu)選地，所述葛仙米與純化水的重量比是1:50。

優(yōu)選地，所述提取時間為6h。

優(yōu)選地，所述提取在室溫下進(jìn)行，一般20～25℃。

優(yōu)選地，所述葛仙米含水量為7％-13％，進(jìn)一步優(yōu)選為11％。

優(yōu)選地，所述過濾前還包括離心的步驟，所述離心轉(zhuǎn)速為5000-10000r/min，離心時間為15-30min；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述離心轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心時間為15min。

具體地，上述葛仙米藻膽蛋白的提取方法，包括將干燥至含水量為11％的葛仙米粉碎至60-80目，加入40-60倍重量的純化水室溫提取6h，于轉(zhuǎn)速8000r/min條件下離心15min，過濾，制得富含藻膽蛋白的粗提液，冷凍干燥，即得葛仙米藻膽蛋白粗提物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1.本發(fā)明方法使用20-80目的葛仙米干粉直接提取藻膽蛋白，填補(bǔ)這一研究領(lǐng)域的空白；本發(fā)明方法簡化了提取工藝，比采用反復(fù)凍融、超聲破壁、磷酸鹽緩沖液浸泡、硫酸銨鹽析提取藻膽蛋白的方法簡單易操作；

2.本發(fā)明方法提高了葛仙米藻膽蛋白粗提物的得率，比現(xiàn)有凍融法提取得率高一倍多，并且也提高了粗提物的藻膽蛋白含量，從7％提高到12％；

3.本發(fā)明方法不需要使用任何有機(jī)試劑，不破壞藻膽蛋白中多種重要的色素蛋白，真正能夠做到安全零添加，放心食用；

4.本方法在提取溫度上也有所創(chuàng)新，實現(xiàn)提取藻膽蛋白不必在低溫條件下進(jìn)行，這突破了目前常用的方法對提取溫度的限制；

5.本發(fā)明方法主要采用葛仙米干物質(zhì)，它比新鮮的葛仙米易于貯存，在使用、運輸過程中方便，節(jié)約成本，同時它也比新鮮葛仙米粉碎后藻膽蛋白得率高；為生產(chǎn)企業(yè)提供一條更簡單實用、節(jié)省成本、安全的可工業(yè)化大生產(chǎn)的技術(shù)工藝。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。

以下藻膽蛋白含量檢測方法為紫外可見分光光度法，測定波長562nm、615nm、652nm處吸光值，按文獻(xiàn)“Bennett A，Bogorad L.Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green-alga[J].Journal of Cell Biology，1973，58(2)：419—435”記載的方法計算含量。

以下所述得率的計算方法為：

得率％＝{藻膽蛋白粗提物重量/葛仙米粗粉重量×(1-水分)}×100

實施例1采用本發(fā)明方法進(jìn)行實驗室小試粗提藻膽蛋白

將經(jīng)過曬干或者烘干水分葛仙米干物質(zhì)(含水量11％)用萬能粉碎機(jī)粉碎至粒徑60目，分別取該葛仙米粗粉21.99g、23.94g、23.35g置于燒杯中加入1100g的純化水，室溫下靜置6小時后，8000r/min離心15min，過濾，得到粗提液，將粗提液冷凍干燥制得葛仙米藻膽蛋白粗提物。結(jié)果見下表1：

表1

由上表1可見，三次提取得到粗提物得率較高，均有20％以上，平均值為22.5％,葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量平均值為12.5％。經(jīng)過三次重復(fù)實驗驗證了本發(fā)明方法有很好的重現(xiàn)性。

實施例2采用本發(fā)明方法進(jìn)行實驗室小試粗提藻膽蛋白

將經(jīng)過曬干或者烘干水分葛仙米干物質(zhì)(含水量11％)用萬能粉碎機(jī)粉碎至粒徑80目，分別取該葛仙米粗粉25.12g、25.30g、25.60g置于燒杯中加入1260g的純化水，室溫下靜置6小時后，8000r/min離心15min，過濾，得到粗提液，將粗提液冷凍干燥制得葛仙米藻膽蛋白粗提物。結(jié)果見下表2：

表2

由上表2可見，三次提取得到粗提物得率較高，均有10％以上，平均值為11.1％,葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量平均值為10.1％。經(jīng)過三次重復(fù)實驗驗證了本發(fā)明方法有很好的重現(xiàn)性。

實施例3采用本發(fā)明方法進(jìn)行實驗室小試粗提藻膽蛋白

將經(jīng)過曬干或者烘干水分葛仙米干物質(zhì)(含水量11％)用萬能粉碎機(jī)粉碎至粒徑20目，分別取該葛仙米粗粉24.87g、25.45g、25.00g置于燒杯中加入1260g的純化水，室溫下靜置6小時后，8000r/min離心15min，過濾，得到粗提液，將粗提液冷凍干燥制得葛仙米藻膽蛋白粗提物。結(jié)果見下表3：

表3

由上表3可見，三次提取得到粗提物得率較高，均有10％以上，平均值為13.2％,葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量平均值為9.8％。經(jīng)過三次重復(fù)實驗驗證了本發(fā)明方法有很好的重現(xiàn)性。

對比例1

將葛仙米干物質(zhì)(含水量11％)粉碎至粒徑100目，取該葛仙米細(xì)粉12.92g、12.39g、13.51g，按文獻(xiàn)“汪興平等，反復(fù)凍融法在葛仙米破壁技術(shù)上的應(yīng)用”記載的方法，采用多次凍融法提取葛仙米藻膽蛋白，制得葛仙米藻膽蛋白粗提物。結(jié)果見下表4：

表4

由上表4可知，三次提取得到的粗提物得率平均值為16.3％，葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量平均值為7.1％，葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量均顯著低于實施例1。

反復(fù)凍融不僅增加了操作次數(shù)，而且在實際生產(chǎn)應(yīng)用中會增加成本，而本發(fā)明方法一次操作即可，驗證了本法可操作性強(qiáng)，操作簡便，使用成本遠(yuǎn)低于反復(fù)凍融。

對比例2

分別取新鮮葛仙米(含水量98％)1.78kg、1.74kg、1.80kg，按與對比例1相同的方法提取葛仙米藻膽蛋白，制得葛仙米藻膽蛋白粗提物。結(jié)果見下表5：

表5

由上表5可知，三次凍融法提取得率均在10％以下，平均值為7.5％，葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量平均值為2.2％。由表1和表5可見，使用本發(fā)明方法從干粉中提取藻膽蛋白粗提物比從新鮮葛仙米中得到的高3倍多。這也是本方法選用葛仙米干品制備而不用新鮮葛仙米的原因。

對比例3

分別取粉碎至粒徑在60目的葛仙米粗粉(含水量11％)33.88g、33.49g、22.21g，采用對比例1反復(fù)凍融法提取藻膽蛋白，制得葛仙米藻膽蛋白粗提物，結(jié)果見下表6：

表6

由上表6可知，三次提取得率均在10％以上，得到的粗提物得率平均值為13.4％；葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量平均值為5.5％。由表1和表6可見，葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量均顯著低于實施例1。

另外，本對比例3所得葛仙米藻膽蛋白粗提物成品外觀、顏色均不如實施例1好。實施例1所得葛仙米藻膽蛋白粗提物顏色為紫色，而對比例3所得葛仙米藻膽蛋白粗提物顏色為紫灰色。

通過對比再一次驗證了本發(fā)明方法比目前普遍使用的多次凍融法提取得到的藻膽蛋白粗提物得率高，且葛仙米藻膽蛋白粗提物中藻膽蛋白含量高，驗證了本法的高效性。

對比例4

分別取葛仙米干物質(zhì)(含水量11％)粉碎至粒徑在10目、60目、100目各22.47g，分別采用實施例1方法和對比例1凍融法進(jìn)行提取，制得葛仙米藻膽蛋白粗提物。對其含量進(jìn)行對比，結(jié)果見下表7：

表7

由上表7可知，粒徑過大(10目)葛仙米干物質(zhì)未能完全粉碎，不能提取藻膽蛋白；采用實施例1方法提取細(xì)粉(100目)含量和得率均不高；實施例1方法粗粉(60目)提取得到的粗提物藻膽蛋白含量高于對比例1細(xì)粉(100目)凍融法。

綜上所述，采用本發(fā)明方法可以從葛仙米中得到藻膽蛋白含量在10％以上，提取得率在20％以上的粗提物，并且本發(fā)明方法比現(xiàn)有報道的研究中采用的制備工藝周期短，操作簡便；比使用新鮮葛仙米和葛仙米細(xì)粉提取得率高，同時本發(fā)明方法還將藻膽蛋白含量從已有文獻(xiàn)中報道的7％提高到12％以上。故本發(fā)明方法比其他提取工藝有明顯的優(yōu)勢和創(chuàng)新。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。