專利名稱：：一種檢測人乳頭瘤病毒中和抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒抗體檢測領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及對人乳頭瘤病毒中和抗體進行檢測的方法。
背景技術(shù)：
：人乳頭瘤病毒(HPV)感染的流行范圍廣，所引發(fā)的相關(guān)致死性的惡性腫瘤和多種性傳播疾病對人類健康具有嚴重的危害性，開發(fā)安全有效的預防或治療性疫苗具有重大意義。針對HPV的中和抗體水平是HPV疫苗研究開發(fā)的關(guān)鍵性指標，因此建立高效、準確和便捷的中和抗體檢測方法十分重要。然而，由于HPV具有嚴格的宿主特異性，同時其病毒復制與宿主細胞的分化狀態(tài)密切相關(guān)，目前難于在體外對HPV進行快速高效的組織培養(yǎng)，也缺乏適宜的動物模型。因此探索建立可及時快速鑒定或篩選中和抗體和評估待選疫苗保護性的方法是十分必要的。目前，已發(fā)展出多種不同類型的HPV中和抗體評估方法，如基于免疫缺陷小鼠組織移植模型的評估方法(WhiteWI等，病毒學雜志，1998年，72巻959-964頁)、基于體外感染原代上皮組織的評估方法(MeyersC等，科學，1992年，257巻971-973頁)、基于HPV類病毒顆粒(VLP)的ELISA方法(1999年，SeminCancerBiol)以及血凝抑制實驗(RodenRB等，病毒學雜志，1996年，70巻3298-3301頁)等，但這些方法分別存在操作復雜、效率低、實驗周期長或不能準確反映抗體的中和保護作用等問題。因此，迫切需要發(fā)展能夠便捷、有效地檢測HPV中和抗體的方法，同時希望新方法能夠適合于進行高通量的檢測。近來，研究顯示HPVVLP具有可非特異5性包裹質(zhì)粒核酸的特點，因此可構(gòu)建攜帶報告質(zhì)粒的HPV假病毒(HPVpseudovirus)用于體外有效模擬HPV感染過程，并可用于對HPV中和抗體進行快速檢測(BuckCB等，病毒學雜志，2004年，78巻751-757頁)?；贖PV假病毒的中和抗體檢測方法相比其它傳統(tǒng)方法具有較為明顯的簡便、效率高的優(yōu)點，實驗周期縮短，對于不同的HPV亞型具有較好的通用性。目前，基于HPV假病毒的中和抗體檢測方法已得到日益廣泛的應用。然而隨著研究的深入，對HPV中和抗體檢測提出了更高的要求，除了靈敏度和準確度好外，同時要求能夠更為快速、簡便，能夠更準確地進行客觀的量化檢測以提高重復性。當前基于HPV假病毒的中和抗體檢測方法，主要有2種(1)以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，構(gòu)建帶有GFP報告基因表達元件的HPV假病毒，在感染293TT胞(被感染細胞)，通過檢測HPV中和抗體對假病毒感染的阻斷能力評估其效價；(2)以分泌型堿性磷酸酶(SEAP)為報告基因，構(gòu)建帶有SEAP報告基因表達元件的HPV假病毒，感染293TT細胞后通過離心收集細胞培養(yǎng)上清，之后通過SEAP化學發(fā)光檢測試劑盒進行顯色，再用化學發(fā)光酶標儀獲得結(jié)果，通過檢測HPV中和抗體對假病毒感染的阻斷能力評估其效價。在應用中發(fā)現(xiàn)，上述第一種方法的操作較為復雜耗時，需要進行細胞消化操作，然后逐孔用FACS進行檢測，l個96孔板的檢測過程通常需要2至3個小時，耗時費力；第二種方法的操作可使用類似酶標儀的儀器進行快速掃描判定，有利于批量檢測，但其試劑盒成本較高，其主要檢測酶促顯色反應程度，同時這種方法存在靈酶度的問題，細胞在被少量感染時SEAP分泌量低就會存在讀值的陽性/陰性值比(P/N比)低的問題，會影響結(jié)果判定。因此為了提高P/N比，就需要使用更大量的假病毒，不利于提高實驗效率。本發(fā)明建立了一種簡單、準確而又高靈敏度的HPV中和抗體檢測方法，可更好地滿足對HPV中和抗體檢測實驗的要求。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是建立簡便、有效、高靈酶度的，并且能夠更適合于進行高通量檢測的HPV中和抗體檢測方法。本發(fā)明在檢測中引入了具有快速掃描檢測能力的斑點檢測儀器，采用斑點檢測法檢測被HPV或HPV假病毒感染的細胞，同時相應采用了可使被感染細胞產(chǎn)生顏色標記信號以適于應用斑點檢測儀器進行檢測的報告基因，從而組合建立了一種新型高效的HPV中和抗體檢測模式，并將這種模式應用于HPV中和抗體的檢測方法，可用于檢測不同亞型HPV的中和抗體。本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法具有簡便、快速、更適于進行高通量檢測的特點。在一個實施方案中，應用本發(fā)明方法和當前常用方法對同一樣品進行了對比檢測實驗，結(jié)果顯示二者具有高度的重合性，說明了本發(fā)明的方法同樣具有很好的靈敏度。由于本發(fā)明的方法采用斑點檢測法，是一種原位檢測的方式，在檢測過程中采用自動化連續(xù)檢測的斑點檢測儀器，可顯著減少檢測過程中的人工干預，從而能夠顯著提高檢測的效率。具體地，本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法涉及了將使被HPV或HPV假病毒感染的細胞產(chǎn)生顏色標記的方法和斑點檢測儀器檢測方法組合應用于HPV中和抗體檢測的方法。本發(fā)明提供了可使被HPV或HPV假病毒感染的細胞產(chǎn)生顏色標記的方法，通過構(gòu)建帶有報告基因表達元件的HPV假病毒，其感染細胞后可介導報告基因的表達，其產(chǎn)物可直接作為信號產(chǎn)生體或間接(如通過催化作用等)導致另外的信號產(chǎn)生體產(chǎn)生可被本發(fā)明所述的斑點檢測儀器所識別檢測的信號。本發(fā)明還提出了其它的可使被HPV或HPV假病毒感染的細胞產(chǎn)生顏色標記的方法，通過一種改造后的細胞，該細胞的基因組中或者基因組外攜帶了其表達產(chǎn)物可以直接或間接導致細胞產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號的報告基因的編碼核酸序列，該編碼核酸序列與表達控制序列可操作地連接，表達控制序列在HPV假病毒或HPV感染后可啟動報告基因的表達，從而使被HPV或HPV假病毒感染后的細胞產(chǎn)生可被斑點檢測儀器檢測的信號。本發(fā)明涉及了將斑點檢測儀器應用于HPV中和抗體檢測。斑點檢測儀器的主要特征是能夠用于從細胞群體中分辨和測算與正常細胞不同顏色的細胞的數(shù)量，同時最好還能夠進行連續(xù)自動檢測。在一個具體實施方案中，本發(fā)明以目前廣泛應用于細胞免疫檢測實驗的儀器Elispot為示例。Elispot的性能符合本發(fā)明提出的對斑點檢測儀器的要求，能夠有效地滿足本發(fā)明的檢測方法的需要。目前，還尚未有Elispot用于HPV中和實驗的報道。本發(fā)明還涉及了選擇適合本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法要求的報告基因。該報告基因具有的特征是其在細胞中的表達產(chǎn)物可以直接或間接導致細胞產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號。在一個具體實施方案中，本發(fā)明以P-半乳糖苷酶報告基因為示例。p-半乳糖苷酶報告基因在細胞中的表達產(chǎn)物P-半乳糖苷酶在顯色底物(如X-gal或bluo-gal等)存在的情況下，可使所表達細胞產(chǎn)生出區(qū)別于未表達細胞的可被斑點檢測儀器(如Elispot)識別的藍色信號。本發(fā)明還提供了構(gòu)建可用于本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法的HPV假病毒的構(gòu)建方法。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法在篩選HPV中和性單克隆抗體中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法在檢測HPV中和抗體效價中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法在制備HPV中和抗體診斷試劑盒中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法在HPV疫苗開發(fā)和質(zhì)控中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法在篩選或制備抗HPV或其相關(guān)疾病藥物中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法在治療HPV感染中的用途。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行更詳細的說明。從下文的詳細描述中，本發(fā)明的上述方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。圖l顯示了使用斑點檢測儀器Elispot對包裝有P-半乳糖苷酶報告質(zhì)粒的HPV假病毒感染后并經(jīng)顯色反應后的293FT細胞的檢測結(jié)果，被感染細胞可顯示出藍色，區(qū)別于未感染細胞，可被Elispot所識別檢測，每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)量可顯示于各孔圖像的左上方。圖2顯示了本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法的示例簡圖。圖3顯示了分別應用本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法與目前常用的HPV中和抗體檢測方法對同一經(jīng)梯度稀釋的HPV16中和性單克隆抗體8A9的中和效價的檢測結(jié)果的相關(guān)性比較結(jié)果，圖4顯示了應用本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法檢測HPV16VLP免疫后的兔、羊的血清樣品中的HPV16中和抗體的水平。圖5顯示了應用本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法在HPV16疫苗供試品免疫保護性評價實驗中的檢測結(jié)果。具體實施例方式除非另外定義，這里所用的所有技術(shù)和科學名詞都表達的是在本發(fā)明涉及領(lǐng)域里的熟練技術(shù)人員所理解的通常含義。這里所用的命名和在細胞培養(yǎng)、分子生物學、生物化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。一方面，本發(fā)明提供一種通過斑點檢測法高通量檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞或其數(shù)量的方法。在一個實施方案中，可以通過使用斑點檢測儀器檢測感染細胞特有(未感染細胞不具有)的信號來檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞或其數(shù)量。本發(fā)明還提供一種高通量檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞或其數(shù)量的方法，包括U)使被HPV假病毒或病毒感染的細胞帶有適于斑點檢測儀器檢測的信號，但未被感染的細胞不帶有該信號；和(2)通過使用斑點檢測儀器檢測該信號(或帶有該信號的細胞)來檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞或其數(shù)量。在一個具體實施方案中，使被HPV假病毒或病毒感染的細胞帶有適于斑點檢測儀器檢測的信號是通過如下方法獲得的報告基因表達元件在感染細胞中表達產(chǎn)生報告蛋白，該報告蛋白可直接產(chǎn)生或間接(例如通過顯色反應)產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號。在一個具體實施方案中，所述的報告基因在感染細胞中的表達是通過人乳頭瘤病毒假病毒或病毒感染細胞實現(xiàn)的。報告基因表達元件可通過帶有報告基因表達元件的人乳頭瘤病毒假病毒感染細胞而導入細胞中表達，或者，也可通過人乳頭瘤病毒假病毒或病毒感染帶有報告基因表達元件的細胞后激活該報告基因表達元件表達，優(yōu)選帶有報告基因表達元件的人乳頭瘤病毒假病毒的方式。在一個具體實施方案中，所述的報告基因為其表達產(chǎn)物可以直接或間接導致產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號的基因，如p半乳糖苷酶基因等。優(yōu)選地，本發(fā)明檢測感染細胞的方法用于被HPV假病毒或病毒感染的細胞的計數(shù)。因此，本發(fā)明還提供一種高通量檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞數(shù)量的方法。所述細胞通常是培養(yǎng)細胞。本發(fā)明還提供一種釆用斑點檢測法檢測樣品中的人乳頭瘤病毒中和抗體的方法。本發(fā)明還提供一種通過使樣品中可能存在的人乳頭瘤病毒中和抗體與人乳頭瘤病毒假病毒或病毒接觸以阻止人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染細胞(通常是培養(yǎng)細胞)，并檢測被人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染的細胞，來檢測樣品中的人乳頭瘤病毒中和抗體的方法，其特征在于采用斑點檢測法高通量檢測被人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染的細胞或其數(shù)量。10在一個實施方案中，可以通過使用斑點檢測儀器檢測感染細胞特有(未感染細胞不具有)的信號來檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞或其數(shù)量。在一個具體實施方案中，所述高通量檢測被人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染的細胞或其數(shù)量采用如下方法來進行，所述方法包括(1)使被HPV假病毒或病毒感染的細胞帶有適于斑點檢測儀器檢測的信號，但未被感染的細胞不帶有該信號；和(2)通過使用斑點檢測儀器檢測該信號(或帶有該信號的細胞)來檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞。另一方面，本發(fā)明涉及一種簡便、高效、適于進行高通量檢測的HPV中和抗體檢測方法，可用于檢測樣品中是否存在HPV中和抗體，也可用于評價樣品中HPV中和抗體的效價。本發(fā)明的方法可適用于檢測不同亞型HPV的中和抗體，在本發(fā)明的具體實施方案中，作為示例，本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法被應用于分別檢測HPV16、HPV18、HPV6、HPV11中和抗體，也可以應用于檢測其他HPV亞型的中和抗體，如HPV33、HPV35、HPV34、HPV52、,45、HPV59、HPV31、HPV56、HPV58等。在本發(fā)明所述方法中，所述樣品為來自待檢個體的分離的生物學樣品，優(yōu)選所述樣品為血清；也來自組織培養(yǎng)的生物學樣品。所述HPV中和抗體檢測方法可用于檢測樣品中人乳頭瘤病毒中和抗體的存在與否和/或其效價。在本發(fā)明中，所述斑點檢測法中檢測數(shù)據(jù)優(yōu)選是通過使用斑點檢測儀器獲得的。斑點檢測儀器能夠用于從細胞群體中分辨和測算產(chǎn)生特定信號(例如顏色)的細胞的數(shù)量，優(yōu)選Elispot。斑點檢測儀器(如Elispot)—般可以通過檢測帶有由報告蛋白直接或間接產(chǎn)生的信號的細胞來檢測被感染細胞的數(shù)量。在一個具體實施方案中，使感染細胞產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號是通過如下方法獲得的報告基因表達元件在感染細胞中表達產(chǎn)生報告蛋白，該報告蛋白可直接產(chǎn)生或間接(例如通過顯色反應)產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號。在一個具體實施方案中，所述的報告基因在感染細胞中的表達是通過人乳頭瘤病毒假病毒或病毒感染細胞實現(xiàn)的。報告基因表達元件細胞中表達，或者，也可通過人乳頭瘤病毒假病毒或病毒感染帶有報告基因表達元件的細胞后激活該報告基因表達元件表達，優(yōu)選帶有報告基因表達元件的人乳頭瘤病毒假病毒的方式。在一個具體實施方案中，所述的報告基因為其表達產(chǎn)物可以直接或間接導致產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號的基因，如P半乳糖苷酶基因等。在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供一種HPV中和抗體檢測方法，該方法包括以下步驟A)將細胞培養(yǎng)于固相培養(yǎng)栽體(例如細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板等，優(yōu)選細胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選96孔細胞培養(yǎng)板)上，作為人乳頭瘤病毒或人乳頭瘤病毒假病毒感染的靶細胞；所述細胞為動物細胞，特別是哺乳動物細胞，也可以是一種改造的細胞，其可在人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染后表達報告蛋白；B)根據(jù)所需要檢測的人乳頭瘤病毒中和抗體所屬的人乳頭瘤病毒型別，準備需要的人乳頭瘤病毒或人乳頭瘤病毒假病毒，例如帶有報告基因表達元件的人乳頭瘤病毒假病毒；C)使待檢測樣品與步驟B)中所述的人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒接觸，使得樣品中的人乳頭瘤病毒中和抗體，如果存在的話，會與人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒結(jié)合，從而能夠阻止人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒對步驟A)中所述靶細胞的感染；該接觸在允許樣品中的中和抗體與人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒結(jié)合的條件下進行，如在4t:放置1小時；D)使步驟C)的產(chǎn)物(檢測樣品與人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒的混合液)和步驟A)的產(chǎn)物(培養(yǎng)于固相培養(yǎng)栽體的細胞)接觸，該接觸在允許細胞正常生長的條件下進行，如在371C0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時；E)應用斑點檢測儀器(如Elispot)(通過例如檢測帶有由報告蛋白直接或間接產(chǎn)生的信號的細胞)檢測被感染細胞的數(shù)量；F)根據(jù)步驟E)獲得的結(jié)果測算樣品中是否有人乳頭瘤病毒中和抗體和/或其效價。在一個優(yōu)選實施方案中，A)中所述的細胞在被B)中所述的人乳頭瘤病毒或者人乳頭瘤病毒假病毒感染后能夠表達報告蛋白，該報告蛋白能直接產(chǎn)生或間接(例如通過顯色反應)產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號。步驟A)中所述的細胞為動物細胞，特別是哺乳動物細胞；也可以是一種改造的細胞。所述的"改造的細胞，，為其在基因組中或者基因組外攜帶包含報告基因編碼序列的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達控制序列可操作地連接，表達控制序列在人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染后可啟動報告基因的表達。其中所述的報告基因需具有如下特征其表達產(chǎn)物可以直接或間接導致所表達的細胞產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號，如P半乳糖苷酶基因等。其中所述的"表達控制序列"是實現(xiàn)基因表達所需要的控制序列，是本領(lǐng)域熟知的，通常必須包括啟動子(可以是任何適于在細胞中表達目的基因的啟動子?？梢允墙M成型的，優(yōu)選是誘導型的。還可以是復合啟動子，如雙啟動子)，常常也包括轉(zhuǎn)錄終止序列，也可以包含其他序列，如增強子序列；基因表達對于蛋白質(zhì)編碼序列通常是指轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)。其中所述的"可操作地連接"是指所連接的分子的連接方式使得能夠?qū)崿F(xiàn)預期的功能，例如，表達控制序列與基因編碼序列的可操作的連接可實現(xiàn)表達控制序列對基因編碼序列的表達控制作用。在制備本發(fā)明所述的"改造的細胞"的方法中，可以通過用包含所述的報告基因編碼核酸序列的表達栽體(如質(zhì)粒載體或病毒載體等)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導細胞來獲得本發(fā)明改造細胞，只要最終得到的細胞包含所述的報告基因的編碼核酸序列即可。步驟B)中所述的帶有報告基因表達元件的人乳頭瘤病毒假病毒通過例如如下方法獲得的將帶有報告基因表達元件(報告基因編碼序列的編碼核酸序列與表達控制序列可操作地連接)的報告質(zhì)粒，與可表達HPVLl蛋白和L2蛋白的表達載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入細胞(如293FT細胞)，在轉(zhuǎn)染后收集細胞的裂解液，該裂解液中含有包裝有報告質(zhì)粒的HPV假病毒。其中所述的報告基因需具有如下特征其表達產(chǎn)物可以直接或間接導致所表達的細胞產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號，如P半乳糖苷酶基因、HIVTAT基因等。其中所述的"表達控制序列"是實現(xiàn)基因表達所需要的控制序列，是本領(lǐng)域熟知的，通常必須包括啟動子(可以是任何適于在細胞中表達目的基因的啟動子?？梢允墙M成型的，也可以是誘導型的。還可以是復合啟動子，如雙啟動子)，常常也包括轉(zhuǎn)錄終止序列，也可以包含其他序列，如增強子序列；基因表達對于蛋白質(zhì)編碼序列通常是指轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)。其中所述的"可操作地連接"是指所連接的分子的連接方式使得能夠?qū)崿F(xiàn)預期的功能，例如，表達控制序列與基因編碼序列的可操作的連接可實現(xiàn)表達控制序列對基因編碼序列的表達控制作用。步驟E)應用斑點檢測儀器(如Elispot)檢測被感染細胞的數(shù)量通過例如如下方法來進行細胞如被本發(fā)明所述的人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染后，通過人乳頭瘤病毒假病毒導入的或細胞內(nèi)的報告基因獲得表達產(chǎn)生報告蛋白，該報告蛋白可直接作為信號產(chǎn)生體產(chǎn)生信號，也可通過反應(如酶促反應等)使其它信號產(chǎn)生體產(chǎn)生信號，其產(chǎn)生信號的方法可以采用已知或已公開的方法或者本發(fā)明實施例中涉及的方法；細胞是否被感染的判定標準是細胞是否具有由信號產(chǎn)生體產(chǎn)生的信號；檢測具有由信號產(chǎn)生體產(chǎn)生的信號的細胞的數(shù)量。本發(fā)明的方法中，信號產(chǎn)生體產(chǎn)生的信號為顏色信號，可使細胞產(chǎn)生與正常細胞不同的顏色(如藍色)，該顏色信號可被斑點檢測儀器(如Elispot)所檢測。本發(fā)明的方法中，信號產(chǎn)生體可以是任何能夠使細胞產(chǎn)生可被斑點檢測儀器(如Elispot)檢測的信號的物質(zhì)，例如可以是酶、蛋白質(zhì)、化學發(fā)光物質(zhì)、同位素、稀土元素。在本發(fā)明所述的方法的一個具體實施方案中，涉及了對上述HPV假病毒的效價進行鑒定的方法。在一個具體實施方案中，本發(fā)明還涉及應用本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法篩選HPV中和性單克隆抗體的方法。在一個具體實施方案中，本發(fā)明還涉及應用本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法檢測HPV中和抗體效價的方法。在一個具體實施方案中，本發(fā)明還涉及應用本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法在HPV疫苗開發(fā)和質(zhì)控中的應用方法。本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法可用于制備HPV中和抗體診斷試劑盒。本發(fā)明還提供斑點檢測儀器或斑點檢測法或本發(fā)明感染細胞或抗體檢測方法在檢測人乳頭瘤病毒中和抗體中的用途、在篩選HPV中和性單克隆抗體中的用途、在檢測HPV中和抗體效價中的用途、在制備HPV中和抗體診斷試劑盒中的用途、在HPV疫苗開發(fā)和質(zhì)控中的用途、在篩選或制備抗HPV或其相關(guān)疾病藥物中的用途、或在治療HPV感染中的用途下面結(jié)合具體實施例與所附圖表，對本發(fā)明進一步加以描述。所述實施例旨在以舉例方式具體闡明本發(fā)明。試劑、試刑的濃度、溫度和其他變量的值以及載體和細胞的選擇只是舉例說明本發(fā)明的應用，而不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例一.本發(fā)明涉及的HPV假病毒的制備和鑒定實施例l.HPV結(jié)構(gòu)蛋白表達栽體的構(gòu)建HPV的病毒顆粒由L1蛋白和L2蛋白共同組成。研究已顯示，在細胞中共表達Ll和L2蛋白可組裝獲得HPV的類病毒顆粒，其結(jié)構(gòu)特點與天然病毒顆粒結(jié)構(gòu)相似(RodenRB等，病毒學雜志，1996年，70巻5875-5883頁)。本發(fā)明中，根據(jù)源自Genbank的HPV的基因數(shù)據(jù)，釆用基因合成的方法分別設計合成包含不同亞型HPV(這里包括了HPV16、HPV18、HPV6、HPVll、HPV52、HPV58作為示例，但是也可以包括其他HPV亞型)的Ll和L2蛋白的基因片段，片段的5，端添加Notl位點，3，端添加Xbal位點；基因片段經(jīng)NotI、Xbal酶切后與經(jīng)同樣酶切的哺乳動物細胞表達載體pCDNA3.1(+)質(zhì)粒連接，構(gòu)建獲得可分別表達不同亞型HPVLl和L2蛋白的表達栽體，分別命名為pCDNA3.1(+)-16Ll、pCDNA3.1(+)-16L2、pCDNA3.1(+)-18Ll、pCDNA3，1(+)-18L2、pCDNA3.1(+)-11L1、pCDNA3.1(+)-11L2、pCDNA3.1(+)-6L1、pCDNA3.1(+)-6L2、pCDNA3.1(+)-52Ll、pCDNA3.1(+)-52L2、pCDNA3.1(+)-58L1、pCDNA3.1(+)-58L2。Genbank公開的HPVLl和L2基因序列如下HPV16Ll的基因序列(Genbank號AJ313179)、HPV16L2的基因序列(Genbank號AJ313180)、HPV18L1的基因序列(Genbank號AY383628)、HPV18L2的基因序列(Genbank號AY383629)、HPV6Ll的基因序列(Genbank號FJ615300)、HPV6L2的基因序列(Genbank號FJ615301)、HPV11Ll的基因序列(Genbank號AY541029)、HPV11L2的基因序列(Genbank號FJ615302)、HPV52Ll的基因序列(Genbank號FJ615303)、HPV52L2的基因序列(Genbank號FJ615304)、HPV58Ll的基因序列(Genbank號FJ615305)、HPV58L2的基因序列(Genbank號FJ615306)。實施例2.報告基因表達質(zhì)粒的選擇本發(fā)明釆用斑點檢測儀器(如Elispot)對HPV假病毒或HPV對靶細胞的感染效果進行檢測，因此由HPV假病毒或HPV感染把細胞后介導的報告基因表達產(chǎn)物產(chǎn)生的信號必須能夠被斑點檢測儀器所識別和檢測，即需要選擇其表達產(chǎn)物能夠?qū)е庐a(chǎn)生合適信號的報告基因。本實施例中，我們以P-半乳糖苷酶作為報告基因進行示例，P-半乳糖苷酶報告基因表達元件在導入細胞后可表達獲得p-半乳糖苷酶，在顯色底物(如X-gal或bluo-gal等)存在的情況下，可使所表達的細胞產(chǎn)生出明顯的藍色信號，這種信號的產(chǎn)生可以不需要其它光源的輔助，并且這種信號可以被斑點檢測儀器(如Elispot)所識別和檢測。斑點檢測儀器(如Elispot)是目前細胞免疫研究最常用的檢測儀器之一，其檢測原理是通過高靈敏度的攝像頭采集樣品板(可以是細胞培養(yǎng)板、專用顯色板、顯色用膜等)上的細胞顯色圖像，通過軟件分析測算顯色細胞的數(shù)量或空斑數(shù)量，具有很好的精確度和靈敏度，其靈敏度可以分辨出顯色的單細胞。Elispot的檢測自動化水平高，可適用于包括96孔細胞培養(yǎng)板在內(nèi)的多種常用的細胞培養(yǎng)容器，可進行全板范圍的快速連續(xù)自動掃描檢測。目前，尚未有將Elispot應用于HPV中和抗體檢測實驗的報道。本實施例中作為示例的p-半乳糖苷酶基因編碼序列位于pCMVP質(zhì)粒(clotech公司，cat.Number631719)中，該質(zhì)?？捎糜谠诩毎斜磉_p-半乳糖苷酶。實施例3.HPV假病毒的制備本發(fā)明通過磷酸鈣多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法在293FT細胞(invitrogen公司，catalogno.R700-07)中制備HPV假病毒。將可表達HPVLI和L2蛋白的表達質(zhì)粒與報告基因表達質(zhì)粒(如pCMVP)共轉(zhuǎn)染入2"FT細胞中，在轉(zhuǎn)染48小時后收集含有HPV假病毒的細胞裂解液。實驗方法293FT細胞培養(yǎng)于1Ocm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(添加10%FBS，2mML-glutamine,0.lmMMEMNon-EssentialAminoAcids及1%penicillin-streptomycin)，匯合率約為80%。l2小時后每皿細胞轉(zhuǎn)染40|igHPVLI表達質(zhì)粒、40報告基因表達質(zhì)粒和4ygHPVL2表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑為磷酸鉀，轉(zhuǎn)染方法參見該試劑的搮作指南。在共轉(zhuǎn)染48小時后分別收集細胞進行裂解。轉(zhuǎn)染48小時后，離心收集細胞，用適當體積的裂解液(含有0.25%Brij85，9.5mMMgCl2的DPBS溶液)重懸，每皿細胞使用250liL裂解液，37X:孵育16小時后，離心收集含有HPV假病毒的上清液。加入o.n倍體積的5MNaCl溶液，分裝成50iuL—份，-801保存。實施例4.HPV假病毒對細胞的感染效果研究已證明，293FT細胞可以作為HPV假病毒的易感細胞，適于進行HPV假病毒的感染實驗(盧五迅等，生物工程學報，2006年，22巻990-995頁)。將收獲的HPV假病毒分別感染293FT細胞，檢測其對293FT細胞的感染效果及所介導的報告基因半乳糖苷酶在細胞中的表達效果。實驗方法293FT細胞培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板中，約1.5xl07孔，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(添加10%FBS，2mML-glutamine，0.ImMMEMNon-EssentialAminoAcids及1%penici11in—streptomycin),匯合率約為80%。培養(yǎng)8h后每孔分別加入0.1jiLHPV16假病毒、HPV18假病毒、HPV6假病毒、HPV11假病毒、HPV52假病毒、HPV58假病毒。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50pL固定液(含有1%曱醛，0.2%戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入lOO^LD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50jaL顯色液(含有2%0.2M亞鐵氛化鉀，2%0，2M鐵氰化鉀，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLX-gal的PBS溶液)，放置在37t:中顯色2小時，2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。實驗對照為未進行感染實驗的293FT細胞。實施例5.應用斑點檢測儀器Elispot檢測HPV假病毒對細胞的感染效果本發(fā)明中，我們構(gòu)建的HPV16假病毒、HPV18假病毒、HPV6假病毒、HPV11假病毒、HPV52假病毒、HPV58假病毒可有效感染細胞，并介導所包裝的P-半乳糖苷酶報告基因在靶細胞中表達，被感染細胞通過顯色反應可顯示出清晰的藍色信號。這種信號在可見光下即可被觀察，可以不需要特殊光源(如激光、限定波長范圍的汞燈光源等)的激發(fā)，適合于用斑點檢測儀器Elispot進行檢測。目前，經(jīng)典的檢測P-半乳糖苷酶表達的方法是對顯色細胞的數(shù)量進行人工計數(shù)，費力耗時，不適于進行高通量檢測實驗；且缺乏客觀性，人為誤差大，容易影響實驗結(jié)果的重復性。應用斑點檢測儀器Elispot進行檢測，具有靈酶度高、特別是能夠進行連續(xù)自動的快速掃描檢測，短時間內(nèi)即可獲得大量樣品的檢測結(jié)果，可滿足高通量檢測的要求。我們應用斑點檢測儀器Elispot對HPV16假病毒、HPV18假病毒、HPV6假病毒、HPV11假病毒、HPV52假病毒、HPV58假病毒感染并進行顯色后的293FT細胞進行了檢測。實驗方法293FT細胞培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板中，約1.5x104/孔，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)8小時后每孔分別加入0.1juLHPV16假病毒、HPV18假病毒、HPV6假病毒、HPV11假病毒、HPV52假病毒、HPVS8假病毒。m培養(yǎng)72小時后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50nL固定液(含有1%甲醛，0.2%戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入100pLD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將d-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50jjL顯色液(含有2%0.2M亞鐵氰化鉀，2%0.2M鐵氛化鉀，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLx-gal的PBS溶液)，放置在37X:中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。啟動斑點檢測儀器Elispot,將進行顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在儀器的取樣板上，用儀器檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。Elispot的詳細操作步驟見該儀器的操作說明書。實驗對照為未進行感染實驗的293FT細胞。通過自動連續(xù)掃描檢測，可迅速獲得所檢測細胞板上各個孔的顯色細胞數(shù)量即被感染細胞數(shù)量，結(jié)果如圖1所示。各個孔中顯色細胞數(shù)量即被HPV假病毒感染的細胞數(shù)量標于各孔圖像的左上方，未進行感染實驗的細胞孔未檢測到顯色細胞。這說明了本發(fā)明的設計思路的可行性，帶有p-半乳糖苷酶報告基因的HPV假病毒感染細胞后可使細胞產(chǎn)生可被斑點檢測儀器Elispot識別的標記信號，同時使整個檢測過程十分的簡便和迅速。實施例6，HPV假病毒感染效價的測定根據(jù)病毒效價空斑測定法的原理，在稀釋度足夠的情況下，HPV假病毒感染細胞后表達報告蛋白產(chǎn)生可被檢測儀器檢測的信號，信號感染單位的HPV假病毒。我們以梯度稀釋藍斑計數(shù)方法檢測所構(gòu)建的HPV假病毒的效價。本實施例中我們以檢測HPV16假病毒、HPV18假病毒的效價作為示例，也可以包括檢測其他亞型HPV假病毒的效價。效價測定方法將293FT細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，1.5x104個/孔，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)8小時。取HPV假病毒原液一份(50jiL)以10。/。DMEM培養(yǎng)基2倍連續(xù)梯度稀釋，最終使每100"L培養(yǎng)基中分別含有0.5jaL、0.25yL、0.125jliL…等10個濃度梯度的病毒稀釋液。將各梯度的病毒稀釋液取100jiL加入預鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中的293FT細胞中，每個梯度采取4孔重復。將96孔板放入37匸培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50|iL固定液(含有1%甲醛，0.2%戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入10(^LD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50jaL顯色液(含有2%0.2M亞鐵氰化鉀，2%0.2M鐵氰化鉀，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLx-gal的PBS溶液)，放置在37X:中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。啟動斑點檢測儀器Elispot，將進行顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在儀器的取樣板上，用儀器檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。Elispot的詳細操作步驟見該儀器的操作說明書。實驗對照為未進行感染實驗的293FT細胞(陰性孔)。結(jié)果如表l所示，與不同的假病毒原液用量對應的為被感染細胞的數(shù)量(為4孔平均值)。HPV假病毒效價計算方法感染效價0"11/1^)=檢測孔被感染細胞數(shù)/檢測孔假病毒原液用量(mU。其中，上述公式中"檢測孔被感染細胞數(shù)"和"檢測孔假病毒原液用量"選擇被感染細胞數(shù)最接近于50且不低于50的檢測孔的被感染細胞數(shù)與其對應的假病毒原液的用量。例如，本實施例中，HPV16假病毒效價檢測實驗中，被感染細胞數(shù)最接近于50且不低于50的檢測孔的被感染細胞數(shù)為102與其對應的假病毒原液用量為6.25x10—5mL，檢測孔的假病毒稀釋液用量為0.lmL，代入上述公式即可計算獲得該HPV16假病毒效價為1.63x106(TU/mL)。同樣，在本實施例的HPV18假病毒效價檢測實驗中，被感染細胞數(shù)最接近于50且不低于50的檢測孔的被感染細胞數(shù)為66與其對應的假病毒原液用量為3.13xl(T5mL，檢測孔的假病毒稀釋液用量為0.lmL，代入上述公式即可計算獲得該HPV16假病毒效價為2.11x106(TU/mL)。表lHPV假病毒的不同用量與被感染細胞數(shù)量的關(guān)系假病毒原液用量0.50.250.1250.06250.03130.0156(l(TmL)HPV16假病毒15276912721024220HPV18假病毒15388103721486646二.本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法的建立實施例7.—種新的HPV中和抗體檢測方法HPV中和抗體水平是評估HPV疫苗的關(guān)鍵性指標，因此建立高效、準確和便捷的中和抗體評估方法十分重要。本發(fā)明應用前面所述的HPV假病毒和斑點檢測儀器(如Elispot)建立了一種新的HPV中和抗體檢測方法。該方法既具有高效、準確的優(yōu)點，同時更有利于提高工作效率，更適于進行高通量檢測。該方法的流程示意簡圖可見圖2。方法流程描述(1)293FT細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，1.5xl(T個/孔，培養(yǎng)基為畫M培養(yǎng)基(添加10%FBS，2mML-glutamine，0.ImMMEMNon-EssentialAminoAcids及1%penici11in-streptomycin)，37r培養(yǎng)8小時;(2)取HPV假病毒原液(如需要檢測的是HPV16中和抗體，可以使用HPV16假病毒；如是檢測針對HPV18中和抗體，可以>使用HPV18假病毒；檢測針對其它亞型HPV的中和抗體，則可分別使用其它亞型的HPV假病毒)，用上述的DMEM培養(yǎng)基(也可以根據(jù)需要選擇其它合適的細胞培養(yǎng)基或緩沖液)進行稀釋，稀釋比例根據(jù)如下方法計算稀釋后HPV假病毒液的用量為96孔細胞培養(yǎng)板每個孔加50nLHPV假病毒稀釋液，以每孔1.5xl(T個細胞估算，HPV假病毒對細胞的MOI為0.02，以此用量計算HPV原液的稀釋比例；(3)將待檢測的樣品(如單克隆抗體樣品、血清樣品、腹水樣品、細胞培養(yǎng)上清液樣品、細胞裂解液樣品等)用上述的DMEM培養(yǎng)基(也可以根據(jù)需要選擇其它合適的細胞培養(yǎng)基或緩沖液)進行稀釋(可以根據(jù)需要選擇合適的稀釋倍數(shù))；注實驗對照設置為未進行感染實驗的293FT細胞(稱為陰性孔，每個96孔板設置3個孔)和只進行HPV假病毒感染的293FT細胞(稱為陽性感染孔，每個96孔板設置6個孔)。(4)稀釋后的待檢測的樣品各取50nL分別與50|iL稀釋后的HPV假病毒(MOI=0.02)混合，41C孵育1小時；(5)將孵育后的樣品-假病毒混合液分別加入上述(1)預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，37C培養(yǎng)72小時；(6)顯色反應培養(yǎng)72小時后進行顯色反應，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50jLiL固定液(含有1%甲醛，0.2。/戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入lOOfiLD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50pL顯色液(含有2%0,2M亞鐵氰化鉀，2%0.2M鐵氛化鉀，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLX-gal的PBS溶液)，放置在37X:中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。22(7)結(jié)果檢測啟動斑點檢測儀器Elispot，將顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在取樣板上，掃描檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。EHspot的詳細操作步驟可見該儀器的操作說明書。(8)結(jié)果判定具有中和能力的定義為在經(jīng)20倍稀釋后(也可以根據(jù)需要選擇合適的稀釋倍數(shù)，也可以為原倍，優(yōu)選20倍稀釋)能達到50%以上感染抑制率的樣品視為具有中和能力。中和抗體效價的定義為以達到50%感染抑制率以上的最大稀釋倍數(shù)作為該樣品的中和效價。感染抑制率的計算方法各樣品孔的感染抑制率-(1-樣品孔被感染細胞數(shù)/(陽性感染孔被感染細胞數(shù)總和/6-陰性孔顯色細胞數(shù)總和/3))x畫。實施例8.與當前常用的HPV中和抗體檢測方法的對比本實施例中，我們將本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法與目前常用的HPV中和抗體檢測方法進行了對比實驗。本實施例中，我們應用兩種方法同時對中和性HPV16單克隆抗體8A9(也可以采用其它抗體，例如市售抗體)的中和效價進行檢測，對兩種方法的應用效果進行對比。實驗方法(1)應用本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法將293FT細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中(1.5xl0V孔)。8小時后將單克隆抗體樣品8A9(lmg/mL)用10。/。DMEM進行連續(xù)倍比稀釋(以1:2稀釋為起點，進行5倍比稀釋)，然后各取50juL分別與50jLiL稀釋于10%DMEM的HPV16假病毒(MOI-O.02)混合。41C混合孵育1小時后分別加入預鋪有"3FT細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)72小時后進行顯色反應，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50jiL固定液(含有1%甲醛，0.2%戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入100juLD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50jLiL顯色液(含有2%0.2M亞鐵氰化鉀，2%0.2M鐵氰化鉀，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLx-gal的PBS溶液)，放置在37r中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。啟動斑點檢測儀器Elispot，將進行顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在取樣板上，檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。Elispot的詳細操作步驟見該儀器的操作說明書。實驗對照設置為未進行感染實驗的293FT細胞(稱為陰性孔，每個96孔板設置3個孔)和只進行HPV16假病毒感染的293FT細胞(稱為陽性感染孔，每個96孔板設置6個孔)。中和效價的判定方法抗體中和效價的定義為以達到50%感染抑制率以上的最大稀釋倍數(shù)作為該單克隆抗體樣品的中和效價。感染抑制率的計算方法各樣品孔的感染抑制率-(1-樣品孔被感染細胞數(shù)/(陽性感染孔被感染細胞數(shù)總和/6-陰性孔顯色細胞數(shù)總和/3))xi00%。(2)應用當前常用的HPV中和抗體檢測方法具體操作步驟可參見文獻(盧五迅等，生物工程學報，2006年，22巻990-995頁)。這里簡述如下將293FT細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中(1.5x104/孔)。8小時后將單克隆抗體樣品8A9(lmg/mL)用10%DMEM進行連續(xù)倍比稀釋(以l:2稀釋為起點，進行5倍比稀釋)，然后各取50jaL分別與50nL稀釋于10%DMEM的包裝有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的HPV16假病毒(MOI-O.2)混合。4"C混合孵育1小時后分別加入預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中。37匸培養(yǎng)72小時后，消化并吹下各孔細胞，分別用流式細胞儀進行檢測各樣品的感染率。實驗對照設置為未進行感染實驗的293FT細胞(稱為陰性孔，每個96孔板設置3個孔)和只進行包裝有EGFP的HPV16假病毒感染的293FT細胞(稱為陽性感染孔，每個96孔板設置6個孔)。中和效價的判定方法抗體中和效價的定義為以達到50%感染抑制率以上的最大稀釋24倍數(shù)作為該單克隆抗體樣品的中和效價。感染抑制率的計算方法各樣品孔的感染抑制率-(l-樣品孔感染率/陽性感染孔感染率)xl00%。檢測結(jié)果在本實施例中，我們分別應用上述兩種方法分別對同樣的中和性HPV16單克隆抗體8A9樣品的中和效價進行了檢測，結(jié)果如圖3所示，應用本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法獲得的檢測結(jié)果與目前較廣泛使用的HPV中和抗體檢測方法相同，具有高度的重合性。三.本發(fā)明的HPV中和抗體檢測方法的應用實施例9.在篩選中和性HPV單克隆抗體中的應用本發(fā)明建立的HPV中和抗體檢測方法可應用于篩選中和性HPV單克隆抗體。本實施例中我們以篩選中和性HPV16單克隆抗體、中和性HPV18單克隆抗體、中和性HPV6單克隆抗體、中和性HPV11單克隆抗體作為示例，也可以包括篩選其他HPV亞型中和性單克隆抗體。本實施例中HPV單克隆抗體的制備方法為將不同亞型的HPVVLP(HPV16VLP(公開號CN101293918A，制備方法見實施例1、2、3、4)、HPV18VLP(申請?zhí)?00810093817.2，制備方法見實施例1、2、3、4)、HPV6VLP(申請?zhí)?00810111390.4,制備方法見實施例1、2、3、4)、HPV11VLP(申請?zhí)?00810111389.1，制備方法見實施例l、2、3、4))分別免疫Balb/c小鼠，初免(劑量為80yg/只)與等量福氏完全佐劑混合，加強免疫(劑量為40Mg/只)則與等量福氏不完全佐劑混合，進行肌肉注射，初免后分別于4、8周各加強一次。加強免疫3次后進行單克隆抗體的篩選和制備，細胞融合、克隆化、腹水制備及純化參見單克隆抗體的常規(guī)方法(HarlowE等，抗體實驗室手冊，1998年，139-312頁)。實驗方法將"3FT細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中(1.5x104/孔)。8h后將待篩選的單克隆抗體樣品用10y。DMEM進行l(wèi):20稀釋，然后取50yL分別與50jaL同樣稀釋于10%DMEM的HPV假病泰MOI-0.02)混合(如需要篩選的是針對HPV16的中和性單克隆抗體，可以使用HPV16假病毒；如需要篩選的是針對HPV18的中和性單克隆抗體，可以使用HPV18假病毒；篩選針對其它亞型HPV的中和性單克隆抗體，則分別使用其它亞型的HPV假病毒)。4t:混合孵育lh后分別加入預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中。37C培養(yǎng)72小時后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50piL固定液(含有1%甲醛，0.2°/。戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入100|uLD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50jiL顯色液(含有2%0.2M亞鐵氰化鉀，2%0.2M鐵氰化鉀，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLx-gal的PBS溶液)，放置在37C中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。啟動斑點檢測儀器Elispot，將進行顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在取樣板上，檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。Elispot的詳細操作步驟見該儀器的搮作說明書。實驗對照設置為未進行感染實驗的293FT細胞(稱為陰性孔，每個96孔板設置3個孔)和只進行HPV假病毒感染的293FT細胞(稱為陽性感染孔，每個96孔板設置6個孔)。中和性HPV單克隆抗體的判定標準在經(jīng)20倍稀釋后能達到50%以上感染抑制率的HPV單克隆抗體視為具有中和能力。感染抑制率的計算方法各樣品孔的感染抑制率-(l-樣品孔被感染細胞數(shù)/(陽性感染孔被感染細胞數(shù)總和/6-陰性孔顯色細胞數(shù)總和/3))xl00%。在本實施例中，我們應用上述方法分別對多林HPV16、HPV18、HPV6、HPV11單克隆抗體進行了中和單克隆抗體篩選，結(jié)果如表2、表3、表4、表5所示。表2:篩選獲得的HPV16中和性單克隆抗體單抗名稱~~20倍稀釋是否具有~~單抗名稱"20倍稀釋是否具有后的感染中和能力后的感染中和能力<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表3:篩選獲得的HPV18中和性單克隆抗體單抗名稱~~20倍稀釋是否具有~~單抗名稱"""20倍稀釋是否具有后的感染中和能力后的感染中和能力<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4:篩選獲得的HPV6中和性單克隆抗體單抗名稱20倍稀釋是否具有單抗名稱20倍稀釋是否具有后的感染中和能力后的感染中和能力<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>17G7>50是15C4>50是15F7>50是13H5>50是表5:篩選獲得的HPV11中和性單克隆抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例10.在檢測中和性HPV單克隆抗體中和效價中的應用本發(fā)明建立的HPV中和抗體檢測方法可應用于檢測中和性HPV單克隆抗體的中和效價。本實施例中我們以檢測中和性HPV16單克隆抗體、中和性HPV18單克隆抗體、中和性HPV6單克隆抗體、中和性HPV11單克隆抗體的中和效價作為示例，也可以包括檢測其他HPV亞型中和性單克隆抗體的中和效價。實驗方法將293FT細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中(1.5x104/孔)。8h后將待檢測的單克隆抗體樣品用10。/。DMEM進行連續(xù)倍比稀斷以1:20稀釋為起點，可以進行2倍比稀釋，也可以進行5倍比稀釋，也可以進行10倍比稀釋或其它類型的稀釋比例，其中優(yōu)選進行2倍比稀釋)，然后各取50juL分別與50luL稀釋于10。/。DMEM的HPV假病毒(MOI-O.02)混合(如需要檢測的是針對HPV16的中和性單克隆抗體的中和效價，可以使用HPV16假病毒；如是檢測針對HPV18的中和性單克隆抗體的中和效價，可以使用HPV18假病毒；檢測針對其它亞型HPV的中和性單克隆抗體的中和效價，則可分別使用其它亞型的HPV假病毒)。4X:混合孵育1小時后分別加入預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中。37X:培養(yǎng)72小時后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50jaL固定液(含有1%甲醛，0.2%戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入IOOjliLD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50^L顯色液(含有2%0.2M亞鐵氰化鉀，2%0.2M鐵氰化鉀，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLx-gal的PBS溶液)，放置在37C中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。啟動斑點檢測儀器Elispot,將進行顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在取樣板上，檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。Elispot的詳細搮作步驟見該儀器的操作說明書。實驗對照設置為未進行感染實驗的293FT細胞(稱為陰性孔，每個96孔板設置3個孔)和只進行HPV假病毒感染的293FT細胞(稱為陽性感染孔，每個96孔板設置6個孔)。中和效價的判定方法抗體中和效價的定義為以達到50%感染抑制率以上的最大稀釋倍數(shù)作為該單克隆抗體樣品的中和效價。感染抑制率的計算方法各樣品孔的感染抑制率-(l-樣品孔被感染細胞數(shù)/(陽性感染孔被感染細胞數(shù)總和/6-陰性孔顯色細胞數(shù)總和/3))xl00%。在本實施例中，我們應用上述方法分別檢測了多個HPV16、HPV18、HPV6、HPV11中和性單克隆抗體的中和效價，結(jié)果分別如表6、表7、表8、表9所示。表6:HPV16中和性單克隆抗體的中和效價<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表7:HPV18中和性單克隆抗體的中和效價<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表9:HPV11中和性單克隆抗體的中和效價<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例11.在檢測血清樣品的HPV中和抗體效價中的應用本發(fā)明建立的HPV中和抗體檢測方法可應用于檢測血清樣品中的HPV中和抗體效價。本實施例中我們檢測血清樣品中HPV16中和抗體作為示例，也可以包括檢測血清樣品中其他亞型HPV中和抗體。待檢測血清樣品為HPV16VLP免疫后的兔和羊血清。兔普通級，雌性，購自廣西省疾病預防與控制中心，并在該中心飼養(yǎng)。用純化的HPV16VLP(公開號CN101293918A，制備方法見實施例l、2、3、4)初免(劑量為100jug/只)與等量福氏完全佐劑混合，加強免疫(劑量為50pg/只)則與等量福氏不完全佐劑混合，進行肌肉注射，初免后分別于4、IO周各加強一次。免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清待檢。羊普通級，雌性，購自廣西省疾病預防與控制中心，并在該中心飼養(yǎng)。用純化的HPV16VLP初免(劑量為lmg/只)與等量福氏完全佐劑混合，加強免疫(劑量為0.5mg/只)則與等量福氏不完全佐劑混合，進行肌肉注射，初免后分別于4、10、18周各加強一次。免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清待檢。中和實驗方法將293FT細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中(1.5x107孔)。8小時后將待檢測的血清樣品用10。/。DMEM進行連續(xù)倍比稀釋(以1:2Q稀釋為起點，可以進行2倍比稀釋，也可以進行5倍比稀釋，也可以進行IO倍比稀釋或其它類型的稀釋比例，其中優(yōu)選進行10倍比稀釋)，然后各取50jiiL分別與50pL稀釋于10。/。DMEM的HPV假病毒(MOI-O.02)混合(如需要檢測的是針對HPV16的中和抗體效價，可以使用HPV16假病毒；如是檢測針對HPV18的中和抗體效價，可以使用HPV18假病毒；檢測針對其它亞型HPV的的中和抗體效價，則可分別使用其它亞型的HPV假病毒)。4t:混合孵育lh后分別加入預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中。37匸培養(yǎng)72小時后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50pL固定液(含有1%甲醛，0.2%戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入100pLD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中31加入50jLtL顯色液(含有2%0,2M亞鐵氛化鉀，2%0.2M鐵氰化鐘，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLx-gal的PBS溶液)，放置在37C中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。啟動斑點檢測儀器Elispot，將進行顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在取樣板上，檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。實驗對照設置為未進行感染實驗的293FT細胞(稱為陰性孔，每個96孔板設置3個孔)和只進行HPV假病毒感染的293FT細胞(稱為陽性感染孔，每個96孔板設置6個孔)。中和效價的判定方法抗體中和效價的定義為以達到50%感染抑制率以上的最大稀釋倍數(shù)(稀釋起點為l:20)作為該血清樣品的中和效價。感染抑制率的計算方法各樣品孔的感染抑制率-(1-樣品孔被感染細胞數(shù)/(陽性感染孔被感染細胞數(shù)總和/6-陰性孔顯色細胞數(shù)總和/3))xi00%。在本實施例中，我們應用上述方法分別檢測了HPV16VLP免疫后的兔、羊血清中的HPV中和抗體效價，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，在HPV16VLP初免及加強后，可誘導出高滴度的中和抗體，HPV16中和抗體效價迅速上升。實施例12.在評價HPV疫苗免疫保護性中的應用本實施例中，我們將本發(fā)明建立的HPV中和抗體檢測方法應用于HPV疫苗免疫保護性評價實驗。本實施例中我們以HPV16疫苗免疫保護性評價實驗作為示例，也可以包括其他亞型HPV疫苗的免疫保護性評價實驗。HPV16疫苗(乂>開號CN101293918A，制備方法見實施例1、2、3、4、5)供試品預處理取10支疫苗供試品混勻，用疫苗稀釋液一步稀釋到80pg/mL，后進行2倍系列稀釋得終濃度分別為40jug/mL、20Mg/邁L的供試品系列溶液。恒河猴普通級，雌性，2歲，購自廣西省疾病預防與控制中心，并在該中心飼養(yǎng)。免疫方法用上述疫苗供試品系列溶液進行左上肢三角肌注射，分5ug、10ug、20ug三個劑量，每個劑量3只恒河猴，每只250iiL，同時用疫苗稀釋液同法操作免疫對照組。飼養(yǎng)9周，每周采血一次，血樣于37。C放置1.5小時后，10，OOOrpm離心5分鐘，收集血清。中和抗體檢測方法(1)293FT細胞預鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，1.5xl(T個/孔，37。C培養(yǎng)8小時；(2)用10。/。DMEM培養(yǎng)基在96孔細胞培養(yǎng)板上對血清樣品進行連續(xù)倍比稀釋(以l:20稀釋為起點，可以進行2倍比稀釋，也可以進行5倍比稀釋，也可以進行10倍比稀釋或其它類型的稀釋比例，其中優(yōu)選進行2倍比稀釋)，稀釋總體積為50)LiL;(3)取-80匸保存的HPV假病毒原液一份，按MOI-0.02加入適量10。/。DMEM稀釋；(4)往稀釋好的血清中加入50|aLHPV假病毒稀釋液。槍尖吹吸3次混勻，4TC孵育1小時；注實驗對照設置未進行感染實驗(加入100yL10%DMEM培養(yǎng)基)的293FT細胞(稱為陰性孔，每個96孔板設置3個孔)；只進行HPV假病毒感染(50jaL10。/。DMEM培養(yǎng)基及50|iLHPV假病毒稀釋液)的293FT細胞(稱為陽性感染孔，每個96孔板設置6個孔)。(5)將各個樣品混合液及對照樣品分別加入預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中。37^培養(yǎng)72小時；(6)培養(yǎng)72小時后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入50pL固定液(含有1%甲醛，0.2%戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入lOOpLD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50juL顯色液(含有2%0.2M亞鐵氰化鉀，2%0.2M鐵氰化鉀，0.1%2MMgCl2，3%40mg/mLx-gal的PBS溶液)，放置在37C中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。33(7)啟動斑點檢測儀器Elispot，將進行顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在取樣板上，檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。Elispot的詳細操作步驟見該儀器的操作說明書。C.結(jié)果分析血清樣品中和抗體效價的定義以達到50%感染抑制率以上的最大稀釋倍數(shù)作為該血清樣品的中和效價。感染抑制率的計算方法各樣品孔的感染抑制率-(1-樣品孔被感染細胞數(shù)/(陽性感染孔被感染細胞數(shù)總和/6-陰性孔顯色細胞數(shù)總和/3))x100%。在本實施例中，我們應用上述方法對HPV16疫苗供試品進行了免疫保護性評價實驗，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，實驗猴經(jīng)HPV16疫苗供試品初免及加強后，可誘導出高滴度的中和抗體，中和抗體效價迅速上升。實施例13.在HPV疫苗效力試驗(EDs。測定)中的應用本實施例中，我們將本發(fā)明建立的HPV中和抗體檢測方法應用于HPV疫苗效力試驗(EDso測定)。本實施例中我們以HPV16疫苗效力試驗作為示例，也可以包括其他HPV亞型疫苗的效力試驗。小鼠SPF級BALB/c小鼠，雌性，6~8周齡，體重約為18~22g。免疫40只小鼠前后采集的共7次血清進行了中和性評價。HPV16疫苗(申請?zhí)?00710097762.8)供試品預處理取10支疫苗供試品混勻，用疫苗稀釋液一步稀釋到0.l|ag/mL，后進行3倍系列稀釋得終濃度分別為0.033ng/mL、0,011ug/mL、0.004ng/mL的供試品系列溶液。實驗方法A.用上述疫苗供試品系列溶液進行小鼠腹腔注射(每個濃度1組小鼠)，每只lmL，同時用疫苗稀釋液同法操作免疫對照組。祠養(yǎng)5周進行眼眶采血，血樣于37°C放置1.5小時后，10，000rpm離心5分鐘，收集血清。B.中和實驗(1)293FT細胞預鋪于96孔平底細胞培養(yǎng)板中，1.5x104個/孔，37t:培養(yǎng)8h;(2)用10%DMEM將血清樣品在96孔細胞培養(yǎng)板上做1:50稀釋(1.0pL血清+59ML培養(yǎng)基)；(3)取-80。C保存的HPV16假病毒原液一份，按MOI-0.02加入適量1Q。/dDMEM稀幹；(4)往稀釋好的血清中加入50iaLHPV假病毒稀釋液。槍尖吹吸3次混勻，4'C孵育1小時；注實驗對照設置未進行感染實驗(加入100pL10%DMEM培養(yǎng)基)的293FT細胞(稱為陰性孔，每個96孔板設置3個孔)；只進行HPV假病毒感染(5QjiL1G。/。DMEM培養(yǎng)基及5Q^LHPV假病毒稀釋液)的293FT細胞(稱為陽性感染孔，每個96孔板設置6個孔)。(5)將各個樣品混合液及對照樣品分別加入預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中。37C培養(yǎng)72小時；(6)培養(yǎng)72小時后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入SOjiL固定液(含有1%甲醛，0.2%戊二醛的PBS溶液)，靜置4分鐘；4分鐘后吸去固定液，每孔中加入IOO^iLD-Hank，s溶液洗細胞三次，再將D-Hank，s溶液吸棄；在每個孔中加入50pL顯色液(含有2%0.2M亞鐵氛化鉀，2%0.2M鐵氰化鉀，0,1%2MMgCl2，3%40mg/mLx-gal的PBS溶液)，放置在37t;中顯色2小時；2小時后吸棄板中的顯色液終止顯色。(7)啟動斑點檢測儀器Elispot，將進行顯色反應后的細胞培養(yǎng)板放在取樣板上，檢測每個孔中的藍色細胞數(shù)即被感染細胞數(shù)。Elispot的詳細操作步驟見該儀器的操作說明書。C.結(jié)果分析具有中和能力的判定標準以能在上述疫苗效力試驗(EDs。測定)中能達到50%以上感染抑制率的血清樣品視為具有中和能力，該樣品所在孔可稱為陽性孔，反之稱為陰性孔。感染抑制率的計算方法樣品孔的感染抑制率-(1-樣品孔被感染細胞數(shù)/(陽性感染孔被感染細胞數(shù)總和/6-陰性孔顯色細胞數(shù)總和/3))x100%。EDs。的計算方法分別統(tǒng)計HPV疫苗供試品的不同免疫劑量組的陽性孔數(shù)和陰性孔數(shù)，然后利用Reed-Munch公式計算各個免疫劑量的中和抗體陽性比例。在本實施例中，我們應用上述方法對HPV16疫苗供試品進行了疫苗效力試驗(ED;。測定)，結(jié)果如表10所示。表10HPV16疫苗的EDs。測定劑量(pg)0wlw2w免疫后時間3w4w5w6w0.101111110.03300.940,940.930.930.930.930.01100.550.550.360.360.450.450.0040000011ED50—0.01000.01000.01500.01500.01200.0120本領(lǐng)域的技術(shù)人員應當明了，盡管為了舉例說明的目的本文描述了本發(fā)明的具體實施方案，但可以對其進行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實施方案和實施例不應當視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請中引用的所有文獻均完整地并入本文作為參考。3權(quán)利要求1、高通量檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞的方法，包括(1)使被HPV假病毒或病毒感染的細胞帶有適于斑點檢測儀器(或，斑點檢測法)檢測的信號，但未被感染的細胞不帶有該信號；和(2)通過使用斑點檢測儀器(或，通過以斑點檢測法)檢測該信號來檢測被HPV假病毒或病毒感染的細胞。2、權(quán)利要求1的方法，用于被HPV假病毒或病毒感染的細胞的計數(shù)。3、通過使樣品中可能存在的人乳頭瘤病毒中和抗體與人乳頭瘤病毒假病毒或病毒接觸以阻止人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染細胞(通常是培養(yǎng)細胞)，并檢測被人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染的細胞，來檢測樣品中的人乳頭瘤病毒中和抗體的方法，其特征在于采用權(quán)利要求1或2的方法來檢測被人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染的細胞。4、權(quán)利要求3所述方法，其中所述樣品為來自待檢個體的分離的生物學樣品，優(yōu)選所述樣品為血清；或來自組織培養(yǎng)的生物學樣品。5、權(quán)利要求3-4任一項所述方法，其中所述方法用于檢測樣品中人乳頭瘤病毒中和抗體的存在與否和/或其效價。6、權(quán)利要求1-5之任一項所述的方法，其中所述斑點檢測法中檢測數(shù)據(jù)是通過使用斑點檢測儀器獲得的，斑點檢測儀器能夠用于從細胞群體中分辨和測算產(chǎn)生特定信號(例如顏色)的細胞的數(shù)量，優(yōu)選Elispot。7、權(quán)利要求l-6之任一項所述的方法，其中使感染細胞產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號是通過如下方法獲得的報告基因表達元件在感染細胞中表達產(chǎn)生報告蛋白，該報告蛋白可直接產(chǎn)生或間接(例如通過顯色反應)產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號。8、權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的報告基因在感染細胞中的表達是通過人乳頭瘤病毒假病毒或病毒感染細胞實現(xiàn)的；報告基因表而導入細胞中表達，或者，也可通過人乳頭瘤病毒假病毒或病毒感染帶有報告基因表達元件的細胞后激活該報告基因表達元件表達，優(yōu)選帶有報告基因表達元件的人乳頭瘤病毒假病毒的方式。9、權(quán)利要求l-8之任一項所述的方法，其中所述的報告基因為其表達產(chǎn)物可以直接或間接導致產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號的基因，如P半乳糖苷酶基因等。10、權(quán)利要求1-9之任一項所述的方法，其包括以下步驟A)將細胞培養(yǎng)于固相培養(yǎng)載體(例如細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板等，優(yōu)選細胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選96孔細胞培養(yǎng)板)上，作為人乳頭瘤病毒或人乳頭瘤病毒假病毒感染的靶細胞；所述細胞為動物細胞，特別是哺乳動物細胞，也可是一種改造的細胞，其可在人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染后表達報告蛋白；B)根據(jù)所需要檢測的人乳頭瘤病毒中和抗體所屬的人乳頭瘤病毒型別，準備需要的人乳頭瘤病毒或人乳頭瘤病毒假病毒，例如帶有報告基因表達元件的人乳頭瘤病毒假病毒；其中，A)中所述的細胞在被B)中所述的人乳頭瘤病毒或者人乳頭瘤病毒假病毒感染后能夠表達報告蛋白，該報告蛋白能直接產(chǎn)生或間接(例如通過顯色反應)產(chǎn)生能夠被斑點檢測儀器檢測的信號；C)使待檢測樣品與步驟B)中所述的人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒接觸，使得樣品中的人乳頭瘤病毒中和抗體，如果存在的話，會與人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒結(jié)合，從而能夠阻止人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒對步驟A)中所述靶細胞的感染；該接觸在允許樣品中的中和抗體與人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒結(jié)合的條件下進行；D)使步驟C)的產(chǎn)物(檢測樣品與人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒的混合液)和步驟A)的產(chǎn)物(培養(yǎng)于固相培養(yǎng)載體的細胞)接觸，該接觸在允許細胞正常生長的條件下進行；E)應用斑點檢測儀器(如Elispot)，通過檢測帶有由報告蛋白直接或間接產(chǎn)生的信號的細胞，檢測被感染細胞的數(shù)量；F)根據(jù)步驟E)獲得的結(jié)果測算樣品中是否有人乳頭瘤病毒中和抗體和/或其效價。11、權(quán)利要求10的方法，其中步驟E)應用斑點檢測儀器(如Elispot)檢測被感染細胞的數(shù)量通過如下方法來進行細胞如被人乳頭瘤病毒或人乳頭瘤病毒假病毒感染后，細胞內(nèi)或通過人乳頭瘤病毒假病毒導入的報告基因表達產(chǎn)生報告蛋白，該報告蛋白可直接作為信號產(chǎn)生體產(chǎn)生信號，也可通過反應(如酶促反應等)使其它信號產(chǎn)生體產(chǎn)生信號；細胞是否被感染的判定標準是細胞是否具有由信號產(chǎn)生體產(chǎn)生的信號；檢測具有由信號產(chǎn)生體產(chǎn)生的信號的細胞的數(shù)量。12、權(quán)利要求9的方法，其中步驟A)中所述的"改造的細胞"為其在基因組中或者基因組外攜帶包含權(quán)利要求9中所述的報告基因編碼序列的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達控制序列可操作地連接，表達控制序列在人乳頭瘤病毒假病毒或人乳頭瘤病毒感染后可啟動報告基因的表達。13、權(quán)利要求11的方法，其中信號產(chǎn)生體產(chǎn)生的信號為顏色信號，可4吏細胞產(chǎn)生與正常細胞不同的顏色(如藍色)，該顏色信號可,皮斑點檢測儀器(如Elispot)所檢測。14、權(quán)利要求ll的方法，其中信號產(chǎn)生體是酶、化學發(fā)光物質(zhì)、同位素、或稀土元素。15、斑點檢測儀器或斑點檢測法或權(quán)利要求1-14任一項的方法在檢測人乳頭瘤病毒中和抗體中的用途、在篩選HPV中和性單克隆抗體中的用途、在檢測HPV中和抗體效價中的用途、在制備HPV中和抗體診斷試劑盒中的用途、在HPV疫苗開發(fā)和質(zhì)控中的用途、在篩選或制備抗HPV或其相關(guān)疾病藥物中的用途、或在治療HPV感染中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種高效、簡便的人乳頭瘤病毒中和抗體的檢測方法，該方法可適用于對人乳頭瘤病毒中和抗體的高通量檢測。本發(fā)明方法的特征在于用斑點檢測法來檢測被人乳頭瘤病毒或假病毒感染的細胞。本發(fā)明同時還公開了上述方法在篩選和鑒定中和性HPV單克隆抗體、評價人乳頭瘤病毒疫苗免疫保護性、人乳頭瘤病毒疫苗效力試驗(ED₅₀測定)等方面的用途。文檔編號G01N33/569GK101551392SQ20091000111公開日2009年10月7日申請日期2009年1月22日優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日發(fā)明者周國棟,夏寧邵,軍張,杜海蓮,通程,舟鄭申請人:廈門大學;養(yǎng)生堂有限公司