專利名稱：：一種人源中和性抗禽流感病毒h5n1基因工程抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及預(yù)防和治療用人源基因工程抗體的制備及應(yīng)用，尤其是特異性針對(duì)高致病性禽流感病毒H5N1，具有中和禽流感病毒感染功能的我國(guó)禽流感恢復(fù)期病人來(lái)源的中和性抗禽流感病毒基因工程抗體。
背景技術(shù)：
：高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病。高致病性禽流感病毒H5N1自1997年發(fā)生18人感染6人死亡疫情以來(lái)，一直受到國(guó)際社會(huì)的高度關(guān)注，特別是自2003年以來(lái)高致病禽流感病毒H5N1動(dòng)物疫情在亞洲已成地方性流行，并且已經(jīng)蔓延到歐洲和非洲。人感染病例以及發(fā)生人感染病例的國(guó)家和地區(qū)不斷擴(kuò)大，2003年底以來(lái)，截止2007年4月11日，全球新發(fā)人禽流感(H5N1)病例數(shù)已上升至291例，其中死亡172例。我國(guó)自2003年11月第一例禽流感病毒H5N1感染病例確診以來(lái)一共有24例，其中15例死亡。高致病性禽流感病毒H5N1突破了種屬屏障不僅對(duì)禽類帶來(lái)巨大威脅，嚴(yán)重影響國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，而且對(duì)人類健康也帶來(lái)巨大的威脅，會(huì)不會(huì)由H5N1禽流感病毒導(dǎo)致一次流感大流行已引起全球的高度關(guān)注。流感病毒是一種球形或桿狀、有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組分為8個(gè)節(jié)段。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA識(shí)別靶細(xì)胞表面受體并與受體相結(jié)合，具有與宿主細(xì)胞膜融合活性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。由于HA基因突變而引起的HA抗原變異往往會(huì)導(dǎo)致免疫失敗和變異毒株流行，流感病毒頻繁并且持續(xù)的發(fā)生抗原性變異，目前還沒(méi)有有效的人用禽流感疫苗，也沒(méi)有有效的治療藥物。作為一類新型特異性抗病毒感染的生物工程制劑，中和性抗體在抗感染治療及緊急被動(dòng)免疫預(yù)防方面一直扮演著重要的角色。因此，研制特異性針對(duì)H5N1禽流感病毒的中和性抗體尤其是針對(duì)不同H5N1分離株具有廣譜中和效應(yīng)的抗體以用于緊急預(yù)防和治療是十分必要和可行的。通過(guò)抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對(duì)單克隆抗體的研究有了突破性進(jìn)展并越來(lái)越顯示出其重要意義及實(shí)際運(yùn)用前景。80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫(kù)技術(shù)興起和整個(gè)基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當(dāng)今世界人源或基因工程抗體的丌發(fā)研究取得很大進(jìn)展并巳由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開(kāi)發(fā)階段。含有特異性抗體的人源或動(dòng)物血清免疫球蛋白用以預(yù)防和治療傳染病已歷史悠久。而人源基因工程抗體的發(fā)展，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來(lái)了新的希望和遠(yuǎn)大前景。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實(shí)驗(yàn)證明，如鼠抗甲肝病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性單克隆抗體可以在體內(nèi)100%保護(hù)動(dòng)物免受病毒攻擊，我們相信特異性中和抗體對(duì)高致病性禽流感病毒H5N1應(yīng)當(dāng)具有良好的預(yù)防和治療效應(yīng)。人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預(yù)防和治療帶來(lái)了新的希望，在抗病毒感染生物藥領(lǐng)域逐漸形成了一類新的抗病毒藥，即所謂的抗體藥(AntibodyDrug)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是通過(guò)基因工程手段和噬菌體表面表達(dá)技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，直接從人抗體基因庫(kù)中篩選出抗高致病性禽流感病毒H5N1的基因工程單克隆抗體，獲得其抗體基因，為將來(lái)可能的臨床抗病毒預(yù)防和治療提供可行性的特異性抗體藥物。本發(fā)明運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，從中國(guó)安徽某禽流感病人恢復(fù)期血中獲得淋巴細(xì)胞，通過(guò)基因工程手段構(gòu)建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗體文庫(kù)，并篩選獲得特異抗禽流感病毒基因工程抗體Fab段及其全抗體。本發(fā)明的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體包括1、兩株Fab抗體，分別命名為AVFluFabl和AVFluFab3。這兩株重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的，并在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合高致病性禽流感病毒H5N1的功能性抗體。它們特異性識(shí)別H5N1高致病性禽流感病毒顆?？乖揖槍?duì)禽流感病毒血凝素蛋白HA，與禽流感病毒H5N1具有明顯的免疫熒光反應(yīng)(IFA)和酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)，具有抗禽流感病毒H5N1感染的中和活性功能。AVFluFabl和AVFluFab3特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來(lái)源于對(duì)人源抗高致病性禽流感病毒H5N1抗體基因庫(kù)的特異性富積篩選，該抗體庫(kù)的建立來(lái)源于中國(guó)安徽H5N1禽流感恢復(fù)期病人血淋巴細(xì)胞基因。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列組合及其CDR區(qū)之間框架區(qū)序列組成了每個(gè)抗體可變區(qū)序列特征，AVFluFabl和AVFluFab3分別隸屬于抗體重鏈家族VH4和VH3，抗體輕鏈家族VL2和VL1。抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列及其互補(bǔ)所決定，6個(gè)相應(yīng)的CDR區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定本專利申請(qǐng)中每個(gè)抗體的抗原結(jié)合特征和抗高致病性禽流感病毒H5N1功能特征。決定每株中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸詳細(xì)序列及其比較結(jié)果如圖1所示，圖中"-"符號(hào)表示與第一行抗體序列相同的氮基酸，陰影部分為CDR區(qū)。AVFluFabl輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDN0.5所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDN0.6所示。AVFluFab3輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDN0.7所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDNO.8所示。根據(jù)本發(fā)明的抗高致病性禽流感病毒H5N1中和抗體AVFluFabl和AVFluFab3可變區(qū)中特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈基因的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗高致病性禽流感病毒中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。2、兩株全抗體，分別命名為AVFluIgGl和AVFluIgG3。將上述2株Fab抗體(AVFluFabl、AVFluFab3)的輕鏈和重Fd段基因，分別克隆入全抗體表達(dá)載體pAC-L-Fc并轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)Sffl細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了全抗體的分泌型表達(dá)，得到全抗體AVFluIgGl和AVFluIgG3。用ELISA、IFA、WesternBlot和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所獲人源單抗的功能特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明這是2株特異性針對(duì)H5N1禽流感病毒而與甲1型和甲3型人流感病毒無(wú)交叉反應(yīng)的人源單抗。2株抗體均針對(duì)H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA，其中AVFluIgGl可分別與變性的滅活病毒及重組HA反應(yīng)，而AVFluIgG3并不與之反應(yīng)。這提示AVFluIgGl所針對(duì)的HA的抗原決定簇為線性抗原決定簇，而AVFluIgG3所識(shí)別的抗原決定簇是構(gòu)象依賴型的。此外，這2株抗體對(duì)亞洲中國(guó)地區(qū)南方和北方的H5N1禽流感病毒人源分離株均具有較高并且廣泛的中和活性，其中AVFluIgG3的中和活性更高也更為廣譜，對(duì)于中國(guó)目前已分離的8株H5N1禽流感病毒人源分離株均具有中和活性，且針對(duì)其中某些地方分離株可在納克級(jí)水平中和病毒，對(duì)于為疫苗研制提供有效的候選表位具有重大意義。本發(fā)明在國(guó)際上首次獲得兩株具有中和活性的抗禽流感病毒H5Nl單克隆抗體Fab段，并在真核系統(tǒng)中表達(dá)了其全抗體，這一結(jié)果的獲得不僅為高致病性禽流感病毒H5N1的預(yù)防和治療帶來(lái)了希望，同時(shí)也為其疫苗研制提供了新的思路。利用上述獲得的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體可變區(qū)基因、Fab抗體基因以及上述每個(gè)抗體基因特征下的全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因的任何其他基因，獲得具有中和高致病性禽流感病毒H5N1感染的抗體產(chǎn)物，制成臨床上用于預(yù)防和治療由H5N1禽流感病毒引起的人禽流感的特異性抗體藥物，從而可在臨床上用于預(yù)防和治療由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感。基于上述工程抗體基因及其直接或間接的基因產(chǎn)物，可制成噴霧型抗體制劑和注射型抗體制劑用于人感染H5N1高致病性禽流感的預(yù)防和治療。圖1是本發(fā)明抗禽流感病毒H5N1人源Fab抗體可變區(qū)氨基酸序列比較圖。圖2是3輪富集后ELISA檢測(cè)得到的45株人源Fab抗體的表達(dá)情況圖。圖3A是用ELISA檢測(cè)表達(dá)的45株人Fab抗體對(duì)禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)的特異性結(jié)合情況圖3B是用ELISA檢測(cè)表達(dá)的45株人Fab抗體對(duì)重組HA(A/Vietnam/1203/2004)的特異性結(jié)合情況圖。圖4是抗禽流感病毒H5Nl人源Fab單抗與禽流感病毒及重組HA的免疫熒光反應(yīng)結(jié)果，其中A、B、C、D分別為陽(yáng)性血清、陰性抗體、AVFluFabl、AVFluFab3與重組HA(A/Anhui/l/2005)反應(yīng)結(jié)果；E、F、G、H分別為陽(yáng)性血清、陰性抗體、AVFluFabl、AVFluFab3與禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)反應(yīng)結(jié)果。圖5是純化后IgG的SDS-PAGE電泳圖。圖6A是ELISA檢測(cè)純化人源IgG抗體對(duì)純化禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)的特異性結(jié)合情況圖6B是ELISA檢測(cè)純化人源IgG抗體對(duì)重組HA(A/Vietnam/1203/2004)的特異性結(jié)合情況圖。圖7是用Westernblot分析抗禽流感病毒H5N1人源IgG單克隆抗體特異性的結(jié)果，其中A，與純化病毒(A/Anhui/l/2005)反應(yīng)；B，與重組桿狀病毒表達(dá)HA(A/Anhui/1/2005)反應(yīng)。圖8是用流式細(xì)胞間接熒光分類法(FACS)分析人源IgG抗體對(duì)禽流感抗原特異性結(jié)合情況圖，其中A、B、C、D分別為陽(yáng)性血清、陰性抗體、AVFluIgGl、AVFluIgG3與表達(dá)重組HA(A/Anhui/l/2005)的Sf9細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果。圖9A是微量中和試驗(yàn)檢測(cè)純化的AVFluIgGl抗體對(duì)中國(guó)H5Nl禽流感病毒人源分離株6的中和活性結(jié)果；圖犯是微量中和試驗(yàn)檢測(cè)純化的AVFluIgG3抗體對(duì)中國(guó)H5Nl禽流感病毒人源分離株的中和活性結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下的優(yōu)先實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，從中國(guó)安徽某禽流感病人恢復(fù)期血中獲得淋巴細(xì)胞，通過(guò)基因工程手段，構(gòu)建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗體文庫(kù)。用純化滅活的人源H5N1安徽分離株(A/Anhui/l/2005)對(duì)Fab噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，并在￡.co/z'中進(jìn)行分泌表達(dá)。通過(guò)ELISA、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定Fab抗體對(duì)H5N1禽流感病毒特異性結(jié)合的功能活性，并進(jìn)行序列測(cè)定。然后將陽(yáng)性克隆的輕鏈和重鏈Fd段基因，分別克隆入全抗體表達(dá)載體pAC-L-Fc轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)S細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)。用ELISA、IFA、WesternBlot和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所獲人源單抗的功能特性進(jìn)行鑒定。材料與方法1.病毒、細(xì)胞、載體和抗原制備人源H5N1分離株A/Anhui/1/2005、A/Guangxi/1/2005、A/Hunan/1/2006、A/Zhejiang/1/2006、A/Sichuan/1/2006、A/Fujian/1/2005、A/Guangdong/1/2006、A/xinjiang/1/2006由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控中所流感室提供。菌株為XLI-Blu(美國(guó)Stratagene);噬菌體表達(dá)載體為pComb3(40kb)，由美國(guó)Scripps研究所饋贈(zèng)；所用噬菌體為VCSM13(美國(guó)Invitrogene公司)。桿狀病毒表達(dá)載體為pAC-L-Fc(德國(guó)PROGENPR3003)(Liang,M.F.,Stefan,D.,Li，D.X.,Queitsch,L，UW.,andBautz,E.F.BaculovirusexpressioncassettevectorsforrapidproductionofcompletehumanIgGfromphagedisplayselectedantibodyfragments.JournalofImmunologicalMethods.247:119-130.)，昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9及MDCK細(xì)胞來(lái)自美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)中心(ATCC)。其中篩庫(kù)抗原為A/Anhui/1/2005(H5N1)感染MDCK細(xì)胞，經(jīng)甲醛滅活和安全檢査后密度梯度超速離心純化病毒顆粒。純化的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)購(gòu)自美國(guó)蛋白科學(xué)公司(ProteinSciencesCorp.)。真核表達(dá)的重組禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)由本研究室構(gòu)建并表達(dá)PCR擴(kuò)增禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)基因序列，將其克隆入桿狀病毒表達(dá)載體pAcUW51(美國(guó)BDPharmingen),通過(guò)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞制備重組桿狀病毒進(jìn)行蛋白表達(dá)。2.噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建用淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma)從安徽疫區(qū)禽流感病人恢復(fù)期抗凝血中分離淋巴細(xì)胞，用RNeasyMiniKit(德國(guó)QIAGEN)提取總細(xì)胞RNA，用Oligo-dT引物將提取的RNA采用Invitrogen公司的第一鏈合成試劑盒(SuperScriptTMlIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR.CatNo.18080-05l)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用一組擴(kuò)增人源抗體IgGl重鏈Fd及輕鏈Kappa和Lambda的引物對(duì)人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94°Cl分鐘，54°Cl分鐘，72'C2分鐘，35個(gè)循環(huán)。上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，經(jīng)過(guò)DNA純化試劑盒QIAquickTMkit(德國(guó)QIAGEN公司)純化后，獲得650—700bp左右的Kappa、Lambda和Fd鏈PCR產(chǎn)物。建庫(kù)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)Barbas,C.FIII.,Kang,A.S.，andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991;88(18):7978-7982。將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產(chǎn)物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用SacI/Xbal和XhoI/Spel克隆入噬菌體載體pComb3，將克隆入輕、重鏈基因的pComb3載體DNA連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用10pl蒸溜水懸起，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入事先制備好的200pl電轉(zhuǎn)菌XLI-Blu(電轉(zhuǎn)條件為Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2.5K伏)，電轉(zhuǎn)后加10mlSOC培養(yǎng)液，37°C1小時(shí)，力卩入10ml帶有氨節(jié)青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)液37。C培養(yǎng)1小時(shí)，加入80-100ml前述SB，37°C2小時(shí)后加入輔助噬菌體VCSM131X1012，l小時(shí)后加入卡那霉素(70pg/ml)，37。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。用4%PEG8000和3XNaCl沉淀噬菌體上清，經(jīng)9000rpm，20分鐘，4。C離心后，用2ml0.02MPBSpH7.4重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫(kù)，分裝保存于-20。C冰柜中。3.用于抗體庫(kù)富集篩選的H5N1禽流感病毒抗原的制備在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中操作，使用m級(jí)生物安全防護(hù)。擴(kuò)增毒株為A/Anhui/1/2005(H5N1)，將病毒原液作梯度稀釋為10"，l(T2，l(T3，104待用。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞(細(xì)胞貼壁達(dá)80%)倒出細(xì)胞生長(zhǎng)液，用Hank氏液清洗細(xì)胞2-3遍。分別將不同稀釋度的病毒稀釋液lml感染MDCK細(xì)胞，35'C吸附lh，吸附完成后，用Hank氏液清洗細(xì)胞2-3遍，在培養(yǎng)瓶中加入維持液，至35t:培養(yǎng)。待感染細(xì)胞有70%-80%出現(xiàn)病變進(jìn)行收獲，收獲之前將細(xì)胞凍融l-2次，收獲上清，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)測(cè)定血凝滴度。經(jīng)甲醛滅活后，感染MDCK細(xì)胞，盲傳三代確定已完全滅活，進(jìn)行蔗糖墊層超速離心純化。4.噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選篩選抗原為超速離心純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)和純化的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)，使用時(shí)用0.1MNaHC03(PH8.6)的溶液稀釋，包被96孔酶標(biāo)板。富集篩選方法基本按文獻(xiàn)進(jìn)行(Barbas，C.Fill.,Kang:A.S.，andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982)，具體如下用0.1MNaHCO3(pH8.6)的溶液包被純化的H5N1禽流感病毒抗原(1:200稀釋)，每孔10(V1，4'C過(guò)夜；次日用1XPBST洗去未吸附的抗原，用4W的脫脂奶37。C封閉1小時(shí)，棄封閉液；每孔加入80pl噬菌體抗體庫(kù)，37。C孵育2小時(shí)，棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用1XTBST(50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.5%Tween20，pH7.5)洗液沖洗各孔，沖洗時(shí)，用帶有吸頭的移液器反復(fù)吹打，共洗10—20遍，以充分洗去未吸附的噬菌體；最后用ddH20洗兩遍，吸凈孔中的液體；每孔加入50pl0^—11(:1&112.2)的洗脫液，室溫孵育IO分鐘，期間反復(fù)吹打數(shù)次。加入適量的2MTris，以中和洗脫下來(lái)的噬菌體；將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮制備的XLI-Blu菌液中(OD6。o=l)，室溫孵育15—20分鐘；然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨芐青霉素20pg/ml，四環(huán)素10pg/ml)，立即取IO|ul涂氨芐青霉素平皿，以滴定噬菌體；三角瓶與37t振蕩培養(yǎng)l小時(shí)，加入IOOmlSB(氨芐青霉素100ng/ml)，37°Cl小時(shí)后，加入輔助噬菌體VCSM13lml，37'C振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，加入卡那霉素(終濃度70jag/inl)，37'C培養(yǎng)過(guò)夜。如此反復(fù)篩選4次。5.Fab段抗體的誘導(dǎo)表達(dá)人源中和性抗禽流感病毒H5Nl基因工程Fab抗體可溶性表達(dá)產(chǎn)物的制備基本按文獻(xiàn)進(jìn)行(Barbas,C.Fill,Kang,A.S.，andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982),具體為將帶有陽(yáng)性抗體輕重鏈基因插入的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA,用SpeI和NheI切除載體中的gIII，變FdgIII融合蛋白為獨(dú)立表達(dá)的蛋白，連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blu菌，從過(guò)夜生長(zhǎng)的氨芐平皿中挑取單個(gè)菌落，接種SB或TB細(xì)菌培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)至OD6oc-0.2一0.3，加入lmMIPTG，在3(TC誘導(dǎo)表達(dá)10—12小時(shí)。收獲細(xì)菌，離心后加入原培養(yǎng)液1/10體積的PBS(0.02MpH7.4)重懸，反復(fù)凍融三次，4°C12000rpm離心30分鐘，上清即為表達(dá)的Fab抗體。備用于進(jìn)一步的檢測(cè)和鑒定。陰性對(duì)照為載體pComb3轉(zhuǎn)化菌按同樣方法制備的細(xì)菌裂解液。6.人源抗H5Nl禽流感病毒Fab抗體的ELISA檢測(cè)4.1Fab表達(dá)的檢測(cè)用0.1MNaHCOs(pH9.6)的溶液包被抗人Fab抗體(美國(guó)Sigma，1:2000稀釋使用)，4。C過(guò)夜；4%脫脂奶封閉，37°Clh，加入表達(dá)的Fab抗體，37。Clh;加入酶標(biāo)抗人Fab二抗(美國(guó)Sigma,1:2000稀釋使用)，37°Clh;顯色液顯色，2MH2S04終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A值。4.2間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Fab與H5Nl禽流感病毒及重組HA結(jié)合活性用純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)和重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)作為包被抗原，隨后的步驟同上。7.間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)H5N1禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)感染MDCK細(xì)胞，35。C培養(yǎng)約48小時(shí)，收獲細(xì)胞，滴加至玻璃底片上，吹干，丙酮固定15min并干燥，制成病毒抗原片。同時(shí)利用己構(gòu)建的表達(dá)禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，4-5天后收獲感染細(xì)胞制成重組HA抗原片。加入表達(dá)的Fab，37。C溫育30min，沖洗，加入FITC標(biāo)記的抗Fab抗體(美國(guó)Sigma)，37'C溫育30min,沖洗，晾干，顯微鏡下觀察。8.Westernblot檢測(cè)抗原分別為純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/05)、真核表達(dá)的重組禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)。陽(yáng)性對(duì)照為禽流感病人恢復(fù)期血清，陰性對(duì)照為針對(duì)甲肝病毒人源單抗HAVIgG16。抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜。轉(zhuǎn)膜后對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮蘭染色以檢査蛋白質(zhì)是否轉(zhuǎn)移完全。將分子量標(biāo)準(zhǔn)的泳道剪下，標(biāo)出分子量標(biāo)準(zhǔn)的參照蛋白位置。對(duì)NC膜進(jìn)行封閉，5%脫脂奶室溫封閉2小時(shí)。一抗AVFluFabl、AVFluFab3及H34表達(dá)產(chǎn)物原液與抗原反應(yīng)，陽(yáng)性血清用封閉液1:10稀釋與抗原反應(yīng)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。lxPBST洗滌3次后與HPR標(biāo)記的抗人Fab(Sigma公司，l:500使用)室溫反應(yīng)l小時(shí)。lxTBST洗滌3次后放入DAB底物顯液色中，至棕色陽(yáng)性條帶出現(xiàn)適時(shí)終止反應(yīng)，避光保存。9.流式細(xì)胞術(shù)分析抗原抗體結(jié)合特異性(flowcytometry,FCM)采用間接熒光分類的方法(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)(TaraHeitner，AnneMoor,"a/.Selectionofcellbindingandinternalizingepidermalgrowthfactorreceptorantibodiesfromaphagelibrary.JournalofImmunologicalsMethods.2001;248:17-30.)，禾U用表達(dá)禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)重組桿狀病毒感染sf9細(xì)胞，4-5天后收獲感染細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)定每個(gè)反應(yīng)體系約為2><105個(gè)細(xì)胞/50^11，加入待測(cè)抗體50pl，冰上作用lh，用250^含0.25%BSA的PBS洗2次，加入IOOpl抗FITC標(biāo)記的抗Fab抗體l:100稀釋(美國(guó)Sigma)，閉光冰上作用30min，PBS洗2次，將細(xì)胞重懸于P/。多聚甲醛-PBS中，待測(cè)。10.人源Fab抗體可變區(qū)基因的核酸序列分析用QiagenMiniprepKit(德國(guó)QIAGEN)制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸序列分析。輕重鏈的測(cè)序弓I物分別為5'-AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3，和5，-CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3，。測(cè)序結(jié)果和InternetV-Base基因庫(kù)中IgG基因序列比較。11.全抗體重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將獲得的Fab抗體的輕鏈先用Xbal/Sacl酶切，用末端補(bǔ)平酶(K片段)補(bǔ)平，克隆入pAC-L-Fc載體(德國(guó)PROGENPR3003)，再將重鏈Fd段利用XhoI/Spel位點(diǎn)克隆進(jìn)去，構(gòu)建成全抗體表達(dá)載體。12.轉(zhuǎn)染和擴(kuò)毒采用美國(guó)Pharmogen公司的BaculoGold共轉(zhuǎn)染試劑盒。操作方法略述如下將5iag的重組質(zhì)粒DNA與0.5iag的BaculoGold線性DNA混合混合后，利用試劑盒中的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)密度為50X的Sf9細(xì)胞，27'C培養(yǎng)4天后，收集上清作為重組病毒的毒種進(jìn)行滴定禾卩擴(kuò)增。具體操作見(jiàn)Baculovirusexpressionvectorsystem手冊(cè)。13.全抗體IgG分泌表達(dá)和純化重組病毒感染生長(zhǎng)密度70%左右的Sf9細(xì)胞，27。C吸附lh.改用SF-900IISFM無(wú)血清培養(yǎng)液，27'C培養(yǎng)35天后收集上清。采用Amersham公司的Protein-A親和層析柱直接純化表達(dá)上清(HarlowE，LaneD."Antibodies:ALaboratoryManual".ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1988.)。用ELISA、IFA、WesternBlot和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所獲對(duì)純化的IgG抗體功能特性進(jìn)行鑒定。具體操作如上。14.人源抗禽流感病毒H5N1抗體微量中和功能測(cè)定將人源抗禽流感病毒IgG純化抗體及陰陽(yáng)性對(duì)照血清過(guò)濾除菌作系列稀釋后，與100TCID50的H5N1禽流感病毒50^d以1:1混合，放37。C溫箱作用2小時(shí)。選擇8孔進(jìn)行病毒回滴，將病毒作系列倍比稀釋，使之成為100TCID50，50TCID50，...0.7。設(shè)立4個(gè)重復(fù)孔為陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照，即將MDCK細(xì)胞與100TCID50病毒進(jìn)行混合培養(yǎng)；設(shè)立4個(gè)重復(fù)孔為陰性細(xì)胞對(duì)照，即將細(xì)胞與稀釋緩沖液混合培養(yǎng)。力tn00pl細(xì)胞液(1.5xl04)于含有病毒-抗體(血清對(duì)照)混合物以及倍比稀釋病毒回滴工作液的微量板中，37'C溫箱孵育18-22小時(shí)。棄去微量培養(yǎng)板中的細(xì)胞液，PBS洗細(xì)胞一次，加入IOOpl/孔固定液，于室溫固定細(xì)胞IO分鐘，棄固定液，室溫干燥。ELISA檢測(cè)中和抗體滴度PBS洗去殘留丙酮，加入一抗(抗流感病毒和蛋白-NP單克隆抗體)室溫作用l小時(shí)，PBS洗漆培養(yǎng)板4次，加入稀釋好二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG)室溫作用l小時(shí)，洗板6次，每孔加入OPD底物IOOpi(10mgOPD+20ml檸檬酸緩沖液+l(Hill30n/。雙氧水，即用即配)。室溫10分鐘顯色，1M硫酸終止，記錄490nm每孔OD。結(jié)果判定(細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照平均OD值一細(xì)胞陰性對(duì)照平均OD值)/2+細(xì)胞陰性對(duì)照平均OD值二XX二細(xì)胞半數(shù)感染域值，每孑LOD值低于X值時(shí)，判定中和試驗(yàn)反應(yīng)陽(yáng)性，中和反應(yīng)陽(yáng)性的抗體最高稀釋度即為中和抗體滴度。結(jié)果1.人源抗禽流感病毒H5N1抗體庫(kù)的篩選用超速離心純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)和純化的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)3輪篩選后隨機(jī)挑取192個(gè)克隆。用抗人Fab抗體(sigma公司，l:2000稀釋使用)、滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)抗原和重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)包被96孔板，加入待測(cè)樣品上清，用酶標(biāo)抗人Fab二抗(sigma公司，l:2000稀釋使用)檢測(cè)。結(jié)果顯示共獲得45株人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆，如圖2所示。45株人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆中，有42個(gè)克隆對(duì)H5N1禽流感病毒特異性結(jié)合，如圖3A所示。用禽流感病毒(A/Ahui/1/2005)純化抗原包被(圖3A)和重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)抗原包被(圖3B)對(duì)收獲的45個(gè)Fab抗體陽(yáng)性克隆表達(dá)上清中抗H5Nl禽流感病毒特異性抗體的ELISA檢測(cè)，其中18株Fab克隆被確定為抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)抗體。122.人源抗禽流感病毒H5N1Fab抗體對(duì)禽流感抗原的特異性結(jié)合為了證實(shí)所獲得的重組Fab抗體是特異性的針對(duì)禽流感病毒H5Nl，本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、WesternBlot鑒定原核表達(dá)Fab抗體的功能活性。H5N1禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)感染MDCK細(xì)胞后制成病毒抗原片，同時(shí)利用已構(gòu)建的表達(dá)禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，4-5天后收獲感染細(xì)胞制成重組HA抗原片待檢。'結(jié)果與上述ELISA結(jié)果完全相符，42個(gè)克隆與禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)免疫熒光均為反應(yīng)陽(yáng)性，其中18株被ELISA確定與重組HA(A/Vietnam/1203/2004)反應(yīng)的抗體與重組HA(A/Anhui/1/2005)免疫熒光均為陽(yáng)性反應(yīng)；其余24株并不針對(duì)重組HA(A/Vietnam/1203/2004)的Fab克隆與重組HA(A/Anhui/1/2005)免疫熒光均為陽(yáng)性反應(yīng)。免疫熒光結(jié)果證明從抗體庫(kù)篩選獲得的陽(yáng)性克隆均針對(duì)禽流感病毒血凝素蛋白HA，如圖4所示，其中A、B、C、D分別為陽(yáng)性血清、陰性抗體、AVFluFabl、AVFluFab3與重組HA(A/Anhui/1/05)反應(yīng)；E、F、G、H分別為陽(yáng)性血清、陰性抗體、AVFluFabl、AVFIuFab3與禽流感病毒(A/Anhui/1/05)反應(yīng)。3.人源抗禽流感病毒H5N1Fab抗體的序列分析用DNASTAR序列分析軟件進(jìn)行分析處理，比較IntemetV-Base基因庫(kù)中的IgG序列，上述42株人源抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程抗體中，18株與禽流感病毒重組HA(A/Vietnam/1203/2004)及重組HA(A/Anhui/1/2005)均反應(yīng)的Fab克隆為同一抗體序列；其余24株與重組HA(A/Anhui/1/2005)反應(yīng)的Fab克隆為同一抗體序列，因此共發(fā)現(xiàn)2株帶有不同的抗體輕重鏈可變區(qū)序列及其組合的抗體，其重鏈可變區(qū)主要分類在IgGVH4和VH3家族，其輕鏈可變區(qū)主要分類在IgGVL2和VL1家族。圖1為2株人源抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程抗體的可變區(qū)基因的氨基酸序列及其相互比較，圖中以第一行抗體序列為比較的標(biāo)準(zhǔn)序列，"-"符號(hào)表示與第一行抗體序列相同的氨基酸，陰影部分為CDR區(qū)。具體的，人源抗禽流感病毒H5N1Fab抗體AVFluFabl的重鏈可變區(qū)氨基酸序列見(jiàn)SEQIDNO.l，相應(yīng)的核苷酸序列見(jiàn)SEQIDN0.6;其輕鏈可變區(qū)氨基序列見(jiàn)SEQIDN0.2，相應(yīng)的核苷酸序列見(jiàn)SEQIDN0.5。AVFluFab3的重鏈可變區(qū)氨基酸序列見(jiàn)SEQIDN0.3，相應(yīng)的核苷酸序列見(jiàn)SEQIDN0.8;其輕鏈可變區(qū)氨基序列見(jiàn)SEQIDN0.4,相應(yīng)的核苷酸序列見(jiàn)SEQIDN0.7。4.全抗體IgG表達(dá)和純化將2株已完成功能鑒定Fab抗體(AVFluFabl、AVFluFab3)的輕鏈和重Fd段基因，分別克隆入全抗體表達(dá)載體pAC-L-Fc轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)。采用Amersham公司的Protein-A親和層析柱直接純化表達(dá)上清，通過(guò)SDS-PAGE檢驗(yàn)全抗體IgG的表達(dá)及純化情況，結(jié)果證實(shí)得到較純蛋白，可清晰觀察到解鏈后的抗體輕、重鏈，分別位于約28KD、55KD處，如圖5所示。5.人源抗禽流感病毒H5N1IgG抗體針對(duì)禽流感抗原的特異性結(jié)合為了證實(shí)所獲得的重組IgG抗體(AVFluIgGl、AVFluIgG3)是特異性的針對(duì)禽流感病毒H5N1，本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)ELISA、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、WesternBlot和流式細(xì)胞術(shù)鑒定全抗體IgG的功能活性。ELISA結(jié)果與驗(yàn)證Fab抗體功能活性相一致，純化的全抗體AVFluIgGl與禽流感病毒(A/Anhui/l/2005)及重組HA(A/Vietnam/1203/2004)均反應(yīng)，而AVFluIgG3可識(shí)別禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)，但與重組HA(A/Vietnam/1203/2004)不反應(yīng)，如圖6所示。間接免疫熒光試驗(yàn)顯示獲得的2株重組IgG抗體(AVFluIgGl、AVFluIgG3)均識(shí)別禽流感病毒重組HA(A/Anhui/1/2005)。WesternBlotting結(jié)果表明AVFluIgGl可分別與變性的滅活病毒及重組HA(A/Anhui/1/2005)反應(yīng)，而AVFluIgG3并不與之反應(yīng)。這提示AVFluIgGl所針對(duì)的HA的抗原決定簇為線性抗原決定簇，而AVIgG3所識(shí)別的抗原決定簇為構(gòu)象依賴型。如圖7所示。本發(fā)明釆用流式細(xì)胞間接熒光分類法(FACS)分析人源IgG抗體對(duì)禽流感抗原特異性結(jié)合，分別用陽(yáng)性血清、陰性抗體、AVFluIgGl、AVFluIgG3與表達(dá)重組HA(A/Anhui/l/2005)的Sf9細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果表明重組IgG抗體(AVFluIgGl、AVFMgG3)均可特異性識(shí)別表達(dá)重組HA(A/Anhui/l/2005)的Sf9細(xì)胞。如圖8所示。6.人源抗禽流感病毒H5N1抗體微量中和功能測(cè)定微量中和試驗(yàn)表明這2株重組IgG抗體(AVFluIgGl、AVFluIgG3)對(duì)亞洲中國(guó)地區(qū)南方和北方的H5N1禽流感病毒人源分離株均具有較高并且廣泛的中和活性，其中AVFluIgG3的中和活性更高也更為廣譜，對(duì)于中國(guó)目前已分離的8株H5N1禽流感病毒人源分離株均具有中和活性，且針對(duì)其中某些地方分離株可在納克級(jí)水平中和病毒，對(duì)于為疫苗研制提供有效的候選表位具有重大意義。試驗(yàn)結(jié)果如圖9及表1所示。表l.純化IgG抗體的微量中和試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>序列表(SEQUENCELISTING)<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所<120>—種人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體<130>JSP090056<160>8<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>112<212>PRT<213>Homosapiens<400>1LeuGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGluThrLeuSerLeu151015ThrCysThrValSerGlyGlySerlieAsnGlyTyrTyrTrpSerTrp202530lieArgGinProProGlyLysGlyLeuGluT卬lieGlyTyrLeuPhe354045AspSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuThrSerArgValThr505560lieSerValAspThrSerLysAsnGinPheSerLeuLysLeuSerSer65707580ValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgArgPheTrp859095GlyLeuAspGlyPheAsplieTrpGlyGinGlyThrThrValThrVal100105110<210>2<211>107<212>PRT<213>Homosapiens<400>2GluLeuGinProAlaSerValSerGlySerProGlyGinSerlieThr151015lieSerCysThrGlyThrSerSerAspValGlyAspTyrAsnTyrVal202530SerTrpTyrGinGinHisProGlyLysAlaProThrLeuMetlieTyr354045AspValAsnLysArgProSerGlyAspSerAsnArgPheSerGlySer505560LysSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrlieSerGlyLeuGinAlaGlu65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysSerSerTyrThrSerSerSerThrTrp859095ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210>3<211>122<212>PRT<213>Homosapiens<400>3LeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGlySerLeuArgVal151015SerCysThrAsnSerGlyPheThrPheSerAspTyrAlaMetSerTrp202530ValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerAlalieSer354045GlyAsnGlyGlySerSerThrTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArg505560PheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrMetTyrLeuGinMet65707580AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysValArgAsp859095AspSerTyrAspGlyGlyGlyGinTyrGlyLeuHisAsnTrpPheAsp100105110SerTrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal115120<210>4<211>107<212>PRT<213>Homosapiens<400>4GluLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGinArgVal151015ThrHeSerCysThrGlySerSerSerAsnlieGlyAlaGlyTyrAsp202530ValHisTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeulie354045TyrGlyAsnSerAsnArgProSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGinAla65707580GluAspGluAlaAspTyrTyrCysGinSerTyrAspSerSerLeuVal859095ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><400>7gagctcacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgc60actgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcagcttcca120ggaacagcccccaaactcctcatctatggtaacagcaatcggccctcaggggtccctgac180cgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggct240gaggatgaggctgattattactgccagtcctatgacagcagccttgtggtattcggcgga300gggaccaagctgaccgtccta321<210>8<211>366<212>DNA<213>Homosapiens<400>8ctcgagtctgggggaggcttggtacaacctggggggtccctgagagtctcctgtacaaac60tctggattcacctttagcgactatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaagggg120ctggagtgggtctcagctattagtggtaatggtggtagtagcacatactacgcagactcc180gtgaaggggcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgatgtatctgcaaatg240aacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgtgagagatgactcctatgat300ggcggtggtcagtacggtctgcacaactggttcgactcctggggccagggaaccctagtc360accgtc36權(quán)利要求1.一種人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體，隸屬于抗體重鏈家族VH3和抗體輕鏈家族VL1，其重鏈可變區(qū)中的三個(gè)高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為DYAMS、AISGNGGSSTYYADSVKG和DDSYDGGGQYGLHNWFDS，其輕鏈可變區(qū)中的三個(gè)高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為TGSSSNIGAGYDVH、GNSNRPS和QSYDSSLVVF。2.如權(quán)利要求1所述的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體，其特征在于，該抗體為Fab抗體或全抗體IgG，其重鏈可變區(qū)具有SEQIDN0.3的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)具有SEQIDN0.4的氨基酸序列。3.—種人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體的基因，編碼權(quán)利要求l或2所述的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體。4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDN0.7的核苷酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQIDN0.8的核苷酸序列。5.權(quán)利要求1或2所述的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體在制備預(yù)防和治療由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感的藥物中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求3所述的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體的基因在制備預(yù)防和治療由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感的藥物中的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體的基因的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO.7的核苷酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQIDN0.8的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體，來(lái)源于中國(guó)高致病性禽流感H5N1恢復(fù)期病人抗體基因文庫(kù)，其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的，并在原核和真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白HA的中和性功能抗體。利用此抗體CDR區(qū)或部分或全基因，可在原核、酵母、昆蟲(chóng)和真核細(xì)胞及任何表達(dá)系統(tǒng)中改造和生產(chǎn)不同形式的基因工程抗體，可在臨床上預(yù)防或治療H5N1禽流感病毒相關(guān)疾病。文檔編號(hào)A61P31/00GK101538328SQ20091013580公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2007年6月15日優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日發(fā)明者劉琴芝,孫麗娜,張全福,川李,李德新,梁米芳,舒躍龍申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所