專利名稱：：人源抗h5n1血凝素蛋白廣譜中和性抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程抗體技術(shù)，具體涉及一種人源抗H5N1血凝素蛋白廣譜中和性抗體，本發(fā)明還涉及該抗體在制備預(yù)防或治療禽流感藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病。高致病性禽流感病毒H5N1自1997年發(fā)生18人感染6人死亡疫情以來，一直受到國際社會(huì)的高度關(guān)注，特別是自2003年以來高致病禽流感病毒H5N1動(dòng)物疫情在亞洲已成地方性流行，并且已經(jīng)蔓延到歐洲和非洲，人感染病例以及發(fā)生人感染病例的國家和地區(qū)不斷擴(kuò)大。高致病性禽流感病毒H5N1突破了種屬屏障不僅對(duì)禽類帶來巨大威脅，嚴(yán)重影響國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，而且對(duì)人類健康也帶來巨大的威脅，會(huì)不會(huì)由H5N1禽流感病毒導(dǎo)致一次流感大流行已引起全球的高度關(guān)注。流感病毒是一種球形或桿狀、有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組分為8個(gè)節(jié)段。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA識(shí)別靶細(xì)胞表面受體并與受體相結(jié)合，具有與宿主細(xì)胞膜融合活性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。由于HA基因突變而引起的HA抗原變異往往會(huì)導(dǎo)致免疫失敗和變異毒株流行，流感病毒頻繁并且持續(xù)的發(fā)生抗原性變異，目前缺乏有效的人用禽流感疫苗及治療藥物。作為一類新型特異性抗病毒感染的生物工程制劑，中和性抗體在抗感染治療及緊急被動(dòng)免疫預(yù)防方面一直扮演著重要的角色。因此，研制特異性針對(duì)H5N1禽流感病毒的中和性抗體尤其是針對(duì)不同H5N1分離株具有廣譜中和效應(yīng)的抗體以用于緊急預(yù)防和治療是十分必要和可行的。含有特異性抗體的人源或動(dòng)物血清免疫球蛋白用以預(yù)防和治療傳染病已歷史悠久。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實(shí)驗(yàn)證明，如鼠抗甲肝病毒、漢坦病毒、麻瘆病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性單克隆抗體可以在體內(nèi)00%保護(hù)動(dòng)物免受病毒攻擊。已有研究表明通過局部注射人免疫球蛋白，F(xiàn)ab或F(ab，)2等形式單抗進(jìn)行被動(dòng)免疫獲得較好的預(yù)防與治療甲型人流感的效果(RamisseF,etal.ClinExpImmunol.1998,111(3):583-587;OkunoY,etal.JVirol.1994,68(1):517-520;MozdzanowskaK,etal.JVirol.2003,77(15):8322-8328.);關(guān)于H5亞型的抗體應(yīng)用研究表明，抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白中和性抗體對(duì)小鼠有良好保護(hù)和治療效果(SimmonsPC,etal.PlosMed.2007,4(5):0928-0936;HansonBJ,etal.RespirRes.2006,7:126-127.);在1918西班牙流感治療中，已有用病人恢復(fù)期血清治療獲得良好效果的報(bào)道(LukeTC,etal.AnnInternMed.2006,145:599—609)，介于血制品容易污染，且來源非常有限，使用人源基因工程產(chǎn)品替代血制品則可克服這些缺陷，而人源基因工程抗體研究的不斷深入，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來了新的希望和廣闊前景。通過抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對(duì)單克隆抗體的研究有了突破性進(jìn)展并越來越顯示出其重要意義及實(shí)際運(yùn)用前景。80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫技術(shù)興起和整個(gè)基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當(dāng)今世界人源或基因工程抗體的開發(fā)研究取得很大進(jìn)展并已由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開發(fā)階段。人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預(yù)防和治療帶來了新的希望，在抗病毒感染生物藥領(lǐng)域逐漸形成了一類新的抗病毒藥，即所謂的抗體藥(AntibodyDrug)。以抗原免疫動(dòng)物獲得多抗血清的途徑一直是獲得抗體的經(jīng)典方法，但缺乏特異性和均一性。繼而建立的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)使得眾多科學(xué)家通過細(xì)胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體(monoclonalantibody,McAb),其特異性強(qiáng)，性質(zhì)均一，易于大量生產(chǎn)。然而McAb多為鼠源性，鼠源McAb的異源性反應(yīng)極大地限制了McAb作為治療制劑在人體的應(yīng)用。免疫球蛋白(Vacciniaimmuneglobulin,VIG)作為抗體成分主要來自捐獻(xiàn)者(恢復(fù)期病人)免疫血清，從獲得陽性血清到通過安全性檢測(cè)均需花費(fèi)大量的人力和財(cái)力，這就使其大量制備受到限制，同時(shí)由于來源于血清所以容易發(fā)生血源性傳播疾病的感染。如同當(dāng)初血源性疫苗向基因工程疫苗的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)在也急需用基因工程抗體替代血源性VIG,如通過嵌合抗體技術(shù)(Boulianne,G丄.etal.,1984;Morrison,S丄.etal.,1984)、人源化抗體技術(shù)(Jones,P.T.etal.,1986)、攜帶人單抗的轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)(Green,L丄.etal.,1994)、異體雜交瘤技術(shù)(James,K.etal.，1987)、噬菌體表面展示技術(shù)(Barbas，C.F.etal.,1991)等產(chǎn)生人源化抗體，現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究的重大方向，并正在逐步走向成功，所有一切都為本發(fā)明解決問題提供了新思路。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種人源抗H5N1血凝素蛋白廣譜中和性抗體及其活性片段。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供編碼上述抗體或其活性片段的基因。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述抗體及其活性片段在制備預(yù)防或治療禽流感藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，從中國安徽某禽流感病人恢復(fù)期血中獲得淋巴細(xì)胞，通過基因工程手段構(gòu)建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗體文庫，并篩選獲得特異抗禽流感病毒基因工程抗體Fab段。獲得的Fab段抗體分別命名為AVFluFabll和AVFluFab33。這兩株重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的，并在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合高致病性禽流感病毒H5N1的功能性抗體。它們特異性識(shí)別H5N1高致病性禽流感病毒顆粒抗原，且均針對(duì)禽流感病毒血凝素蛋白HA,與禽流感病毒H5N1具有明顯的免疫熒光反應(yīng)(IFA)和酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)，具有抗禽流感病毒H5N1感染的中和活性功能。AVFluFabll和AVFluFab33特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對(duì)人源抗高致病性禽流感病毒H5N1抗體基因庫的特異性富積篩選，該抗體庫的建立來源于中國安徽H5N1禽流感恢復(fù)期病人血淋巴細(xì)胞基因。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列組合及其CDR區(qū)之間框架區(qū)序列組成了每個(gè)抗體可變區(qū)序列特征，AVFluFabll和AVFluFab33分別隸屬于抗體重鏈家族VH4和VH3,抗體輕鏈家族VL2和VL1。抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列及其互補(bǔ)所決定，6個(gè)相應(yīng)的CDR區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定發(fā)明中每個(gè)抗體的抗原結(jié)合特征和抗髙致病性禽流感病毒H5N1功能特征。決定每株中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸詳細(xì)序列及其比較結(jié)果如圖1所示，圖中"-"符號(hào)表示與第一行抗體序列相同的氨基酸，陰影部分為CDR區(qū)。AVFluFabll輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；AVFluFab33輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示。編碼AVFluFabll輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDNO.l所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDNO.3所示。AVFluFab33輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDNO.5所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDNO.7所示。應(yīng)當(dāng)理解，在不影響Fab抗體活性的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6或SEQIDNo.8所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列，例如在非高變區(qū)將具有類似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行替換，例如將SEQIDNo.2的第7位的Val替換為Ala。.此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，對(duì)編碼上述Fab段抗體的基因序列進(jìn)行修改，獲得編碼相同抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表達(dá)抗體宿主的密碼子偏愛性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達(dá)效率。進(jìn)一步，本發(fā)明將上述Fab抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)進(jìn)行重組，獲得分子量更小的單鏈抗體(ScFv)，該抗體同樣能夠特異性識(shí)別H5N1表面抗原，具有細(xì)胞內(nèi)免疫的作用。單鏈抗體穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用?？蓪⑸鲜鼍幋aFab抗體的基因、ScFv基因克隆到表達(dá)載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主，通過誘導(dǎo)表達(dá)獲得Fab抗體以及單鏈抗體。此外，可將上述Fab抗體的輕鏈編碼基因和重Fd段基因克隆到全抗表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，獲得表達(dá)抗H5N1的全抗免疫球蛋白。在本發(fā)明的實(shí)施例中，將上述2株Fab抗體(AVFluFabl1、AVFluFab33)的輕鏈和重Fd段基因分別克隆入全抗體表達(dá)載體pAC-L-Fc并轉(zhuǎn)染昆蟲S巧細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了全抗體的分泌型表達(dá)，得到全抗體AVFluIgGll和AVFluIgG33。利用SDS-PAGE、ELISA、IFA、WesternBlot、流式細(xì)胞術(shù)及SPR親和力測(cè)定對(duì)獲得的全抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明2株人源IgG全抗體(AVFluIgGl1、AVFMgG33)均特異性針對(duì)H5N1禽流感病毒血凝素HA,其中AVFluIgGll識(shí)別線性表位，親和力高達(dá)1.20xl(T"M;AVFluIgG33識(shí)別空間構(gòu)象的表位，親和力為l化xi(^M。利用血凝抑制試驗(yàn)和微量中和試驗(yàn)對(duì)全抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明AVFluIgGll可以廣泛有力地中和HA基因進(jìn)化上屬于Clade0,1,2的H5N1人禽流感病毒代表株；AVFluIgG33可交叉中和2005-2006年中國區(qū)分離的所有Clade2系毒株及其它同系國際毒株，對(duì)屬于Clade0的代表株A/HongKong/156/97及Clade1的代表株A/Vietnam/1203/2004沒有中和活性，其中血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果與中和試驗(yàn)結(jié)果相一致。2株禽流感抗體對(duì)小鼠的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明2株抗體均具有保護(hù)性，并且在2.5mg/kg劑量對(duì)小鼠具有完全的保護(hù)性，其保護(hù)性具有劑量依賴性。利用多個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)分段表達(dá)安徽株HA,包括構(gòu)建安徽株HA的2個(gè)亞基HA1和HA2桿狀病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞，以及構(gòu)建HA1的N端和C端缺失突變體克隆轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，利用免疫熒光IFA對(duì)2株抗體(AVFluIgGll、AVFluIgG33)所針對(duì)的抗原表位進(jìn)行分析，初步將這2株人源單抗所結(jié)合的表位區(qū)域限定在HA第94~274位氨基酸之間。生物信息學(xué)分析H5N1禽流感毒株HA(94274)氨基酸序列，參考以前報(bào)道的H5亞型禽流感病毒HA的關(guān)鍵抗原位點(diǎn)及其三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合本發(fā)明WesternBlot及中和試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)可能的關(guān)鍵抗原位點(diǎn)，以安徽株HA1為骨架，對(duì)推測(cè)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過IFA分析人源抗體與一系列HA突變體的結(jié)合活性，結(jié)果表明AVFMgGll識(shí)別的線性表位位于HA1上第116-123位氨基酸(IIPKSSWS),在266株人源毒株中的保守程度為96.2%~99.6%，其中l(wèi)lel16，Ilein,Pro118,Serl20Serl21,Trpl22和Serl23突變，會(huì)導(dǎo)致AVFluIgGll對(duì)安徽株HA抗原的結(jié)合活性消失或明顯減弱。AVFhxIgG33識(shí)別的構(gòu)象型表位由3個(gè)空間位點(diǎn)SiteI(11ell6,Ilell7,Trp122),SiteH(Glul26,Serl29)和SiteHI(Lysl52,Asnl55)共同組成，其中Ilell6、Ilell7、Trpl22是AVFluIgGll和AVFluIgG33共同識(shí)別的重疊表位。本發(fā)明運(yùn)用噬菌體抗體庫技術(shù)，成功地獲得了2株兩株具有廣譜中和活性的特異性針對(duì)H5N1人禽流感病毒HA的高親和力人源單抗；并在小鼠動(dòng)物模型上驗(yàn)證了2株禽流感抗體的保護(hù)性效果。在國際上首次解析了人源抗H5N1禽流感病毒血凝素HA中和抗體表位，并首次結(jié)合三維結(jié)構(gòu)分析我國毒株的特性，在空間結(jié)構(gòu)上描述了分布于HA頭部的抗原變異位點(diǎn)及與人體免疫有關(guān)的關(guān)鍵抗原決定簇。這一結(jié)果的獲得為人禽流感的預(yù)防和治療帶來了希望，對(duì)HA進(jìn)化乃至抗原漂移機(jī)制及疫苗免疫原的設(shè)計(jì)具有重要意義，不僅為設(shè)計(jì)新型表位疫苗及藥物奠定基礎(chǔ)，也為禽流感疫情監(jiān)測(cè)提供理論指導(dǎo)。利用上述獲得的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗體可變區(qū)基因、Fab抗體基因以及上述每個(gè)抗體基因特征下的全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因的任何其他基因，獲得具有中和高致病性禽流感病毒H5N1感染的抗體產(chǎn)物，制成臨床上用于預(yù)防和治療由H5N1禽流感病毒引起的人禽流感的特異性抗體藥物，從而可在臨床上用于預(yù)防和治療由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感?；谏鲜龉こ炭贵w基因及其直接或間接的基因產(chǎn)物，可制成噴霧型抗體制劑和注射型抗體制劑用于人感染H5N1高致病性禽流感的預(yù)防和治療。圖l顯示的是抗禽流感病毒H5N1人源Fab抗體可變區(qū)基因的氨基酸序列比較；圖2顯示的是純化后IgG的SDS-PAGE電泳圖，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1和2分別為AVFluIgGll和AVFluIgG33;圖3顯示的是抗禽流感病毒H5N1人源IgG單抗與禽流感病毒H5N1及其重組HA以及流感病毒H1N1、H3N2的免疫熒光反應(yīng)結(jié)果；圖4顯示的是競(jìng)爭(zhēng)型ELISA檢測(cè)結(jié)果；圖5顯示的是WesternBlot分析抗原抗體結(jié)合特異性的結(jié)果；圖6顯示的是應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)測(cè)定抗禽流感病毒人源單抗AVFluIgGll親和力的結(jié)果；圖7顯示的是應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)測(cè)定抗禽流感病毒人源單抗AVFluIgG33親和力的結(jié)果；圖8顯示2株人源抗禽流感病毒單抗對(duì)小鼠的保護(hù)性評(píng)價(jià)。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例l材料和方法1.病毒、細(xì)胞、載體人源H5N1分離株A/Anhui/1/2005(GenebankaccessionnumberDQ371928),A/Guangxi/1/2005(DQ371930),A/Hunan/1/2006(FJ492879),A/Zhejiang/1/2006(FJ492880),A/Sichuan/1/2006(FJ492881),A/Fujian/1/2005(FJ492882),A/Fujian/1/2007(FJ492883),A/Guangdong/1/2006(FJ492884),A/Jiangxi/1/05(FJ492885),A/Xinjiang/1/2006(FJ492886),A/VietNam/1203/2004(AY818135),A/HongKong/156/1997(AF023709),A/Turkey/15/2006(EF619989),A/Indonesia/5/2005(EU146622)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所及美國疾病預(yù)防控制中心提供。菌株為XLI-Blu(美國Stratagene);噬菌體表達(dá)載體為pComb3(40kb),由美國Scripps研究所饋贈(zèng)；所用噬菌體為VCSM13(美國Invitrogene公司)。桿狀病毒表達(dá)載體為pAC-L-Fc(德國PROGENPR3003)(Liang,M.F.，Stefan,D.,Li，D.X,,Queitsch,I"Li,W.,andBautz,E.F.BaculovirasexpressioncassettevectorsforrapidproductionofcompletehumajnIgGfromphagedisplayselectedantibodyfragments.JournalofImmunologicalMethods.247:119-130.),昆蟲細(xì)胞Sf9及MDCK細(xì)胞來自美國細(xì)胞培養(yǎng)中心(ATCC)。純化的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)購自美囯蛋白科學(xué)公司(ProteinSciencesCorp.)。2.抗原制備2.1H5N1禽流感病毒抗原的純化將H5N1禽流感病毒分離株A/Anhui/1/2005以100TCID5o感染7590%滿的MDCK細(xì)胞，37。C吸附l2小時(shí)，吸附后用Hank's液清洗細(xì)胞，補(bǔ)加維持液液，放置于33~35°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)75~100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，收獲之前將細(xì)胞凍融1~2次，離心收獲上清，經(jīng)甲醛滅活和安全檢查后，將上清濃縮后緩慢加于30%~60%蔗糖墊層之上，40000g,4。C離心3h(BeckmanSW28)。收集乳白色病毒條帶用PBS溶液重懸，于-70。C保存?zhèn)溆谩?.2H5N1禽流感血凝素HA在昆蟲桿狀病毒表達(dá)利用流感室提供的H5N1禽流感病毒分離株A/Anhui/1/2005的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增HA基因，引物用于克隆禽流感HA的引物HAF:5'-CGCGGATCCATGGAGAAAATAGTGCTTC-3';HAR:5'-CGCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGAATGCAAATTCTGCA墨3'，2端均引入BamHI酶切位點(diǎn)，并且在3'段添加6-His標(biāo)簽。純化的擴(kuò)增產(chǎn)物用BamHI酶切，將酶切后的片段回收，直接克隆到同樣經(jīng)BamHI酶切的桿狀病毒表達(dá)載體pAcUW51中，使HA基因在多角體啟動(dòng)子的控制下，經(jīng)PCR鑒定目的基因插入方向后，獲得重組質(zhì)粒為pAc-HA。通過將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞制備重組桿狀病毒進(jìn)行蛋白，表達(dá)采用美國Pharmogen公司的BaculoGold共轉(zhuǎn)染試劑盒。操作方法略述如下將5嗎的重組質(zhì)粒DNA與0.5ng的BaculoGold線性DNA混合混合后，利用試劑盒中的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染生長密度為5(T/。的Sf9細(xì)胞，27。C培養(yǎng)4天后，收集上清作為重組病毒的毒種進(jìn)行滴定和擴(kuò)增。具體操作見Baculovirusexpressionvectorsystem手冊(cè)。3.噬菌體抗體庫的構(gòu)建用淋巴細(xì)胞分離液(美國Sigma)從安徽疫區(qū)禽流感病人恢復(fù)期抗凝血中分離淋巴細(xì)胞，用RNeasyMiniKit(德國QIAGEN)提取總細(xì)胞RNA,用Oligo-dT引物將提取的RNA采用Invitrogen公司的第一鏈合成試劑盒(SuperScriptTMlIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR.CatNo.l8080-051)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用一組擴(kuò)增人源抗體IgGl重鏈Fd及輕鏈Kappa和Lambda的引物對(duì)人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94°Cl分鐘，54°Cl分鐘，72。C2分鐘，35個(gè)循環(huán)。上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，經(jīng)過DNA純化試劑盒QIAquickTMkit(德國QIAGEN公司)純化后，獲得650-700bp左右的Kappa、Lambda和Fd鏈PCR產(chǎn)物。建庫方法參見文獻(xiàn)Barbas,C.Fill"Kang,A.S.,andlamer,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982。將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產(chǎn)物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用SacI/Xbal和XhoI/Spel克隆入噬菌體載體pComb3,將克隆入輕、重鏈基因的pComb3載體DNA連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用10pl蒸溜水懸起，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入事先制備好的200pl電轉(zhuǎn)菌XLI-Blu(電轉(zhuǎn)條件為Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2.5K伏)，電轉(zhuǎn)后加10mlSOC培養(yǎng)液，37°C1小時(shí)，力口入10ml帶有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)液37。C培養(yǎng)1小時(shí)，加入80-100ml前述SB,37°C2小時(shí)后加入輔助噬菌體VCSM13lxio12,l小時(shí)后加入卡那霉素(7(^g/ml)，37。C搖床培養(yǎng)過夜。用4%PEG8000和3。/。NaCI沉淀噬菌體上清，經(jīng)9000rpm,20分鐘，4'C離心后，用2ml0.02MPBSpH7.4重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫，分裝保存于-20。C冰柜中。4.用于抗體庫富集篩選的H5N1禽流感病毒抗原的制備在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中搡作，使用m級(jí)生物安全防護(hù)。擴(kuò)增毒株為A/Anhui/1/2005(H5N1)，將病毒原液作梯度稀釋為10",l(T2，l(T3，10，寺用。將生長狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞(細(xì)胞貼壁達(dá)80%)倒出細(xì)胞生長液，用Hank氏液清洗細(xì)胞2-3遍。分別將不同稀釋度的病毒稀釋液lml感染MDCK細(xì)胞，35'C吸附lh,吸附完成后，用Hank氏液清洗細(xì)胞2-3遍，在培養(yǎng)瓶中加入維持液，至35'C培養(yǎng)。待感染細(xì)胞有70%-80%出現(xiàn)病變進(jìn)行收獲，收獲之前將細(xì)胞凍融l-2次，收獲上清，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)測(cè)定血凝滴度。經(jīng)甲醛滅活后，感染MDCK細(xì)胞，盲傳三代確定已完全滅活，進(jìn)行蔗糖墊層超速離心純化。5.噬菌體抗體庫的富集篩選篩選抗原為超速離心純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)和純化的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)，使用時(shí)用0.1MNaHC03(pH8.6)的溶液稀釋，包被96孔酶標(biāo)板。富集篩選方法基本按文獻(xiàn)進(jìn)行(Barbas,C.Fill"Kang,A.S.,andlamer,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegenefflsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982)，具體如下用0.1MNaHCO3(pH8.6)的溶液包被純化的H5N1禽流感病毒抗原(1:200稀釋)，每孔100W,4。C過夜；次日用lxPBST洗去未吸附的抗原，用4%的脫脂奶37'C封閉l小時(shí)，棄封閉液；每孔加入801噬菌體抗體庫，37'C孵育2小時(shí)，棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用lx丁BST(50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.5%Tween20，pH7.5)洗液沖洗各孔，沖洗時(shí)，用帶有吸頭的移液器反復(fù)吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌體；最后用ddH20洗兩遍，吸凈孔中的液體；每孔加入5(HdGly-HCl(pH2.2)的洗脫液，室溫孵育10分鐘，期間反復(fù)吹打數(shù)次。加入適量的2MTris,以中和洗脫下來的噬菌體；將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮制備的XLI-Blu菌液中(OD60。=1),室溫孵育15-20分鐘；然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，加入SBIOml(氨芐青霉素:20嗎/ml，四環(huán)素10嗎/ml),立即取10pl涂氨節(jié)青霉素平皿，以滴定噬菌體；三角瓶與37。C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，加入IOOmlSB(氨節(jié)青霉素100g/ml),37tM小時(shí)后，加入輔助喧菌體VCSM13lml,37°C振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，加入卡那霉素(終濃度70g/ml)，37'C培養(yǎng)過夜。如此反復(fù)篩選4次。6.Fab段抗體的誘導(dǎo)表達(dá)人源中和性抗禽流感病毒H5Nl基因工程Fab抗體可溶性表達(dá)產(chǎn)物的制備基本按文獻(xiàn)進(jìn)行(Barbas,C.Fill"Kang,A.S.,andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrarieson■phagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982)，具體為將帶有陽性抗體輕重鏈基因插入的陽性克隆擴(kuò)增后按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA,用SpeI和NheI切除載體中的gIII，變FdgIII融合蛋白為獨(dú)立表達(dá)的蛋白，連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blu菌，從過夜生長的氨芐平皿中挑取單個(gè)菌落，接種SB或TB細(xì)菌培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)菌長至006()0=0.2-0.3,加入lmMIPTG，在3(TC誘導(dǎo)表達(dá)10-12小時(shí)。收獲細(xì)菌，離心后加入原培養(yǎng)液l/10體積的PBS(0.02MpH7.4)重懸，反復(fù)凍融三次，4°C12000rpm離心30分鐘，上清即為表達(dá)的Fab抗體。備用于進(jìn)一步的檢測(cè)和鑒定。陰性對(duì)照為載體pComb3轉(zhuǎn)化菌按同樣方法制備的細(xì)菌裂解液。7.人源抗H5Nl禽流感病毒Fab抗體的ELISA檢測(cè)7.1Fab表達(dá)的檢測(cè)用0.1MNaHC03(pH9.6)的溶液包被抗人Fab抗體(美國Sigma,1:2000稀釋使用)，4'C過夜；4%脫脂奶封閉，37°Clh，加入表達(dá)的Fab抗體，37'Clh;加入酶標(biāo)抗人Fab二抗(美國Sigma,1:2000稀釋使用)，37°Clh;顯色液顯色，2MH2SCU終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A值。7.2間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Fab與H5N1禽流感病毒及重組HA結(jié)合活性用純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)和重組血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)作為包被抗原，隨后的步驟同上。8.人源Fab抗體可變區(qū)基因的核酸序列分析用QiagenMiniprepKit(德國QIAGEN)制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸序列分析。輕重鏈的測(cè)序引物分別為5'-AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3'和5'-CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3，。測(cè)序結(jié)果和InternetV-Base基因庫中IgG基因序列比較。9.全抗體重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將獲得的Fab抗體的輕鏈先用XbaI單酶切，然后用Klenow酶進(jìn)行補(bǔ)平，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。再用Sacl對(duì)目的片段進(jìn)行酶切，此時(shí)瓊脂糖凝膠電泳中所見的大約700bp的片段即輕鏈片段。再次使用凝膠回收試劑盒回收輕鏈片段。pAC-L-Fc載體(德國PROGENPR3003)經(jīng)SacI/EcoRV雙酶切，用QIAGEN酶切回收試劑盒回收目的片段。輕鏈片段與pAC-L-Fc載體連接(常規(guī)連接方法)，轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆pAC-L-L-Fc。重鏈片段的克隆對(duì)pComb3-Fab進(jìn)行Xhol/Spel雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳中除載體片段外可見一700bp左右片段，即重鏈片段，用凝膠回收試劑盒回收。pAC-L-L-Fc的處理Xhol/Spel雙酶切質(zhì)粒，QIAGEN酶切回收試劑盒回收目的片段。將回收的重鏈片段(約700bp)各2pl分別與2pl處理好的pAC-L-L-Fc連接，轉(zhuǎn)化，挑取克隆，酶切、測(cè)序鑒定。10.轉(zhuǎn)染和擴(kuò)毒釆用美國Pharmogen公司的BaculoGold共轉(zhuǎn)染試劑盒。操作方法略述如下將5嗎的重組質(zhì)粒DNA與0.5pg的BaculoGold線性DNA混合混合后，利用試劑盒中的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染生長密度為5(T/。的Sf9細(xì)胞，27。C培養(yǎng)4天后，收集上清作為重組病毒的毒種進(jìn)行滴定和擴(kuò)增。具體操作見Baculovirusexpressionvectorsystem手冊(cè)。11.全抗體IgG分泌表達(dá)和純化重組病毒感染生長密度70%左右的Sf9細(xì)胞，27。C吸附lh.改用SF-900IISFM無血清培養(yǎng)液，27。C培養(yǎng)35天后收集上清。采用Amersham公司的Protein-A親和層析柱直接純化表達(dá)上清(HarlowE,LaneD."Antibodies:ALaboratoryManual".ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，l988.)。用ELISA、IFA、WesternBlot和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所獲對(duì)純化的IgG抗體功能特性進(jìn)行鑒定。具體操作如上。12.間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)H5N1禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)感染MDCK細(xì)胞，35。C培養(yǎng)約48小時(shí)，收獲細(xì)胞，滴加至玻璃底片上，吹干，丙酮固定15mhi并干燥，制成病毒抗原片。同時(shí)利用已構(gòu)建的表達(dá)禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，4-5天后收獲感染細(xì)胞制成重組HA抗原片。加入表達(dá)的IgG全抗體，37'C溫育30min,沖洗，加入FITC標(biāo)記的抗Fab抗體(美國Sigma),37。C溫育30min,沖洗，晾干，顯微鏡下觀察。13.Westernblot檢測(cè)抗原分別為純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/05)、真核表達(dá)的重組禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)。陽性對(duì)照為禽流感病人恢復(fù)期血清，陰性對(duì)照為針對(duì)甲肝病毒人源單抗HAVIgG16?？乖M(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜。轉(zhuǎn)膜后對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮蘭染色以檢査蛋白質(zhì)是否轉(zhuǎn)移完全。將分子量標(biāo)準(zhǔn)的泳道剪下，標(biāo)出分子量標(biāo)準(zhǔn)的參照蛋白位置。對(duì)NC膜進(jìn)行封閉，5%脫脂奶室溫封閉2小時(shí)。一抗AVFMgGll，AVFluIgG33及HAVIgG16表達(dá)上清與抗原反應(yīng)，陽性血清用封閉液1:10稀釋與抗原反應(yīng)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。lxPBST洗滌3次后與HPR標(biāo)記的抗人Fab(Sigma公司，l:500使用)室溫反應(yīng)l小時(shí)。lxTBST洗滌3次后放入DAB底物顯液色中，至棕色陽性條帶出現(xiàn)適時(shí)終止反應(yīng)，避光保存。14.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)14.1ELISA滴定純化IgG全抗體抗原結(jié)合活性用0.1MNaHC03(PH9.6)的溶液分別包被純化的安徽株H5N1禽流感病毒顆粒，4。C過夜。用PBS-T洗液洗板3次，充分去除液體，加入5%脫脂奶100M1,37。C溫育lh。PBS-T洗液洗板3次，充分去除液體，加入用5%PBS-脫脂奶進(jìn)行不同稀釋的純化IgG抗體lOOnI,37。C溫育lh。PBS-T洗液洗板6次，充分去除液體，加入酶標(biāo)抗人Fc抗體(Sigma公司，1:2000稀釋使用)10(^1,37。C溫育lh。PBS-T洗液洗板6次，充分去除液體，加入顯色液A、B室溫顯色10min'2MH2S04終止反應(yīng)，OD450讀數(shù)。14.2競(jìng)爭(zhēng)ELISA采用安徽株H5N1禽流感病毒顆粒作為包被抗原，根據(jù)上文中ELISA滴定純化IgG全抗體的滴度，選擇每孔加入4nglgG抗體作為一抗；不同稀釋度的Fab抗體，分別為AVFluFabll,AVFluFab33及無關(guān)對(duì)照抗體H34作為竟?fàn)幙贵w，二抗為酶標(biāo)抗人Fc抗體，具體搡作如上文3.3.1中所列。15.親和力測(cè)定這里我們利用生物傳感器BIAcoreTM1000測(cè)定2株人源單抗的親和力，本發(fā)明使用純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/05)作為抗原偶聯(lián)至生物傳感芯片來測(cè)定AVFluIgG33的親和力，而AVFluIgGll的親和力則通過偶聯(lián)重組血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)來測(cè)定。1)BIAcore1000的開啟將CM5傳感芯片模塊按要求嵌入BIAcoreTMIOOO儀器(Dock);初始化(Prime)5min;0.5mlNormalizingsolution正?；?Normalize)5min。2)偶聯(lián)抗原首先要進(jìn)行Preconcentration-抗原，目的是選擇一個(gè)合適pH值的NaAC(10mM)稀釋抗原，使其在此條件下的偶聯(lián)值能達(dá)到最高。然后將分別含有NHS、EDC、乙醇胺以及50嗎/ml禽流感抗原(選擇pH4.5NaAC稀釋)的各100jul的小管置于BIAcore1000自動(dòng)進(jìn)樣器架的適當(dāng)位置，開動(dòng)儀器，流動(dòng)相為HBS-EPBuffer以5pl/min的流速流過樣品池，儀器自動(dòng)將75fil的NHS和75(_d的EDC加入到同一個(gè)空管中，混勾，注射70nL的NHS/EDC混合物(10(al/min)使芯片表面活化，之后注射抗原60^il(50ng/mL,10|al/min，6min)，使其通過氨基固定到傳感片表面，偶聯(lián)后用乙醇胺封閉，注射50mMNaOH洗掉表面未偶聯(lián)的蛋白和乙醇胺。3)加入不同稀釋度的單抗基線(baseline):流動(dòng)相HBS-EPBuffer以5(al/min的流速流過偶聯(lián)好的樣品池，使其平衡至基線；結(jié)合(association):注入不同稀釋度單抗(0—500nM,流速30^/min注入2min)結(jié)合至飽和；解離(dissociation):換HBS-EPBuffer,待單抗結(jié)合與解離達(dá)到平衡(解離約3min)。再生(regeneration):在注射不同濃度單抗溶解液前需快速注射10^120mMGlydne-HCl對(duì)芯片進(jìn)行再生?；貜?fù)基線更換為HBS-EPBuffer,再次回到基線，開始下一個(gè)循環(huán)測(cè)定。親和常數(shù)用BIAcore附帶軟件BIAevaluation3.0計(jì)算。首先計(jì)算出紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)所需的病毒抗原的總量，每份抗體或血清作8孔稀釋，每孔用抗原25pl，那么測(cè)定一份需a2mL抗原。根據(jù)總共參與試驗(yàn)的抗體(2份AVFluIgGll和AVFluIgG33)或陰陽性血清(2份)的份數(shù)計(jì)算所需病毒抗原量為0.8ml。接下來計(jì)算病毒稀釋度，用病毒紅細(xì)胞凝集滴度(HA滴度)除以8，得到的商即為4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的稀釋度。同時(shí)需對(duì)新配制的4個(gè)凝集單位抗原進(jìn)行復(fù)核滴定取50pl稀釋好的抗原，用等量PBS作倍比稀釋后加入50nl紅細(xì)胞懸液，至室溫孵育3060min后觀察凝集結(jié)果。若只有前4孔出現(xiàn)凝集，表明50pl病毒含有8個(gè)凝集單位(即25pl中含有4個(gè)紅細(xì)胞凝集)，則該病毒稀釋準(zhǔn)確。將待測(cè)2份單抗(AVFluIgGll和AVFluIgG33)及陰陽性血清(2份)從原液其進(jìn)行倍比稀釋8孔，每孔保留25pl，之后每孔各加入25pl待測(cè)病毒液(4個(gè)凝集單位的抗原)；混勻，至室溫孵育1530min,然后每孔加入1%紅細(xì)胞懸液50pl混勻，至室溫孵育3060min,觀察紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判定當(dāng)特定的抗體與相應(yīng)的紅細(xì)胞凝集素抗原結(jié)合后，可以抑制病毒引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)是指抑制紅細(xì)胞凝集出現(xiàn)時(shí)血清的最高稀釋度的倒數(shù)。17.微量中和試驗(yàn)將人源抗禽流感病毒IgG純化抗體(AVFMgGll，AVFluIgG33)及陰陽性對(duì)照血清過濾除菌作系列稀釋后，與100TCID50的H5N1禽流感病毒50nl以l:l混合，放37。C溫箱作用2小時(shí)。選擇8孔進(jìn)行病毒回滴，將病毒作系列倍比稀釋，使之成為100TCID50,50TCID50,...0.7。設(shè)立4個(gè)重復(fù)孔為陽性細(xì)胞對(duì)照，即將MDCK細(xì)胞與100TCID50病毒進(jìn)行混合培養(yǎng)；設(shè)立4個(gè)重復(fù)孔為陰性細(xì)胞對(duì)照，即將細(xì)胞與稀釋緩沖液混合培養(yǎng)。加100pl細(xì)胞液U.5xl04)于含有病毒-抗體(血清對(duì)照)混合物以及倍比稀釋病毒回滴工作液的微量板中，37。C溫箱孵育18-22小時(shí)。棄去微量培養(yǎng)板中的細(xì)胞液，PBS洗細(xì)胞一次，加入100nl/孔固定液，于室溫固定細(xì)胞10分鐘，棄固定液，室溫干燥。ELISA檢測(cè)中和抗體滴度PBS洗去殘留丙酮，加入一抗(抗流感病毒和蛋白-NP單克隆抗體)室溫作用l小時(shí)，PBS洗滌培養(yǎng)板4次，加入稀釋好二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG)室溫作用l小時(shí)，洗板6次，每孔加入OPD底物IOO^tl(10mgOPD+20ml檸檬酸緩沖液+10^d130%雙氧水，即用即配)。室溫10分鐘顯色，1M硫酸終止，記錄490nm每孔OD。結(jié)果判定(細(xì)胞陽性對(duì)照平均OD值-細(xì)胞陰性對(duì)照平均OD值)/2+細(xì)胞陰性對(duì)照平均OD值=XX二細(xì)胞半數(shù)感染域值，每孔OD值低于X值時(shí)，判定中和試驗(yàn)反應(yīng)陽性，中和反應(yīng)陽性的抗體最高稀釋度即為中和抗體滴度。18.動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)8周齡雌性小鼠分別腹腔接種0.5ml不同濃度計(jì)量的純化抗體(AVFluIgGll，AVFluIgG33)包括0.025mg/kg,0.25mg/kg,2.5mg/kg;陽性對(duì)照組注射越南株血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)的高免兔多抗血清；陰性對(duì)照組為純化人IgGl型抗體(Sigma,Missouri,USA),每組5只，每批分別腹腔注射。被動(dòng)免疫24小時(shí)后，用禽流感病毒安徽株(AH/1/05)50u^lOLD50(=104MID50;1055EID50)的感染計(jì)量攻擊小鼠，連續(xù)21天觀察并記錄小白鼠發(fā)病，體重及死亡狀況，測(cè)定其保護(hù)率。19安徽株H5N1禽流感病毒HA的分段及突變表達(dá)為了鑒定2株人源單抗與HA抗原結(jié)合的表位，利用流感室提供的H5N1禽流感病毒分離株A/Anhui/1/2005的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增HA1、HA2及其缺失基因。引物如表3-l中所列(本文通篇有關(guān)H5N1血凝素HA的編號(hào)均為成熟HA蛋白的編號(hào)，不包含前16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽)，分別以N端和C端為基點(diǎn)對(duì)HA1進(jìn)行缺失突變，其中N端缺失33aa，103aa,133aa，203aa共4段，其克隆分別命名為HA1N34，HA1畫,HA1N134,HA1N2Q4;C端(包括并從第322位起)分別缺失至第274,234,194，146及94位氨基酸,其克隆命名為HAlcm,HA1C274,HA1C234，HA1C194,HA1C146，HA1C94。將以上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化酶切，克隆至各自相應(yīng)的表達(dá)載體中(如表l)，克隆均轉(zhuǎn)化Eco//DH5oc,提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞及293T細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)人源單抗與分段及突變表達(dá)HA的結(jié)合活性。20.安徹株H5N1禽流感病毒HA1的定點(diǎn)突變20.1生物信息學(xué)分析可能的HA抗原位點(diǎn)本文利用DNASTAR軟件中的MegAlign程序(DNASTARInc.,USA)對(duì)涉及中和試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn)的進(jìn)化上屬于Clade0,1，2的代表毒株的HA氨基酸序列進(jìn)行了分析比對(duì)，根據(jù)上文通過分段表達(dá)HA確定人源單抗與HA結(jié)合的最小區(qū)域?yàn)?4~274aa,參考以前報(bào)道的H5亞型禽流感病毒HA的關(guān)鍵抗原位點(diǎn)及其三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合本發(fā)明WestemBlot及中和試驗(yàn)結(jié)果，我們著重分析了這一區(qū)域(94~274aa)在以上CladeO，1,2各代表毒株間存在的關(guān)鍵抗原變異位點(diǎn)，由于這些變異位點(diǎn)的存在可能引起個(gè)別毒株對(duì)人源中和抗體(AVFluIgG11,AVFluIgG33)產(chǎn)生逃逸的，進(jìn)而推測(cè)人源單抗(AVFluIgGll，AVFluIgG33)可能針對(duì)的關(guān)鍵抗原位點(diǎn)。經(jīng)過生物信息學(xué)及前文中相關(guān)研究數(shù)據(jù)(WB，MNT,HI)等綜合分析，本文以安徽株HA1為模板，對(duì)上述分析獲得的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的進(jìn)行突變，而突變氨基酸的選擇我們遵循以下分析通過分析流感病毒數(shù)據(jù)庫中收錄的266株人源H5N1禽雍感病毒HA的上述分析獲得的關(guān)鍵區(qū)域氨基酸序列(InfluenzaVirusResourcehttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html),除了高度保守的氨基酸位點(diǎn)，每個(gè)被選定的關(guān)鍵氨基酸都被突變成禽流感毒株中相應(yīng)位置出現(xiàn)的變異氨基酸，其中主要考慮本文參與中和試驗(yàn)的Clade0，1,2代表毒株及其出現(xiàn)的變異；而高度保守的氨基酸位點(diǎn)則突變成為甘氨酸(Gly)。20.2安徽株H5N1禽流感病毒HA定點(diǎn)突變克隆構(gòu)建采用重疊延伸PCR方法，引物設(shè)計(jì)方案如下，HA1編碼區(qū)上游引物含起始密碼子和BamHI酶切位點(diǎn)，為CF:5'-CGCGGATCCATGGAGAAAATAGTGCTTC-3';下游引物含終止密碼子和Xhol酶切位點(diǎn)，C1R:5'-CCGCTCGAGTTATAGAGGACTATTTC-3'(見表1)。突變引物中含有定點(diǎn)突變氨基酸的編碼序列，其上、下游突變引物序列彼此重疊且互補(bǔ)，見表2。按照文獻(xiàn)記載的重疊延伸PCR法進(jìn)行，具體參見文獻(xiàn)[HoSN，HuntHD,HortonRM,PullenJK,PeaseLR.(1989)Site-directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreaction.Gene77:51-59.]。純化突變HA1PCR產(chǎn)物，經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切后，直接克隆到pCDNA3.0質(zhì)粒中。對(duì)重組克隆進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)人源單抗與定點(diǎn)突變表達(dá)HA的結(jié)合活性。21非高變區(qū)突變后的抗體對(duì)H5N1抗性的研究基于AVFluIgGl1輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，將SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第7位的Val替換為Ala，將SEQIDNo.4重鏈可變區(qū)的第12位的Glu替換為Gln。分別合成AVFluIgGll的輕鏈編碼核酸序列(在相應(yīng)位置將密碼子gtg替換為gcc)以及重鏈編碼核酸序列(在相應(yīng)位置將密碼子gag替換為cag)。按照上述917的方法，將輕鏈基因和重鏈Fd段克隆到pAC-L-Fc中，并轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)，并對(duì)該突變體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。結(jié)果1.人源抗H5N1禽流感病毒抗體庫的富集篩選用純化的人源H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)及重組血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行富集篩選，經(jīng)3輪篩選后隨機(jī)挑取384個(gè)克隆。用抗人Fab抗體(sigma公司，1:2000稀釋使用)、H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)抗原和越南株重組血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)包被96孔板，加入待測(cè)樣品上清，用酶標(biāo)抗人Fab二抗(Sigma公司，l:2000稀釋使用)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示共獲得245株人源Fab表達(dá)陽性克隆。在245株人源Fab表達(dá)陽性克隆中，有142個(gè)克隆對(duì)安徽株禽流感病毒的ELISA檢測(cè)為陽性；同時(shí)還有68株Fab克隆對(duì)越南株血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)的ELISA檢測(cè)為陽性，因此本發(fā)明獲得的142株對(duì)安徽株禽流感病毒特異性結(jié)合的抗體中，有68株同時(shí)針對(duì)越南株HA反應(yīng)為陽性。2.人源抗H5N1禽流感病毒Fab抗體的序列分析用DNASTAR序列分析軟件進(jìn)行分析處理，比較InternetV-Base基因庫中的IgG序列，上述142株對(duì)安徽株禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)特異性結(jié)合人源Fab單抗中，其中68株與越南株重組HA(A/VietNam/1203/2004)也反應(yīng)的Fab克隆為同一抗體基因序列，本文命名為AVFluFabll;其余74株為另一相同抗體基因序列，命名為AVFluFab33。因此本發(fā)明成功篩選并克隆2株帶有不同的抗體輕重鏈可變區(qū)序列及其組合的抗體，其重鏈可變區(qū)主要分類在IgGVH4和VH3家族，其輕鏈可變區(qū)主要分類在IgGVL2和VL1家族。2株人源Fab抗體的可變區(qū)基因的氨基酸序列及其相互比較如圖l所示，"-"符號(hào)表示與第一行抗體序列相同的氨基酸，陰影部分為CDR區(qū)。3.全抗體IgG表達(dá)和純化將2株已完成功能鑒定Fab抗體(AVFluFabll、AVFluFab33)的輕鏈和重Fd段基因，分別克隆入全抗體表達(dá)載體pAC-L-Fc轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)。采用Amersham公司的Protein-A親和層析柱直接純化表達(dá)上清，通過SDS-PAGE檢驗(yàn)全抗體IgG的表達(dá)及純化情況，結(jié)果證實(shí)得到較純蛋白，可清晰觀察到解鏈后的抗體輕、重鏈，分別位于約28KD、55KD處，如圖2所示。4.間接免疫熒光鑒定人源IgG抗體對(duì)H5N1禽流感抗原的結(jié)合特異性為了證實(shí)所獲得的人源IgG抗體對(duì)禽流感病毒H5N1的結(jié)合特異性，本發(fā)明進(jìn)一步通過間接免疫熒光試驗(yàn)UFA)鑒定全抗體的功能活性。結(jié)果表明，2株人源IgG抗體(AVFluIgGll和AVFMgG33)與安徽株禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)及其重組HA免疫熒光均為陽性，與甲1型人流感病毒A/Hubeihs/53/2005(H1N1)及甲3型人流感病毒A/Yunnan/1145/2005(H3N2)免疫熒光均為陰性，如圖3所示。免疫熒光結(jié)果證明從抗體庫篩選獲得的陽性克隆均針對(duì)H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA,而與甲l型和甲3型人流感病毒無交叉反應(yīng)的人源單抗。5.競(jìng)爭(zhēng)ELISA釆用安徽株H5N1禽流感病毒顆粒作為包被抗原，選擇每孔加入4nglgG抗體作為一抗；加入不同稀釋度的Fab抗體，分別為AVFluFabll，AVFluFab33及無關(guān)對(duì)照抗體H34作為競(jìng)爭(zhēng)抗體，同時(shí)選擇加入PBS為空白對(duì)照，即不加竟?fàn)幙贵w的情況下此OD值為最大結(jié)合，二抗為酶標(biāo)抗人Fc抗體。結(jié)果如圖4所示，隨著竟?fàn)幙贵wAVFluFabll,AVFluFab33濃度增加，這2株IgG抗體AVFluIgG11，AVFluIgG33與抗原的結(jié)合率降低，而對(duì)照Fab抗體(H34)的加入則對(duì)這2株IgG抗體無影響，說明這2株抗體之間存在部分的競(jìng)爭(zhēng)，其所針對(duì)的表位可能有部分的重疊。6.Westernblot檢測(cè)本發(fā)明選擇的抗原分別為純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/05)、桿狀病毒表達(dá)的重組禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/05)。陽性對(duì)照為禽流感病人恢復(fù)期血清，陰性對(duì)照為針對(duì)SARS病毒人源單抗SARS58。如圖5所示，AVFluIgGll與天然滅活的安徽株禽流感病毒HA及重組表達(dá)安徽株禽流感病毒HA均有反應(yīng)，與病人血清結(jié)果一致，出現(xiàn)的目的條帶分別為天然滅活病毒HA約62kD,重組HA70kD左右；而AVFluIgGll與以上兩種抗原均不反應(yīng)陰性；對(duì)照均未出現(xiàn)非特異反應(yīng)(結(jié)果未列出)。證明2株特異結(jié)合H5N1禽流感病毒HA蛋白的人源單抗中，AVFluIgGll針對(duì)可能針對(duì)線性表位，而AVFluIgG33可能針對(duì)構(gòu)象型表位。7.親合力測(cè)定本發(fā)明使用純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/05)作為抗原偶聯(lián)至生物傳感芯片來測(cè)定AVFluIgG33的親和力，而AVFluIgGll的親和力則通過偶聯(lián)重組血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)來測(cè)定，親和常數(shù)用BIAcore附帶軟件BIAevaluation3.0計(jì)算，如圖6,圖7所示。AVFluIgG11針對(duì)重組血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)的結(jié)合常數(shù)(K。)和解離常數(shù)(Krf)分別為l^xloV^S-1與2.30xlO-7S"，由此計(jì)算出AVFluIgGll結(jié)合抗原親和力達(dá)到皮摩爾級(jí)，即Kfl.20xlO-"M。同時(shí)，本發(fā)明使用純化的滅活H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/05)作為抗原偶聯(lián)至生物傳感芯片來測(cè)定AVFMgG33的親和力，其結(jié)合常數(shù)(K。)和解離常數(shù)(Krf)分別為5.02xl04M"S-1與1.75x10-48、由此計(jì)算出AVFluIgG33結(jié)合抗原親和力達(dá)到納摩爾級(jí)，即KD=3.49xlO—9M,由此可見2株人源抗H5N1禽流感病毒單抗均具有很高的親和力，見表l。表1.抗禽流感病毒人源抗體針對(duì)越南株rHA及安徽株病毒顆粒的親合力測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>8.血凝抑制試驗(yàn)(HI)選擇分屬禽流感病毒CladeO,Cladel，Clade2.1，Clade2.2,Clade2.3的多株代表毒株及對(duì)照H1N1，H3N2參與血凝抑制試驗(yàn)，分析獲得的2株人源單抗針對(duì)不同毒株的交叉反應(yīng)性，結(jié)果表明，AVFluIgGll和AVFluIgG33與對(duì)照普通流感病毒A/Wyoming/3/03(WY/3/03)及A/NewCaledonia/20/99(NC/20/99)均無血凝抑制活性。AVFluIgGll對(duì)本發(fā)明所選擇的Clade0，Cladel,Clade2三個(gè)引起人H5N1禽流感的主要進(jìn)化支系的毒株均有血凝抑制活性，引起各毒株發(fā)生血凝抑制所需的最低抗體范圍約在1.63.1itig/ml之間(見表2)。AVFluIgG33對(duì)Clade0的代表株A/HongKong/156/1997及Clade1的代表株A/VietNam/1204/2003均無血凝抑制活性，這一點(diǎn)與ELISA結(jié)果相一致，即AVFluIgG33與越南株A/VietNam/1204/2003不反應(yīng)；而AVFluIgG33對(duì)Clade2的所有毒株，包括Clade2.1,Clade2.2,Clade2.3均具有血凝抑制活性，其中Ciade2.3主要是從中國分離的人源H5N1毒株，從表2中所列數(shù)據(jù)可以看出，AVFluIgG33對(duì)親本株A/Anhui/1/2005的血凝抑制活性最高(0.8ng/ml)，引起其它Clade2毒株發(fā)生血凝抑制所需的最低抗體范圍約在1.63.1|ig/ml之間。表2人源抗體對(duì)不同H5N1毒株的血凝抑制活性A型流感病毒亞型遺傳進(jìn)化枝濃度Og/ml)aAWluIgGllAVFluIgG33HK/156/97H5N101.6>250雨l203/04H5NIf1.6〉250Indo/5/05H5N12.13.13.1Turkey/15/06H5N12.21.63.1XJ/1/06H5N12.23.13.1AH/1/05H5N12.31.60.8GX/1/05H5N12.31,61.6FJ/1/05H5N12.33.11.6JX/1/05H5N12,33.11.6SC/1/06H5N12.33.11.6A/Fujian/1/07(FJ/1/07)H5N12.3L63.1A/Wyoming/3/03(WY/3/03)H3N2NAb>250〉250A/NewCaledonia/20/99(NC/20/99)H1N1NA>250>2509.微量中和試驗(yàn)(MNT)本發(fā)明首先分析了人源抗體對(duì)中囯不同H5N1毒株的中和活性(見表3),除了A/Xinjiang/1/06，這些中國分離株主要集中于Clade2.3,結(jié)果表明，除A/Guangdong/1/2006夕卜，AVFluIgG11能夠廣泛地中和所有中國分離毒株，AVFluIgGl1對(duì)各株病毒(1OOTCID5o)中和效率達(dá)50%時(shí)的滴度范圍主要在1.3~5.2lig/ml之間；AVFluIgG33可以廣泛中和所有的中國分離株，尤其是針對(duì)Clade2.3的中國分離株表現(xiàn)出高的中和效率，滴度范圍主要在0.83.1pg/ml。_表3人源抗體對(duì)中國不同H5N1毒株的中和活性_病毒遺傳進(jìn)化枝濃度(嗎/ml)AVFluIgG11AVFluIgG33A/Xinjiang/畫(XJ/1馬)2.21.312.5A/Anhui/1/05(AH/1/05)2.31.30.8A/Guangxi/1/05(GX/1/05)2.32.63.1A/Fujian/1/05(FJ/1/05)2.32.61.6A/Sichuan/1/06(SC/1/06)2.35.20.8A/Hunan/1/06(HN/1/06)2.31.30.8A/Zhejiang/1/06(ZJ/1/06)2.35.23,1A/Guangdong/1/06(GD/1/06)2,3>5001.6本發(fā)明進(jìn)一步分析了人源抗體對(duì)中國及其他國家不同H5N1毒株的中和活性(見表4)，結(jié)果表明，AVFluIgGll能夠廣泛地中和HA基因進(jìn)化上屬于Clade0，Clade1，Clade2.1,Clade2.2，Clade2.3的所有毒株，AVFluIgGll對(duì)各株病毒(100TCID5。)中和效率達(dá)50%時(shí)的滴度范圍主要在0.40.8嗎/ml之間；AVFluIgG33雖然不能中和Clade0的代表株A/HongKong/156/1997及Clade1的代表株A/VietNam/1204/2003;但是AVFMgG33對(duì)Clade2的所有毒株，包括Clade2.1，Clade2.2,Clade2.3均具有中和活性，其中Clade2.3主要是從中國分離的人源H5N1毒株，遍布中囯南方(A/Guangxi/I/2005、A/Fujian//2005)、北方(A/Xinjiang//2006)及中部地區(qū)(A/Anhui/1/2005、A/Hunan/1/2006、A/Zhejiang/1/2006、A/Sichuan/1/2006)。上述中和試驗(yàn)結(jié)果與血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果是相符的，表明本發(fā)明獲得了2株特異性針對(duì)H5N1禽流感血凝素HA的具有廣譜中和活性的高親和力人源單抗。_表4人源抗體對(duì)中國及其他國家不同H5N1毒株的中和活性_病毒遺傳進(jìn)化枝.濃度(pg/ml)__AVFluIgGll_AVFluIgG33A/HongKong/156/97(HK/156/97)00.4〉500A/VietNam/1203/04(VN/1203/04)10.8>500A/Indonesia/5/05(Indo/5/05)2.112.56.3A/Turkey/15/06(Turkey/15/06)2.20.46.3A/Anhui/1/05(AH/1/05)_^__^_10.動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)2株人源抗禽流感病毒單抗對(duì)小鼠的保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，2株抗體均具有保護(hù)性，并且在2.5mg/kg劑量對(duì)小鼠具有完全的保護(hù)性，其保護(hù)性具有劑量依賴性，如圖8所示。11.非高變區(qū)突變后的抗體對(duì)H5N1抗性影響按照上述9~17的方法，將基于AVFluIgGl1修改后的輕鏈基因和重鏈基因克隆到pAC-L-Fc中，并轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)，得到突變體AVFhiIgGll'。對(duì)該突變體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明AVFluIgGU，能特異性針對(duì)H5Nl禽流感病毒血凝素蛋白HA，而與甲1型和甲3型人流感病毒無交叉反應(yīng)，親和力實(shí)驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、微量中和實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)表明其性質(zhì)與AVFluIgGll基本相同。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage21</image>AspSerGlySerThrLysTyrAsnProSerLeuThrSerArgValThr505560lieSerValAspThrSerLysAsnGinPheSerLeuLysLeuSerSer65707580ValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgGlyPheTrp859095GlyLeuAspGlyPheA印lieTrpGlyGinGlyThrThrValThrVal100105110〈210〉5<211>321<212>DNA<213〉人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(321)<400>5g恥etc3CgceigccgcccteagtgtctggggccCC3C3g3gggtc48accatetectgcactgggageagetecateggggesggttatgat96gtacactggta_ccagcagcttggagccCCCaaaetcetcate144tatggtaacageeggcccteaggggtccctgaccgattctctggc192tec朋gtctggcteagcctecctggccateactgggetcC3gget240gaggatgaggetgattatt￡LCtgccagtect￡ltgacageagegttgtg288gtattcggcggsggg肌gctggtceta321<2iO〉6〈211>107<212>PRT〈213>人工序列〈400〉6GluLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGinArgVal151015ThrlieSerCysThrGlySerSerSerAsnlieGl.yAlaGlyTyrAsp202530ValHisTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeulie354045TyrGlyAsnSerAsnArgProSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGinAla65707580GluAspGluAlaAspTyrTyrCysGinSerTyrAspSerSerValVal859095ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210>7<211〉366<212〉薩<213〉人工序列<220><221>CDS<222>(l)..(366)<400>7etcgagtctgggggaggcttggtacaacctggggggtecctggtc48tectgtaca肌ctctggattcacctttElgCtatgccutg3gCtgg96gtccgccaggetccagggaaggggctgg3gtgggtcteagetattagt144ggt肌tggtggtagtggcacatactacgC3g3Ctecgtg助ggggegg192ttcaccatetec聊gacaattecaag肌Cacgatgtatctgatg24033C3gCctg卿gccgaggacacggccgt3tattactgtgtg卿gat288gactectatgatggcggtggtcattacggtctgC3Ctgg■ttc336tectggggccagggaaccetagtcaccgtc366<210>8<211>122<212>PRT<213>人工序列<400>8LeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGlySerLeuArgVal15101523SerCysThrAsnSerGlyPheThrPheSerAsnTyrAlaMetSerTrp202530ValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValS。rAlalieSer354045GlyAsnGlyGlySerGlyThrTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArg505560PheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrMetTyrLeuGinMet65707580AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysValArgAsp85恥95AspSerTyrAspGlyGlyGlyHisTyrGlyLeuHisAsnTrpPheAsp100105110SerTrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal115120<210>9<211〉649<212>腿<213>人工序列<400>9gagctccagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcact60gggaccagcagtgacgttggtgattataactatgtctcctggtatcaacagcacccaggc120a犯gcccccacactcatgatttatgatgtc肌t肌gcggccctcaggggattctaatcgc180ttctctggctcc犯gtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgag240gacg郷ctgattattactgcagctcatatacaagcagcaacacttgggtgttcggcgga300tgaccgtcctgggtragccc朋ggctgccccctcggtcactctgttcccg360ccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcat犯gtgacttc420tax:ccgggagccgtgacagtggcctgg卿gcagatagcagccccgtcaaggcgggagtg480gagaCCElCCacaccctcc犯cggccagcagctacctgagc540ctgacgcctgagcagtggaagtcccacaaaagctacagctgccaggtcacgcatgaaggg600agcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcat649<210>10〈211〉663<212>DNA<213〉人工序列<400>10ctcgagtcgggcccaggactggtg犯gccttcgg兆accctgtccctcacctgcactgtc60tctggtggctCC3tC朋t3gttactactggagctggatccggcagccccc120ctggagtggattggctatctctttgax:agtggcagtaccaagUicaacccttcactxacg180恥tcgagtcaccatatcagtggacacgtcctctccctgaagctgagctct240gtgaccgctgcggacacggctgtgcgagag樹tctggggtctcg3tggt300tttgatatatgacaacggtcaccgtctcttcagcctccacc犯gggccca360tcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggc420tgcctggtcaaggactacttccccgaatcggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctg4808CC3gCggCgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagc540agcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaat600C3C肌gCCC3ggtgg織agaaagttgagcccaaa/tcttgtgacaaaact660恥t663<210〉11〈211〉649<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉11gagctcacgcagccgccctcagtgtctggggcccc鄉(xiāng)gc灘agggtcaccatctcctgc60actgggagcagctccaacatcggggc鄉(xiāng)ttatgatgteicactggtaccagcagcttcca120ggaac鄧ccccca犯ctcctcatctatggtaacagc犯tcggccctcaggggtccctgac180cgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggct240ctgattattactgccagtccgcgttgtggtattcggcgga300gggacc卿ctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccg360ccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttc420tacccgggagccgtgacagtggcctgg犯ggca_gata^gc￡igccccgtcaaggcgggagtg480gagaccaccacsccctccaaatca^gc犯caacaagtacgcggccagcagctatctgagc540ctgacgcctgagc敏gg肌gtcccacagaa_gctacagctgccaggtcacgcatg卿gg600鄉(xiāng)3CCgtggagaagacagtggcccctaca649<210〉12〈211〉693〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉12ctcg兆tctggggg鄉(xiāng)cttggtac朋cctggggggtccctgagagtctcctgta_caaac60tctggattcacctttagcaactatgccatgagctgggtccgccaggctccaggg卿ggg120ctggagtgggtctcagctattagtggt肌tggtggtagtggcacatactacgcagactcc180gtg犯ggggcggttcaccatctccagagac犯ttccaag3acacg.atgtatctgc肌atg240aacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgctcctatgat300ggcggtggtcattacggtctgcacaactggttcgactcctggggcc郷gaaccctagtc360accgtctccgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaag420agcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaccccgaaccg480gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtc540ctaca_gtcctcaggactctactccctcagcccgtgccctxcagcagcttg600ggcacccagacctacatctgcaacgtgaatgca^cacc犯ggtggac犯g660aaagttgagcccaaatxttg恥t693<210>13<211>28<212〉腿<213>人工序列<400〉13cgcggatccatggagaaaatagtgcttc28<210>14<211>45<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉14cgcggatccttagtgatgatgatgatgatgaatgcaaattctgca45<210〉15<211〉21<212>DNA<213>人工序列<400>15aaactagctagtcgccaagga21<210〉16<211>20<212>DNA<213>人工序列〈400〉16ccgcggtggcggccgcaaat20〈210>17〈211〉28〈212〉DNA<213>人工序列〈400>17cgcggatccatggagaaaatagtgcttc28<210>18<211>26<212〉DNA<213>人工序列〈400>18ccgctcgagttatagaggactatttc2權(quán)利要求1、人源抗H5N1血凝素蛋白抗體，其輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為TGTSSDVGDYNYVS、DVNKRPS和SSYTSSNTWVF，其重鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SYYWS、YLFDSGSTKYNPSLTS和GFWGLDGFDI；或者其輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為TGSSSNIGAGYDVH、GNSNRPS和QSYDSSVVVF，其重鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為NYYAMS、AISGNGGSGTYYADSVKG、DDSYDGGGHYGLHNWFDS。2、如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNa2所示，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；或其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNo.8所示。3、如權(quán)利要求2所述的抗體，其為Fab抗體或全抗體免疫球蛋白IgG。4、編碼權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述抗體的基因。5、如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQIDNo.l所示，編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；或編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。6、含有權(quán)利要求4或5所述基因的表達(dá)載體。7、含有權(quán)利要求6所述表達(dá)載體的宿主。8、權(quán)利要求13所述任一項(xiàng)所述抗體在制備預(yù)防或治療禽流感藥物或制備禽流感診斷試劑中的應(yīng)用。9、含有權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述抗體的藥物。10、如權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于，該藥物為噴霧劑或注射劑。全文摘要本發(fā)明提供了一種人源抗H5N1血凝素蛋白廣譜中和性抗體，該抗體是運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選獲得，決定抗體特異性的高變區(qū)(CDRs)序列如圖1所示。本發(fā)明抗體特異性識(shí)別H5N1高致病性禽流感病毒顆?？乖?，且均針對(duì)禽流感病毒血凝素蛋白HA，與禽流感病毒H5N1具有明顯的免疫熒光反應(yīng)和酶聯(lián)免疫反應(yīng)，具有抗禽流感病毒H5N1感染的中和活性功能?？蓪⒈景l(fā)明抗體制成臨床上用于預(yù)防和治療由H5N1禽流感病毒引起的人禽流感的特異性抗體藥物，從而可在臨床上用于預(yù)防和治療由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感。文檔編號(hào)C07K16/10GK101538327SQ20091008340公開日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年5月4日優(yōu)先權(quán)日2009年5月4日發(fā)明者劉琴芝,孫麗娜,張全福,川李,李德新,梁米芳,舒躍龍申請(qǐng)人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所