專利名稱：一種廣譜抗人p21Ras蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株KGH-R1及單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種廣譜抗人Ras蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株KGH-Rl及單克隆抗體。
背景技術(shù)：
Ras基因是一種重要的細(xì)胞原癌基因，其命名來自大鼠肉瘤的英文rat sarcoma。Ras基因家族包括三個(gè)主要成員，S卩H-Ras, K-Ras和N-Ras，分別定位于第12、11和I號(hào)染色體，編碼由188-189個(gè)氨基酸組成的分子量約為21KD的蛋白質(zhì)，即p21Ras蛋白，三種p21Ras蛋白的氨基酸序列約有85%的同源性。p21Ras蛋白作為極其重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常分化和增殖。p21Ras蛋白定位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)面發(fā)揮其生物學(xué)功能。p21Ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分別與GTP和GDP結(jié)合形成一種分子開關(guān)機(jī)制。p21Ras蛋白在細(xì)胞外生長(zhǎng)信號(hào)刺激下與GTP結(jié)合成為活性狀態(tài)的p21Ras-GTP形式，從而激活Ras蛋白下游眾多信號(hào)通道，促進(jìn)細(xì)胞分裂、增生，抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞間接觸抑制減弱；而其在GTP酶激活蛋白水解下變成與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)。當(dāng)Ras基因發(fā)生突變、p21Ras蛋白過表達(dá)或Ras上游生長(zhǎng)因子受體活化時(shí)均可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。研究表明，大約30%的人類腫瘤中存在Ras基因突變或Ras蛋白過表達(dá)，部分學(xué)者認(rèn)為Ras蛋白主要在腫瘤形成的早期階段充當(dāng)重要角色。目前國(guó)內(nèi)尚未有國(guó)產(chǎn)化的Ras蛋白抗體，而國(guó)外的商品化抗體多是針對(duì)三種Ras蛋白的共同區(qū)域合成多肽為免疫原制備的，這樣篩選出來抗體是針對(duì)多肽序列的，且國(guó)外抗體價(jià)格通常較貴，也限制了該蛋白在臨床檢測(cè)中的推廣應(yīng)用。另外，蛋白質(zhì)發(fā)揮其生物學(xué)功能是要通過折疊形成一定空間構(gòu)象的，那么針對(duì)多肽序列所產(chǎn)生的抗體就會(huì)發(fā)生由于 Ras蛋白在折疊過程中形成空間位阻，導(dǎo)致抗體與抗原決定簇的結(jié)合能力下降；抗體所拮抗的抗原決定簇在蛋白質(zhì)折疊過程中折疊進(jìn)蛋白內(nèi)部不能暴露于蛋白質(zhì)表面，從而不能與活性狀態(tài)的Ras蛋白結(jié)合的情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種廣譜抗人p21Ras蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株KGH-Rl及其抗體，該抗體能用于ELISA、Western、免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ras蛋白，同時(shí)可為后續(xù)的Ras細(xì)胞內(nèi)抗體的制備奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的一種廣譜抗人p21Ras蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株KGH-Rl，于2011年9月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào)CCTCCNO C201197o所述的廣譜抗人p21Ras蛋白的單克隆抗體，其特征在于該抗體是將分泌廣譜抗p21Ras蛋白的交瘤細(xì)胞株KGH-R1，IX IO6個(gè)注射入預(yù)先經(jīng)滅菌液體石蠟處理過的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，然后待腹水足夠多而小鼠處于瀕死前抽取腹水，并將腹水離心收集上清獲得的。本發(fā)明中，用基因合成和RT-PCR方法得到Ras基因的⑶S區(qū)全長(zhǎng)序列，通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，原核表達(dá)重組Ras蛋白，Ras蛋白復(fù)性后作為免疫原免疫小鼠，并取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，通過三種Ras蛋白的ELISA鑒定得到的。該雜交瘤細(xì)胞分泌的抗p21Ras抗體類型為IgG2b、κ。本發(fā)明中所參考的人H-Ras、K-Ras、N-Ras基因序列在GeneBank的登記號(hào)分別為NM_005343、M54968 和 BC005219。本發(fā)明中K-Ras、N-Ras基因的全蛋白表達(dá)序列(⑶S)通過人工合成方式獲得。H-Ras的CDS區(qū)全長(zhǎng)序列是從肝癌細(xì)胞株7703 (來自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))中由RT-PCR方法獲得，擴(kuò)增基因引物序列為，正義鏈5’ -GGATCCAGAGGAGCGATGACGGAATATA-3’，上游引入 BamH I 酶切位點(diǎn)，反義鏈5’-AAGCTT GGTGGCATTTGGGATGTTC-3’，下游 引入Hindm酶切位點(diǎn)，原核表達(dá)載體為PET-28a ( + )。所述雜交瘤細(xì)胞株KGH-Rl的制備方法是將原核表達(dá)的p21Ras_H、p21Ras_N、p2IRas-K三種Ras蛋白經(jīng)親和純化、復(fù)性后，用p21Ras_H為免疫原免疫小鼠，取血清效價(jià)大于I: IO6的Balb/c小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50%PEG_4000進(jìn)行融合，經(jīng)次黃嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶脫氧核苷培養(yǎng)液(HAT)選擇性培養(yǎng)(含20%的胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基)，用分別包被有復(fù)性后的H-Ras、K-Ras、N-Ras蛋白的ELISA板進(jìn)行ELISA篩選，經(jīng)過多次有限稀釋，篩選出穩(wěn)定分泌高效價(jià)的同時(shí)拮抗人p21Ras-H、p21Ras-N、p21Ras-K的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為KGH-Rl。KGH-Rl單克隆抗體的制備方法是以IX IO6個(gè)/只的細(xì)胞數(shù)將雜交瘤細(xì)胞KGH-Rl注入BALB/c小鼠腹腔，飼養(yǎng)10-14天，每日觀察小鼠狀況，等小鼠腹部膨脹時(shí)抽取腹水，以分別包被有三種Ras蛋白的ELISA板進(jìn)行抗體效價(jià)及特異性鑒定；染色體計(jì)數(shù)確認(rèn)融合成功；免疫層析實(shí)驗(yàn)鑒定抗體亞型；進(jìn)一步用純化的三種Ras蛋白行SDS-PAGE，以上述雜交瘤細(xì)胞株KGH-Rl的培養(yǎng)液上清(含所分泌的抗體)為一抗進(jìn)行Western blot鑒定；并以該上清為一抗對(duì)19株腫瘤細(xì)胞株，分別是人胃癌細(xì)胞株BGC-853、MKN28，人肝癌細(xì)胞株QGY-7703、SMMC-7721、H印G2，人乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCT-7，人白血病細(xì)胞株 THP-I、K562、MT4 CD4+、Daud I、C8166 CD4+、HL60，人宮頸癌細(xì)胞株 HeLa，人喉鱗癌細(xì)胞株H印-2，人卵巢癌細(xì)胞株SK0V3，人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCTl 16，人膀胱癌細(xì)胞株T-24 (以上細(xì)胞株均來自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)；對(duì)人體各系統(tǒng)常見的癌腫及正常組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示該單克隆抗體的敏感性及特異性均較高，可特異性識(shí)別天然構(gòu)象的p21Ras-H、p21Ras-N、p21Ras_K,可用于臨床診斷性實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明利用大腸桿菌原核表達(dá)H-Ras、K-Ras, N-Ras基因CDS區(qū)(蛋白編碼區(qū))的全長(zhǎng)序列，通過蛋白質(zhì)復(fù)性后恢復(fù)Ras蛋白的活性空間構(gòu)象，用復(fù)性后的p21Ras-H作為免疫原免疫小鼠，并分別用p21Ras-H、p21Ras_N、p21Ras_K蛋白進(jìn)行ELISA篩選，由于三種p21Ras蛋白的氨基酸序列約有85%的同源性，最終獲得同時(shí)拮抗三種活性狀態(tài)Ras蛋白的廣譜單克隆抗體，該針對(duì)p21Ras蛋白的單克隆抗體可用于Ras蛋白的臨床檢測(cè),還可進(jìn)一步構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)抗體，通過拮抗過表達(dá)的Ras蛋白，抑制組織的惡性轉(zhuǎn)化而起到積極的預(yù)防腫瘤發(fā)生作用，對(duì)過表達(dá)Ras蛋白的腫瘤則起到積極的靶向治療作用。


圖I 為 PET_28a(+)圖譜。圖2為H-Ras- PET_28a(+)測(cè)序 部分序列。圖3為K-Ras- PET_28a(+)測(cè)序部分序列。圖4為N-Ras- PET_28a(+)測(cè)序部分序列。圖5 為 p21Ras 的 Western blot 分析；
M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Marker),
泳道1-3 :分別為純化后的H，K，N-p21Ras蛋白，
泳道4 :陰性對(duì)照為不含重組質(zhì)粒的空白細(xì)菌誘導(dǎo)后的上清。圖6腹水抗p21Ras單克隆抗體效價(jià)測(cè)定；
檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞KGH-Rl腹腔注射小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水中抗體的效價(jià)，稀釋倍數(shù)依次為 I :300,1 :600,1 :1200、1:2400、1 :4800,1 :9600,1 :19200,1 :38400,1 :76800,1 153600。圖7為雜交瘤細(xì)胞染色體檢測(cè)瑞士染色400 X，染色體數(shù)目約為97條。圖8為抗p21Ras單克隆抗體免疫蛋白的類型及亞型檢測(cè)，類型為IgG2b、κ。圖9為抗p21Ras單克隆抗體的Western blot檢測(cè)；
其中，泳道1-3 :分別為原核表達(dá)的H-Ras, K-Ras, N-Ras蛋白，
泳道4-10 :分別為腫瘤細(xì)胞株QGY7703，T24, H印2，SK0V3, HCTl 16，SMMC7721, BGC853 提取的蛋白。圖10為抗H-Ras，K-Ras, N-Ras單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞株免疫組化染色結(jié)果； 其中，圖 A、B、C、D 分別為 HCT116、QGY7703、BGC853、SK0V3 細(xì)胞株 ICC 染色 SP 法 400 X
(胞質(zhì)和胞膜陽性，細(xì)顆粒狀)。圖11為抗p21Ras_H、N、K單克隆抗體對(duì)乳腺癌組織免疫組化結(jié)果；
SP法200X 400X (胞質(zhì)和胞膜陽性，細(xì)顆粒狀)。圖12為抗p21Ras_H、N、K單克隆抗體對(duì)膀胱癌組織免疫組化結(jié)果；
SP法200X 400X (胞質(zhì)和胞膜陽性，細(xì)顆粒狀及環(huán)胞膜深染狀)。圖13為抗p21Ras_H、N、K單克隆抗體對(duì)結(jié)腸癌組織免疫組化結(jié)果；
SP法200X 400X (胞質(zhì)和胞膜陽性，細(xì)顆粒狀及點(diǎn)彩狀)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
(I)免疫原的制備
從肝癌細(xì)胞株7703 (中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))中提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增H-Ras基因⑶S區(qū)。采取全基因合成技術(shù)，按照Genebank中編號(hào)為M54968和BC005219的序列分別人工合成K，N-Ras mRNA對(duì)應(yīng)的⑶S區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)載體H-Ras-PET-28a (+)、K-Ras-PET_28a (+)和 N-Ras-PET_28a (+)，在大腸桿菌 BL21 (DE3)中表達(dá)，利用Ni2+-NTA親和層析純化，梯度透析復(fù)性獲得純度在95%以上的復(fù)性重組人H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白，分別命名為 p21Ras_H、p21Ras_K、p21Ras_N。(2)分泌廣譜抗p21Ras蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株KGH-Rl的建立 ①BALB/c小鼠的免疫
以純化的p21Ras-H為免疫原，免疫4-6周齡的BALB/c小鼠。第一次免疫時(shí)將p21Ras_H與等量的完全福氏佐劑混合以每只100μ g/500ul的量多點(diǎn)注射到小鼠皮下；隔兩周后將p21Ras-H與等量的不完全福氏佐劑混合，以每只100 μ g/500ul的量皮下多點(diǎn)注射；再隔兩周分別進(jìn)行第三、四次免疫用PBS稀釋p21Ras-H，以每只100 μ g/500 μ I的量改由腹腔注射。于第四次注射5天后尾靜脈取血進(jìn)行ELISA檢測(cè)效價(jià)，取效價(jià)大于I: IO6的Balb/c小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行融合。②雜交瘤細(xì)胞的制備
在無菌操作臺(tái)內(nèi)，取第四次加強(qiáng)免疫后3天的Balb/c小鼠脾B淋巴細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞按二者數(shù)量比5 :1放于50ml無菌圓底玻璃刻度離心管內(nèi)，用20ml預(yù)溫至370C的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，用手指輕彈離心管底使細(xì)胞沉淀呈糊狀，然后在37°C水浴中緩慢、逐滴、沿離心管內(nèi)壁加入預(yù)溫的I ml濃度為50%的聚乙二醇，邊加邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，確保在一分鐘內(nèi)加完，加完后靜置一分鐘。立即滴加預(yù)溫至37°C的無血清RPMI1640培養(yǎng)液15 ml以終止聚乙二醇的作用，第一分鐘內(nèi)逐滴、緩慢滴加完I ml ;第二分鐘內(nèi)滴加3 ml ;第三分鐘加完剩余的11 ml，最后補(bǔ)加預(yù)溫至37°C的無血清RPMI1640培養(yǎng)液至40ml，輕柔混勻，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，緩慢加入30ml預(yù)溫至37°C的含20% (V/V)新生小牛血清的HAT選擇性細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，混勻，鋪預(yù)先制備好的加有小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板3塊，放37°C、5%C02恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。③雜交瘤細(xì)胞的篩選和單克隆化
融合成功的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行間接ELISA法篩選出分泌廣譜拮抗p21Ras-H、p21Ras_K、p21Ras-N抗體的細(xì)胞株。用PH 9. 6的O. 05M碳酸鹽緩沖液將p21Ras_H、p21Ras_K、p21Ras-N分別稀釋至5μ g/ml，在每個(gè)酶標(biāo)板孔內(nèi)加入100 μ I稀釋后蛋白液，4°C冰箱內(nèi)過夜包被。第二天棄孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干，每孔加入O. 15M PBS-Tweenz洗漆緩沖液300 μ 1，置震蕩搖床上，200rpm，振搖3分鐘，棄孔內(nèi)液體，吸水紙拍干，重復(fù)洗滌3次。每孔加入1%BSA-PBS封閉液100 μ 1，置37°C恒溫恒濕細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)孵育I小時(shí)，洗板三次。每孔加入100 μ I適當(dāng)稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，置濕盒內(nèi)37°C恒溫孵育I小時(shí)后洗板三次，同時(shí)設(shè)置空白、陰性、陽性對(duì)照。每孔加入I :2000稀釋的酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG) 100 μ 1，置濕盒內(nèi)37°C孵育40分鐘后洗板三次。用重蒸餾水重復(fù)洗滌2次后每孔加入100 μ I新鮮配制的TMB (四甲基聯(lián)苯胺)底物液，避光作用5-10分鐘，當(dāng)陽性對(duì)照明顯呈藍(lán)色而空白、陰性對(duì)照呈無色時(shí)即可每孔加入2Μ H2SO4 50 μ1終止反應(yīng)。放酶標(biāo)儀內(nèi)讀取OD45tl值，凡待測(cè)孔值/陰性對(duì)照孔值> 2即為陽性。將準(zhǔn)備克隆化的雜交瘤細(xì)胞群落從細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板孔內(nèi)輕輕吹下，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20% (V/V)新生小牛血清的HT (次黃嘌呤胸腺嘧啶脫氧核苷)細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋為5-10個(gè)細(xì)胞/ml。在加有飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的96孔酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入100μ I稀釋后的雜交瘤細(xì)胞懸液，置37°C、5%C02恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。大約第三天可見細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)雜交瘤細(xì)胞克隆形成并記錄克隆個(gè)數(shù)，第5天小心半量換取含20%(V/V)新生小牛血清HT細(xì)胞培養(yǎng)液，第7天補(bǔ)加HT細(xì)胞培養(yǎng)液100 μ I,繼續(xù)培養(yǎng)直至再次間接ELISA檢測(cè)上清中的特異性抗p21Ras單克隆抗體。選擇再次ELISA法檢測(cè)時(shí)效價(jià)高、呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)、形態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞據(jù)需按照上述方法重復(fù)進(jìn)行3次亞克隆和擴(kuò)大培養(yǎng)，第2-4次克隆化時(shí)換用含20% (V/V)新生小牛血清RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液代替20% (V/V)新生小牛血清的HT選擇性細(xì)胞培養(yǎng)液。將第四次克隆化后，上清抗三種Ras蛋白的雜交瘤細(xì)胞命名為KGH-Rl，送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。(3)廣譜抗p21Ras蛋白單克隆抗體的大量制備及效價(jià)測(cè)定
將雜交瘤細(xì)胞KGH-Rl注射入預(yù)先經(jīng)滅菌液體石蠟處理過的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)(I X IO6個(gè)/只)，每天密切觀察小鼠情況，待腹水足夠多而小鼠處于瀕死前抽取腹水，離心收集上清，加入終濃度為O. 2g/L疊氮鈉備用。將制備的腹水倍比稀釋后進(jìn)行間接ELISA法
測(cè)定其效價(jià)，結(jié)果示5株單抗的效價(jià)均在I :100000以上。(4)單克隆抗體的特征性鑒定
①分泌廣譜抗p21Ras蛋白的雜交瘤細(xì)胞株染色體檢測(cè)
將雜交瘤細(xì)胞株KGH-Rl傳代培養(yǎng)48小時(shí)后加入O. 1%秋水仙素應(yīng)用液，使其終濃度為O. 05-0. I μ g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2. 5小時(shí)。用IOml移液管輕輕吹下半貼壁生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，移入15毫升無菌刻度離心管內(nèi)，IOOOrpm,離心10分鐘，棄上清，加入5毫升預(yù)溫至37攝氏度的O. 075mol/L氯化鉀溶液，用滴管輕輕吹打混勻，放37攝氏度水浴內(nèi)15-20分鐘，加入I毫升新鮮配制的固定液并混勻，IOOOrpm,離心10分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀加入5毫升固定液，室溫下靜置30分鐘，IOOOrpm,離心10分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀加入2_5毫升固定液后輕輕吹散細(xì)胞。吸取2-3滴細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷的潔凈載玻片上，立即輕輕吹散細(xì)胞，在酒精燈火焰上通過幾次使細(xì)胞平鋪于載玻片上，自然干燥后用瑞士染液染色10分鐘，用蒸餾水洗去染色液，自然干燥后用中性樹膠封片，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)完整的分裂中期的雜交瘤細(xì)胞核，記錄染色體數(shù)目。雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)目大約為97條，提示融合成功。②廣譜抗p21Ras單克隆抗體的免疫球蛋白亞型的鑒定
根據(jù)試劑盒說明書用O. OlM pH7. 3的PBS應(yīng)用液將待測(cè)的雜交瘤細(xì)胞KGH-Rl培養(yǎng)上清稀釋到終濃度為I. O μ g/mlo從小鼠單克隆抗體分型檢測(cè)試劑盒內(nèi)(英國(guó)AbD Serotec公司datasheet:MMTl;Batch NO: 19118; 10 tests)取出檢測(cè)試紙條和密封的含有耦聯(lián)上呈色微顆粒的羊抗鼠免疫球蛋白凍干粉的試管，置室溫下片刻，吸取150 μ I上述新鮮稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加入試管內(nèi)，室溫下靜置30秒后輕輕混勻，將試紙條的紅色一端插入試管底部，當(dāng)陽性對(duì)照顯色明顯時(shí)，及時(shí)將試紙條從試管內(nèi)取出以終止反應(yīng)，風(fēng)干試紙條，判斷結(jié)果。結(jié)果顯示5株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗p21Ras抗體類型均為IgG2b、κ輕鏈,為單克隆性。③Western blot法鑒定抗p21Ras單克隆抗體的腫瘤特異性
將原核表達(dá)的三種p21Ras蛋白、原核表達(dá)空載體BL21細(xì)菌裂解液的陰性對(duì)照及19種腫瘤細(xì)胞株，分別是人肝癌細(xì)胞株QGY-7703，人胃癌細(xì)胞株BGC-853，人白血病細(xì)胞株THP-1，人白血病細(xì)胞株K562，人白血病細(xì)胞株MT4⑶4+，人白血病細(xì)胞株Daud I,人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株HCT116，人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T-24，人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，人喉鱗癌細(xì)胞株H印2，人胃癌細(xì)胞株MKN-28，人肝癌細(xì)胞株H印G2，人卵巢癌細(xì)胞株SK0V3，人白血病細(xì)胞株C8166 CD4+，人白血病細(xì)胞株HL60，人宮頸癌細(xì)胞株HeLa，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435，人乳腺癌細(xì)胞株MCF7 (上述腫瘤細(xì)胞株均來自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))的蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，目的條帶在電轉(zhuǎn)儀內(nèi)轉(zhuǎn)移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，封閉后加入從雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，37°C恒溫恒濕孵育I小時(shí)進(jìn)行免疫雜交。加入適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG (從Lengton生物公司獲得，Cat No:LTE007), 37°C恒溫恒濕孵育I小時(shí)進(jìn)行DAB(3, 3’ - 二氨基聯(lián)苯胺)顯色或化學(xué)發(fā)光法顯色。結(jié)果顯示KGH-Rl雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的抗p21Ras單克隆抗體能與原核表達(dá)的三種p21Ras蛋白結(jié)合，同時(shí)也能與腫瘤細(xì)胞所提取的p21Ras蛋白結(jié)合且表觀分子量大小正確。④免疫組織化學(xué)鑒定抗p21Ras單克隆抗體的腫瘤特異性
將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述19種腫瘤細(xì)胞株收集于刻度離心管內(nèi)，離心棄上清，細(xì)胞沉淀用生理鹽水洗一遍，離心棄上清，用95%乙醇重懸細(xì)胞沉淀，離心后讓細(xì)胞沉淀在95%乙醇·中固定3小時(shí)，小心取出腫瘤細(xì)胞沉淀塊按常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化及高壓抗原修復(fù)后，加入本申請(qǐng)人制備的廣譜抗Ras蛋白的雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表達(dá)p21Ras蛋白的情況，所用免疫組化標(biāo)記試劑盒為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品(UltraVision Plus Detection System,REF:TP-125-HLX，L0T:HLX-90609)。結(jié)果顯示本室制備的單克隆抗體與其中的15種腫瘤細(xì)胞株呈陽性反應(yīng)。選取人體各系統(tǒng)常見的腫瘤病例及正常組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。SP法試劑盒為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品(UltraVision Plus Detection System,REF:TP-125-HLX，L0T:HLX-90609)。首先鏡下重新審閱各病例的蘇木素伊紅(HE)染色切片，選取病變完整且無明顯的出血、壞死的腫瘤蠟塊進(jìn)行厚度為4um切片。用防脫片載玻片撈取組織后，按常規(guī)脫蠟、水化及高壓抗原修復(fù)后，加入過氧化氫(H2O2)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用Ultra V Block (TA-125-UB)封閉玻片后加入本室制備的廣譜抗Ras蛋白的雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗過夜孵育，加入生物素化羊抗鼠IgG(BiotinylatedGoat Anti-polyvalent plus, TS-125-BNS)作為二抗，加鏈霉親和素過氧化物酶復(fù)合物(TS-125-HRS)后用DAB (3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺)進(jìn)行顯色，顯色時(shí)間控制在目的標(biāo)記細(xì)胞或組織著色而背景不著色為準(zhǔn)。切片經(jīng)蘇木素復(fù)染，常規(guī)中性樹膠封片后進(jìn)行鏡下觀察。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陽性及陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定按染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行記分及統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示本申請(qǐng)人制備的抗p21Ras單克隆抗體與肺鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、皮膚基底細(xì)胞癌、皮脂腺癌、B細(xì)胞淋巴瘤等中的絕大多數(shù)病例呈明顯陽性反應(yīng)，陽性表達(dá)部位為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，可以呈細(xì)顆粒、環(huán)胞膜深染狀及胞質(zhì)內(nèi)點(diǎn)彩狀染色，見附圖12、13、14。正常組織表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)一般均少于5%，染色強(qiáng)度亦為弱陽性。所有病變中的纖維間質(zhì)、血管等均呈陰性。結(jié)果證實(shí)本申請(qǐng)構(gòu)建的單克隆抗體具有良好的腫瘤特異性。
權(quán)利要求
1.一種廣譜抗人p21RaS蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株KGH-R1，于2011年9月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO :C201197。
2.一種廣譜抗人p21Ras蛋白的單克隆抗體，其特征在于該抗體是將分泌廣譜抗p21Ras蛋白的交瘤細(xì)胞株KGH-Rl，I X IO6個(gè)注射入預(yù)先經(jīng)滅菌液體石蠟處理過的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，然后待腹水足夠多而小鼠處于瀕死前抽取腹水，并將腹水離心收集上清獲得。
全文摘要
一種廣譜抗人p21Ras蛋白的單克隆抗體交瘤細(xì)胞株KGH-R1及單克隆抗體，屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種廣譜抗人Ras蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株KGH-R1及單克隆抗體。該雜交瘤于2011年9月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCCNOC201197。本發(fā)明最終獲得同時(shí)拮抗三種活性狀態(tài)Ras蛋白的鼠單克隆抗體，該針對(duì)p21Ras蛋白靶點(diǎn)的單克隆抗體可用于該蛋白的臨床檢測(cè)，還可進(jìn)一步構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)抗體，通過拮抗過表達(dá)的Ras蛋白，抑制組織的惡性轉(zhuǎn)化而起到積極的預(yù)防腫瘤發(fā)生作用，對(duì)相應(yīng)過表達(dá)Ras蛋白的腫瘤則起到積極的靶向抗癌作用。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102796707SQ201210321970
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者楊舉倫, 陳玥, 甄時(shí)建, 周云剛, 趙穩(wěn)興 申請(qǐng)人:楊舉倫