一種豬p21蛋白抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬P21蛋白抗體及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過表達(dá)和純化所得到的豬的P21蛋白制備免疫原，免疫純種新西蘭兔，制備出兔抗豬P21蛋白的抗體，所制備的兔抗豬的P21抗體能夠很好的識(shí)別豬和鼠的P21蛋白；而市售的抗人的P21抗體僅能夠有限的識(shí)別鼠的P21蛋白。本發(fā)明所制得的豬P21蛋白抗體彌補(bǔ)了豬特異性抗體缺乏的空白，為豬遺傳育種科學(xué)研究提供了材料。
【專利說明】一種豬P21蛋白抗體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬P21蛋白抗體及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在動(dòng)物的基因組中，p21、cdkl、p53、checkl、helb、atm等基因是維持動(dòng)物遺傳穩(wěn)定的主要基因，它們的穩(wěn)定表達(dá)對細(xì)胞的生長、維持和分化都具有重要的意義。
[0003]p21基因是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制家族中的重要成員，其編碼的蛋白，即P21蛋白是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白。參與細(xì)胞的生長、分化、衰老及死亡過程；p21蛋白同時(shí)又與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在細(xì)胞的生理、病理過程中發(fā)揮著重要的作用:研究表明P21能夠與cyclin D/CDK形成復(fù)合物使細(xì)胞周期停滯在Gl期；它還可以通過編碼其蛋白的氨基酸的C端與PCNA相互作用，阻斷PCNA活化DNA聚合酶的活性從而抑制DNA的合成，使細(xì)胞周期停滯。因此它與腫瘤的分化、浸潤深度、增生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，具有判斷預(yù)后的價(jià)值。
[0004]目如關(guān)于人和鼠中的p21基因的研究較多，也廣生許多針對人和鼠的p21基因而制成的抗體，但國內(nèi)外針對豬的P21基因的抗體制備非常稀少，因?yàn)樵谝载i為實(shí)驗(yàn)材料的研究中，經(jīng)常會(huì)遇到檢測某一蛋白的表達(dá)時(shí)找不到合適的抗體的情況；而目前使用市售的人和鼠的P21抗體均不能很好的檢測豬p21蛋白，這使得許多關(guān)于豬的研究無法全面的展開；隨著豬分子遺傳育種工作的深入開展，對豬特異性抗體的需求愈加強(qiáng)烈。因此，發(fā)明制備豬的P21蛋白抗體迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)中豬特異性抗體資源的不足，提供一種豬P21蛋白抗體。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種豬P21蛋白抗體的制備方法。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種豬P21蛋白抗體的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種豬P21蛋白抗體，它以豬的P21蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，分離動(dòng)物抗血清，純化后得到豬P21蛋白抗體。 [0009] 本發(fā)明同時(shí)提供了所述豬P21蛋白抗體的制備方法，包括以下步驟:
51.克隆得到豬P21基因，將豬P21基因進(jìn)行原核表達(dá)得到豬P21蛋白；
52.將豬P21蛋白進(jìn)行純化，獲得純度較高的P21蛋白；
53.將純化后的豬P21蛋白與等劑量的免疫佐劑均勻混合，制成免疫原，皮下注射純種動(dòng)物，經(jīng)過多次免疫后，收集動(dòng)物血清，通過蛋白A瓊脂糖凝膠純化獲得豬P21蛋白抗體。
[0010]其中S1中所述原核表達(dá)得到豬P21蛋白時(shí)IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.01mM ；S2中所述豬P21蛋白的純化方法為N1-NTA蛋白柱層析；S3中所述純種動(dòng)物為純種新西蘭兔。
[0011]S3中所述免疫原的制備方法為:將400μL純化的豬Ρ21蛋白和600μL PBS溶液和ImL完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑相互混合，攪拌20min混勻后得到的白色油乳劑即為免疫原；
本發(fā)明還提供了所述豬P21蛋白抗體的應(yīng)用，所述豬P21蛋白抗體能夠高效特異的識(shí)別豬P21蛋白；所述應(yīng)用包括用免疫學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測豬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明首次用豬P21蛋白為抗原，制備P21抗體。目前市售P21抗體主要是以人或鼠源P21蛋白所制備的，且市售的人或鼠的p21抗體均不能很好的檢測豬p21蛋白，而本發(fā)明制備的P21抗體能夠更特異的識(shí)別豬P21蛋白，不僅彌補(bǔ)了豬特異性抗體缺乏的空白，更是為以豬為研究對象的科學(xué)研究中供了材料，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0013]本發(fā)明首次制備的P21抗體通過檢測試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其效價(jià)能達(dá)到1:1000，能夠很好的應(yīng)用于科學(xué)研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明豬P21蛋白抗體的制備流程圖；
圖2為豬P21基因PCR產(chǎn)物電泳圖；1為以豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞總cDNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M 為 DL1000 DNA marker ；
圖3為含有pMD18-T-P21重組質(zhì)粒的陽性候選克隆PCR鑒定結(jié)果；1和2為單克隆菌落；M 為 DL1000 DNA marker ； 圖4為重組載體測序比對結(jié)果；
圖5為豬p21蛋白序列及信號肽預(yù)測結(jié)果；
圖6為不同誘導(dǎo)濃度下豬P21蛋白表達(dá)量檢測7為IPTG濃度依次是0，0.01，0.05，
0.1,0.5,l,2mM時(shí)豬P21蛋白表達(dá)量；M為蛋白Marker ；
圖7為N1-NTA柱純化后P21蛋白的電泳結(jié)果；1為lysis buffer濾液；2為washbuffer濾液；3為wash buffer第二次濾液；4為純化后蛋白；M為蛋白Marker ；
圖8為經(jīng)蛋白A瓊脂糖凝膠純化后的P21蛋白抗體；1飛為純化后抗體；6為血清樣品； 為洗脫液;M為蛋白Marker ；
圖9為ELISA法檢測豬p21抗體效價(jià)；
圖10為westernblot檢測豬p21抗體；1~2為豬源蛋白；3~4為鼠源蛋白；5飛為免疫原P21蛋白；
圖11為Westernblot檢測市售抗鼠P21抗體；I為豬源蛋白；2為鼠源蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
[0016]實(shí)施例1.豬P21蛋白抗體的制備，技術(shù)路線如圖1，包括以下步驟:
S1.豬P21基因的克隆
本發(fā)明中，首先提取豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板克隆得到豬P21基因。具體包括以下步驟:Sll.總RNA的提取:豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞總RNA的提取參照TAKARA公司的RNAiso Plus總RNA提取試劑使用說明書。
[0017]S12.總RNA的反轉(zhuǎn)錄:提取得到的總RNA的反轉(zhuǎn)錄參照TIANGEN公司的TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行操作,具體步驟如下:
在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應(yīng)混合物:
【權(quán)利要求】
1.一種豬P21蛋白抗體，其特征在于，以豬的P21蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，分離動(dòng)物抗血清，純化得到豬P21蛋白抗體。
2.—種權(quán)利要求1所述的豬P21蛋白抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.克隆得到豬P21基因，將豬P21基因進(jìn)行原核表達(dá)得到豬P21蛋白； 52.將豬P21蛋白進(jìn)行純化，獲得純度較高的P21蛋白； 53.將純化后的豬P21蛋白與等劑量的免疫佐劑均勻混合，制成免疫原，皮下注射純種動(dòng)物，經(jīng)過多次免疫后，收集動(dòng)物血清，通過蛋白A瓊脂糖凝膠純化獲得豬P21蛋白抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬P21蛋白抗體的制備方法，其特征在于，SI中所述原核表達(dá)時(shí)，確定IPTG的誘導(dǎo)濃度為ImM。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬P21蛋白抗體的制備方法，其特征在于，S2中所述豬P21蛋白的純化方法為N1-NTA蛋白柱層析。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬P21蛋白抗體的制備方法，其特征在于，S3中所述免疫原的制備方法為:將400μL純化的豬Ρ21蛋白和600μL PBS溶液和ImL完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑相互混合，攪拌20min混勻后得到的白色油乳劑即為免疫原。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬P21蛋白抗體的制備方法，其特征在于，S3中所述純種動(dòng)物為純種新西蘭兔。
7.—種權(quán)利要求1所述的豬P21蛋白抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述豬P21蛋白抗體能夠高效特異的識(shí)別豬 P21蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的豬P21蛋白抗體的應(yīng)用，其特征在于，包括用免疫學(xué)方法檢測豬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
【文檔編號】C07K16/18GK103880953SQ201410075635
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】王翀, 徐建, 吳珍芳, 張守全, 余麗明, 鄒潭, 焦義仁, 段軍莉, 史中元, 蔣承鳳 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)