應(yīng)用microRNA-7抑制前列腺腫瘤生長及其腫瘤進(jìn)程的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及應(yīng)用microRNA-7抑制前列腺腫瘤生長及其腫瘤進(jìn)程。本發(fā)明通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-7的前列腺癌細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系，并建立相應(yīng)的裸小鼠皮下荷瘤動物模型，在體外及體內(nèi)驗證了miR-7抑制前列腺腫瘤細(xì)胞生長以及前列腺癌干細(xì)胞“干性維持”能力的作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后，可以靶向抑制PI3K/Akt信號通路的表達(dá)，降低Akt的活性，并顯著下調(diào)其下游周期調(diào)控蛋白p21的磷酸化水平，促進(jìn)了非磷酸化的p21蛋白的入核，從而在腫瘤細(xì)胞中實現(xiàn)了細(xì)胞周期進(jìn)程的阻滯，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖能力。本發(fā)明在體內(nèi)外均驗證了miR-7具有抑制前列腺腫瘤生長以及腫瘤進(jìn)程的作用。提示了miR-7這類天然核酸分子作為新型的小分子藥物在前列腺癌的臨床治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】應(yīng)用microRNA-7抑制前列腺腫瘤生長及其腫瘤進(jìn)程

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種微小RNA，microRNA-7 (miR-7)。在前列 腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)miR-7可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長。同時，通過抑制前列腺癌 干細(xì)胞干性維持的能力，穩(wěn)定過表達(dá)miR-7可以有效地抑制前列腺癌的腫瘤進(jìn)程。提示了 將miR-7作為天然核酸類小分子藥物可應(yīng)用于針對前列腺癌的靶向基因治療中。

【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤，其中95%發(fā)病于60歲以上的老年群體中。 隨著我國人口老齡化程度的加深，每年約有7-8萬名前列腺癌新增病例，發(fā)病率以每年 25%-30%的速度增長，成為發(fā)病率增加最快的惡性腫瘤。在北京，上海，廣州等沿海發(fā)達(dá)城 市，前列腺癌已經(jīng)成為危害老年男性健康的重大疾病。因此，全面深入了解其腫瘤發(fā)生的機 制或能為相關(guān)的臨床治療提供全新的思路。已有的研究表明，如列腺癌的臨床表現(xiàn)與目iu 盛行的腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs)理論相一致[1]。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，腫瘤是由 體細(xì)胞突變而成，每個腫瘤細(xì)胞都可以無限制地生長。但這無法解釋腫瘤細(xì)胞似乎具有無 限的生命力以及并非所有腫瘤細(xì)胞都能無限制生長的現(xiàn)象。臨床上常規(guī)療法（包括化療、 放療、激素療法等）通常不能殺死腫瘤組織的所有腫瘤細(xì)胞。不能被殺死的腫瘤細(xì)胞和能 被殺死的腫瘤細(xì)胞顯然具有不同的生物學(xué)特性。也就是說，腫瘤組織含有不同類型的腫瘤 細(xì)胞，不同的腫瘤細(xì)胞具有不同的分子生物特性。腫瘤組織在細(xì)胞和分子水平上是不均一 的。其中大多數(shù)細(xì)胞對常規(guī)療法敏感，而那些小數(shù)目的對常規(guī)療法不敏感的細(xì)胞，具有高致 瘤性，高遷移性，其生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點與干細(xì)胞的基本特性十分相似，被稱為"腫瘤干 細(xì)胞"，這就是"腫瘤干細(xì)胞"理論[2]。腫瘤干細(xì)胞理論在急性粒細(xì)胞白血病、乳腺癌、腦腫 瘤、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和黑色素瘤的研究工作[3-10]中得到了支持：腫瘤干細(xì)胞 的存在、其干性的強弱，與腫瘤抵抗放化療能力的強弱、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及腫瘤預(yù)后與復(fù) 發(fā)等腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)。這一理論為本發(fā)明重新認(rèn)識前列腺腫瘤的起源和本質(zhì)，以及臨床 治療提供了新的方向和視覺角度。
[0003] 對于前列腺癌干細(xì)胞，研究其基本生物學(xué)特性及相關(guān)的調(diào)控機制將有助于本發(fā)明 進(jìn)一步認(rèn)識前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。其中，"干性維持"(maintenance of pluripotency) 能力是前列腺癌干細(xì)胞維持自身數(shù)量、保持自我更新和分化能力的必要條件[11]。已有的 研究表明多種因子及信號通路與前列腺癌干細(xì)胞"干性維持"能力的調(diào)控相關(guān)[12-16]。最 近的研究又進(jìn)一步指出microRNAOniRNA)在前列腺癌干細(xì)胞"干性維持"的調(diào)控過程中發(fā) 揮了重要的作用[17-24]。
[0004] microRNA(miRNA)是一種內(nèi)源的非編碼小RNA，已有的研究表明，miRNA在包括前 列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中都具有調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[24-26]。microRNA-7 (miR-7) 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA。在肝癌、結(jié)直腸癌、頭頸癌、乳腺癌、胃癌、神經(jīng)瘤等多種腫瘤 中已經(jīng)證實miR-7能發(fā)揮顯著的抑癌作用[25, 27-34]。但是miR-7是否在前列腺癌中發(fā)揮 抑癌基因的作用，是否通過調(diào)控前列腺癌干細(xì)胞的"干性維持"參與前列腺癌腫瘤進(jìn)程的調(diào) 控，以及相關(guān)的作用機制都尚不明了。
[0005] 基于此，本發(fā)明通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-7的前列腺癌細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系，并建 立相應(yīng)的裸小鼠荷瘤動物模型，在體外、體內(nèi)評估m(xù)iR-7對于前列腺癌細(xì)胞的生長抑制作 用，以及對于前列腺癌干細(xì)胞"干性維持"能力的調(diào)控作用并且闡明其可能的作用機制。本 發(fā)明發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)miR-7有效地抑制了腫瘤細(xì)胞在體外、體內(nèi)的生 長。同時miR-7能有效地抑制前列腺癌干細(xì)胞的"干性維持"能力，提示其具有通過調(diào)控前 列腺癌干細(xì)胞干性抑制腫瘤進(jìn)程的能力。該發(fā)明對于改進(jìn)已有的前列腺癌臨床診斷與治療 方案具有積極的借鑒意義，同時，將miR-7作為天然核酸類小分子藥物可應(yīng)用于針對前列 腺癌的靶向基因治療中。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是應(yīng)用miR-7抑制前列腺腫瘤細(xì)胞的生長，抑制腫瘤進(jìn)程（通過削 弱前列腺癌干細(xì)胞的干性維持能力）。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了 microRNA-7在作為PI3K/Akt信號通路的表達(dá) 抑制劑方面的作用。
[0008] 本發(fā)明還提供了 microRNA-7在作為KLF4的靶向抑制劑中的作用。
[0009] 本發(fā)明還提供了 microRNA-7在制備抑制前列腺腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供了 micr〇RNA-7在制備阻滯前列腺腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的藥物中的應(yīng) 用。
[0011] 本發(fā)明通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-7的前列腺癌細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系，并建立相應(yīng)的 裸小鼠皮下荷瘤動物模型，在體外及體內(nèi)驗證了 miR-7抑制前列腺腫瘤細(xì)胞生長以及前列 腺癌干細(xì)胞"干性維持"能力的作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后，可以靶向抑制PI3K/ Akt信號通路的表達(dá)，降低Akt的活性，并顯著下調(diào)其下游周期調(diào)控蛋白p21的磷酸化水平， 促進(jìn)了非磷酸化的P21蛋白的入核，從而在腫瘤細(xì)胞中實現(xiàn)了細(xì)胞周期進(jìn)程的阻滯，抑制 了腫瘤細(xì)胞的增殖能力。
[0012] 本發(fā)明在前列腺癌細(xì)胞系中首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個全新的miR-7的靶基因 KLF4(Kriippel-like factor4)。KLF4屬于KLF轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族的成員參與調(diào)控多種 基因的表達(dá)，這些基因涉及細(xì)胞分化，生長和凋亡等多種生物學(xué)過程，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展 過程密切相關(guān)[35, 36]。此外，KLF4已被證實與胚胎干細(xì)胞的"干性維持"密切相關(guān)。抑 制KLF4表達(dá)會減弱胚胎干細(xì)胞的"干性維持"能力[37]。在前列腺癌中本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn) miR-7通過靶向抑制KLF4的表達(dá)削弱了前列腺癌干細(xì)胞的"干性維持"能力。在穩(wěn)定過表 達(dá)miR-7的前列腺癌細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系中，通過細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶44、⑶133分選前列腺癌 干細(xì)胞（CD44+/CD133+)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所得的前列腺癌干細(xì)胞在體外的成球能力以及體內(nèi)的 再次成瘤能力顯著下降，且已知的干性因子（KLF4，0ct4，Sox2, Nanog)的表達(dá)被顯著抑制 了。
[0013] 本發(fā)明構(gòu)建了鑒定miRNA靶標(biāo)分子的熒光素酶報告系統(tǒng)：通過常規(guī)的分子生物學(xué) 方法，本發(fā)明以表達(dá)Firefly熒光素酶基因的phEW-luc質(zhì)粒為骨架[40]，通過限制性內(nèi)切 酶Bglll單酶切，插入人工合成的與需要研究的miRNA完全互補配對的序列（此處以miR-7 為例，但不限于此），構(gòu)建陽性對照報告載體。該序列除兩端包含Bglll酶切識別位點外， 在5'端和3'端還分別引入限制性內(nèi)切酶Nhel和EcoRV的酶切識別位點（序列四）。通 過Nhel/EcoRV雙酶切，可去除陽性對照序列并將質(zhì)粒骨架線性化。通過常規(guī)PCR方法克 隆或人工合成靶標(biāo)基因 mRNA的3'UTR序列，同時在其5'端和3'端分別引入限制性內(nèi)切 酶Nhel (或其同尾酶Xbal)和EcoRV(或其他產(chǎn)生平末端的限制性內(nèi)切酶）的酶切識別位 點。通過雙酶切該片段，再與線性化的質(zhì)粒骨架進(jìn)行連接，構(gòu)建含有靶標(biāo)基因 mRNA3' UTR 序列的報告載體。將報告載體或陽性對照載體與表達(dá)Renilla突光素酶基因的內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-cmv(購于美國promega公司）、需研究的miRNA的次級前體分子pre-miRNA(此處以 pre-miR-7為例，但不限于此）或其成熟分子的模擬物mimic，三者使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法 共轉(zhuǎn)染人源的細(xì)胞系（此處以人的前列腺癌細(xì)胞系PC3為例，但不限于此）。轉(zhuǎn)染后18? 24小時，使用雙熒光素酶檢測試劑盒（購于美國promega公司）檢測并計算相對熒光素酶 的活性，考察預(yù)期的靶標(biāo)基因是否確實受所研究的miRNA調(diào)控（此處以miR-7及其靶標(biāo)基 因 KLF4為例，但不限于此，詳見實施例2)。在本發(fā)明中，運用該系統(tǒng)，本發(fā)明首次在前列腺 癌中驗證了一個miR-7的靶標(biāo)基因 KLF4。
[0014] 本發(fā)明評估了 miR-7作為天然的核酸小分子藥物應(yīng)用于前列腺癌的靶向基因治 療的可行性，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。具體是通過構(gòu)建一個在真核細(xì)胞中表達(dá)miR-7 的表達(dá)載體，運用嘌呤霉素抗性及EGFP熒光陽性聯(lián)合篩選的方法構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-7的 前列腺癌亞克隆細(xì)胞系。以PC3為例，在其亞克隆細(xì)胞系PC3-miR-7中，miR-7的穩(wěn)定表達(dá) 量相對于對照PC3-null增高了近26倍。建立相應(yīng)的小鼠皮下植瘤模型后發(fā)現(xiàn)，PC3-miR-7 來源的腫瘤組織，接種后30天其腫瘤體積為對照組的0. 5倍，瘤重為對照的0. 44倍。其中， 用于真核細(xì)胞表達(dá)miRNA的表達(dá)載體、嘌呤霉素抗性及EGFP熒光陽性聯(lián)合篩選構(gòu)建穩(wěn)定過 表達(dá)miRNA亞克隆細(xì)胞系的方法、用于鑒定miRNA靶標(biāo)分子的熒光素酶報告系統(tǒng)、以及小鼠 皮下植瘤動物模型的建立，除了適用于評估m(xù)iR-7抑制前列腺腫瘤生長的作用，也可應(yīng)用 于評估其他miRNA調(diào)控腫瘤進(jìn)程的作用，具有廣泛的應(yīng)用價值。
[0015] 本發(fā)明通過標(biāo)記特定的前列腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞表面分子通過流式細(xì)胞分選獲 得前列腺癌干細(xì)胞：對于體外培養(yǎng)的亞克隆細(xì)胞系，本發(fā)明通過常規(guī)的0.05%胰酶（含 0. 02% EDTA)消化，完全培養(yǎng)基中和胰酶后離心收集細(xì)胞的方法；對于皮下植瘤獲得的腫 瘤組織，本發(fā)明通過機械剪切，IV型膠原酶（1毫克/毫升）+胰酶消化（0. 01 % )，完全培養(yǎng) 基中和胰酶后離心收集細(xì)胞的方法，最終將?1〇8個細(xì)胞用基本培養(yǎng)基重懸于EP管中并定 容到100微升。同時加入APC標(biāo)記的人的⑶44抗體[38]和PE標(biāo)記的人的⑶133抗體[39] 各5微克（兩種抗體均購于德國美天旎MACS公司），4°C避光孵育40?50分鐘，離心去除 上清，用PBS重懸漂洗1?2次后，用含1% FBS的PBS重懸到適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)行流式細(xì)胞分 選。獲?、?4+⑶133+雙陽性細(xì)胞和⑶44TD133_雙陰性細(xì)胞。通過檢測兩群細(xì)胞干性相關(guān) 因子的表達(dá)（詳見實施例7)、梯度稀釋后體外成球能力分析（詳見實施例8)、皮下成瘤能 力分析（詳見實施例9)，結(jié)合已有的相關(guān)報道，驗證CD44+CD133+雙陽性細(xì)胞即前列腺癌干 細(xì)胞（S cell)，⑶44XD133^雙陰性細(xì)胞為分化程度較高的非癌干細(xì)胞（NS cell)。結(jié)果顯 示穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后前列腺癌干細(xì)胞（PC3-miR-7-S)的比例下降為對照組（PC3-null-S) 的〇. 75倍。將分選所得的細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋再次成瘤，發(fā)現(xiàn)PC3-miR-7-S來源的腫瘤在接 種后40天（接種量102個細(xì)胞）才有可見的瘤狀突起，比PC3-null-S來源（對照）的腫 瘤出現(xiàn)瘤狀突起的時間推遲了 10天。到接種后70天，其體積為對照組的0. 29倍，瘤重為 對照的0. 31倍。同樣對于雙陰（PC3-null-NS、PC3-miR-7-NS)的細(xì)胞群，進(jìn)行該實驗后也 發(fā)現(xiàn)PC3-miR-7-NS來源的腫瘤，接種后50天（接種量105個細(xì)胞），體積為對照組的0. 36 倍，瘤重為對照的〇. 45倍。其中，用于評價腫瘤干細(xì)胞"干性強弱"的梯度稀釋小鼠皮下植 瘤模型，除了適用于評估m(xù)iR-7抑制前列腺癌干細(xì)胞"干性維持"能力的作用，也可應(yīng)用于 評估其他miRNA對不同腫瘤干細(xì)胞的"干性調(diào)控"作用，同樣具有廣泛的應(yīng)用價值（詳見實 施例9)。
[0016] 本發(fā)明建立了亞克隆細(xì)胞系及前列腺癌干細(xì)胞皮下成瘤小鼠模型：將對照及亞克 隆細(xì)胞系（分別稀釋為1〇 6個細(xì)胞/50微升），或分選后獲得的CD44XD133-雙陰性細(xì)胞（稀 釋為105個細(xì)胞/50微升、10 4個細(xì)胞/50微升兩個梯度）及⑶44+⑶133+雙陽性細(xì)胞（稀 釋為103個細(xì)胞/50微升、10 2個細(xì)胞/50微升兩個梯度）重懸于基本培養(yǎng)基中，在冰上與等 體積的metrogel (購于美國BD Bioscience公司）混勻后，使用胰島素注射器注射于5周 齡無胸腺雄性裸小鼠（購于斯萊克實驗動物公司）的大腿外側(cè)皮下，建立相應(yīng)的皮下成瘤 小鼠模型。在SPF級標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)房及獨立凈化飼養(yǎng)系統(tǒng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。在適當(dāng)?shù)臅r間 點觀察，測量小鼠皮下瘤塊的體積。待體積接近lcm 3時處死小鼠，摘除腫瘤組織，用于后續(xù) 的相關(guān)分析。對于接種了⑶44TD133^雙陰性細(xì)胞或⑶44+⑶133+雙陽性細(xì)胞后獲取的腫瘤 組織，消化成單細(xì)胞后可用CD44, CD133作為標(biāo)記物再次分選前列腺癌干細(xì)胞（雙陽）及分 化程度較高的非癌干細(xì)胞（雙陰），進(jìn)行第二輪的梯度稀釋成瘤分析，以此類推。該模型可 用于長程評估腫瘤干細(xì)胞的干性維持能力（詳見實施例9)。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 本發(fā)明在體內(nèi)外均驗證了 miR-7具有抑制前列腺腫瘤生長以及腫瘤進(jìn)程（抑制前 列腺癌干細(xì)胞"干性維持"能力）的作用。提示了 miR-7這類天然核酸分子作為新型的小 分子藥物在前列腺癌的臨床治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1 :使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定miRNA與靶標(biāo)基因 mRNA3'UTR之間的互作。圖 上方是成熟的KLF4mRNA的序列概圖，通過序列比對提示在其3' UTR部分存在兩個miR-7的 識別結(jié)合位點（黑色三角所示）。圖下方是雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測的結(jié)果，表明在miR-7 存在的條件下，通過miR-7與KLF43' UTR的互作，能有效地降低Firefly熒光素酶的表達(dá)， 與scramble RNA對照相比能顯著降低相對突光活性（p < 0. 01)。這一結(jié)果提示了 miR-7 能特異性地與KLF43' UTR互作，并在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控其表達(dá)。
[0020] 圖2 :鑒定穩(wěn)定過表達(dá)miR-7的前列腺癌亞克隆細(xì)胞系。（a)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7 后，使用TaqMan MicroRNA Assay的方法鑒定PC3-miR_7中miR-7的表達(dá)量上升為對照的 26倍。（b)通過qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后，其靶標(biāo)基因 KLF4,及其下游p21 和cyclinDl ;-個已知的靶標(biāo)基因 ρ100 δ，及其下游Akt和mTOR的表達(dá)與對照相比顯著降 低。（c)通過蛋白免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn)，在蛋白水平上相關(guān)基因的表達(dá)與mRNA的表達(dá)水平 一致，即穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后相關(guān)基因的表達(dá)及活性狀態(tài)均顯著下降。同時，由于p-Akt (反 映 Akt的活性狀態(tài)）顯著下降，導(dǎo)致下游的p-p21 (定位于細(xì)胞質(zhì)中）的量隨之下降，從而 使得進(jìn)入細(xì)胞核的非磷酸化的P21的量相對增加，提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后可能造成細(xì) 胞周期阻滯。GAPDH為細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參，TBP為細(xì)胞核蛋白內(nèi)參。:p< 0.01。
[0021] 圖3:穩(wěn)定過表達(dá)miR-7可在前列腺癌細(xì)胞系中實現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。（a)通過 Hoechst方法及流式細(xì)胞分選，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期同步化后，PC3-miR-7細(xì)胞從血清饑餓的狀態(tài) 恢復(fù)（G0/G1期細(xì)胞比例< 70% )需要12個小時，而對照PC3-null細(xì)胞僅需要8個小時。 S期（b)以及G2/M期（c)細(xì)胞比例變化表明，PC3-miR-7細(xì)胞完成一個細(xì)胞周期需要約14 個小時，而PC3-null細(xì)胞需時12個小時。結(jié)果提示了在前列腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)miR-7 后，可引起細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。
[0022] 圖4 :穩(wěn)定過表達(dá)miR-7在體外能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。（a)通過CCK8 方法檢測，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后細(xì)胞在450nm處的吸光值較之對照顯著降低。提示了 穩(wěn)定過表達(dá)miR-7可以在體外，細(xì)胞貼壁生長的狀態(tài)下抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。（b)在細(xì)胞同 步化后恢復(fù)血清供給，16小時后通過免疫熒光方法檢測細(xì)胞增殖相關(guān)基因 ki-67的表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后ki-67的表達(dá)量顯著降低，提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7可以在體外 顯著抑制貼壁生長的前列腺癌細(xì)胞的增殖。顯微成像放大比例為200倍，比例尺長度為20 微米。* * :p < 0· 01。
[0023] 圖5 :穩(wěn)定過表達(dá)miR-7在體外能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的離壁生長能力。通過三 維離壁培養(yǎng)實驗，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后，前列腺癌細(xì)胞形成大細(xì)胞球（直徑> 80微米） 的能力顯著降低。圖左側(cè)展示了兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系來源的有代表性的細(xì)胞球顯微成像，放大 倍數(shù)分別為100倍和400倍，比例尺長度為50微米。圖右側(cè)為細(xì)胞球數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果。* 女：p < 0· 01。
[0024] 圖6 :穩(wěn)定過表達(dá)miR-7在體內(nèi)抑制前列腺腫瘤的生長。（a)通過建立裸小鼠皮下 植瘤模型，分別在腿部外側(cè)皮下接種PC3-null、PC3-miR-7連續(xù)觀察30天腫瘤體積變化，發(fā) 現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后腫瘤在皮下的生長得到顯著抑制。圖左側(cè)為生長曲線的統(tǒng)計結(jié)果， 右側(cè)為30天后處死小鼠，從皮下取出的腫瘤組織。（b)將取出的腫瘤組織稱取重量，發(fā)現(xiàn) PC3-miR-7來源的腫瘤組織的重量顯著低于對照。（c)分別從PC3-null、PC3-miR-7來源的 腫瘤組織中提取總RNA，通過TaqMan MicroRNA Assay的方法鑒定，發(fā)現(xiàn)PC3-miR-7來源的 腫瘤組織中miR-7的表達(dá)量仍然維持在對照的5倍以上。通過qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)其他的相 關(guān)靶基因在PC3-miR-7來源的腫瘤組織中的表達(dá)量均顯著低于其在對照中的表達(dá)量。分別 從PC3-null、PC3-miR-7來源的腫瘤組織中提取總蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測，同樣得到 與mRNA水平一致的結(jié)果。（d)分別將PC3-nul 1、PC3-miR-7來源的腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋切 片并做H&E染色，發(fā)現(xiàn)在PC3-null來源的腫瘤組織（T指示區(qū)域）中已經(jīng)有明顯的腫瘤血管 生成（黑色箭頭指示區(qū)域），并伴有一定程度的皮下脂肪滲入（*指示區(qū)域），而PC3-miR-7 來源的腫瘤組織中只有少量的紅細(xì)胞滲入（黑色箭頭指示區(qū)域），且皮膚（S指示區(qū)域）與 腫瘤組織間存在均一、界限分明的結(jié)締組織。圖左側(cè)為放大100倍的顯微成像，右側(cè)為左側(cè) 方框中區(qū)域的400倍顯微成像，比例尺長度為20微米。* :p <0· 05, * * :p <0· 01。
[0025] 圖7 :從皮下腫瘤組織、亞克隆細(xì)胞系中分別進(jìn)行流式分選前列腺癌干細(xì)胞 (CD44+CD133+)。（a)將PC3-null、PC3-miR-7亞克隆細(xì)胞（圖上方三組），以及兩者皮下接 種來源的腫瘤組織消化所得的單細(xì)胞（圖下方三組）通過APC標(biāo)記的人CD44抗體以及PE 標(biāo)記的人CD133抗體共染后進(jìn)行流式細(xì)胞分選，發(fā)現(xiàn)直接從體外貼壁生長的細(xì)胞中得到的 CD44+CD133+細(xì)胞比例在兩者中并無顯著差異，但是進(jìn)過皮下植瘤從組織中消化所得細(xì)胞中 ⑶44+CD133+細(xì)胞比例在穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后顯著下降為對照的0. 75倍，提示了穩(wěn)定過表 達(dá)miR-7后在體內(nèi)減弱了前列腺癌干細(xì)胞的干性維持能力。（b)對于分選所得的細(xì)胞進(jìn)行 甩片后，通過免疫熒光染色檢測相關(guān)干性因子（以KLF4，Nanog為例，但不限于此）的表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)無論是從體外貼壁生長的細(xì)胞中直接分選（圖上方兩行）還是經(jīng)過皮下植瘤后再消化 分選（圖下方兩行），KLF4及Nanog在細(xì)胞核中的定位及表達(dá)量在穩(wěn)定過表達(dá)mIR-7后均 顯著降低，提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后抑制了干性相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低了前列腺癌 干細(xì)胞的干性維持能力。顯微成像放大倍數(shù)為200倍，比例尺長度為10微米。
[0026] 圖8 :體外檢測穩(wěn)定過表達(dá)miR-7對前列腺癌干細(xì)胞"干性維持"能力的影響。將 PC3-null、PC3-miR-7亞克隆細(xì)胞皮下植瘤后，從腫瘤組織中分選⑶44+⑶133+前列腺癌干 細(xì)胞進(jìn)行三維離壁生長，在體外評估穩(wěn)定過表達(dá)miR-7對前列腺癌干細(xì)胞干性的影響。15 天后統(tǒng)計不同直徑的細(xì)胞球的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后，形成的大直徑（> 80微 米）細(xì)胞球個數(shù)僅占總數(shù)的約10%，顯著低于對照（35%)，提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7能通 過抑制前列腺癌干細(xì)胞的干性，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。圖左側(cè)為代表性的細(xì)胞球顯微 成像，放大倍數(shù)為400倍，比例尺長度為50微米；圖右側(cè)為細(xì)胞球數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果，* * :P < 0· 01。
[0027] 圖9 :梯度稀釋再次皮下植瘤小鼠模型在體內(nèi)評價穩(wěn)定過表達(dá)miR-7對前列腺癌 干細(xì)胞"干性維持"能力的抑制作用。（a)梯度稀釋再次皮下植瘤小鼠模型的策略概圖。（b) 通過統(tǒng)計皮下腫瘤生長曲線，發(fā)現(xiàn)對于CD44TD133^細(xì)胞（PC3-null-NS、PC3-miR-7-NS)， 在1〇 5個細(xì)胞的接種量時，穩(wěn)定過表達(dá)miR-7顯著地抑制了非腫瘤干細(xì)胞在體內(nèi)的再次生 長；對于CD44+CD133+細(xì)胞（PC3-null-S、PC3-miR-7-S)，在10 2個細(xì)胞的接種量時，穩(wěn)定過 表達(dá)miR-7同樣能通過抑制前列腺癌干細(xì)胞的干性，有效地抑制了腫瘤干細(xì)胞來源的腫 瘤組織在體內(nèi)的生長。（c)在分別接種后50天（PC3-null-NS、PC3-miR-7-NS)，及70天 (PC3-null-S、PC3-miR-7-S)，取腫瘤組織稱重，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7,對于非腫瘤干細(xì)胞 及腫瘤干細(xì)胞來源的腫瘤組織，其腫瘤重量均顯著低于對照，提示了 miR-7可以通過抑制 腫瘤干細(xì)胞的干性發(fā)揮抑制腫瘤生長及腫瘤進(jìn)程的作用。:P< 0.01。

【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0029] 實施例1
[0030] 使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定miRNA與靶標(biāo)基因 mRNA3' UTR之間的互作：將PC3 細(xì)胞（購買于中科院細(xì)胞庫，以此為例，但不限于此）在24孔板中使用DMEM完全培養(yǎng)基 (含10 %胎牛血清，購于美國Gibco公司）貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70 %?80 %時，使用 lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑（購于美國Life Technology公司）進(jìn)行如下操作：1)取3孔 細(xì)胞作為平行樣，同時轉(zhuǎn)染陽性對照報告載體（此處的陽性對照為與miR-7完全互補配對 的序列，即序列四）、表達(dá)Renilla突光素酶基因的內(nèi)參載體pRL-cmv (購于美國promega公 司）及對照scramble RNA (購于美國Life Technology公司，數(shù)據(jù)見圖1左側(cè)miR_7target 列中白色圖注）；2)取3孔細(xì)胞作為平行樣，同時轉(zhuǎn)染上述陽性對照報告載體、上述內(nèi)參載 體pRL-cmv及需研究的miRNA的次級前體分子pre-miRNA(此處以pre-miR-7為例，但不 限于此，購于美國Life Technology公司，數(shù)據(jù)見圖1左側(cè)miR-7target列中黑色圖注）； 3)取3孔細(xì)胞作為平行樣，同時轉(zhuǎn)染包含靶標(biāo)基因 mRNA3'UTR序列的報告載體（此處以 KLF43' UTR為例，見序列五，但不限于此）、上述內(nèi)參載體pRL-cmv及上述對照scramble RNA(數(shù)據(jù)見圖1右側(cè)full-length KLF43'UTR列中白色圖注）；4)取3孔細(xì)胞作為平行樣， 同時轉(zhuǎn)染上述包含KLF43' UTR序列的報告載體、上述內(nèi)參載體pRL-cmv及pre-miR-7分子 (數(shù)據(jù)見圖1右側(cè)full-length KLF43' UTR列中黑色圖注），具體操作流程按照轉(zhuǎn)染試劑 制造商提供的說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后18?24小時，使用雙熒光素酶檢測試劑盒（購于美國 promega公司）在熒光素酶冷光儀（BERTHOLD Technology)上檢測并計算相對熒光素酶的 活性R1/R2。其中R1表示報告載體表達(dá)的Firefly熒光素酶的活性，R2表示內(nèi)參載體表達(dá) 的Renilla熒光素酶的活性（圖1)。結(jié)果表明，當(dāng)有pre-miR-7存在的時候，能夠通過與 KLF43' UTR互作，在轉(zhuǎn)錄后水平上下調(diào)Firefly熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致其相對熒光素酶的活 性相比用scramble RNA時顯著降低。這一結(jié)果提示KLF4在前列腺癌中是miR-7的一個可 能的新靶標(biāo)基因。
[0031] 實施例2:
[0032] (1)構(gòu)建用于真核細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)miRNA的表達(dá)載體：以pEGP-miR質(zhì)粒為骨架 (購于美國Cell BioLab公司），通過常規(guī)的限制性內(nèi)切酶BamHI/Nhel雙酶切，將質(zhì)粒線 性化。通過人工合成所需的miRNA的前體分子序列（此處以miR-7的三種不同前體分子 pri-miR-7-1、pri-miR-7-2、pri-miR-7-3為例，但不限于此，見序列一、二、三），同時在序 列的5 '端和3 '端分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和NheI (也可以是Xbal，是NheI的同尾酶） 的識別位點。對獲得的片段進(jìn)行常規(guī)的限制性內(nèi)切酶BamHI/Nhel (也可以是BamHI/Xbal) 雙酶切，以及常規(guī)的DNA連接操作，構(gòu)建用于真核細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)miRNA的表達(dá)載體（此處以 pEGP-miR-7-1，pEGP-miR-7-2, pEGP-miR-7-3為例，但不限于此，三者均能有效地實現(xiàn)成熟 miR-7分子的表達(dá)，以下以pEGP-miR-7-l獲得的結(jié)果為例說明）。
[0033] (2)通過嘌呤霉素抗性及EGFP熒光陽性聯(lián)合篩選的方法構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miRNA的 前列腺癌亞克隆細(xì)胞系：通過常規(guī)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法（本發(fā)明中采用lip〇fectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑，購于美國Life Technology公司，但不限于此）將穩(wěn)定過表達(dá)miRNA的表達(dá)載體 (此處以pEGP-miR-7-l為例，但不限于此）或?qū)φ召|(zhì)粒pEGP-null (購于美國Cell BioLab 公司）分別轉(zhuǎn)入前列腺癌細(xì)胞系中。涉及的前列腺癌細(xì)胞系包含但不限于：PC3, DU145， LNCaP(在三者中均能成功實現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7的亞克隆細(xì)胞系構(gòu)建，以下以PC3中構(gòu)建 的亞克隆細(xì)胞系為例說明，PC3前列腺癌細(xì)胞系可從中科院細(xì)胞所獲得。轉(zhuǎn)染后72小時，通 過常規(guī)的貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法將細(xì)胞轉(zhuǎn)入直徑l〇cm的培養(yǎng)dish中擴大培養(yǎng)至細(xì)胞密度 達(dá)到70%?80%。加入嘌呤霉素（購于美國sigma公司）至終濃度0.5微克/毫升，2? 3天換液一次，持續(xù)給予嘌呤霉素10天，觀察細(xì)胞不再繼續(xù)死亡后停止嘌呤霉素篩選。收 集存活的細(xì)胞，通過常規(guī)的流式細(xì)胞分選方法，篩選出EGFP陽性細(xì)胞（pEGP-miR質(zhì)粒骨架 中含有嘌呤霉素抗性基因與EGFP的融合蛋白，該融合蛋白與miRNA前體分子共用同一的啟 動子）。該聯(lián)合篩選的方法相較于傳統(tǒng)的單一抗性基因表達(dá)篩選方法，能有效地避免因前 列腺癌細(xì)胞系自發(fā)耐藥性強造成的假陽性結(jié)果，即具有嘌呤霉素抗性且EGFP熒光陽性的 細(xì)胞才是穩(wěn)定過表達(dá)miRNA的前列腺癌亞克隆細(xì)胞。將獲得的亞克隆細(xì)胞在75cm 2細(xì)胞培 養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)并連續(xù)傳代3次，期間維持終濃度0. 5微克/毫升嘌呤霉素的含量，再次通 過流式細(xì)胞分選方法檢驗，其EGFP熒光陽性率高于95%，則可以確認(rèn)該亞克隆細(xì)胞構(gòu)建成 功。若EGFP熒光陽性率過低，可重復(fù)上述篩選過程，逐代富集EGFP熒光陽性的細(xì)胞，直至 建立所需的亞克隆細(xì)胞系PC3-miR-7。
[0034] (3)鑒定穩(wěn)定過表達(dá)miR-7的前列腺癌亞克隆細(xì)胞系：此處以PC3-miR-7細(xì)胞為 例，但不限于此。將細(xì)胞使用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，購于美國Gibco公司） 貼壁培養(yǎng)與6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70 %?80%時去除培養(yǎng)基，使用Trizol (購于美國 Life Technology公司）進(jìn)行常規(guī)的總RNA抽提。使用miR-7特異性的反轉(zhuǎn)錄引物（購于美 國Life Technology公司），miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購于美國Life Technology公司），按照 制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行miR-7的反轉(zhuǎn)錄。用同樣的方法對U44(小的核RNA, snRNA，內(nèi) 參）進(jìn)行特異性的反轉(zhuǎn)錄。將得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，分別使用miR-7特異的探針，以 及U44特異的探針（兩種探針均購于美國Life Technology公司），采用TaqMan MicroRNA Assay方法（有專用試劑盒，購于美國Life Technology公司），在實時定量PCR儀上按照試 劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行定量分析成熟的miR-7的表達(dá)量（圖2a)。結(jié)果表明，相對于對照 細(xì)胞系PC3-null，PC3-miR-7中成熟的miR-7的表達(dá)量提高了 26倍。同時，本發(fā)明使用常規(guī) 的mRNA反轉(zhuǎn)錄盒（購于日本TAKARA公司）對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR-Green 試劑（購于日本Τ0Υ0Β0公司）對KLF4, p21，cyclin Dl，pll0delta(PI3K的催化亞基）， Akt，mT0R基因的mRNA水平進(jìn)行qRT-PCR分析（圖2b)。結(jié)果表明miR-7的靶標(biāo)基因 KLF4 及其下游的p21、cyclin D1的表達(dá)；已知的miR-7的祀標(biāo)基因 pllOdelta[Hepatology，F(xiàn)ang YX]及其下游的Akt，mTOR的表達(dá)在PC3-miR-7中均顯著下降。同時，分別從PC3-null和 PC3-miR-7細(xì)胞中通過常規(guī)方法分別提取總蛋白、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白，通過蛋白免疫 印跡方法檢測了上述基因的蛋白表達(dá)量（圖2c)。結(jié)果與mRNA水平的定量分析一致，穩(wěn)定 過表達(dá)miR-7后，總蛋白中KLF4，pll0delta，Akt，p-Akt，mT0R的表達(dá)量顯著降低，其中Akt 的活化形式P-Akt的含量被顯著抑制，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中p-p21的含量下降，促進(jìn)了 p21在細(xì)胞 核中的定位和富集（抗體購于美國SantaCruz公司或CST公司）。這種富集會導(dǎo)致細(xì)胞周 期阻滯在G1-S期，提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后可能會延伸細(xì)胞周期，并因此影響細(xì)胞的增 殖。
[0035] 實施例3 :
[0036] 穩(wěn)定過表達(dá)miR-7可在前列腺癌細(xì)胞系（以PC3-miR-7細(xì)胞為例，但不限于此）中 實現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯：將PC3-miR-7及對照PC3-null通過常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法在12孔板中 貼壁培養(yǎng)，每種細(xì)胞在每個檢測的時間點需重復(fù)3個復(fù)孔。本實施例中每2小時檢測一次 各細(xì)胞時期（G0/G1期，S期，G2/M期）的細(xì)胞數(shù)量比例，連續(xù)檢測48小時，共24個時間點。 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%?70%時，將完全培養(yǎng)基替換成無血清的基本培養(yǎng)基，通過血清饑餓 30?36小時，使細(xì)胞周期同步化到G0期，并處于靜息狀態(tài)?；謴?fù)血清供應(yīng)后開始檢測，以 恢復(fù)血清供應(yīng)的起點為〇小時，依次計時。在檢測時間點用常規(guī)細(xì)胞消化收集方法進(jìn)行消 化收集，即用0. 05%胰酶（含0. 02% EDTA)進(jìn)行細(xì)胞消化后，中和胰酶并離心收集細(xì)胞，用 1 X PBS重懸后離心一次去除殘余的培養(yǎng)基，將所收集到的細(xì)胞沉淀用500微升1 X PBS重懸 并轉(zhuǎn)移至5毫升流式細(xì)胞分選上樣管中。加入1微升10毫克/毫升濃度的Hoechst (購于 美國Molecular Probe公司），37°C避光孵育10分鐘，通過流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行細(xì)胞周期分 析，使用ModfitLT軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對數(shù)據(jù)統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后細(xì)胞從血清 饑餓狀態(tài)中恢復(fù)（G0/G1期比例低于70% )的能力減弱，對照PC3-null中恢復(fù)需要8個小 時，而PC3-miR-7需要12小時（圖3a)。其次，從各個時期的比例變化可見，對照PC3-null 在血清饑餓恢復(fù)后完成一個細(xì)胞周期需12?13小時，而PC3-miR-7在相同條件下則需要 14小時（圖3a-3c)，提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7能有效地阻滯前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，并 可以此抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
[0037] 實施例4 :
[0038] 通過CCK8增殖實驗和Ki-67染色法檢測穩(wěn)定過表達(dá)miR-7對前列腺癌細(xì)胞系（以 PC3-miR-7細(xì)胞為例，但不限于此）體外增殖能力的影響：通過實施例3中的常規(guī)細(xì)胞消化 收集方法，將收集到的對照PC3-null、PC3-miR-7細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸于EP管中并定容 至1毫升。使用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取24孔板每孔中接種5000個細(xì)胞，連續(xù)檢測一 周，每天檢測5個復(fù)孔。檢測時在500微升完全培養(yǎng)基中加入50微升CCK8試劑（購于碧云 天公司）混勻，37°C避光孵育2小時。取20微升上清液于96孔板中，使用酶標(biāo)儀，在450nm 處檢測吸收值。對一周的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析（圖4a)，發(fā)現(xiàn)PC3-miR-7細(xì)胞經(jīng)反應(yīng)后 的吸光度顯著小于PC3-null細(xì)胞，提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7可以在體外，細(xì)胞貼壁生長的 狀態(tài)下抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。同時，本發(fā)明取12孔板放入細(xì)胞爬片，在玻片上接種5000個 細(xì)胞（200微升體積），待細(xì)胞完全貼壁后，去除上清，在孔中加入完全培養(yǎng)基，通過血清饑 餓的方法進(jìn)行同步化（見實施例3)，在細(xì)胞同步化后恢復(fù)血清供給，在恢復(fù)血清供應(yīng)16小 時后取出玻片，通過常規(guī)的細(xì)胞免疫熒光染色方法，檢測細(xì)胞中Ki-67 (抗體購于美國CST 公司）這一增殖相關(guān)基因的表達(dá)（圖4b)。通過熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)PC3-miR-7細(xì)胞的 Ki-67表達(dá)顯著低于對照PC3-null細(xì)胞，再次提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7能顯著抑制前列腺 腫瘤細(xì)胞在體外的增殖。
[0039] 實施例5 :
[0040] 通過三維培養(yǎng)實驗在體外檢測穩(wěn)定過表達(dá)miR-7對前列腺癌細(xì)胞系（以 PC3-miR-7細(xì)胞為例，但不限于此）離壁生長能力的影響：通過實施例3中的常規(guī)細(xì)胞消化 收集方法，將收集到的對照PC3-null、PC3-miR-7細(xì)胞用基本培養(yǎng)基重懸于EP管中并定容 至1毫升，使用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)備用。將含有生長因子的matrigel和Geltrex (兩 者均購于美國BD Bioscience公司）于冰上按1 : 1比例混勻。在96孔板中滴加入混合液 20微升/孔，迅速鋪勻后在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置30分鐘使其充分凝固。將細(xì)胞濃度稀 釋至200個細(xì)胞/40微升，滴加于凝固的基質(zhì)上，在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。期間制 備上層基質(zhì)：將含有生長因子的matrigel用基本培養(yǎng)基稀釋至4% (體積比）。將100微 升上層基質(zhì)滴加于已有的細(xì)胞懸液中，在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3天后第一次換液， 之后每2天換液一次。換液時從液面處吸取80微升（考慮培養(yǎng)箱中水分蒸發(fā)）后，滴加入 新制備的上層基質(zhì)。每組接種3個復(fù)孔，細(xì)胞接種后15天，使用相差顯微鏡拍照并統(tǒng)計不 同直徑大小的細(xì)胞球的數(shù)量（圖5)。結(jié)果表明，PC3-miR-7細(xì)胞形成的直徑在20?80微 米的細(xì)胞球的數(shù)量，以及80微米以上超大細(xì)胞球的數(shù)量相比PC3-null細(xì)胞在相同條件下 形成的細(xì)胞球數(shù)量顯著減少。提示在三維培養(yǎng)的狀態(tài)下，穩(wěn)定過表達(dá)mIR-7同樣具有抑制 前列腺腫瘤細(xì)胞增殖的能力。
[0041] 實施例6:
[0042] 通過建立裸小鼠皮下植瘤模型在體內(nèi)評價穩(wěn)定過表達(dá)miR-7對前列腺腫瘤生 長的抑制作用：通過實施例3中的常規(guī)細(xì)胞消化收集方法，將收集到的對照PC3-null、 PC3-miR-7細(xì)胞用基本培養(yǎng)基重懸于EP管中并定容至1毫升，使用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì) 胞計數(shù)備用。將細(xì)胞定容至1〇6個細(xì)胞/50微升，在冰上與等體積的含有生長因子的 matrigel (購于美國BD Bioscience公司）混勻。選用于5周齡無胸腺雄性裸小鼠（購于 斯萊克實驗動物公司）建立動物模型。使用胰島素注射器將混勻后的細(xì)胞懸液分別注射在 小鼠大腿外側(cè)的皮下（本例中左側(cè)注射對照PC3-nul 1細(xì)胞，右側(cè)注射PC3-miR-7細(xì)胞），重 復(fù)5只小鼠作為平行樣，整個過程在SPF級動物房的生物安全柜內(nèi)操作。注射后的實驗小鼠 在SPF級動物房中通過常規(guī)實驗動物飼養(yǎng)方法進(jìn)行飼養(yǎng)，每5天觀察并使用游標(biāo)卡尺測量 皮下腫瘤的體積（體積=長X寬X高Χ6/π)。注射后連續(xù)記錄30天，統(tǒng)計并繪制腫瘤 體積的生長曲線（圖6a)。同時，將實驗小鼠處死后獲取皮下腫瘤組織并稱重（圖6b)，將部 分組織在液氮中迅速冷卻后在_80°C深冷保存，分別用于提取總RNA、總蛋白，在組織中檢 測相關(guān)基因的表達(dá)（圖6c);將部分組織在4%多聚甲醛中固定，用于石蠟包埋切片及HE病 理染色（圖6d);將部分組織剪碎后用IV型膠原酶消化組織，用于前列腺癌干細(xì)胞的流式 細(xì)胞分選（見實施例7)。結(jié)果表明，PC3-miR-7來源的腫瘤組織，接種后30天其腫瘤體積 為對照組的0. 5倍，瘤重為對照的0. 44倍。通過前述方法提取總RNA、對相關(guān)基因進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄，分別采用TaqMan MicroRNA Assay方法和常規(guī)qRT-PCR方法（見實施例2)檢測miR-7， KLF4, pllOdelta，Akt，mTOR，及cyclin D1 (以這些基因為例，但不限于此）的表達(dá)。發(fā)現(xiàn) PC3-miR-7來源的腫瘤組織中miR-7的表達(dá)為對照PC3-null來源的腫瘤組織中的5倍，而 KLF4和cyclin D1的表達(dá)則均小于0. 5倍、pllOdelta為0. 33倍。Akt，mTOR的表達(dá)也均 降低（圖6c)。通過蛋白免疫印跡在蛋白水平上檢測時也得到一致的結(jié)果（圖6c)。對組 織進(jìn)行HE染色后（圖6d)，發(fā)現(xiàn)對照PC3-null來源的腫瘤組織中有明顯的腫瘤血管生成， 并伴有一定程度的皮下脂肪組織滲入。而在PC3-miR-7來源的腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞與小 鼠皮膚之間由皮下結(jié)締組織隔離，兩者界限分明，在腫瘤組織中未見明顯的腫瘤血管生成。 上述結(jié)果均提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7能在體內(nèi)有效地抑制前列腺癌的細(xì)胞增殖。
[0043] 實施例7 :
[0044] 從皮下腫瘤組織、亞克隆細(xì)胞系中分別進(jìn)行流式分選前列腺癌干細(xì)胞 (⑶44+CD133+):分別將對照PC3-null來源的腫瘤組織和PC3-miR-7來源的腫瘤組織剪碎 后，加入4毫升IV型膠原酶，終濃度為1毫克/毫升（購于美國Life Technology公司）。 在37°C水浴振蕩箱中孵育30分鐘后，加入1毫升0. 05%胰酶（含0. 02% EDTA)，終濃度為 0. 01 %，繼續(xù)孵育5分鐘，進(jìn)一步將細(xì)胞消化為單細(xì)胞。加入等體積的完全培養(yǎng)基終止反應(yīng) 離心收集細(xì)胞。使用1XPBS重懸后離心進(jìn)行漂洗，重復(fù)兩次。將細(xì)胞用1XPBS重懸轉(zhuǎn)移 到EP管中并定容至1毫升，使用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞按10 8個細(xì)胞/100微 升分裝至EP管中，同時加入APC標(biāo)記的人的⑶44抗體[38]和PE標(biāo)記的人的⑶133抗體 [39]各5微克（兩種抗體均購于德國美天旎MACS公司），4°C避光孵育40?50分鐘，離心 去除上清，用PBS重懸漂洗1?2次后，用含1% FBS的PBS重懸到適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)行流式細(xì) 胞分選。采用APC-PE雙通道分選獲取CD44+CD133+雙陽性細(xì)胞和CD44XD133-雙陰性細(xì)胞 (圖7a)。對于貼壁培養(yǎng)PC3-null和PC3-miR-7細(xì)胞，通過常規(guī)的消化收集方法，計數(shù)并定 容至相同的細(xì)胞濃度后，按照相同的方法進(jìn)行抗體孵育和后續(xù)操作，并用相同的分選條件 獲取的結(jié)果⑶44+CD133+雙陽性細(xì)胞和⑶44TD133_雙陰性細(xì)胞（圖7a)。將獲取的細(xì)胞依 次進(jìn)行離心甩片、4%多聚甲醛固定和常規(guī)免疫熒光檢測兩群細(xì)胞干性相關(guān)因子的表達(dá)差 異（圖7b)。結(jié)果表明，無論是從亞克隆細(xì)胞系直接分選，還是從各自接種的皮下異植瘤中 分選，穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后CD44+CD133+雙陽性細(xì)胞（即前列腺癌干細(xì)胞）占總體細(xì)胞的 比例均有所下降。將獲得的細(xì)胞進(jìn)行甩片后，通過常規(guī)的免疫熒光染色檢測干性相關(guān)因子 (以KLF4，Nanog為例，但不限于此）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后CD44+CD133+雙陽性 細(xì)胞中這些因子的表達(dá)水平均低于對照，提示了穩(wěn)定過表達(dá)miR-7后可以通過抑制這些重 要的干性因子的表達(dá)發(fā)揮削弱前列腺癌干細(xì)胞"干性維持"能力的作用。
[0045] 實施例8 :
[0046] 通過三維培養(yǎng)實驗在體外檢測穩(wěn)定過表達(dá)miR-7對前列腺癌干細(xì)胞"干性維持" 能力的影響：按照實施例5的方法，將對照PC3-null或PC3-miR-7來源的腫瘤組織中獲取 的CD44+CD133+雙陽性細(xì)胞（即前列腺癌干細(xì)胞）進(jìn)行體外三維離壁培養(yǎng)，每組均接種3 個復(fù)孔。接種后15天，使用相差顯微鏡拍照并統(tǒng)計不同直徑大小的細(xì)胞球的數(shù)量（圖8)。 結(jié)果表明，穩(wěn)定過表達(dá)PC3-miR-7后，形成的細(xì)胞球絕大部分直徑在20?80微米之間，80 微米超大細(xì)胞球的數(shù)量僅占10%，顯著低于對照中超大細(xì)胞球的數(shù)量（PC3-null來源的為 35% )。提示了在體外，穩(wěn)定過表達(dá)PC3-miR-7后削弱了前列腺癌干細(xì)胞的干性。
[0047] 實施例9 :
[0048] 通過建立梯度稀釋再次皮下植瘤小鼠模型在體內(nèi)評價穩(wěn)定過表達(dá)miR-7對前列 腺癌干細(xì)胞"干性維持"能力的抑制作用：將對照PC3-null或PC3-miR-7來源的腫瘤組織中 獲取的CD44+CD133+雙陽性細(xì)胞（即前列腺癌干細(xì)胞，分別命名為PC3-null-S、PC3-miR7-S) 和CD44XD133_雙陰性細(xì)胞（非癌干細(xì)胞，分別命名為PC3-null-NS、PC3-miR7-NS)使 用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后用無血清的基本培養(yǎng)基稀釋定容到不同的濃度：對于 ⑶44XD133^雙陰性細(xì)胞稀釋為10 5個細(xì)胞/50微升、104個細(xì)胞/50微升兩個梯度；對于 ⑶44+CD133+雙陽性細(xì)胞稀釋為10 3個細(xì)胞/50微升、102個細(xì)胞/50微升兩個梯度。在冰 上將稀釋后的細(xì)胞懸液與等體積的含有生長因子的matrigel (購于美國BD Bioscience公 司）混勻。選用于5周齡無胸腺雄性裸小鼠（購于斯萊克實驗動物公司）建立動物模型。 使用胰島素注射針，將PC3-null-NS、PC3-miR7-NS "細(xì)胞-matrigel"混合液分別注射在小 鼠的大腿外側(cè)皮下，1〇5稀釋度重復(fù)5只小鼠作為平行樣；10 4稀釋度重復(fù)5只小鼠作為平 行樣。將PC3-null-S、PC3-miR7-S "細(xì)胞-matrigel"混合液同樣分別注射在小鼠的大腿 外側(cè)皮下，1〇3稀釋度重復(fù)5只小鼠作為平行樣；10 2稀釋度重復(fù)5只小鼠作為平行樣（圖 9a)。每5天觀察并測量皮下腫瘤體積（方法同實施例6)，PC3-null-NS、PC3-miR7-NS組連 續(xù)觀察到接種后50天處死實驗小鼠，獲取皮下腫瘤組織并稱重；PC3-null-S、PC3-miR7-S 組連續(xù)觀察到接種后70天處死實驗小鼠，獲取皮下腫瘤組織并稱重（圖9b，9c)。結(jié)果表 明，PC3-miR7-NS來源的腫瘤組織，在10 5個細(xì)胞接種量下，接種后50天其腫瘤體積為對照 組（PC3-null-NS)的 0· 36 倍，瘤重為對照（PC3-null-NS)的 0· 45 倍。PC3-miR7-S 來源的 腫瘤組織，在1〇2個細(xì)胞接種量下，接種后70天其腫瘤體積為對照組的0. 29,瘤重為對照的 〇. 31倍。提示了 miR-7在非癌干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞中具有抑制其細(xì)胞增殖的能力，同時對于 癌干細(xì)胞還能有效地抑制其"干性維持"的能力。
[0049] 上述實施例的結(jié)果驗證了 miR-7這一天然核酸類分子作為新型的小分子藥物在 前列腺癌的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景，是一種理想的靶向基因備選藥物。
[0050] 本發(fā)明中例舉的相關(guān)基因序列：
[0051] 序列一：
[0052] miR-7 前體分子 1 (pri-miR-7-l):染色體定位 9q21. 32
[0053] NR-029605. 1
[0054] lttggatgttg gcctagttct gtgtggaaga ctagtgattt tgttgttttt agataactaa
[0055] 61atcgacaaca aatcacagtc tgccatatgg cacaggccat gcctctacag
[0056] 序列二：
[0057] miR-7 前體分子 2(pri-miR-7-2):染色體定位 15q26. 1
[0058] NR-029606. 1
[0059] lctggatacag agtggaccgg ctggccccat ctggaagact agtgattttg ttgttgtctt
[0060] 61actgcgctca acaacaaatc ccagtctacc taatggtgcc agccatcgca
[0061] 序列三：
[0062] miR-7 前體分子 3 (pri-miR-7-3):染色體定位 19pl3. 3
[0063] NR-029607. 1
[0064] lagattagagt ggctgtggtc tagtgctgtg tggaagacta gtgattttgt tgttctgatg
[0065] 61tactacgaca acaagtcaca gccggcctca tagcgcagac tcccttcgac
[0066] 序列四：
[0067] 人工合成的與成熟的miR-7完全互補的序列：
[0068] 5, -AGA TCT GCT AGC CAA CAA AAT CAC TAG TCT TCC AGA TAT CAG ATC T-3'
[0069] 其中AGATCT是限制性內(nèi)切酶Bglll的識別作用位點；GCTAGC是限制性內(nèi)切酶 Nhel的識別作用位點；GATATC是限制性內(nèi)切酶EcoRV的識別作用位點。下劃線序列！￡1 工￡￡表示與miR-7的核心識別序列5' -GGUUGU-3'的互補區(qū)域。
[0070] 序列五：
[0071] 本發(fā)明中驗證的與miR-7具有互作的KLF4mRNA中的3' UTR序列：
[0072] latcccagaca gtggatatga cccacactgc cagaagagaa ttcagtattt tttacttttc
[0073] 61acactgtctt cccgatgagg gaaggagccc agccagaaag cactacaatc atggtcaagt
[0074] 121tcccaactga gtcatcttgt gagtggataa tcaggaaaaa tgaggaatcc aaaagacaaa
[0075] 181aatcaaagaa cagatggggt ctgtgactgg atcttctatc attccaattc taaatccgac
[0076] 241ttgaatattc ctggacttac aaaatgccaa gggggtgact ggaagttgtg gatatcaggg
[0077] 301tataaattat atccgtgagt tgggggaggg aagaccagaa ttcccttgaa ttgtgtattg
[0078] 361atgcaatata agcataaaag atcaccttgt attctcttta ccttctaaaa gccattatta
[0079] 421tgatgttaga agaagaggaa gaaattcagg tacagaaaac atgtttaaat agcctaaatg
[0080] 481atggtgcttg gtgagtcttg gttctaaagg taccaaacaa ggaagccaaa gttttcaaac
[0081] 541tgctgcatac tttgacaagg aaaatctata tttgtcttcc gatcaacatt tatgacctaa
[0082] 601gtcaggtaat atacctggtt tacttcttta gcatttttat gcagacagtc tgttatgcac
[0083] 661tgtggtttca gatgtgcaat aatttgtaca atggtttatt cccaagtatg ccttaagcag
[0084] 721aacaaatgtg tttttctata tagttccttg ccttaataaa tatgtaatat aaatttaagc
[0085] 781aaacgtctat tttgtatatt tgtaaactac aaagtaaaat gaacattttg tggagtttgt
[0086] 841attttgcata ctcaaggtga gaattaagtt ttaaataaac ctataatatt ttatctgaaa
[0087] 其中下劃線部分為可被miR-7識別并結(jié)合區(qū)域。
[0088] 本發(fā)明中引用的相關(guān)參考文獻(xiàn)：
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【權(quán)利要求】
1. microRNA-7在作為PI3K/Akt信號通路的表達(dá)抑制劑方面的作用。 2. microRNA-7在作為KLF4的靶向抑制劑中的作用。 3. microRNA-7在制備抑制前列腺腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。 4. microRNA-7在制備阻滯前列腺腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K48/00GK104138603SQ201410314955
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】高維強, 方煜翔, 常云麗 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院