通過抑制轉錄因子atf5來抑制腫瘤細胞的組合物和方法
【專利說明】通過抑制轉錄因子ATF5來抑制腫瘤細胞的組合物和方法
[0001] 與相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年2月22日提交的序列號61/768, 390的美國臨時申請的權益， 該臨時申請的全部內以引用的方式并入本文。
[0003] 政府權益公告
[0004] 本發(fā)明得到批準號RCA126924A的美國國立衛(wèi)生署資助項目的支持。因此，美國政 府對本發(fā)明享有某些權利。 1.【背景技術】
[0005] 美國每年有大約一百萬人被診斷出癌癥，而且目前有數(shù)百萬各年齡段的美國人患 有某種類型的癌癥。在這些人的一生當中，每兩個美國男性中有一個以及每三個美國女 性中有一個將會被診斷出患有某種類型的癌癥。在每年確診患有癌癥的一百萬人中，有 1，7000人患有腦腫瘤。腦腫瘤侵襲并破壞正常組織，產生諸如感覺運動障礙和認知功能障 礙、顱內壓增高、腦水腫以及壓迫腦組織、腦神經和腦血管這樣的癥狀。惡性腦腫瘤患者中 有25%的人的最初癥狀是困倦、無力、反應遲鈍、人格改變、行為異常以及智力障礙。腦腫瘤 的治療通常是多種方式的，這取決于腫瘤的病理學特點和位置。對惡性神經膠質瘤來說，包 括化學療法、放射療法和手術在內的多方式治療用于設法減小腫瘤塊。但不論采用何種方 法，腦腫瘤患者的預后能達到：化學療法、放射療法和手術后的平均生存時間僅為1年，這 些患者中只有25%的人生存時間為2年。
[0006] 癌癥的患病率，尤其是現(xiàn)有治療方法難以治愈的腦腫瘤的患病率使人們發(fā)現(xiàn)轉錄 因子對于神經細胞的細胞周期控制具有影響，轉錄因子包括ATF5(Acharay等，JStruct Biol155 :130-139(2006))。ATF5屬于堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子的轉錄激活因子/CREB 家族（等，JStructBiol155:130-139(2006);Greeneetal.，JNeurochem108: 11-22 (2009))。對于神經和神經膠質譜系，ATF5被神經干細胞和祖細胞高度表達，并且當這 些細胞發(fā)生分化時，其表達驟然下降（Angelastro等，JNeurosci23:4590-4600(2003); Angelastro等，JNeurosci25 :3889_3899(2005);Mason等，MolCellNeurosci29 : 372-380 (2005))。由于神經祖細胞中的組成型ATF5表達使這些細胞停留在細胞周期內 并阻擋它們分化，（Angelastro等，JNeurosci23:4590-4600(2003);Angelastro等，J Neurosci25:3889-3899(2005);Mason等，MolCellNeurosci29:372-380 (2005))，由于 GBM(多形性成膠質細胞瘤）被認為是源自于神經干細胞和祖細胞，因此對GBM中的ATF5表 達進行測定（Tanaka等，NatRevClinOncol10:14-26(2012))。對 29 例切除的GBM的 檢查顯示全部出現(xiàn)ATF5高表達，并且所有9個嚙齒類和人類GBM譜系都出現(xiàn)ATF5高表達 (Angelastro等，Oncogene25:907-916(2006))。這些結論已經得到證實，并且有額外的 數(shù)據(jù)表明了ATF5水平與GBM預后之間的聯(lián)系（Dong等，JNeuropatholExpNeurol64: 948-955(2005);Sheng等，NatMed16:671-677(2010))。
[0007] 為了檢驗ATF5在GBM中扮演何種角色，制造出一種顯性陰性抑制劑蛋白來干擾 ATF5 功能（Acharay等，JStructBiol155 :130-139(2006)，Angelastro等，Oncogene25: 907-916 (2006))，并培養(yǎng)si/shRNAs以抑制ATF5的表達。人和大鼠GBM譜系的培養(yǎng)試驗表 明d/n-ATF5和ATF5si/shRNAs都引起了它們的大量細胞凋亡（Angelastro等，Oncogene 25 :907-916(2006))。相比之下，ATF5+使神經祖細胞和星形膠質細胞增殖，未出現(xiàn)出這種 細胞凋亡反應。在最初的體內研究中發(fā)現(xiàn)，如果d/n-ATF5以逆轉錄病毒的方式遞送，它將 會有選擇性地并以極高的效率殺死由移植的C6大鼠GBM細胞產生的腫瘤細胞，但并不破壞 正常生長的腦細胞（Angelastro等，Oncogene25:907-916(2006))。在隨后的研究中，使 用成年小鼠模型，在模型中，用表達TOGF-B的逆轉錄病毒和p53shRNA(Arias等，Oncogene 31 :739-751 (2012))進行感染以有效產生神經膠質瘤（等級范圍從低分級神經膠質瘤至 GBM)。所使用的小鼠是經過改造以有條件地表達人GFAP啟動子的d/n-ATF5 (其在神經干細 胞/祖細胞、星形膠質細胞和GBM中表達），d/n-ATF5的導入使腫瘤完全退化/根除，24只 治療過的小鼠全部存活。同樣地，在注射roGF-B/shRNA-p53逆轉錄病毒前，85%的小鼠體 內的d/n-ATF5的表達阻止了腫瘤生長。相比這下，對于未導入d/n-ATF5的小鼠，15/16患 上了腫瘤，并且有40%在試驗期內死亡。正常細胞未受明顯影響（Arias等，Oncogene31 : 739-751(2012))。 2.
【發(fā)明內容】

[0008] 在某些實施例中，本發(fā)明涉及用于治療和/或預防腫瘤以及/或者促使贅生性細 胞凋亡的方法，該方法包括使贅生性細胞與細胞穿透顯性陰性ATF5 ( "CP-d/n-ATF5"）接 觸，其中CP-d/n-ATF5能夠抑制ATF5的功能和/或活性。
[0009] 在某些實施例中，贅生性細胞選自由以下各項組成的集群：乳腺、子宮、子宮內膜、 胃、結腸、肝、胰腺、腎臟、膀胱、前列腺、睪丸、皮膚（例如，黑色素細胞/黑色素瘤細胞）、食 道、舌頭、嘴、腮腺、喉、嗯、淋巴結、肺、血液（例如，血液系統(tǒng)癌癥）、周圍神經系統(tǒng)和腦部。 在某些實施例中，贅生性細胞選自由以下各項組成的集群：成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、神 經膠質瘤、成神經管細胞瘤、腦膜瘤、間皮瘤和成神經細胞瘤。在某些實施例中，贅生性細胞 與原發(fā)性或復發(fā)性腦腫瘤相關。
[0010] 在某些實施例中，CP-d/n-ATF5為口服給藥、腸胃外給藥（例如，皮下給藥）、鼻內 給藥和/或經皮給藥。
[0011] 在某些實施例中，CP-d/n-ATF5包含一部分人、大鼠或小鼠ATF5肽序列、或者 以上各項的組合。在某些實施例中，細胞穿透顯性陰性ATF5包含選自由以下各項組 成的集群的序列:LEQENAE、LEKEAEELEQENAE、LARENEELLEKEAEELEQENAE、LEQRAEELAREN EELLEKEAEELEQENAE或LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAE,該序列與形成亮氨酸柃鏈的妝 連接，并且與細胞穿透序列連接。在某些實施例中，CP-d/n-ATF5包含選自由以下各項組 成的集群的序列：LEQENAELEGECQGLEARNRELKERAES、LEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELK ERAES、LARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERAES、LEQRAEELARNEELLEKEAEELEQE NAELEGECQGLEARNRELKERAES、LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERAESV, 其中，加下劃線序列為顯性陰性序列，其余序列為ATF5亮氨酸拉鏈，該序列可操作地與細 胞穿透序列連接（框內）。在某些實施例中，細胞穿透顯性陰性ATF5包含選自由以下各項 組成的集群的序列：LEQENAELEGECQGLEARNRELRERAES、LEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELR ERAES、LARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAES.LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQE NAELEGECQGLEARNRELRERAES、LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAESV, 其中，加下劃線序列為顯性陰性序列，其余序列為ATF5亮氨酸拉鏈，該序列可操作地與細 胞穿透序列連接。
[0012] 在某些實施例中，細胞穿透顯性陰性ATF5包含選自由以下各項組成的集群的序 列：(l)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRQIKIffFQNRRMKffKKDYKDDDDKMASMTGGQQMGRDPDLEQRAEELARE NEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAESV,其中，加下劃線殘基(MG-HM)為 6XHis_ 標 簽前導序列，粗體殘基（RQ-KK)為Penetratin序列，斜體殘基（DY-DK)為Flag標簽，字體 無改變的殘基（MA-PD)為間隔氨基酸，粗斜體殘基（LE-AE)為d/n序列，加下劃線粗體殘 基(LE-SV)為在第一纈氨酸后被截短的ATF5亮氨酸柃鏈：（2)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLEY GRKKRRQRRRYPYDVPDYAMASMTGGQQMGRDPDLEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRE LRERAESV,其中，加下劃線殘基(MG-LE)為6XHis_標簽前導序列，粗體殘基（YG-RR)為TAT 序列，斜體殘基（YP-YA)為HA標簽，字體無改變的殘基（MA-PD)為間隔氨基酸，粗斜體殘基 (LE-AE)為d/n序列，加下劃線粗體殘基(LE-SV)為在第一纈氨酸后被截短的ATF5亮氨酸 拉鏈；(3)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRQIKIffFQNR
[0013]RMKffKKLEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERAESV,其中，加下劃 線殘基(MG-HM)為6XHis-標簽前導序列，粗體殘基（RQ-KK)為Penetratin序列，斜體殘基 (LE-AE)為d/n序列，加下劃線粗體殘基(LE-SV)為在第一纈氨酸后被截短的ATF5亮氨酸 拉鏈；以及(4)RQIKIffFQNRRMKffKKLEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERA ESV,其中，耜體殘基(RQ-KK)為Penetratin序列，斜體殘基（LE-AE)為d/n序列，加下劃線 粗體殘基(LE-SV)為在第一纈氨酸后被截短的ATF5亮氨酸拉鏈。在某些實施例中，細胞穿 透顯性陰性ATF5為化學合成。
[0014] 在某些實施例中，本發(fā)明還涉及在治療和/或預防腫瘤并且/或者促使贅生性細 胞凋亡中使用的試劑盒。以下描述將使本發(fā)明的其他方面清晰明了。 3.【附圖說明】
[0015] 圖1GFP-d/n-ATF5C-端截短的融合蛋白（GFP-d/n-ATF5-Tr)與C6神經膠質瘤細 胞中的全長GFP-d/n-ATF5蛋白達到相同的促使細胞凋亡水平。用pQC-X-I-eGFP、pQC-d/ n-GFPATF5或pQC-GFPATF5-tr轉染C6細胞。2天后確定轉染細胞中密集的凋亡細胞核的 百分比（平均值土SEM，n= 4 ;每種條件下細胞總記數(shù)約為200個）。T檢驗；GFP+細胞對 比GFP-d/n-ATF5+ 細胞或GFP-d/n-ATF5-tr細胞，（*p< 0? 05) ;GFP-d/n-ATF5+ 細胞對比 GFP-d/n-ATF5-tr細胞，（不顯著）。
[0016] 圖2細菌表達的純化6x組氨酸-Flag標簽Penetratin-Flag-D/ N-ATF5_tr(Pen-d/n_ATF5-RP)肽和 6x組氨酸-Flag標簽Penetratin-Flag-對照（Pen-對 照-RP)肽的純度和分子性質。（A)純化Pen-d/n-ATF5-RP和Pen-對照-RP(每道5yg)的 SDS-PAGE被考瑪斯染色。左側顯示分子量標記，每道上顯示每種肽的線性圖。在方法部分 中對純化進行描述。（B)純化Pen-d/n-ATF5-RP的LC-高分辯率質譜法的去卷積質譜。最 多的物種是無甲酰蛋氨酸的12, 948. 88Da單體形式，其次是甲酰蛋氨酸13, 127Da單體形式 (異構體）。質譜還顯示出少量25,897.5〇3二聚體。（〇?611-(1/11-4了?5-1^在人血清中的 穩(wěn)定性。Pen-d/n-ATF5-RP(36yM)與人血清（在PBS中25%v/v)在37°C培養(yǎng)0至48小 時。在不同時間取出等分試樣，Pen-d/n-ATF5-RP肽通過SDS-PAGE分解，然后轉移到PVDF膜，用抗-Flag抗體進行探測。使用LiCor軟件通過近紅外線檢測抗-Flag信號，對預期量 的Pen-d/n-ATF5-RP條帶進行密度測定，并用ImageJ確定數(shù)量。數(shù)值為平均值土SEM，n= 3〇
[0017] 圖3培養(yǎng)的成膠質細胞瘤細胞對Pen-d/n-ATF5-RP的吸收和滯留。（A)與200nM Pen-對照-RP(左）或Pen-d/n-ATF5-RP(右）一起培養(yǎng)4小時的C6大鼠成膠質細胞瘤細 胞的共焦圖像。細胞經過沖洗、固定以及用抗-Flag(紅）和DAPI(藍）染色。比例尺= 2ym。⑶大鼠C6和人U87成膠質細胞瘤細胞與3yMPen-d/n-ATF5-RP-起培養(yǎng)圖中所示 時間，然后沖洗、固定以及用抗-Flag(綠）和DAPI(藍）免疫染色。比例尺=5ym。
[0018] 圖4Pen-d/n-ATF5-RP促使C6成膠質細胞瘤細胞凋亡。用3yMPen-d/n-ATF5-RP 或3yMPen-對照-RP處理C6細胞，或者不做處理。5天后確定細胞中密集凋亡細胞核的 百分比（平均值土SEM;在2個獨立試驗中n=4;細胞記數(shù)約為200個）。T檢驗；Pen-d/ n-ATF5-RP細胞對比Pen-對照-RP細胞或未經處理細胞，（*p<0. 05) ;Pen-對照-RP細胞 對比未經處理細胞，（P=0. 29)。
[0019] 圖5Pen-d/n-ATF5-RP進入小鼠腦部并引起目標神經膠質瘤細胞凋亡。（A-F)用 Flag抗體對典型腦部切片染色以指示Pen-d/n-ATF5-RP或HA的存在，以此識別由逆轉錄 病毒（紅）誘導的腫瘤的存在；用TUNEL識別細胞凋亡（綠），用DAPI定位細胞核（藍）。 (A)用Pen-d/n-ATF5-RP治療后24小時（最后一次注射后16小時）的鼠科動物腦部腫瘤 (逆轉錄病毒注射后52天）。（B)(A)中同一小鼠的對側正常大腦半球。（C)注射生理鹽水 后24小時的鼠科腦部腫瘤（注射逆轉錄病毒后59天）。通過增多的Flag抗體著色確認 經過治療的小鼠（A，B)的細胞內出現(xiàn)Pen-d/n-ATF5,與生理鹽水對照樣本對比。與（B)和 (C)相比較，（A)中增多的TUNEL著色（綠）說明Pen-d/n-ATF5-RP引起神經膠質瘤細胞特 異性誘導凋亡。（D)逆轉錄病毒注射后160天和Pen-control-RP注射后3天的含有腫瘤的 腦部切片的TUNEL和DAPI著色。請注意識別腫瘤細胞的HA+細胞以及無TUNEL著色。（E) 與（D)同樣著色，是含腫瘤切片的著色（逆轉錄病毒注射后143天）以及Pen-d/n-ATF5-RP 治療后3天的著色。請注意，與（A)和（D)相比較，HA+腫瘤細胞中出現(xiàn)TUNEL著色，并且 著色呈現(xiàn)零碎的外觀。（F)與（D)同樣著色，是含腫瘤切片在逆轉錄病毒注射后150天的著 色以及Pen-d/n-ATF5-tr-RP皮下注射2次治療后2天的著色。請注意著色圖案與（E)中 零碎的TOGF-B-HA著色圖案和TUNEL著色圖案的定性相似度。比例尺等于20ym。
[0020] 圖6給藥后，Pen-d/n_ATF5-RP在小鼠體內不同時間的滯留情況。如本文所述，小 鼠接受4次生理鹽水（A)或Pen-d/n-ATF5-RP(B，C)腹腔內注射。最后一次注射后40小時 (A，B)或64小時（C)后殺死動物，用抗-Flag(紅色；以顯現(xiàn)Pen-d/n-ATF5-RP)或DAPI(藍 色；以顯現(xiàn)細胞核）對動物的固定腦部切片染色。（D)抗-Flag免疫染色的密度測定。確 定每個圖像中十五個隨機0. 176平方英寸面積的光密度（紅色通道）并使用Image求平 均數(shù)土SD。T檢驗；Pen-d/n-ATF5-RP(64小時）或者（40小時）對比生理鹽水。比例尺為 10 y m〇
[0021] 圖7SVZ和海馬齒狀回的H&E著色顯示，經Pen-d/n-ATF5-RP治療的小鼠與未經 治療的小鼠的這些結構之間沒有可以檢測到的差異。（A，A'）用Pen-d/n-ATF5-RP進行第 二次皮下治療后183天（還可參見圖S8以獲得同一小鼠的其他數(shù)據(jù)）時，荷瘤小鼠的側腦 室/SVZ(A)和海馬齒狀回（A'）。（B，B'）未用Pen-d/n-ATF5-RP治療也未注射逆轉錄病毒 的同齡對照小鼠的側腦室/SVZ(B)和海馬齒狀回（B'）。（C，C'）用Pen-d/n-ATF5-RP進行 第二次皮下治療后1天（第一次治療后5天）時，非荷瘤小鼠的側腦室/SVZ(C)和海馬齒 狀回（C'）。（D，D'）未經治療的非荷瘤小鼠的側腦室/SVZ(D)和海馬齒狀回（D'）。A-C的 比例尺為20ym，D-F的比例尺為50ym。
[0022] 圖8用Pen-對照-RP肽治療的小鼠神經膠質瘤的MRI及組織病理學實例。（A) 未注射roGF-B-HA/sh-p53逆轉錄病毒的對照小鼠大腦的強化后3DFLASHMRI冠狀面圖像。 (B)注射PDGF-B-HA/sh-p53逆轉錄病毒后246天且用Pen-Control-RPp印tide治療前的 對照小鼠大腦的強化后3DFLASHMRI冠狀面圖像，圖中顯示出雙側腫瘤（白色對比）。（C) 同一小鼠用Pen-對照-RP肽皮下治療40天后（如文中所述）大腦的強化后3DFLASHMRI 圖像，圖像顯示腫瘤仍然存在（箭頭所指）。（D)同一小鼠大腦含腫瘤區(qū)域1和含腫瘤區(qū) 2 (圖像（C)中箭頭所示）的H&E著色切片。由于出現(xiàn)瀕死行為，用Pen-對照-RP肽進行第 二次治療后116天，小鼠被殺死。兩種切片都通過細胞核濃染和較高細胞細胞密度顯示了 腫瘤的存在。（E)圖像（C)所示區(qū)域1和區(qū)域2的切片中的HAtag免疫染色顯示出在誘導 的腫瘤細胞中存在病毒傳送的TOGF-B-HA。（F)圖像（C)所示區(qū)域1和區(qū)域2的切片免疫 染色顯示出象征腫瘤的高指數(shù)Ki67+/分裂細胞。d-f中的比例尺為20ym