本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥制劑蟾毒靈新的藥用用途，具體涉及蟾毒靈在制備靶向抑制胰腺癌干細(xì)胞制劑中的用途，所述的制劑抑制腫瘤干細(xì)胞自我更新，逆轉(zhuǎn)胰腺癌的耐藥。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了胰腺癌作為腫瘤患者死亡原因的第四位，5年生存率僅為5％，調(diào)查顯示胰腺癌患者中大部分在發(fā)現(xiàn)時已失去手術(shù)機會，即使其中部分患者有機會接受手術(shù)治療，但仍有大部分患者會出現(xiàn)局部病灶復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。因此，尋求新的治療策略以抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展顯得十分必要。有研究公開了腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；研究顯示，在胰腺癌中，約有0.2％-0.8％的腫瘤細(xì)胞屬于腫瘤干細(xì)胞，其在胰腺癌細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中扮演關(guān)鍵角色；有研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌干細(xì)胞中，cd44、cd24和esa有明顯的表達上調(diào)；然而，目前臨床實踐中尚無有效的藥物能抑制胰腺癌干細(xì)胞的分布。

蟾毒靈是從中醫(yī)藥蟾酥中提取的一種強心苷類藥，研究顯示，蟾毒靈具有明顯的抗肝癌，肺癌，前列腺癌等癌癥，廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤的治療；迄今，未見蟾毒靈抑制胰腺癌干細(xì)胞的報道。

2007年li等首次報道了胰腺癌csc的分離和鑒定，他們將手術(shù)獲得的人胰腺癌標(biāo)本分離出了一類表型為cd44⁺cd24⁺esa⁺的癌細(xì)胞，成瘤率高達50％，比cd44^-cd24^-esa^-癌細(xì)胞致瘤能力至少提高了100倍，證實了胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的存在。目前流式細(xì)胞分選系統(tǒng)是比較成熟和公認(rèn)的胰腺csc分離方法，其中，將人胰腺癌sw1990/gem耐藥細(xì)胞株制備成單細(xì)胞懸液，加入cd44⁺cd24⁺esa⁺相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體孵育后，流式細(xì)胞分離系統(tǒng)分選胰腺癌csc；裸鼠腫瘤移植實驗是較理想的鑒定腫瘤干細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的方法，有研究經(jīng)nod/scid鼠成瘤實驗表明，cd44⁺cd24⁺esa⁺細(xì)胞較陰性細(xì)胞具有更強的成瘤能力，且能分化出cd44⁺cd24⁺esa⁺亞群細(xì)胞，表明胰腺癌中cd44⁺cd24⁺esa⁺亞群細(xì)胞具有自我更新和分化的干細(xì)胞樣特性；有研究通過體外實驗，顯示無血清懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)sw1990/gem細(xì)胞株成球率低。

基于現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)，本申請的發(fā)明人擬提供中藥制劑蟾毒靈新的藥用用途，具體涉及蟾毒靈在制備靶向抑制胰腺癌干細(xì)胞制劑中的用途，該制劑能抑制腫瘤干細(xì)胞自我更新，達到逆轉(zhuǎn)胰腺癌的耐藥狀況。

與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有：

1.pandols,gukovskayaa,edderkaouim,dawsond,eiblg,lugeaa.epidemiology,riskfactors,andthepromotionofpancreaticcancer:roleofthestellatecell.jgastroenterolhepatol2:127-134,2012.

2.onkendie.o.,boostroms.y.,sarrm.g.15-yearexperiencewithsurgicaltreatmentofduodenalcarcinoma:acomparisonofperiampullaryandextra-ampullaryduodenalcarcinomas.jgastrointestsurg16:682-69,2012.

3.liy,kongd,ahmada,baob,sarkarfh.pancreaticcancerstemcells:emergingtargetfordesigningnoveltherapy.cancerlett338:94-100,2013.

4.lic,heidtdg,dalerbap,burantcf,zhangl,adsayv,wicham,clarkemf,simeonedm.identificationofpancreaticcancerstemcells.cancerres67:1030-1037,2007.。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，提供中藥制劑蟾毒靈新的藥用用途，具體涉及蟾毒靈在制備靶向抑制胰腺癌干細(xì)胞制劑中的用途，該制劑能抑制腫瘤干細(xì)胞自我更新，達到逆轉(zhuǎn)胰腺癌的耐藥狀況。

本發(fā)明還提供了采用無血清懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)miapaca2/gem，獲得較高的干細(xì)胞球比例的方法。

本發(fā)明進行了體外實驗和體內(nèi)試驗，實驗結(jié)果顯示，所述的蟾毒靈能抑制胰腺癌耐藥細(xì)胞系的干細(xì)胞球形成比例，以及蟾毒靈可明顯抑制miapaca2/gem移植瘤裸小鼠的腫瘤生長；以及抑制胰腺癌miapaca2/gem裸小鼠皮下移植瘤體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，以及抑制移植瘤組織腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達和影響hedgehog信號通路相關(guān)蛋白的表達。

本發(fā)明從腫瘤干細(xì)胞角度，經(jīng)試驗表明了蟾毒靈可抑制胰腺癌耐藥細(xì)胞系miapaca2/gem中腫瘤干細(xì)胞的比例，在一定程度上證實了蟾毒靈抗胰腺癌的潛在機制，所述實驗結(jié)果不但為研發(fā)有效抗胰腺癌藥物提供了科學(xué)的實驗依據(jù)，而且為蟾毒靈進入臨床應(yīng)用提供了重要的實驗基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目地通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)，

1)采用無血清懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)miapaca2/gem，獲得較高的干細(xì)胞球比例，利于后續(xù)實驗；

2)采用體內(nèi)外試驗明確蟾毒靈對胰腺癌干細(xì)胞表達率的影響；

3)實驗證實hedgehog信號通路在蟾毒靈抑制胰腺癌干細(xì)胞自我更新的調(diào)控作用，

本發(fā)明中通過應(yīng)用rt-pcr方法檢測cd44⁺cd24⁺esa⁺細(xì)胞亞群中hedgehog信號通路重要基因ptch，shh，gii-1和smoh的表達情況，提供蟾毒靈抑制胰腺癌干細(xì)胞自我更新的實驗基礎(chǔ)。

本發(fā)明從腫瘤干細(xì)胞角度，經(jīng)試驗顯示，中藥制劑蟾毒靈在制備靶向抑制胰腺癌干細(xì)胞制劑中的用途，所述制劑能抑制腫瘤干細(xì)胞自我更新，尤其抑制胰腺癌耐藥細(xì)胞系miapaca2/gem中腫瘤干細(xì)胞的比例，從而達到逆轉(zhuǎn)胰腺癌的耐藥狀況。

附圖說明

圖1顯示了富集的球細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征。

圖2顯示了胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白cd24和esa明顯下調(diào)，

其中，(a)cck8實驗篩選蟾毒靈作用濃度；(b)成球比例明顯下降；(c,d)胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白cd24和esa明顯下調(diào)。

圖3顯示了建立的裸小鼠皮下移植瘤模型，

其中，(a，b)為腹腔給藥蟾毒靈，裸小鼠的腫瘤體積明顯變小，(c)顯示了蟾毒靈延長了腫瘤形成時間(d)顯示兩組裸小鼠體重沒有明顯變化。

圖4顯示了胰腺癌耐藥細(xì)胞具有更高的腫瘤干細(xì)胞比例，

其中，(a)蟾毒靈預(yù)處理組中腸道轉(zhuǎn)移，(b)蟾毒靈預(yù)處理組中肺轉(zhuǎn)移，(c)顯示對照組中蟾毒靈預(yù)處理組沒有發(fā)現(xiàn)。

圖5顯示蟾毒靈用藥后，胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白cd24和esa表達下調(diào)(a，b)。

圖6顯示了蟾毒靈預(yù)處理胰腺癌耐藥細(xì)胞系后，hedgehog信號通路的相關(guān)蛋白受到影響。

具體實施方式

實施例1用無血清懸浮培養(yǎng)富集胰腺癌干細(xì)胞

實驗方法：

1).常規(guī)培養(yǎng)人胰腺癌miapaca2/gem細(xì)胞，

0.25％胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，pbs沖洗2次，接種于含堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bfgf)、表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,egf)和白血病抑制因子(leukaemiainhibitoryfactor,lif)生長因子的無血清dmem/f12培養(yǎng)基(csc培養(yǎng)液)培養(yǎng)，25cm²低粘附培養(yǎng)瓶添加上述培養(yǎng)基10ml，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1x10⁵/ml.37℃恒溫、5％c02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h輕晃1次，每3天采用半量換液法換液，兩周后基本可以看到成球的細(xì)胞；

2).胰腺癌干細(xì)胞球干性鑒定：

流式篩選鑒定

用0.25％胰蛋白酶消化佐加機械消化的方法消化miapaca2/gem干細(xì)胞球細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清，5ml無菌hanks液洗兩次，1000rpm離心10min，棄上清重懸于300ul的hanks液中，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體cd44、cd24和esa，震蕩3秒后置于4℃冰箱20min，加入3ml無菌hanks液洗兩次，1000rpm離心10min，棄上清重懸于5ml無菌hanks液中開始流式細(xì)胞儀檢測胰腺癌干細(xì)胞比例；

克隆形成實驗

用0.25％胰蛋白酶消化佐加機械消化的方法消化miapaca2/gem干細(xì)胞球細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液.六孔培養(yǎng)皿每孔接種2000個細(xì)胞，兩周后觀察克隆形成能力；

球分化實驗

將富集得到的miapaca2/gem干細(xì)胞球細(xì)胞接種到常規(guī)培養(yǎng)基中，半小時后球細(xì)胞貼壁，每日觀察球細(xì)胞分化能力；

nod/scid裸鼠腫瘤移植實驗

將正常的miapaca2/gem細(xì)胞以及富集出的球細(xì)胞，分別制成不同濃度(5×10⁶ml～5×10³/ml)的單細(xì)胞懸液，各取0.1ml接種于裸鼠(雌性，6～8周齡，體重20±2g)雙側(cè)腋下的皮下，共接種3只小鼠。兩周后觀察成瘤能力；

實驗結(jié)果顯示：采用無血清懸浮培養(yǎng)的方法成功富集了胰腺癌干細(xì)胞球(a)，并通過克隆形成實驗(b)，動物成瘤實驗(c)，流式細(xì)胞實驗(d)，westernblot實驗(e)以及腫瘤細(xì)胞球分化實驗(f)進行了驗證，證明了富集的球細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征(如圖1所示)；

本發(fā)明中采用無血清懸浮培養(yǎng)的方法篩選胰腺癌中干細(xì)胞，較現(xiàn)有技術(shù)的方法，能較快較多的得到較純的干細(xì)胞，本方法能克服現(xiàn)有技術(shù)存在的胰腺癌中干細(xì)胞比例十分低，大約0.1％左右，用流式細(xì)胞儀篩選耗時費力等缺陷。

實施例2蟾毒靈抑制胰腺癌耐藥細(xì)胞系的干細(xì)胞球形成比例實驗

將胰腺癌細(xì)胞制成5x10³/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μl。根據(jù)課題組前期體外實驗結(jié)果，蟾毒靈組設(shè)1000nm，500nm，100nm，50，10nm，0nm共4個濃度，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔；將96孔板置于37℃、5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24，48，72h，按照cck8實驗說明書測定細(xì)胞增殖曲線，取平均值計算藥物的中效濃度(即ic50)。計算細(xì)胞存活率(％)＝(a1—a)/(a0-a)×100％，a1為蟾毒靈組od值，a為空白對照組od值，a0為陰性對照組od值。取ic50作為后續(xù)干預(yù)濃度。并預(yù)處理胰腺癌耐藥細(xì)胞株后，用無血清懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)干細(xì)胞球，并統(tǒng)計比例，同時用westernblot以及免疫熒光的方法進行干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的觀察；

實驗結(jié)果顯示：用cck8實驗篩選蟾毒靈作用濃度(a)，然后用蟾毒靈對胰腺癌耐藥細(xì)胞系miapaca2/gem預(yù)處理，然后用無血清懸浮培養(yǎng)法重新富集干細(xì)胞球，結(jié)果顯示其成球比例明顯下降(b)，westernblot和免疫熒光實驗進一步證明胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白cd24和esa明顯下調(diào)(c,d)(如圖2所示)；

本實施例中，用蟾毒靈預(yù)先處理胰腺癌耐藥細(xì)胞株miapaca2/gem，這是由于，如果蟾毒靈可以對干細(xì)胞有抑制作用，那么采用無血清懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)干細(xì)胞球后，成球比例應(yīng)該會更低；在本實驗中，沒有采用在培養(yǎng)基中直接加藥的方法來驗證蟾毒靈對胰腺癌耐藥細(xì)胞株中干細(xì)胞的抑制作用，因為如果在實驗過程中直接加藥，可能會造成細(xì)胞數(shù)量的不一致，導(dǎo)致實驗結(jié)果的不嚴(yán)密；另外，由于用流式細(xì)胞儀對干細(xì)胞球進行驗證后，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株miapaca2/gem以及富集的干細(xì)胞球細(xì)胞中cd44陽性的比例基本一致，所以在后續(xù)的實驗中選擇cd24以及esa去驗證蟾毒靈的效果。

實施例3蟾毒靈明顯抑制miapaca2/gem移植瘤裸小鼠的腫瘤生長實驗

將胰腺癌耐藥細(xì)胞株miapaca2/gem，制成濃度為1×10⁶/ml的單細(xì)胞懸液，各取0.1ml接種于裸鼠(雌性，6～8周齡，體重20±2g)，右側(cè)腋下的皮下。在接種的第二天根據(jù)體重隨機分為2組，每組6只：對照組，蟾毒靈組。蟾毒靈組(1.5mg/kg/d)腹腔注射蟾毒靈0.2ml，d1-28，每日1次；對照組：腹腔注射生理鹽水0.2ml，d1-28，每日1次；(以上腹腔注射均每日固定時間9∶00am)。末次用藥結(jié)束后次日脫椎處死裸小鼠，分離皮下腫瘤。每隔三天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大直徑和橫徑，估算腫瘤體積(v)，取各組平均值，繪制生長曲線：v＝1/2(直徑×橫徑²)。治療結(jié)束后次日處死裸小鼠，稱量體重和瘤重。計算實體腫瘤生長抑制率(ir)：ir(％)＝(1－治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％。

實驗結(jié)果顯示：建立的裸小鼠皮下移植瘤模型，腹腔給藥蟾毒靈(1.5mg/kg)，發(fā)現(xiàn)裸小鼠的腫瘤體積明顯變小(a，b)，并且發(fā)現(xiàn)蟾毒靈延長了腫瘤形成時間(c)。另外，在實驗中還發(fā)現(xiàn)，兩組裸小鼠體重并沒有明顯變化(d)(如圖3所示)；由于胰腺癌干細(xì)胞具有更高的成瘤能力，因此接種后顯示蟾毒靈組的成瘤時間明顯長于對照組，驗證了蟾毒靈對胰腺癌干細(xì)胞的抑制作用。

實施例4蟾毒靈抑制胰腺癌miapaca2/gem裸小鼠皮下移植瘤體內(nèi)的轉(zhuǎn)移實驗

將胰腺癌耐藥細(xì)胞株miapaca2/gem，制成濃度為1×10⁶/ml的單細(xì)胞懸液，然后尾靜脈注射的方法，每只0.1ml接種于雌性，6～8周齡，體重20±2g，)。在接種的第二天根據(jù)體重隨機分為2組，每組6只：對照組、蟾毒靈組。蟾毒靈組為蟾毒靈體外預(yù)處理胰腺癌耐藥細(xì)胞miapaca2/gem。四周后用取裸小鼠肺組織，腸道組織進行腫瘤轉(zhuǎn)移灶的統(tǒng)計并行病理驗證；

實驗結(jié)果顯示：由于胰腺癌耐藥細(xì)胞具有更高的腫瘤干細(xì)胞比例，因此更容易形成腫瘤轉(zhuǎn)移，本實驗中通過尾靜脈注射胰腺癌耐藥細(xì)胞miapaca2/gem發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈預(yù)處理組中腸道轉(zhuǎn)移(a)和肺轉(zhuǎn)移(b)的情況較少；在對照組中的一只裸小鼠出現(xiàn)了肌肉轉(zhuǎn)移，而蟾毒靈預(yù)處理組沒有發(fā)現(xiàn)(c)(如圖4所示)；

本發(fā)明經(jīng)體外研究顯示蟾毒靈對胰腺癌干細(xì)胞的抑制作用，由于腫瘤干細(xì)胞具有更強的轉(zhuǎn)移能力，因此，進一步采用體外預(yù)先給予蟾毒靈處理的胰腺癌耐藥細(xì)胞通過尾靜脈注射于裸小鼠，實驗結(jié)果證實蟾毒靈組中的裸小鼠出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移以及腸道轉(zhuǎn)移的情況更低，其中在對照組的一只裸小鼠出現(xiàn)了肌肉轉(zhuǎn)移。

實施例5蟾毒靈抑制移植瘤組織腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達試驗

免疫組織化學(xué)以及免疫熒光實驗：按照實驗試說明書的要求，經(jīng)常規(guī)病理組織切片，脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，一抗過夜，二抗再結(jié)合反應(yīng)，dab顯色，蘇木素復(fù)染后，顯微鏡檢分析；

實驗結(jié)果顯示：在之前的裸小鼠皮下移植瘤模型中，取下移植瘤組織并行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示蟾毒靈用藥后，胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白cd24和esa表達下調(diào)(a，b)(如圖5所示)；在體外實驗已經(jīng)證實蟾毒靈用藥后胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白cd24，esa降低的基礎(chǔ)上，對取下移植瘤組織行免疫組織化學(xué)及免疫熒光實驗驗證。結(jié)果顯示在組織層面上，蟾毒靈用藥后，胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白cd24，esa同樣會降低，體內(nèi)外實驗的結(jié)果基本一致。

實施例6蟾毒靈影響hedgehog信號通路相關(guān)蛋白的表達實驗

以用胰腺癌干細(xì)胞及裸鼠移植瘤組織為研究對象，細(xì)胞裂解后提取細(xì)胞總蛋白，取變性樣品進行sds-page蛋白電泳，通過電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，50g/l脫脂奶粉封閉1h，tbst洗3次，每次5min；50g/l脫脂奶粉稀釋一抗(1:300)，4℃孵育過夜，tbst洗3次，每次5min；50g/lbsa稀釋二抗(1:100)，孵育1h，tbst洗3次，hrp-avidin(1:200)室溫孵育1h；化學(xué)發(fā)光法(ecl)顯影檢測。實驗步驟按照eclwestern免疫印跡分析說明書進行；

實驗結(jié)果顯示：hedgehog信號通路在胰腺癌干細(xì)胞中扮演重要作用，用蟾毒靈預(yù)處理胰腺癌耐藥細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)hedgehog信號通路的相關(guān)蛋白受到影響(如圖6所示)；本實驗采用westernblot的實驗方法結(jié)果顯示hedgehog信號通路的相關(guān)蛋白受到不同程度的上調(diào)和下調(diào)，表明蟾毒靈可以通過調(diào)控hedgehog信號通路以達到抗胰腺癌干細(xì)胞的作用。