文），并且從組織學(xué)上通過HA 標(biāo)簽的出現(xiàn)以及細(xì)胞密集、胞核深染和Ki67著色增加加以確認(rèn)。
[0112] 在實(shí)驗(yàn)的初次治療中，對具有腫瘤的小鼠實(shí)施腹膜內(nèi)給予Pen-d/n-ATF5-RP、生理 鹽水或Pen-對照-RP，單次治療是注射四次，每次lmg/kg，間隔1-2小時注射一次。最后一 次注射后16-64小時小鼠死亡，用抗Flag抗體染色固定腦部來檢測Pen-d/n-ATF5-RP或者 抗HA來標(biāo)記表達(dá)腫瘤細(xì)胞的TOGF-B-HA，以便用TUNEL來確定死亡細(xì)胞。在16小時時，月中 瘤和正常腦細(xì)胞（腫瘤對側(cè)腦半球中的）顯示的Flag著色說明Pen-d/n-ATF5-RP被廣泛 吸收；生理鹽水注射無信號顯示（圖5A-圖5C)。Flag著色在治療后40小時時仍然明顯 并可檢測得到，但在64小時時水平下降（圖6)。雖然正常腦組織顯示無TUNEL著色（圖 5B)，但用Pen-d/n-ATF5-RP治療后一天，在腫瘤內(nèi)有廣泛TUNEL著色（圖5A)。用生理鹽水 治療的動物腫瘤中很少或沒有觀察到TUNEL信號（圖5C)。共定位的TUNEL和roGF-B-HA+ 腫瘤標(biāo)記物著色在Pen-d/n-ATF5-RP治療64小時后仍然明顯，但信號指示，與用這種肽治 療16小時（圖5A)或者Pen-對照-RP肽治療（圖5D)的細(xì)胞相比，細(xì)胞出現(xiàn)退化和碎裂 (圖 5E)。
[0113] 為了加強(qiáng)Pen-d/n-ATF5-RP給藥潛在的長期治療效果，對治療方案做出修改，具 有腫瘤的動物接受兩次皮下注射治療，每隔5天進(jìn)行一次注射治療，每次治療如上文所述 進(jìn)行。第二次治療后兩天（初次治療7天后）對小鼠的腫瘤進(jìn)行評測，腫瘤顯示的HA和 TUNEL的著色圖案與單次治療操作后64小時時一樣，指示出細(xì)胞退化和碎裂（圖5F)。
[0114] 上述雙重治療方案結(jié)束后一天（n= 2)或兩天（n= 2)對沒有腫瘤的動物進(jìn)行全 身尸檢，結(jié)果顯示內(nèi)臟無明顯病理學(xué)損傷，而且大腦和小腦無明顯異常（圖7和表1)。此 外，第二次Pen-d/n-ATF5-RP注射治療后1天進(jìn)行的肝-腎血清生化檢查顯示器官無損傷 (表 1;n= 2)
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119] MRI和組織學(xué)檢查顯示，全身給藥的Pen-d/n-ATF5-RP促進(jìn)了小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 快速退化，并且無復(fù)發(fā)。對Pen-d/n-ATF5-RP全身給藥是否促進(jìn)了小鼠模型中神經(jīng)膠質(zhì)瘤 的持續(xù)退化進(jìn)行了評測。為了達(dá)到這一目的，用MRI(強(qiáng)化后3DFLASHT1加權(quán)像）對用Pen-d/n-ATF5-RP、Pen-對照-RP治療之前及之后不同時間的或未治療的腫瘤進(jìn)行評測。在 很多情況下，治療之前（圖8、圖9、圖10和圖11)的腫瘤要么是多病灶的、要么出現(xiàn)在兩個 半球中。根據(jù)前文所述的治療方案將這種肽進(jìn)行皮下注射。由MRI證實(shí)腫瘤存在并隨機(jī)選 定目標(biāo)后才開始進(jìn)行治療。
[0120] 正如預(yù)期的那樣，未經(jīng)治療的動物（n= 5)或用Pen-對照-RP(n= 4)治療的動物 經(jīng)MRI檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤決無退化。圖8顯示了用對照肽治療的動物的典型實(shí)例。經(jīng)組織學(xué)檢 查證實(shí)，那些死亡的或者出現(xiàn)瀕死行為后被殺死的動物或者研究終點(diǎn)時仍存活的動物（MRI 腫瘤檢查后6個月）的腦中有腫瘤存在。這些腫瘤是HA+(圖8E和圖10)，顯示出被標(biāo)記的 TOGF-B出現(xiàn)、細(xì)胞核濃染顯現(xiàn)（圖8D)以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤Ki67典型著色升高（圖8F)。浸潤 性腫瘤邊界與MRI圖像中腫瘤邊界相符（圖8)。
[0121] 對于用Pen-d/n-ATF5-RP治療的小鼠，MRI顯示，治療后8天（監(jiān)測的最早時間） 腫瘤信號顯著減少（2/5;圖9和圖11)或未檢測到腫瘤信號（3/5)，并且3周內(nèi)可檢測到的 腫瘤信號完全消失（n= 7/7)。肽治療后176天至125天，用MRI評測，被評測的7/7小鼠 無腫瘤（參見實(shí)例，圖8、圖11和圖12B)。因此，Pen-d/n-ATF5-RP治療表現(xiàn)出可快速清除 神經(jīng)膠質(zhì)瘤，并且至少6-7個月未出現(xiàn)MRI可檢測到的腫瘤復(fù)發(fā)。
[0122] 尸體解剖組織學(xué)（n= 6 ;治療后183-259天；腫瘤檢測后190-305天）證實(shí)了腫 瘤消退/根除的MRI結(jié)果（圖8、圖11和圖12C)。在腦部的其余部位，起初MRI檢測為腫 瘤陽性的區(qū)域未顯示出細(xì)胞核濃染或高細(xì)胞密度或Ki67著色升高（圖8和圖11)。而且也 沒有roGF-B-HA+著色（除了少數(shù)分散的單細(xì)胞）（圖8和圖11)。但有GFAP+細(xì)胞病灶，這 說明曾出現(xiàn)腫瘤的區(qū)域中神經(jīng)膠質(zhì)被激活并留下瘢痕（圖8和圖11)。
[0123] 全身給藥的Pen-d/n-ATF5-RP促進(jìn)長期存活，同時保持腦部和組織完整性。所有 用Pen-d/n-ATF5-RP治療的八只荷瘤小鼠都在檢測出腫瘤后存活了研究終點(diǎn)的名義180天 (圖12A)。相比之下，這個時間內(nèi)有6/9小鼠死亡。在過去的研究中，40%(n= 16)小鼠 在腫瘤生成 180 天內(nèi)死亡[Arias等，Oncogene2012 ;31 (6) :739_51]。
[0124] 除了 6只小鼠在Pen-d/n-ATF5-RP治療后6-8個月時被殺死以便進(jìn)行組織學(xué)檢查 外，2只動物在治療后一直存活了 12個月。
[0125] 除了腫瘤消失和曾出現(xiàn)腫瘤位置存在神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕外，用Pen-d/n-ATF5_RP治療 后6-8個月被殺死的動物腦部的H&E著色顯示無明顯異常，并且腦室下和海馬顆粒下層都 顯示正常（圖7)。此外，經(jīng)治療小鼠的體重在被殺死前在同齡對照小鼠平均體重一個標(biāo)準(zhǔn) 偏差內(nèi)（4/6)或大于一個標(biāo)準(zhǔn)偏差（2/6)，所述平均體重由杰克遜實(shí)驗(yàn)室的小鼠表型組數(shù) 據(jù)庫給出（http://phenome.jax.org/db/q?rtn=strains/details&strainid= 7) 〇 對 兩只治療大于6個月的小鼠（190天和183天，分別對應(yīng)圖8和圖11中的根除腫瘤的小鼠） 進(jìn)行全身尸檢。所有檢查的器官均未見病理改變（表1)。
[0126] 5. 1.3 討論
[0127] 本文給出的結(jié)果顯示，Pen-d/n-ATF5_RP進(jìn)入培養(yǎng)的GBM細(xì)胞并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡活 性，并且對動物全身給藥時，穿過血腦屏障，進(jìn)入腦部和腫瘤細(xì)胞，引起大量腫瘤細(xì)胞死亡 及持續(xù)性腫瘤退化/根除，而對正常組織無明顯傷害。
[0128] 本文給出的研究的另一個特征是經(jīng)治療的荷瘤動物存活了至少6-12個月。相對 之下，2/3對照動物在腫瘤檢測189天內(nèi)死亡或出現(xiàn)病態(tài)，并且所有對照動物在死亡時或者6個月時都為腫瘤陽性?？傊?，本文給出的結(jié)果提供了細(xì)胞穿透形式的d/n-ATF5可用于治 療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的證據(jù)。
[0129] 在即時研究中使用的模型是用逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)的TOGF-B和p53shRNA在成年小鼠體內(nèi) 誘導(dǎo)產(chǎn)生惡性膠質(zhì)瘤，惡性膠質(zhì)瘤很可能由roGF-a-受體+神經(jīng)祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞前 體細(xì)胞轉(zhuǎn)換而來。這種腫瘤類似于高分級人神經(jīng)膠質(zhì)瘤[Arias等，Oncogene2012 ;31 (6): 739-51]，而且正如后者一樣，高度分散，而且相對較大，可侵襲兩個半球?？紤]到ATF5在 人GBM和低分級神經(jīng)膠質(zhì)瘤中廣泛表達(dá)以及表達(dá)并需要ATF5才能生存的源自人和嚙齒 目動物的GBM細(xì)胞系（具有或沒有受損p53和PTEN)[Arias等，Oncogene2012 ;31 (6): 739-51]的多樣化，期望根據(jù)本文給出的數(shù)據(jù)，一系列惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞類型對于細(xì)胞 穿透d/n-ATF5會是敏感的。而且，雖然惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是本研究的中心，必須值得注意 的是，ATF5被很多類型的癌表達(dá)[Sheng等，Oncotarget2010 ;1(6) :457_60;ChenA等， Internationaljournalofgynecologicalpathology2012 ；31 (6) :532_7;Fernandez 等，Oncogene2004 ；23 (29) ：5084-91.;Kong等，Experimentalandtherapeuticmedicine 2011 ;2 (5) :827-831;Monaco等，IntJCancer2007 ; 120(9) : 1883-90 ;以及Hu等， Anticancerresearch2012 ;32 (10) :4385_94]，并且培養(yǎng)研究已經(jīng)表明d/n_ATF5或 ATF5siRNA對不同類型組織的腫瘤具有促使細(xì)胞凋亡作用。[Sheng等，Oncotarget2010; 1(6) :457_60;ChenA等，Internationaljournalofgynecologicalpathology2012 ； 31 (6) :532_7;Monaco等，IntJCancer2007; 120(9) : 1883-90;以及Hu等，Anticancer research2012 ;32(10) :4385-94]。因此，根據(jù)本文給出的數(shù)據(jù)，多種類型的癌癥對于細(xì)胞 穿透d/n-ATF5將是敏感的。
[0130] 該即時研究的一個重要方面是，雖然Pen-d/n-ATF5-RP促使腫瘤退化/根除，但它 對正常組織無明顯副作用。有意義的是，經(jīng)過治療的動物存活至少6-12個月，而且無明顯 影響，并且未觀察到明顯的嚴(yán)重或長期損害。此外，Pen-d/n-ATF5-RP的任何潛在負(fù)面作用 可由于治療周期短而減輕。
[0131] 5. 2附加細(xì)胞系和CP-d/n-ATF5組合物
[0132] 5. 2. 1TAT-d/n-ATF5促使培養(yǎng)的黑色素瘤MEL501細(xì)胞凋亡性死亡
[0133] 將連接有TAT的顯性陰性ATF5肽以圖13中所示的濃度（單位yM)加入到MEL501 黑色素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中。4天后，用Hoescht染料對細(xì)胞染色，細(xì)胞染色是為顯示凋亡細(xì) 胞核的比例。如圖10所示，TAT-d/n/ATF5以隨劑量而定的方式促使細(xì)胞凋亡。
[0134] 5. 2. 2TAT-d/n-ATF5降低了內(nèi)源性ATF5在培養(yǎng)的U373成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表 達(dá)
[0135] 將連接有TAT的顯性陰性ATF5肽以圖14中所示的濃度（單位yM)加入到U373 成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中17小時天，然后收獲細(xì)胞，用Western免疫印跡對收獲的細(xì) 胞的內(nèi)源性ATF5水平進(jìn)行分析。請注意，TAT-d/n-ATF5大大降低了內(nèi)源性ATF5的表達(dá)。 之前的研究已經(jīng)表明腫瘤細(xì)胞需要內(nèi)源性ATF5才能存活，但是拋開理論的限制，細(xì)胞穿透 TAT-ZIP肽殺死腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制可能是由于導(dǎo)致內(nèi)源性ATF5蛋白缺失而致。還請注意 當(dāng)TAT-ZIP肽存在時的內(nèi)源性ATF5上面的涂片。這說明TAT-ZIP通過引起內(nèi)源性ATF5泛 素化和蛋白酶降解而使內(nèi)源性ATF5減少。
[0136] 5. 2. 3TAT-d/n-ATF5誘導(dǎo)促凋亡基因DDIT3的表達(dá)
[0137]TAT-d/n-ATF5 (TAT-ZIP)肽誘導(dǎo)促凋亡基因DDIT3 (CHOP)在不同腫瘤細(xì)胞系中的 表達(dá)。用TAT-d/n-ATF5以圖15所示時間和劑量（單位yM)對細(xì)胞進(jìn)行處理，然后收獲細(xì) 胞，并用Western免疫印跡對收獲的細(xì)胞的CHOP和其他無響應(yīng)蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析。請注 意，CHOP在所有情況下都升高。由于CHOP可促使細(xì)胞死亡，這些數(shù)據(jù)表明CHOP蛋白的誘 導(dǎo)可能是TAT-d/n-ATF5殺死腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一。
[0138] 5. 2. 4用siRNA使CHOP蛋白沉默部分地保護(hù)U87細(xì)胞不受TAT-d/n-ATF5的影響
[0139] 用siRNA使CHOP蛋白沉默（圖16中頂部的Western免疫染色）部分地保護(hù)U87 細(xì)胞免于由TAT-d/n-ATF5肽導(dǎo)致的死亡。使用siCHOP(圖16中頂部的Western免疫印 跡）或?qū)φ誷iRNA對細(xì)胞進(jìn)行處理，使CHOP表達(dá)沉默。然后將其暴露于TAT-d/n-ATF5兩 天，對細(xì)胞中凋亡細(xì)胞核比例進(jìn)行測定。數(shù)據(jù)表明TAT-d/n-ATF5殺死腫瘤細(xì)胞的機(jī)制部分 在于提高了腫瘤細(xì)胞CHOP的表達(dá)進(jìn)而間接促成了細(xì)胞死亡。
[0140] 5.2.TAT-D/N-ATF5 下調(diào)BCL2 生存蛋白水平
[0141]TAT-D/N-ATF5下調(diào)BCL2生存蛋白水平。如圖17所示，用圖中所示濃度的 TATZIP(TAT-d/n-ATF5肽）（單位yM)對培養(yǎng)的U87人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞處理30小時。然 后收獲細(xì)胞，用Western免疫印跡對收獲的細(xì)胞的存活蛋白BCL2的表達(dá)進(jìn)行測定。這些結(jié) 果表明，除了提高促凋亡CHOP外，TAT-d/n-ATF5殺死腫瘤細(xì)胞的機(jī)制還在于降低了腫瘤細(xì) 胞BCL2存活蛋白的水平。
[0142] 5.9TAT-D/N-ATF5與替莫唑胺協(xié)同殺死培養(yǎng)的U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞
[0143]TAT-D/N-ATF5與替莫唑胺（TMZ)協(xié)同殺死培養(yǎng)的U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞。如圖 18所示，用亞致死水平的TAT-d/n-ATF5(TZIP1yM)和TMZ(50yM)分別或共同與細(xì)胞培養(yǎng) 一天，然后對具有凋亡細(xì)胞核的細(xì)胞比例進(jìn)行測定。TMZ目前是人GBM的一線治療藥物。數(shù) 據(jù)顯示TAT-d/n-ATF5不僅在TMZ存在的情況下發(fā)揮作用，而且兩種藥物協(xié)同配合殺死GBM 細(xì)胞。這說明TAT-d/n-ATF5可以給予正在服用TMZ的病人。
[0144] 5. 10TAT-D/N-ATF5降低U87細(xì)胞、U373細(xì)胞和MSG細(xì)胞的生存能力
[0145] 如圖19所示，如MTA檢驗(yàn)測得的，重組TAT-d/n-ATF5 (3yM)治療3-5天降低了兩 種人GMB細(xì)胞系和一種小鼠GMB細(xì)胞系的生存能力。
[0146] 5. 11合成PEN-D/N-ATF5降低U87細(xì)胞的生存能力
[0147] 如圖20所示，合成PEN-d/n-ATF5降低了培養(yǎng)的U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存能 力。正如用MTA檢驗(yàn)所測量得的，用圖中所示濃度（iiM)處理5天。
[0148] 5. 12TAT-D/N-ATF5促使U87細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡
[0149] 如圖21所示，正如AnnexinV/PI著色和流式細(xì)胞計(jì)顯示的，重組TAT-d/n-ATF5 促進(jìn)了培養(yǎng)的U87人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡。左下象限中（88%對照對比58%治療過的） 顯示了活細(xì)胞比例。死亡細(xì)胞比例在右下象限和右上象限中顯示（9%對照對比36%治療 過的）。
[0150] 5.13 合成PEN-D/N-ATF5促使GS9-6 細(xì)胞凋亡
[0151] 如圖22所示，合成PEN-d/n-ATF5促進(jìn)了生長在類似半球的培養(yǎng)基中的原發(fā)性 GS9-6人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞的凋亡性死亡。數(shù)據(jù)反映了處理6天的結(jié)果。用AnnexinV/ PI著色和流式細(xì)胞計(jì)確定數(shù)據(jù)。
[0152] 5. 13 重組PEN-D/N-ATF5 促使GS9-6 細(xì)胞凋亡
[0153] 如圖23所示，重組PEN-d/n-ATF5促進(jìn)了生長在類似半球的培養(yǎng)基內(nèi)的原發(fā)性 GS9-6人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞的凋亡性死亡。處理5天。用AnnexinV/PI著色和流式細(xì)胞 計(jì)確定數(shù)據(jù)。
[0154] 氺氺氺氺
[0155] 本文引用了若干出版物，所述出版物的全部內(nèi)部內(nèi)容以引用的方式并入本文。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于治療和/或預(yù)防腫瘤以及/或者促進(jìn)贅生性細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包 括使所述贅生性細(xì)胞與細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5接觸，其中所述細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5能 夠抑制ATF5的功能和/或活性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中，所述贅生性細(xì)胞選自由以下各項(xiàng)組成的集群：乳 腺、子宮、子宮內(nèi)膜、胃、結(jié)腸、肝、胰腺、腎臟、膀胱、前列腺、睪丸、皮膚、食道、舌頭、嘴、腮 腺、B侯、嗯、淋巴結(jié)、肺、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和腦。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其中，所述贅生性腦細(xì)胞選自由以下各項(xiàng)組成的集群：成 膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、間皮瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤，所述贅生 性腦細(xì)胞與原發(fā)性或復(fù)發(fā)性腦腫瘤相關(guān)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中，所述細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5為口服給藥、腸胃外給 藥和/或經(jīng)皮給藥。5. -種包含細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5的組合物，其中，所述細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5亮氨酸拉鏈，所述序列可操作地與細(xì)胞穿透序列連接。6. -種包含細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5的組合物，其中，所述細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5亮氨酸拉鏈，所述序列可操作地與細(xì)胞穿透序列連接。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中，所述細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5包含選自由以下 各項(xiàng)組成的集群的序列： (1)序列，所述粗體殘基（RQ-KK)為Penetratin序列，所述斜體殘基（DY-DK)為Flag標(biāo)簽，所 述字體無改變的殘基（M-PD)為間隔氨基酸，所述粗斜體殘基（LE-AE)為d/n序列，所述加 下劃線粗體殘基（LE-SV)為在第一纈氨酸后被截短的ATF5亮氨酸拉鏈； (2)粗體殘基（YG-RR)為TAT序列，所述斜體殘基（)為HA標(biāo)簽，所述字體無改變 的殘基（M-PD)為間隔氨基酸，所述粗斜體殘基（I)為d/n序列，所述加下劃線粗 體殘基（LE-SV)為在第一纈氨酸后被截短的ATF5亮氨酸拉鏈； (3)其中，所述加下劃線殘基(MG-HM)為6XHis-標(biāo)簽前導(dǎo)序列，所述粗體殘坫（RQ-KK) 為Penetratin序列，所述斜體殘基（￡>為d/n序列，所述加下劃線粗體殘基 (LE-SV)為在第一纈氨酸后被截短的ATF5亮氨酸拉鏈；以及 (4)為Penetratin序列，所述斜體殘基}為d/n序列，所述加下劃線粗體殘基(IE-SV)為在第一纈氨酸后被截短的ATF5亮氨酸拉鏈。8.-種試劑盒，包含權(quán)利要求5-7中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防腫瘤并且/或者促使贅生性細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括使贅生性細(xì)胞與細(xì)胞穿透顯性陰性ATF5(“CP-d/n-ATF5”)接觸，其中，CP-d/n-ATF5能夠抑制ATF5的功能和/或活性。
【IPC分類】A61K38/16
【公開號】CN105228642
【申請?zhí)枴緾N201480022835
【發(fā)明人】勞埃德·A·格林, 詹姆士·安杰拉史壯
【申請人】紐約市哥倫比亞大學(xué)理事會
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2014年2月21日
【公告號】EP2958432A1, US20160046686, WO2014130758A1