Otud3蛋白在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)的產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了OTUD3蛋白在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。OTUD3蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體或表達(dá)OTUD3蛋白的慢病毒在制備具有如下1)-7)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，OTUD3作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的重要抑癌蛋白抑制腫瘤的生成與轉(zhuǎn)移，OTUD3功能的發(fā)現(xiàn)將對(duì)腫瘤診斷、預(yù)防及治療提供重要的科學(xué)依據(jù)與應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】0TUD3蛋白在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)的產(chǎn)品中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種0TUD3蛋白在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]抑癌蛋白 PTEN (phosphatase and tens1n homologue deleted from chromosome10，又稱作MMACl或TEP1)基因是1997年由美國(guó)的兩個(gè)獨(dú)立研究小組在人類染色體10q23.3定位的一個(gè)新的抑癌基因。該基因編碼的蛋白PTEN長(zhǎng)403個(gè)氨基酸，由磷酸酶結(jié)構(gòu)域(15-185)、C2 結(jié)構(gòu)域(186-351)、PEST 模序區(qū)(352-400)和 PDZ 結(jié)合區(qū)(401-403)構(gòu)成，PTEN具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白質(zhì)磷酸酶活性，更為精細(xì)的研究表明，其脂質(zhì)磷酸酶活性在其抑癌活性中具有更為重要的地位，它能特異性地使磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3, 4, 5-triphosphate, PIP3)的3位磷酸基團(tuán)去磷酸化，從而拮抗PI3K激酶的功能，抑制PI3K下游特別是Akt通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移等多種效應(yīng)。PTEN基因是繼p53基因之后目前已知與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切的抑癌基因之一，在血液系統(tǒng)腫瘤、腦膠質(zhì)瘤、消化道腫瘤、婦科腫瘤、泌尿道腫瘤、肺癌、骨肉瘤等諸多腫瘤中均檢測(cè)到該基因的突變或雜合性缺失(LOH)，并發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)水平下調(diào)或缺失，在腫瘤易感的疾病如Cowden疾病、Bannayan-Riley-Ruvalcaba綜合征病人中也常檢測(cè)到PTEN突變。純合缺失PTEN基因的小鼠胚胎致死，雜合缺失PTEN基因的小鼠則自發(fā)形成多種類型的腫瘤，確證PTEN確實(shí)在體內(nèi)具有抑癌基因的功能。近年來(lái)，大量組織特異性的PTEN基因敲除小鼠模型的建立及表型分析進(jìn)一步揭示，PTEN在細(xì)胞代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性與極性、腫瘤微環(huán)境、細(xì)胞衰老、干細(xì)胞調(diào)控等諸多細(xì)胞學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了極為重要的生理功能。目前公認(rèn)的PTEN在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的主要作用機(jī)理仍然是通過(guò)調(diào)控PIP3的去磷酸化而抑制PI3K-Akt通路，因此常稱為PTEN-PI3K-Akt通路或PTEN-Akt-mTOR通路等，在幾乎每一種PTEN基因敲除的組織或器官中，Akt活性均上調(diào)，且Aktl敲除可以挽救PTEN+/_小鼠在許多易感組織成瘤的表型，表明PTEN確實(shí)是Akt信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)控分子。近五年來(lái)，有研究揭示，PTEN不僅在細(xì)胞質(zhì)以磷酸酶依賴的方式發(fā)揮作用，也可以在細(xì)胞核內(nèi)以磷酸酶非依賴的方式發(fā)揮功能且對(duì)其抑癌作用同樣具有重要貢獻(xiàn)。PTEN可定位于著絲粒并與動(dòng)粒蛋白CENP-C蛋白結(jié)合，維持著絲粒穩(wěn)定性；作用于染色質(zhì)，上調(diào)Rad51水平，促進(jìn)DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)，維持染色體穩(wěn)定性；同時(shí)也可以與泛素連接酶APC/C結(jié)合，增強(qiáng)APC/C-Cdhl復(fù)合體的抑癌作用。
[0003]鑒于PTEN的重要性，其活性與穩(wěn)定性必然受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控。與P53半衰期非常短(約15-30分鐘)、細(xì)胞內(nèi)源蛋白水平很低不同，PTEN半衰期相對(duì)較長(zhǎng)(幾個(gè)小時(shí))、細(xì)胞內(nèi)源蛋白水平較高，二者同為重要的抑癌蛋白，發(fā)揮功能的機(jī)制雖也有交叉、但更多的是不同，P53主要在細(xì)胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能，而PTEN主要在細(xì)胞質(zhì)中作為磷酸酶發(fā)揮功能；在細(xì)胞周期進(jìn)程中，P53主要監(jiān)控G1/S期，PTEN主要調(diào)控M期。理論上講，蛋白穩(wěn)定性及蛋白量的控制，除了受到轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)合成的影響外，非常重要的一種機(jī)制就是泛素化降解與去泛素化的陰陽(yáng)平衡調(diào)控。泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3)促進(jìn)底物泛素化修飾，攜帶泛素鏈的蛋白為26S蛋白酶體識(shí)別并降解為肽段；與之相反，去泛素化酶(deubiquitinase, DUB)可以去除底物的泛素化，阻斷蛋白酶體介導(dǎo)的降解(proteasomaldegradat1n),保護(hù)底物蛋白使其水平上調(diào)。E3與DUB,就如同激酶與磷酸酶一樣,構(gòu)成調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性的重要分子對(duì)?？紤]到P53和PTEN的半衰期差異，相對(duì)而言，促進(jìn)p53泛素化修飾的E3 (如Mdm2、ARFBPl等)在調(diào)節(jié)p53半衰期中具有重要功能，相反，抑制PTEN泛素化修飾、阻斷蛋白酶體降解的DUB在調(diào)節(jié)PTEN半衰期中具有相對(duì)更為重要的角色。
[0004]截至目前，促進(jìn)PTEN泛素化(包括單泛素化與多聚泛素化)的E3已報(bào)道有5個(gè)分子，分別是Nedd4-1、WWP2、CHIP、XIAP和剛剛在線發(fā)表的TRM27/RFP，而促進(jìn)PTEN去泛素化的DUB只報(bào)道有I個(gè)分子，即HAUSP (又稱作USP7)，值得注意的是HAUSP特異地去除PTEN的單泛素化、促使PTEN從細(xì)胞核移位到細(xì)胞質(zhì)，但并不影響PTEN的蛋白穩(wěn)定性和蛋白量。確實(shí)，單泛素化和K63鏈?zhǔn)降亩嗑鄯核鼗话悴⒉挥绊懙鞍踪|(zhì)的降解，而包括K48鏈?zhǔn)皆趦?nèi)的其他類型的多聚泛素化才介導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解。因此，截至目前，去除PTEN多聚泛素化、抑制PTEN降解的DUB仍未見(jiàn)報(bào)道。
[0005]0TUD3是在國(guó)際上首次鑒定到的一個(gè)重要的蛋白，截止目前國(guó)際上0TUD3所公開(kāi)的信息只有其基因序列、蛋白序列與其OTU結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)，關(guān)于它的生物學(xué)功能與疾病相關(guān)性則均無(wú)公開(kāi)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供0TUD3蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體或表達(dá)0TUD3蛋白的慢病毒的用途。
[0007]本發(fā)明提供的0TUD3蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體或表達(dá)0TUD3蛋白的慢病毒在制備具有如下1)-9)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用:
[0008]I)治療和/或預(yù)防腫瘤；2)抑制腫瘤細(xì)胞增殖；3)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；4)抑制腫瘤細(xì)胞遷移；5)抑制腫瘤細(xì)胞偽足形成；6)抑制腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落形成能力；7)抑制正常細(xì)胞發(fā)生癌變；8)抑制腫瘤形成；9)抑制腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移；所述0TUD3蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0009]上述應(yīng)用中，所述0TUD3蛋白編碼基因的核昔酸序列為序列表中序列I。
[0010]上述應(yīng)用中，所述含有其編碼基因的重組載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體；
[0011 ] 所述表達(dá)載體具體為慢病毒表達(dá)載體或原核表達(dá)載體。
[0012]上述應(yīng)用中，所述表達(dá)0TUD3蛋白的慢病毒為將含有其編碼基因的重組慢病毒載體侵染宿主細(xì)胞，包裝得到慢病毒；
[0013]所述重組慢病毒載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入慢病毒表達(dá)載體中得到的重組載體。
[0014]本發(fā)明另一個(gè)目的是提供抑制0TUD3蛋白表達(dá)的物質(zhì)的用途。
[0015]本發(fā)明提供的抑制0TUD3蛋白表達(dá)的物質(zhì)在制備具有如下I)-8)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍:1)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；2)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；3)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移；4)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞偽足形成；5)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落形成能力；6)促進(jìn)正常細(xì)胞發(fā)生癌變；8)促進(jìn)腫瘤形成；8)促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。
[0016]上述應(yīng)用中，所述抑制0TUD3蛋白表達(dá)的物質(zhì)為0TUD3蛋白的抑制劑，為干擾0TUD3基因表達(dá)的siRNA、干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA、含有干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的重組載體、表達(dá)干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA的慢病毒；
[0017]所述干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的核昔酸序列為序列表中序列6或序列7。
[0018]上述應(yīng)用中，所述含有干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的重組載體為將干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體；
[0019]所述表達(dá)載體具體為慢病毒表達(dá)載體或原核表達(dá)載體；
[0020]所述表達(dá)0TUD3蛋白的慢病毒為將含有其編碼基因的重組慢病毒載體侵染宿主細(xì)胞，包裝得到慢病毒；
[0021]所述重組慢病毒載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入慢病毒表達(dá)載體中得到的重組載體。
[0022]上述應(yīng)用中，所述腫瘤為乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌或子宮頸癌。
[0023]上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥品。
[0024]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種抑制0TUD3蛋白表達(dá)的物質(zhì)。
[0025]本發(fā)明提供的物質(zhì)，為干擾0TUD3基因表達(dá)的siRNA、所述干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA、所述含有干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的重組載體或所述表達(dá)干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA的慢病毒；
[0026]所述干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6或序列7。
[0027]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，0TUD3作為抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶，通過(guò)去除PTEN的多聚泛素化修飾、抑制PTEN蛋白質(zhì)降解、穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中PTEN的蛋白穩(wěn)定性,從而抑制Akt通路的激活。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明0TUD3的敲低顯著促進(jìn)細(xì)胞的成瘤能力及轉(zhuǎn)移能力，而0TUD3的過(guò)表達(dá)則顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因小鼠模型也證明0TUD3的高表達(dá)能夠抑制小鼠乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。來(lái)自乳腺癌病人的臨床樣本顯示0TUD3在癌旁組織中的表達(dá)高于癌組織，與PTEN的表達(dá)成正相關(guān)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)在癌組織中0TUD3存在功能性基因突變，是在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)0TUD3作為一個(gè)抑癌蛋白抑制腫瘤的生成與轉(zhuǎn)移。
[0028]綜上所述，0TUD3作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的重要抑癌蛋白，可以抑制腫瘤的生成與轉(zhuǎn)移，0TUD3功能的發(fā)現(xiàn)將對(duì)腫瘤診斷、預(yù)防及治療提供重要的科學(xué)依據(jù)與應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為敲低0TUD3的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與遷移
[0030]其中，IA敲低0TUD3的表達(dá)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果；IB細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果；IC在乳腺癌細(xì)胞MCF7中敲低0TUD3的表達(dá)遷移能力結(jié)果；1D在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、肝癌細(xì)胞H印G2以及子宮頸癌細(xì)胞HeLa中敲低0TUD3的表達(dá)遷移能力結(jié)果；1E在乳腺癌細(xì)胞MCF7、結(jié)腸癌細(xì)胞HCTl 16、肝癌細(xì)胞H印G2以及子宮頸癌細(xì)胞HeLa中敲低0TUD3的表達(dá)細(xì)胞偽足結(jié)果；IF軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)。
[0031 ] 圖2為0TUD3抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)
[0032]圖2A，2B為敲低0TUD3的表達(dá)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0033]圖2C，2D為過(guò)表達(dá)0TUD3軟瓊脂集落形成及裸鼠成瘤能力；
[0034]圖2E、2F、2G、2H為0TUD3抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的發(fā)生結(jié)果；
[0035]圖21為其它腫瘤細(xì)胞中敲低0TUD3的表達(dá)WB結(jié)果；
[0036]圖3為敲低0TUD3的腫瘤細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移
[0037]圖3A-3D為敲低0TUD3腫瘤細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移能力結(jié)果；
[0038]圖3E為對(duì)臨床腫瘤(乳腺癌、結(jié)直腸癌等)病人樣本癌旁組織中0TUD3的mRNA結(jié)果;
[0039]圖3F為通過(guò)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)0TUD3在癌旁組織中的表達(dá)；
[0040]圖3G、3H、3I對(duì)200多例臨床樣本分析0TUD3的表達(dá)與PTEN的表達(dá)呈正相關(guān)性；
[0041]圖4為0TUD3突變體E86K對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與遷移的影響
[0042]圖4A為0TUD3突變位點(diǎn)E86K ；
[0043]圖4B和4C為E86K的突變導(dǎo)致0TUD3喪失了對(duì)PTEN的穩(wěn)定作用；
[0044]圖4D和4E為E86K的突變使0TUD3喪失了對(duì)PTEN的去泛素化能力；
[0045]圖4F和4G為E86K突變導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快；
[0046]圖4H為E86K突變導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)；
[0047]圖41為E86K突變有利于細(xì)胞偽足；
[0048]圖4J為E86K突變利于細(xì)胞軟瓊脂集落的形成。

【具體實(shí)施方式】
[0049]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0050]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051]實(shí)施例1、過(guò)表達(dá)0TUD3慢病毒和敲低0TUD3表達(dá)慢病毒的獲得
[0052]1、過(guò)表達(dá)0TUD3慢病毒的獲得
[0053]I)、0TUD3蛋白及編碼基因的獲得
[0054]人源0TUD3基因包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，其mRNA序列全長(zhǎng)6523nt (核苷酸序列為序列5)，CDS區(qū)為1197nt (核苷酸序列為序列1)，編碼一個(gè)含有398個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)0TUD3 (氨基酸序列為序列2)。
[0055]0TUD3蛋白主要含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域:0TU (ovarian tumor domain)結(jié)構(gòu)域和UBA (ubiquitin-associated domain)結(jié)構(gòu)域。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到0TUD3主要定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
[0056]利用購(gòu)買的0TUD3抗體，在12種乳腺癌細(xì)胞系、HCT116(結(jié)腸癌細(xì)胞)、H印G2(肝癌細(xì)胞)以及HeLa (子宮頸癌細(xì)胞)和293T (人胚腎細(xì)胞)中檢測(cè)了 0TUD3的表達(dá)，結(jié)果顯示0TUD3在各細(xì)胞系中均有表達(dá)，但在轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)很低。
[0057]2)、過(guò)表達(dá)0TUD3重組質(zhì)粒Flag_0TUD3的制備
[0058]設(shè)計(jì)正向反向引物對(duì):
[0059]正向引物:gatGAATTC a ATGTCCCGAAAGCAGGCGG(斜體為 EcoRI 的酶切位點(diǎn))
[0060]反向引物:ataGGTACC TCAGATGTTGAGAGCGGCG(斜體為 KpnI 的酶切位點(diǎn))
[0061]以人工合成的序列2為模板，用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收1216bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)同樣酶切的pFlag-CMV-2表達(dá)載體(Sigma，目錄號(hào)為E7398)連接，得到重組載體Flag-0TUD3,經(jīng)過(guò)測(cè)序,該重組質(zhì)粒為將序列表序列2所示的0TUD3插入pFlag-CMV-2表達(dá)載體的EcoR I和Kpn I酶切位點(diǎn)間得到的重組載體。
[0062]3)過(guò)表達(dá)0TUD3的慢病毒制備
[0063]設(shè)計(jì)正向反向引物對(duì):
[0064]正向引物:gatggatcc ac ATGTCCCGAAAGCAGGCGG(斜體為 BamH I 的酶切位點(diǎn))
[0065]反向引物:ataaccggt TCAGATGTTGAGAGCGGCG(斜體為 Age I 的酶切位點(diǎn))
[0066]以Flag_0TUD3質(zhì)粒為模板，用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收1216PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Age I雙酶切上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物與AgeI酶切的慢病毒表達(dá)載體FUGW(Addgene，目錄號(hào)為14883)連接，得到重組慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)測(cè)序,重組慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒為將序列表中序列2所示的0TUD3插入慢病毒表達(dá)載體FUGW的Age I酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0067]將重組慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集帶病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，濃縮儲(chǔ)存，得到過(guò)表達(dá)0TUD3的慢病毒(滴度為5X108TU/ml)。
[0068]將FUGW與慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集帶病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，濃縮儲(chǔ)存，得到陰性對(duì)照慢病毒。
[0069]2、敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒制備
[0070]設(shè)計(jì)如下三條靶向人源0TUD3基因的shRNA的編碼基因:
[0071 ] #1: TGGAAATCAGGGCTTAAAT (序列 6)
[0072]#2:GAGTTACACATCGCATATC (序列 7)
[0073]#3: CGTCTGCCATCGCATATTA (序列 8)
[0074]Contro 1: TTCTCCGAACGTGTCACGT (序列 9)
[0075]以上各條shRNA以及陰性對(duì)照control shRNA由Dharmacon公司負(fù)責(zé)合成。
[0076]分別將合成的四條shRNA連接到慢病毒載體GV112上，得到連接不同shRNA的重組慢病毒敲低質(zhì)粒#1、#2、#3。
[0077]經(jīng)過(guò)測(cè)序，
[0078]重組慢病毒敲低質(zhì)粒#1為將序列表中序列6所示的核苷酸插入慢病毒載體GV112的Agel和EcoRl酶切位點(diǎn)間得到的載體；
[0079]重組慢病毒敲低質(zhì)粒#2為將序列表中序列7所示的核苷酸插入慢病毒載體GV112的Agel和EcoRl酶切位點(diǎn)間得到的載體；
[0080]重組慢病毒敲低質(zhì)粒#3為將序列表中序列8所示的核苷酸插入慢病毒載體GVl 12的Agel和EcoRl酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0081]將重組慢病毒敲低質(zhì)粒#1、重組慢病毒敲低質(zhì)粒#2、重組慢病毒敲低質(zhì)粒#3分別與慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集帶病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，濃縮儲(chǔ)存，得到敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒#1、#2、#3 (滴度均為5X 108TU/ml)。
[0082]實(shí)施例2、0TUD3或敲低0TUD3表達(dá)的物質(zhì)的功能研究
[0083]一、0TUD3在抑制腫瘤細(xì)胞的增殖中的應(yīng)用
[0084]用由實(shí)施例1制備的敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒#1、過(guò)表達(dá)0TUD3的慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒分別感染乳腺癌細(xì)胞MCF7(北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù))，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7、過(guò)表達(dá)0TUD3的細(xì)胞系MCF7和陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7。
[0085]將IX 13個(gè)上述3種細(xì)胞分別種植于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)后加入0.05mg Inr1MTS (Promega)，在37°C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，檢測(cè)490納米光波下的吸光度值(0D490)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。
[0086]結(jié)果如圖1A所示:
[0087]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7 (sh0TUD3#l)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)的細(xì)胞數(shù)分別為3X 103、5.5X 103、8X 103、1.6X 14個(gè);陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7 (control)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)的細(xì)胞數(shù)分別為1.5Χ103、3.5Χ 103、4X 103、7X 13個(gè)。
[0088]結(jié)果如圖4G所示:
[0089]過(guò)表達(dá)0TUD3的細(xì)胞系MCF7 (0TUD3-WT)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)的細(xì)胞數(shù)分別為2X103、3X103、4.5X 13,8X 13U.1 X 14個(gè)；陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)的細(xì)胞數(shù)分別為3Χ103、5.5Χ103、8Χ103、1.2Χ104、1.8Χ104 個(gè)。
[0090]從上述可以看出，與陰性對(duì)照細(xì)胞系相比，過(guò)表達(dá)0TUD3細(xì)胞系抑制腫瘤細(xì)胞增殖；敲低0TUD3細(xì)胞系促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，表明，0TUD3抑制腫瘤細(xì)胞增殖、敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。
[0091]二、0TUD3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡
[0092]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7 (sh0TUD3#l)和陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7 (control)培養(yǎng)48小時(shí)后加10 μ M cisplatin(Sigma)和陰性對(duì)照試劑DMSO處理12小時(shí)，收集細(xì)胞，用PBS 洗漆后，用 fluorescein isoth1cyanate-Annexin V and propidium 1dide (BeijingB1sea b1technology Annexin V Kit)染色。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞的比率。
[0093]結(jié)果如圖1B所示:
[0094]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系凋亡細(xì)胞的比率為12% ；
[0095]陰性對(duì)照細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系凋亡細(xì)胞的比率為28%。
[0096]從上述可以看出，與陰性對(duì)照細(xì)胞系相比，敲低0TUD3細(xì)胞系抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，表明，0TUD3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，敲低0TUD3的慢病毒抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0097]三、0TUD3抑制腫瘤細(xì)胞的遷移
[0098]用敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒#1、#2和陰性對(duì)照慢病毒分別感染乳腺癌細(xì)胞MCF7、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、肝癌細(xì)胞H印G2以及子宮頸癌細(xì)胞HeLa，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3 表達(dá)的細(xì)胞系 MCF7 (#1、#2)、HCTl 16 (#1、#2)、H印G2 (#1、#2)、HeLa (#1、#2)和陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7、HCT116、H印G2、HeLa。用0TUD3過(guò)表達(dá)的慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒分別感染乳腺癌細(xì)胞MCF7，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到0TUD3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系MCF7和陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7。
[0099]將IX 16個(gè)上述各種細(xì)胞分別懸浮于不含有血清的培養(yǎng)基中種植于transwell小皿的內(nèi)室中，外室中添加含有10% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后，用棉簽去除內(nèi)室的細(xì)胞，在外室培養(yǎng)基中加入終濃度0.05mg Iiir1MTS(Promega)，在37°C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，在490納米光波下檢測(cè)吸光度值。
[0100]結(jié)果如圖1C所示:
[0101]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7(sh01D3#l)遷移的細(xì)胞數(shù)為1.4X 15個(gè)；
[0102]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7 (sh01D3#2)遷移的細(xì)胞數(shù)為1.6 X 15個(gè)；
[0103]陰性對(duì)照的細(xì)胞系MCF7的遷移細(xì)胞數(shù)為0.6 X 15個(gè)；
[0104]結(jié)果如圖1D所示:
[0105]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系HCT116(sh0TUD3#l)遷移的細(xì)胞數(shù)為1.2X 15個(gè)；
[0106]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系HCT116(sh0TUD3#2)遷移的細(xì)胞數(shù)為1.0X 15個(gè)
[0107]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系H印G2(sh0TUD3#l)遷移的細(xì)胞數(shù)為1.4X 15個(gè)；
[0108]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系H印G2 (sh0TUD3#2)遷移的細(xì)胞數(shù)為1.5 X 15個(gè)
[0109]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系HeLa(sh0TUD3#l)遷移的細(xì)胞數(shù)為0.85 X 15個(gè)；
[0110]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系HeLa(sh0TUD3#2)遷移的細(xì)胞數(shù)為0.9 X 15個(gè)；
[0111]陰性對(duì)照的細(xì)胞系HCT116的遷移細(xì)胞數(shù)為0.3X105個(gè)；
[0112]陰性對(duì)照的細(xì)胞系!fepG2的遷移細(xì)胞數(shù)為0.4 X 15個(gè)；
[0113]陰性對(duì)照的細(xì)胞系HeLa的遷移細(xì)胞數(shù)為0.2 X 15個(gè)。
[0114]結(jié)果如圖4H所示:
[0115]0TUD3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系MCF7 (0TUD3-WT)遷移的細(xì)胞數(shù)為0.5 X 14個(gè)；
[0116]陰性對(duì)照的細(xì)胞系MCF7(_)的遷移細(xì)胞數(shù)為2.2 X 14個(gè)；
[0117]可以看出，0TUD3抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒促進(jìn)遷移。
[0118]四、0TUD3抑制腫瘤細(xì)胞偽足的形成
[0119]用敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒#1和陰性對(duì)照慢病毒分別感MCF7、HCT116、H印G2和HeLa ;通過(guò)嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7、HCT116、H印G2、HeLa和陰性對(duì)照細(xì)胞系 MCF7、HCTl 16、H印G2、HeLa。
[0120]將上述各種細(xì)胞株種植在confocal小皿中，48小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。封閉處理后對(duì)F-actin，PTEN, 0TUD3進(jìn)行間接免疫熒光染色以及對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞偽足的形成情況。
[0121]結(jié)果如圖1E所示，control為陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7、sh0TUD3為敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7(sh 0TUD3#1)，可以看出，與control相比，sh0TUD3偽足的形成能力顯著增強(qiáng)。
[0122]轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、肝癌細(xì)胞H印G2以及子宮頸癌細(xì)胞HeLa，結(jié)果與上述無(wú)顯著差異。
[0123]表明，0TUD3抑制腫瘤細(xì)胞偽足的形成、敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒促進(jìn)腫瘤細(xì)胞偽足的形成。
[0124]五、0TUD3抑制腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落形成能力
[0125]用敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒#1、#2、過(guò)表達(dá)0TUD3的慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒分別感染乳腺癌細(xì)胞MCF7，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7、過(guò)表達(dá)0TUD3的細(xì)胞系MCF7、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7。
[0126]在6孔板中加入Iml含有0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。將上述各細(xì)胞系IX 14個(gè)穩(wěn)定細(xì)胞株懸浮于含有0.35%低熔點(diǎn)瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，加入上層。在37°C、5% CO2恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)3周后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色對(duì)直徑大于
0.1mm的克隆群進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0127]結(jié)果如圖1F所示:
[0128]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7(sh0TUD3#l)的克隆群數(shù)為100個(gè)左右，敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF7 (sh0TUD3#2)的克隆群數(shù)為90個(gè)左右，陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7的克隆群數(shù)為25個(gè)左右；
[0129]結(jié)果如圖4J所示:
[0130]過(guò)表達(dá)0TUD3的細(xì)胞系MCF7(WT)的克隆群數(shù)為100個(gè)左右，陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7的克隆群數(shù)為35個(gè)左右。
[0131]表明，敲低0TUD3的慢病毒促進(jìn)MCF7細(xì)胞的軟瓊脂集落形成能力，0TUD3抑制MCF7細(xì)胞的軟瓊脂集落形成能力。
[0132]六、敲低0TUD3促進(jìn)正常細(xì)胞的癌變
[0133]用敲低0TUD3表達(dá)的慢病毒#1、#2和陰性對(duì)照慢病毒分別感染正常乳腺上皮細(xì)胞MCFlOA(北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù))，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCF1A、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF1A。
[0134]用Western blotting檢測(cè)(WB檢測(cè))敲低 0TUD3 表達(dá)的細(xì)胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF10A，結(jié)果如圖2A所示，可以看出，與陰性對(duì)照細(xì)胞系MCFlOA相比，sh0TUD3#l和sh0TUD3#2細(xì)胞中0TUD3表達(dá)量明顯降低，說(shuō)明敲低成功。
[0135]在6孔板中加入Iml含有0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。將I X 14個(gè)敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCFlOA懸浮于含有0.35%低熔點(diǎn)瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，加入上層。在37°C、5% CO2恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)3周后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色對(duì)直徑大于0.1mm的克隆群進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0136]結(jié)果如圖2B所示，
[0137]敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCFlOA(sh0TUD3#l)的克隆群數(shù)為100個(gè)左右；敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCFlOA (sh0TUD3#2)的克隆群數(shù)為90個(gè)左右；
[0138]陰性對(duì)照細(xì)胞系MCFlOA卻沒(méi)有克隆形成。
[0139]將24只6周齡雌裸鼠隨機(jī)分為3組，分別將2X 17個(gè)上述制備的敲低0TUD3表達(dá)的細(xì)胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCFlOA (control)種植在6周齡雌裸鼠的近腋窩處的皮下。每周觀察小鼠的成瘤情況。對(duì)腫瘤做H&E染色和免疫組化分析。
[0140]結(jié)果如下表I所示，
[0141]
裸鼠皮+K注射敲低0TUD3奪圍性對(duì)愿_胞系MCFlOA后的成瘤怙況

?瘤小鼠的數(shù).? (%)—
3周4周5周
Control 0/8 (0)0/8 (0)0/8 (0)
shOTUDS #1 4/8 (50)δ/8 (62.δ)5/8 (62.5)
shOTUDS #2 3/8 (87.5) 4/8 (50)5/8 (62.5)
[0142]sh0TUD3#l組有5只小鼠成瘤；
[0143]sh0TUD3#2組有5只小鼠成瘤；
[0144]control組有O只小鼠成瘤；
[0145]可以看出，敲低0TUD3促進(jìn)正常細(xì)胞的癌變。
[0146]七、過(guò)表達(dá)0TUD3抑制腫瘤的形成
[0147]用上述得到的0TUD3過(guò)表達(dá)的以及陰性對(duì)照慢病毒感染乳腺癌細(xì)胞MCF7，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到0TUD3過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MCF7、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7。
[0148]用WB檢測(cè)0TUD3過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MCF7 (WT)、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7，結(jié)果如圖2C所示，可以看出，與陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7相比，0TUD3過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MCF7 (WT)中0TUD3表達(dá)量明顯提高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)成功。
[0149]在6孔板中加入1ml含有0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。將I X 14個(gè)0TUD3過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MCF7 (WT)、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7懸浮于含有0.35%低熔點(diǎn)瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，加入上層。在37°C、5% CO2恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)3周后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色對(duì)直徑大于0.1mm的克隆群進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0150]結(jié)果如2D所示， [0151 ] 0TUD3過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MCF7 (WT)的克隆群數(shù)為35個(gè)左右；
[0152]陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7的克隆群數(shù)為100個(gè)左右。
[0153]將16只6周齡雌裸鼠隨機(jī)分為2組，將2 X 17個(gè)0TUD3過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MCF7 (WT)、陰性對(duì)照細(xì)胞系MCF7分別種植在6周齡雌裸鼠的近腋窩處的皮下。每周觀察小鼠的成瘤情況。對(duì)腫瘤做H&E染色和免疫組化分析。
[0154]結(jié)果如表2所示，

【權(quán)利要求】
1.0TUD3蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體或表達(dá)0TUD3蛋白的慢病毒在制備具有如下1)-9)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用: 1)治療和/或預(yù)防腫瘤； 2)抑制腫瘤細(xì)胞增殖； 3)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡； 4)抑制腫瘤細(xì)胞遷移； 5)抑制腫瘤細(xì)胞偽足形成； 6)抑制腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落形成能力； 7)抑制正常細(xì)胞發(fā)生癌變； 8)抑制腫瘤形成； 9)抑制腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移； 所述0TUD3蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述0TUD3蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述含有其編碼基因的重組載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體； 所述表達(dá)載體具體為慢病毒表達(dá)載體或原核表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述表達(dá)0TUD3蛋白的慢病毒為將含有其編碼基因的重組慢病毒載體侵染宿主細(xì)胞，包裝得到慢病毒； 所述重組慢病毒載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入慢病毒表達(dá)載體中得到的重組載體。
5.抑制0TUD3蛋白表達(dá)的物質(zhì)在制備具有如下1)-8)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用: 1)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖； 2)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡； 3)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移； 4)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞偽足形成； 5)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落形成能力； 6)促進(jìn)正常細(xì)胞發(fā)生癌變； 7)促進(jìn)腫瘤形成； 8)促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述抑制0TUD3蛋白表達(dá)的物質(zhì)為干擾0TUD3基因表達(dá)的siRNA、干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA、含有干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的重組載體、表達(dá)干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA的慢病毒； 所述干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6或序列7。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述含有干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的重組載體為將干擾0TUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體； 所述表達(dá)載體具體為慢病毒表達(dá)載體或原核表達(dá)載體； 所述表達(dá)0TUD3蛋白的慢病毒為將含有其編碼基因的重組慢病毒載體侵染宿主細(xì)胞，包裝得到慢病毒； 所述重組慢病毒載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入慢病毒表達(dá)載體中得到的重組載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述腫瘤為乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌或子宮頸癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述產(chǎn)品為藥品。
10.一種抑制OTUD3蛋白表達(dá)的物質(zhì)，為干擾OTUD3基因表達(dá)的siRNA、所述干擾OTUD3基因表達(dá)的shRNA、所述含有干擾OTUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的重組載體或所述表達(dá)干擾OTUD3基因表達(dá)的shRNA的慢病毒； 所述干擾OTUD3基因表達(dá)的shRNA編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6或序列7。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104174012SQ201410413298
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】張令強(qiáng), 賀福初, 袁林, 呂艷蓉, 李洪昌, 邢桂春 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所