專利名稱：檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
錯配識別蛋白(mismatch binding protein,MutS)是錯配修復(fù)系統(tǒng)行使修復(fù)功能的第一個蛋白，能夠識別并結(jié)合全部八種堿基錯配 ，還能識別結(jié)合I至4個核苷酸插入或缺失形成的loop環(huán)結(jié)構(gòu)引起的錯配。 利用MutS的上述特殊功能，近年來己有一些研究探索MutS在檢測和富集突變以及檢測SNP方面的應(yīng)用。其中，Rober Wanger等提出了一種利用固定化的MutS檢測突變的方法，大致包括以下步驟1)將含有MutS溶于反應(yīng)緩沖液中，所述反應(yīng)緩沖液為pH7. 6，含有5mM氯化鎂，O. ImM 二硫蘇糖醇，O. OlmMEDTA的Tris-HCl溶液；2)將預(yù)濕的硝酸纖維膜置于48孔板中，加入含有MutS的反應(yīng)緩沖液，每孔含有的MutS 500ng，室溫反應(yīng)20min ；3)然后加入3% BSA, 200 μ L/孔，封閉lh，洗去封閉液；4)將待測DNA溶于含有3% BSA的反應(yīng)緩沖液中，并加至經(jīng)步驟3)處理后的48孔板中，O. 05 μ g/ μ L-0. 5 μ g/ μ L，20 μ L，室溫反應(yīng)30min ;5)用100 μ L反應(yīng)緩沖液沖洗5次；6)加入含O. 05 μ g/mL的鏈霉親和素_辣根過氧化物酶(Str印tavidin-HRP)，含BSA的反應(yīng)緩沖液，100 μ L/孔，室溫反應(yīng)20min ；7)用100 μ L反應(yīng)緩沖液沖洗5次；8)將硝酸纖維膜從48孔板中移出，用反應(yīng)緩沖液沖洗,吸干，然后浸入化學(xué)發(fā)光試劑(ECL development solution, Amersham)中反應(yīng)lmin,吸干后用X射線拍圖。上述基于MutS檢測突變的方法中檢測步驟繁瑣，檢測效率不高，且無法直接排除檢測結(jié)果中的假陰性結(jié)果，準(zhǔn)確率不高。如果要排除檢測結(jié)果中的假陰性實驗結(jié)果，需要對同一樣品進行重復(fù)檢測，這就必然進一步降低檢測效率，需要更多的待測樣品，而且這種重復(fù)檢測也僅僅能排除假陰性中因檢測步驟中的失誤引起的假陰性結(jié)果，而對于實驗材料，如固定有MutS的固相載體上固定的MutS單位密度過低而引起的假陰性結(jié)果無能為力。上述方法中披露了一種固定有MutS的固相載體，在具體的檢測應(yīng)用中，該固定有MutS的固相載體檢測步驟繁瑣，檢測效率不高，且至少需要兩個固定有MutS的固相載體才能排除檢測結(jié)果中的部分假陰性結(jié)果?；谏鲜龇椒ㄅ兜墓潭ㄓ蠱utS的固相載體形成的試劑盒同樣存在上述問題。因此需要一種新的檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法，該固相載體、試劑盒在實際應(yīng)用中能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結(jié)果中的假陰性結(jié)果，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率；該檢測核酸突變的方法能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結(jié)果中的假陰性結(jié)果，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)檢測步驟繁瑣、檢測效率不高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確率低的問題。一種檢測核酸突變的固相載體，所述固相載體表面固定有MutS ;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數(shù)量。其中，所述報告基團可為熒光標(biāo)記基團或無熒光標(biāo)記基團。其中，所述無熒光標(biāo)記基團優(yōu)選為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素。上述任一種方案中，所述固相載體表面為適于包被蛋白的材料。優(yōu)選的，所述材料包括天然纖維素、被修飾的纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龍、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、橡膠、金屬、金屬氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一種。
一種檢測核酸突變的試劑盒，包括檢測核酸突變的固相載體；所述固相載體表面固定有MutS ;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數(shù)量。其中，所述固相載體可采用本發(fā)明的檢測核酸突變的固相載體中的任一種。其中，所述試劑盒還可包括標(biāo)準(zhǔn)品；所述標(biāo)準(zhǔn)品包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品；所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為含有堿基錯配或由I至4個核苷酸缺失或插入引起的錯配的雙鏈核苷酸分子；所述陰性標(biāo)準(zhǔn)品為完全互補的雙鏈核苷酸分子。其中，所述試劑盒還可包括用于擴增特定區(qū)域的特異性引物。上述任一種方案中，所述報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素；所述試劑盒還包括顯色試劑；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應(yīng)進而指示固相載體上MutS的數(shù)量。一種基于本發(fā)明的檢測核酸突變的固相載體檢測核酸突變的方法，所述MutS所含有的報告基團為熒光標(biāo)記基團或無熒光標(biāo)記基團；所述熒光標(biāo)記基團的熒光標(biāo)記與待測樣品攜帶的熒光標(biāo)記不同；所述包括以下步驟
A.將帶有熒光標(biāo)記的待測樣品和陰性對照品混合，變性，退火，得帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物；所述陰性對照品為完全互補的雙鏈核酸分子，該核酸分子含有與待測樣品的待檢測區(qū)域的野生型序列完全相同的核酸序列；
B.將帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物加至檢測核酸突變的固相載體上，使帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物中的存在錯配的退火產(chǎn)物與固相載體上的MutS結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合至固相載體上的退火產(chǎn)物；
C.檢測與固相載體結(jié)合的退火產(chǎn)物的熒光標(biāo)記和固相載體上的MutS的報告基團，以確定待測樣品中是否存在突變。其中，所述步驟C可包括
Cl.熒光掃描步驟B的產(chǎn)物，初步確定待測樣品中是否含有突變；
C2.對MutS上的報告基團進行檢測，以確定固相載體上MutS的數(shù)量；
C3.根據(jù)步驟Cl和C2的結(jié)果確定待測樣品中是否存在突變。其中，步驟A之前可包括步驟A0.利用帶熒光標(biāo)記的特異性引物對源核酸進行擴增，得帶熒光標(biāo)記的待測樣品；或利用帶熒光標(biāo)記的核苷酸對源核酸進行末端標(biāo)記，得帶熒光標(biāo)記的待測樣品。上述任一種方案中，所述報告基團可為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素。上述任一種方案中，所述固相載體表面的材料包括硝酸纖維素膜、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯和尼龍中的至少一種。其中，所述步驟C可包括
Cl.熒光掃描步驟B的產(chǎn)物，初步確定待測樣品中是否含有突變；
C2.利用顯色試劑對MutS上的報告基團進行檢測，以確定固相載體上MutS的數(shù)量；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應(yīng)并指示固相載體上MutS的數(shù)量；
C3.根據(jù)步驟Cl和C2的結(jié)果確定待測樣品中是否存在突變。由上可知，本發(fā)明的檢測核酸突變的固相載體、試劑盒,通過對固相載體上固定的MutS的特殊設(shè)計，在應(yīng)用于檢測核酸突變的過程中，能夠減少檢測步驟，提高檢測效率， 排除檢測結(jié)果中的假陰性結(jié)果，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率；本發(fā)明的檢測核酸突變的方法能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結(jié)果中的假陰性結(jié)果，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率。


圖I是本發(fā)明一個實施例中克隆菌菌落PCR鑒定圖。圖2是本發(fā)明一個實施例中表達菌菌落PCR鑒定圖。圖3是本發(fā)明一個實施例中所得融合蛋白His-TthMutS PAGE電泳圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。本發(fā)明提供了一種檢測核酸突變的固相載體，所述固相載體表面固定有MutS;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數(shù)量。需要說明的是所述報告基團指示固相載體上MutS的數(shù)量的方式可以是直接指示也可以間接指示；所述直接指示是指直接對報告基團進行檢測，進而得出固相載體上MutS的數(shù)量，或者直接利用報告基團的數(shù)量來指示固相載體上MutS的數(shù)量；所述間接指示是指使報告基團與某些特定物質(zhì)反應(yīng)，然后對反應(yīng)產(chǎn)物進行檢測，進而得出固相載體上MutS的數(shù)量；在得出固相載體上MutS的數(shù)量后，可根據(jù)固相載體上用于固定MutS的表面積來計算出MutS的單位密度。所述特定物質(zhì)包括但不限于辣根過氧化物酶顯色劑、堿性磷酸酶顯色劑、偶聯(lián)有鏈霉親和素的檢測基團或帶生物素標(biāo)記的檢測基團；所述特定物質(zhì)與報告基團的反應(yīng)將在后文中進一步闡述。本方案的檢測核酸突變的固相載體，利用MutS能夠結(jié)合含有錯配的雙鏈核苷酸分子的特性，能夠?qū)崿F(xiàn)對含有突變的核酸的檢測，且因為MutS被固定在固相載體表面，使得整個檢測步驟更為簡單、方便。此外，因為MutS上含有報告基團，可以通過報告基團來檢測固相載體上的MutS的數(shù)量，進而計算出MutS的單位密度，從而排除因固相載體上固定的MutS的密度過低而導(dǎo)致的假陰性的結(jié)果，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。上述MutS的單位密度可以是絕對密度也可以是相對密度；所述絕對密度是指利用得到的固相載體上的MuS數(shù)量除以固相載體上用于固定MutS的表面積得到的密度值；所述相對密度是指固相載體上的MutS數(shù)量或報告基團的數(shù)量，當(dāng)然采用這種計算方式的前提是，各固相載體上用于固定MutS的表面積相同。此外，因為報告基團的存在，可利用報告基團對檢測核酸突變的固相載體的質(zhì)量進行檢測和評價。其中，所述報告基團可為熒光標(biāo)記基團或無熒光標(biāo)記基團。對于熒光標(biāo)記基團和無熒光標(biāo)記基團，有以下幾點需要說明。所述熒光標(biāo)記基團為在吸收特定波長的光子后能夠被活化并發(fā)生波長更長的光子的物質(zhì)，包括但不限于異硫氰酸突光素(FITC)、羅丹明(Rhodamine)、羅丹明B (Rhodamine B)、四甲基羅丹明(TAMRA)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、羅丹明紅X(RhodamineRed-X)、AmcA、4’, 6- 二脈基-2-苯基卩引噪(DAPI)、得克薩斯紅(Texas Red)、藻紅蛋白(R-Phycoerythrin)、Cy3、Cy5 或 5-羧基突光素(5-FAM)。當(dāng)所述報告基團為熒光標(biāo)記基團時，可直接通過對報告基團的檢測來確定固相載體表面固定的MutS的數(shù)量(即該報告基團可通過直接指示的方式指示固相載體上MutS的數(shù)量)，進而根據(jù)固相載體的表面積計算出固相載體表面固定的MutS的單位密度。本方案 與含不能直接指示固相上MutS的數(shù)量的報告基團的方案相比，本方案的檢測核酸突變的固相載體在具體使用過程中能夠減少實驗步驟，提高實驗效率。所述無熒光標(biāo)記基團為不含熒光標(biāo)記、能夠被直接或間接檢測的物質(zhì)，包括但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、鏈霉親和素或親和素。當(dāng)所述報告基團為不含熒光標(biāo)記能夠被直接檢測的物質(zhì)時，本方案與報告基團為熒光標(biāo)記基團的方案一樣，本方案的檢測核酸突變的固相載體在具體使用過程中能夠減少實驗步驟，提聞實驗效率。當(dāng)所述報告基團為不含熒光標(biāo)記能被間接檢測的物質(zhì)時，可通過對報告基團的間接檢測來確定固相載體表面固定的MutS的數(shù)量(即該報告基團可通過間接指示的方式指示固相載體上MutS的數(shù)量)，進而根據(jù)固相載體的表面積計算出固相載體表面固定的MutS的單位密度。本方案與報告基團為能夠被直接檢測的方案相比，本方案的檢測核酸突變的固相載體，在對報告基團的間接檢測過程中，可通過信號放大的步驟，提高對固相載體上MutS數(shù)量檢測的準(zhǔn)確性。例如，當(dāng)報告基團為辣根過氧化物酶時，可利用辣根過氧化物酶顯色劑實現(xiàn)對報告基團的間接指示，進而確定固相載體表面固定的MutS的數(shù)量，進而根據(jù)固相載體的表面積計算出固相載體表面固定的MutS的單位密度。當(dāng)報告基團為堿性磷酸酶時，可利用堿性磷酸酶顯色劑實現(xiàn)對報告基團的間接指示，進而確定固相載體表面固定的MutS的數(shù)量，進而根據(jù)固相載體的表面積計算出固相載體表面固定的MutS的單位密度。當(dāng)報告基團為生物素時，可基于生物素能夠特異性的與鏈霉親和素結(jié)合的特性，利用偶聯(lián)有鏈霉親和素的檢測基團實現(xiàn)對報告基團的間接指示，進而確定固相載體表面固定的MutS的數(shù)量，進而根據(jù)固相載體的表面積計算出固相載體表面固定的MutS的單位密度，所述檢測基團可為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光標(biāo)記基團。同樣的，當(dāng)報告基團為鏈霉親和素時，可利用帶生物素標(biāo)記的檢測基團實現(xiàn)對報告基團的間接指示，進而確定固相載體表面固定的MutS的數(shù)量，進而根據(jù)固相載體的表面積計算出固相載體表面固定的MutS的單位密度，所述檢測基團可為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光標(biāo)記基團。優(yōu)選的，所述報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素。本方案的檢測核酸突變的固相載體，在對報告基團的間接檢測過程中，可通過信號放大的步驟，提高對固相載體上MutS數(shù)量檢測的準(zhǔn)確性。上述任一種方案中，所述固相載體表面為適于包被蛋白的材料。優(yōu)選的，所述材料包括天然纖維素、被修飾的纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龍、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、橡膠、金屬、金屬氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一種。以下將通過第一具體實施例來進一步說明本發(fā)明的檢測核酸突變的固相載體是如何獲得的。一、生物素標(biāo)記的His-TthMutS蛋白的獲得。I.克隆構(gòu)建。I)PCR 擴增以 TthMutS-F (SEQ ID NO: I),TthMutS-R (SEQ ID NO: 2)為引物，Thermus thermophilus HB8 基因組(TaKaRa，3071)為模板，PCR 擴增 TthMutS 的編碼基因， 然后將PCR產(chǎn)物點在O. 8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，切膠回收PCR產(chǎn)物，回收的TthMutS片段于-20°C保存?zhèn)溆谩?)雙酶切利用 Nde I (NEB, #R0111S)和 Not I -HF (NEB, #R3189S)分別雙酶切pET-Avi質(zhì)粒(江蘇普羅賽生物技術(shù)有限公司，ΑΖ-Γ026)和步驟I)切膠回收的TthMutS片段，然后分別將雙酶切產(chǎn)物在O. 8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，切膠回收，回收產(chǎn)物分別于-20°C保存?zhèn)溆谩?)連接按I :5的摩爾比將步驟2)中回收產(chǎn)物中的雙酶切回收質(zhì)粒和雙酶切TthMutS片段回收產(chǎn)物，在T4 DNA Ligase (NEB，#M0202S)的作用下16°C連接過夜。4)轉(zhuǎn)化將步驟3)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細胞，然后涂于含50ng/ μ LKanr的LB平板中，37°C恒溫培養(yǎng)12tT24h。5)鑒定利用上游引物Fl (SEQ ID NO: 3)和下游引物Rl (SEQ ID NO: 4)，對步驟4)中LB平板上的單克隆進行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖I所示。結(jié)果顯示，泳道1、2、3均含有與預(yù)期產(chǎn)物大小相同的條帶出現(xiàn)，初步判定泳道1、2、3對應(yīng)的單克隆菌落均為陽性菌落。然后將圖I中泳道I對應(yīng)的陽性菌落進行擴大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒，送英俊公司測序，測序結(jié)果見SEQ ID NO: 5，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了 pET-His-TthMutS-Avi重組質(zhì)粒。保存泳道I對應(yīng)的陽性菌落。2.融合蛋白His-TthMutS的表達。I)表達菌轉(zhuǎn)化將成功構(gòu)建的pET-His-TthMutS-Avi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 ( DE3 )PLysS感受態(tài)細胞，涂于含50ng/ μ L Kanr的LB平板，37°C恒溫培養(yǎng)12tT24h。2)表達菌鑒定利用上游引物Fl (SEQ ID NO: 3)和下游引物Rl (SEQ ID NO:4)，對上述步驟I)中LB平板上的單克隆進行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，泳道1、2、3均含有與預(yù)期產(chǎn)物大小相同的條帶出現(xiàn)，判定泳道1、2、3對應(yīng)的單克隆菌落為陽性表達菌菌落。分別保存泳道1、2、3對應(yīng)陽性菌落，并分別命名為1、2、3號表達菌菌株。3)表達菌培養(yǎng)將I號表達菌菌株接種至20mL含50ng/ μ L Kanr的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm搖床培養(yǎng)過夜；然后取IOmL過夜培養(yǎng)菌液，轉(zhuǎn)接至IL新鮮的含50ng/μ L Kanr的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm搖床培養(yǎng)至OD600在O. 6至O. 7 (約3h)之間；加入IM的IPTG使其終濃度為O. 5mM,然后在37°C，200rpm搖床誘導(dǎo)表達6h。4)菌體回收4°C,5000rpm離心收集菌體。
3.菌體破碎。I)菌體重懸將收集的菌體在 20mL 的 Binding Buffer (IOOmM Tris-HCl, 300mMNaCl, 10% glycerol, IOmM imidazole, 5mM β-ME, 100 μ M PMSF)中重懸。2)菌體破碎將步驟I)中重懸的菌體于冰浴上超聲破碎，功率500W，超聲4s，間歇4s，超聲裂解100次。3)將步驟2)的破碎產(chǎn)物在4°C，IOOOOrpm離心4min，去除菌體殘骸，留上清，準(zhǔn)備上Ni-NTA親和柱。4.融合蛋白 His-TthMutS 的 Ni-NTA 純化。使用再生完畢的Ni-NTA柱非變性親和純化融合蛋白His-TthMutS，以下操作在4°C層析柜中操作。·
I)使用 20mL Binding BufferC IOOmM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10% glycerol, IOmMimidazole, 5mM β-ME)平衡柱子。2)將步驟3中所得的上清按8mL/h的流速過柱。3)使用 Washing Solution I (IOOmM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10% glycerol, 20mMimidazole, 5mM β -ME),按 20mL/h 的流速洗至流出液 OD280 < 0. 01。4)使用 30mL Washing Solution II (IOOmM Tris-HCl,300mM NaCl,10%glycerol, 50mM imidazole, 5mM β-ME),按20mL/h的流速洗柱,監(jiān)測流出液蛋白分布。5)使用 Elution Solution (IOOmM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10% glycerol, 250mMimidazole, 5mM β -ME),按6mL/h的流速洗脫目標(biāo)蛋白，監(jiān)測目標(biāo)蛋白分布,并收集洗脫液。5.透析除鹽。I)將步驟4所得洗脫液裝入透析帶，使用IL 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl,1.0mMEDTA, 10%甘油，5mM β -ME的透析液，4°C透析過夜，使用磁力攪拌器對透析液進行攪拌，以加速透析過程。2)以 300mL 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, I. OmM EDTA，50% 甘油，5mM β-ME 的儲
存液對步驟I)的透析產(chǎn)物進行第二次透析，4°C透析3h，同樣使用磁力攪拌器對透析液進行攪拌，以加速透析過程，得融合蛋白His-TthMutS純品。然后取步驟5所得的融合蛋白His-TthMutS純品10 μ L，加入5 μ L 3Χ蛋白上樣緩沖液，煮沸5min ;取5 μ L進行點樣，在5%、15%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，恒流30mA，電泳45min，考馬斯亮藍染色，結(jié)果如圖3所示。如圖3所示，經(jīng)上述步驟純化所得的融合蛋白His-TthMutS電泳所在泳道僅有單一條帶，大小約為96kDa,說明經(jīng)上述步驟純化所得的融合蛋白His-TthMutS的純度極高。6.融合蛋白His-TthMutS濃度的測定。使用Bradford法檢測融合蛋白濃度，以商品BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體操作方法為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在此不再贅述。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=l. 4717x-0. 1067,R2=O. 9956。取5 μ L步驟5所得的融合蛋白His-TthMutS純品測得OD595=O. 436，代入上述方程，可算出步驟5所得的融合蛋白His-TthMutS純品濃度為0. 535mg/mL。超濾濃縮后，以50mM Tris-HCl, 300mM NaCl，I. OmM EDTA, 50%甘油，5mM β -ME 的儲存液稀釋濃縮液，使其終濃度為lmg/mL，分裝至潔凈的EP管中，于_20°C保存。二、生物素標(biāo)記的His-TthMutS的包被。
以(λ 05Μ ρΗ9. 6的碳酸鹽緩沖液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3)為包被緩沖液將生物素標(biāo)記的His-TthMutS稀釋至蛋白質(zhì)含量為5ng/ μ L，在96孔酶標(biāo)板(生工生物工程(上海)有限公司，PEL10196)的每個的反應(yīng)孔中加100 μ L 5ng/ μ L的生物素標(biāo)記的His-TthMutS，4°C過夜；次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液I (ρΗ7· 4的PBST，8mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4,IOmM KC1，0. 14M NaCl，0. 1% (v/v) Tween-20)洗 3 次，200 μ L/ 孔，每次 3 分鐘。洗滌后每孔加入200 μ L O. 5%的BSA，于37°C封閉2h，棄去孔內(nèi)溶液，存于_20°C。經(jīng)上述步驟，生物素標(biāo)記的His-TthMutS被包被至96孔酶標(biāo)板上,得檢測核酸突變的固相載體。需要說明的是，TthMutS是MutS中的一種，發(fā)現(xiàn)于嗜熱微生物Thermusthermophilus中,其能有效識別并結(jié)合I至3個核苷酸的插入或缺失以及所有8種類型的堿基錯配產(chǎn)生的異源雙鏈DNA分子，并能在低于80°C的溫度下保持穩(wěn)定。上述具體實施例中的Tth-MutS可用E. coli MutS> S. typhimurium MutS或其他的野生型MutS或具有錯配核酸結(jié)合活性的重組MutS代替，當(dāng)然相應(yīng)的克隆構(gòu)建過程中所使用的擴增引物和鑒定引物需進行相應(yīng)的調(diào)整。不過因為TthMutS在識別和結(jié)合存在錯配的異源雙鏈DNA分子時能夠耐受更高的溫度，所以利用TthMutS進行核酸突變檢測時，可通過提高反應(yīng)溫度來減 少非特異性結(jié)合，進而提高檢測的準(zhǔn)確率。另外，TthMutS對不同類型的錯配突變的識別能力差異不大，而大腸桿菌MutS對不同類型的錯配突變的識別能力差異則稍大，所以利用TthMutS進行核酸突變檢測得到的結(jié)果更易分析，能夠在定性檢測突變的基礎(chǔ)上進一步進行核酸突變的定量分析。上述具體實施例中，因為細菌中含有生物素連接酶，所以步驟一中6所純化出的融合蛋白His-TthMutS上的Avi tag是已經(jīng)被生物素化了的。當(dāng)然，為了保證所有的融合蛋白His-TthMutS上的Avi tag均被生物素化，可在本具體實施例中步驟6之后增加一個步驟7，即利用生物素連接酶(例如GeneCopoeia，B0101A)的酶催化反應(yīng)保證融合蛋白His-TthMutS上的所有Avi tag都被標(biāo)記上生物素,相關(guān)反應(yīng)條件可參考GeneCopoeia的生物素連接酶說明書。當(dāng)然也可通過其他方式來實現(xiàn)對TthMutS或大腸桿菌MutS的生物素標(biāo)記，例如化學(xué)標(biāo)記法。優(yōu)選通過在細菌中表達含有Avi tag的TthMutS或大腸桿菌MutS來實現(xiàn)對TthMutS或大腸桿菌MutS的生物素標(biāo)記。因為與通過化學(xué)標(biāo)記法相比,這種方式更加方便，重復(fù)性更好，且反應(yīng)條件更加溫和，標(biāo)記的專一性更高；且生物素標(biāo)記的位置不是隨機分布的，與構(gòu)建的融合蛋白的克隆序列中Avi tag的表達框所在位置對應(yīng)，這些優(yōu)點對于保持TthMutS或大腸桿菌MutS的生物活性是非常有幫助，能防止因TthMutS或大腸桿菌MutS的生物活性位點被生物素標(biāo)記而導(dǎo)致的活性喪失。上述具體實施例中的克隆構(gòu)建、融合蛋白表達、融合蛋白純化、透析除鹽等步驟所采用的方法均是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，其中各步驟中所使用的實驗材料、實驗條件均可進行相應(yīng)的調(diào)整。例如融合蛋白純化過程中的Ni-NTA柱可用Ni-IMAC Sepharose FF替換；透析除鹽步驟可用Q-Sepharose FF柱層析步驟替換。96孔酶標(biāo)板的孔表面的材質(zhì)主要為聚苯乙烯，96孔酶標(biāo)板可用其他材料例如尼龍、PVDF膜、或表面為天然纖維素、被修飾的纖維素、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、橡膠、金屬、金屬氧化物、玻片、硅片和陶瓷的其他材料替換?？砂瓷鲜鼍唧w實施例所體現(xiàn)的原理，使用多種方法制備的檢測核酸突變的固相載體。
此外，將生物素標(biāo)記的His-TthMutS包被至固相載體表面的方法也有多種，上述具體實施例中只是選擇了一種較為常見的方法，現(xiàn)有技術(shù)中可將蛋白包被至固相載體表面的方法均適用于本方法。再有，上述具體實施中MutS上的生物素標(biāo)記也可用其他報告基團替代，可用于替代的報告基團在上面已經(jīng)進行了詳細的說明，在此不再贅述。當(dāng)然隨著報告基團的不同，使MutS帶上報告基團的方法會有些不同，但是這些方法均是現(xiàn)有技術(shù)，在此就不再贅述，只進行簡單的說明。當(dāng)報告基團為熒光標(biāo)記基團時，現(xiàn)有技術(shù)中使蛋白帶上熒光標(biāo)記基團的方法均適用于本發(fā)明?，F(xiàn)有技術(shù)中有很多使蛋白帶上熒光標(biāo)記的試劑盒，例如生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)的蛋白FITC標(biāo)記試劑盒(貨號786-059)、蛋白羅丹明標(biāo)記試劑盒(貨號786-058)，對于如何使用這些試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司提供了相應(yīng)的說明書進行詳細的說明。當(dāng)報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、鏈霉親和素或親和素等時，現(xiàn)有技術(shù)中，使一種蛋白與另一種蛋白偶聯(lián)的方法同樣適用于本發(fā)明，現(xiàn)有技術(shù)中同樣有很多使一種蛋白與另一種蛋白偶聯(lián)的試劑盒，例如生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)的蛋白HRP標(biāo)記試劑盒(貨號786-313)、蛋白AP標(biāo)記試劑盒(貨號786-315)等，對于如何使用這些試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司提供了相應(yīng)的說明書進行詳細的說明。
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在本發(fā)明的一個具體實施例中，制備含Cy5標(biāo)記的MutS的方法大致如下，配置IOmL 的反應(yīng)體系，該體系pH為 7. 9，含有 IOmM HEPES,50mM KCl, 5mM MgCl2，ImM DTT,0. 2mM甲基橫酸氟液，10% (v/v)甘油，12. 5 μ M Cy5 monofuctional dye (Amersham PharmaciaBiotech, Amersham, UK), lmg/mL 大腸桿菌 MutS (Genecheck Fort Collins, CO),然后在20°C反應(yīng) 30min，然后用 Buffer AClOmM HEPES,50mM KCl,5mM MgCl2，ImM DTT,0. 2mM 甲基磺酰氟液，10% (v/v)甘油)透析得含Cy5標(biāo)記的MutS。本發(fā)明還提供了一種檢測核酸突變的試劑盒，包括檢測核酸突變的固相載體；所述固相載體表面固定有MutS ;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數(shù)量。需要說明的是，本方案的檢測核酸突變的試劑盒所包括的檢測核酸突變的固相載體可采用上述的檢測核酸突變的固相載體中的任一種。本方案的檢測核酸突變的試劑盒，以檢測核酸突變的固相載體為基礎(chǔ)，利用MutS能夠結(jié)合含有錯配的雙鏈核苷酸分子的特性，能夠?qū)崿F(xiàn)對含有突變的核酸的檢測，且因為MutS被固定在固相載體表面，使得整個檢測步驟更為簡單、方便；此外，因為MutS上含有報告基團，可以通過報告基團來檢測固相載體上的MutS的數(shù)量，進而根據(jù)固相載體上用于固定MutS的表面積計算出MutS的單位密度，從而排除因固相載體上固定的MutS的單位密度過低而導(dǎo)致的假陰性的結(jié)果，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。其中，所述試劑盒還可包括標(biāo)準(zhǔn)品；所述標(biāo)準(zhǔn)品包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品；所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為含有堿基錯配或由I至4個核苷酸缺失或插入引起的錯配的雙鏈核苷酸分子；所述陰性標(biāo)準(zhǔn)品為完全互補的雙鏈核苷酸分子。利用上述標(biāo)準(zhǔn)品，可加強本發(fā)明的檢測核酸突變的試劑盒的易用性以及檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。其中，所述試劑盒還可包括用于擴增特定區(qū)域的特異性引物。本方案中的試劑盒因為包含用于擴增特定區(qū)域的特異性引物，可使其尤其適用于該特定區(qū)域的核酸突變檢測，使得用戶在利用該試劑盒檢測該特定區(qū)域的核酸突變時，無需再自行設(shè)計引物，減輕了用戶的工作量，提高了試劑盒的易用性。上述任一種方案中，所述試劑盒中的檢測核酸突變的固相載體上的MutS所包含的報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、親和素、鏈霉親和素或生物素；所述試劑盒還包括顯色試劑；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應(yīng)進而指示固相載體上MutS的數(shù)量。所述報告基團為過氧化物酶時，所述顯色試劑可采用市場上常見的辣根過氧化物酶顯色試劑，包括但不限于天根生化科技(北京)有限公司的可溶型單組分TMB底物溶液(PA107-01)。所述報告基團為堿性磷酸酶顯色試劑時，所述顯色試劑可采用市場上常見的堿性磷酸酶顯色試劑，包括但不限于天根生化科技(北京)有限公司的BCIP/NBT底物顯色試劑盒(PA111)。
所述報告基團為生物素時，所述顯色試劑包括與鏈霉親和素偶聯(lián)的過氧化物酶或與生物素偶聯(lián)的堿性磷酸酶，以及相應(yīng)的辣根過氧化物酶顯色試劑或堿性磷酸酶顯色試劑。本發(fā)明還提供了一種基于上述任一種檢測核酸突變的固相載體檢測核酸突變的方法，所述MutS所含有的報告基團為熒光標(biāo)記基團或無熒光標(biāo)記基團；所述熒光標(biāo)記基團的熒光標(biāo)記與待測樣品攜帶的熒光標(biāo)記不同；所述方法包括以下步驟
A.將帶有熒光標(biāo)記的待測樣品和陰性對照品混合，變性，退火，得帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物；所述陰性對照品為完全互補的雙鏈核酸分子，該核酸分子含有與待測樣品的待檢測區(qū)域的野生型序列完全相同的核酸序列；
B.將帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物加至檢測核酸突變的固相載體上，使帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物中的存在錯配的退火產(chǎn)物與固相載體上的MutS結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合至固相載體上的退火產(chǎn)物；
C.檢測與固相載體結(jié)合的退火產(chǎn)物的熒光標(biāo)記和固相載體上的MutS的報告基團，以確定待測樣品中是否存在突變。需要說明的是，上述方案基于上述的任一種檢測核酸突變的固相載體，利用MutS能夠結(jié)合含有錯配的雙鏈核苷酸分子的特性，實現(xiàn)了對含有突變的核酸的檢測，且因為MutS被固定在固相載體表面，使得整個檢測步驟更為簡單、方便；此外，本方案利用MutS上含有的報告基團來檢測固相載體上的MutS的數(shù)量，進而根據(jù)固相載體上用于固定MutS的表面積計算出MutS的單位密度,從而排除因固相載體上固定的MutS的單位密度過低而導(dǎo)致的假陰性的結(jié)果，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確；而對與固相載體結(jié)合的退火產(chǎn)物的熒光標(biāo)記的檢測，以及對固相載體上的MutS的報告基團的檢測是在同一固相載體上進行的，因此在提高準(zhǔn)確率的同時，避免了為了排除假陰性結(jié)果而重復(fù)實驗的操作，提高了實驗效率，降低了成本；另外，對與固相載體結(jié)合的退火產(chǎn)物的熒光標(biāo)記的檢測，以及對固相載體上的MutS的報告基團的檢測可同時進行，也可相繼進行，且相互之間無順序關(guān)系。當(dāng)固相載體上的MutS的報告基團也是熒光標(biāo)記基團時，其熒光標(biāo)記與待測樣品攜帶的熒光標(biāo)記不同。所述待測樣品為帶熒光標(biāo)記的單鏈或雙鏈核酸分子，其序列中可能含有與野生型序列不一致的地方，即該待測樣品中可能含有突變。所述待測樣品可以是針對從生物體、組織或細胞中提取獲得的核酸分子進行處理后獲得的帶熒光標(biāo)記的單鏈或雙鏈核酸分子。
其中，所述步驟C可包括
Cl.熒光掃描步驟B的產(chǎn)物，初步確定待測樣品中是否含有突變；
C2.對MutS上的報告基團進行檢測，以確定固相載體上MutS的數(shù)量；
C3.根據(jù)步驟Cl和C2的結(jié)果確定待測樣品中是否存在突變。需要說明的是，本方案中，若步驟Cl中檢測到熒光，則可初步判定待測樣品中含有突變，若未檢測到熒光，則可初步判定待測樣品中不含有突變。若經(jīng)步驟Cl初步判定待測樣品中不含有突變，然后經(jīng)步驟C2檢測出固相載體上MutS的數(shù)量，并根據(jù)該固相載體上用于固定MutS的表面積計算出該固相載體上MutS的單位密度,若該固相載體上MutS的單位密度過低，則可判定步驟Cl的結(jié)果可能為假陰性，該待測樣品是否含有突變不確定，需重新檢測。若經(jīng)步驟Cl初步判定待測樣品中不含有突變，經(jīng)步驟C2檢測出的固相載體上MutS的數(shù)量計算出的MutS的單位密度不過低，則可判定該樣品中不含有突變。若經(jīng)步驟Cl 初步判定待測樣品中含有突變，經(jīng)步驟C2檢測出的固相載體上MutS的數(shù)量計算出的MutS的單位密度不過低，則可判定該樣品中含有突變。至于固相載體上MutS的單位密度是否過低，與用于檢測熒光標(biāo)記的熒光檢測裝置相關(guān)?？筛鶕?jù)用于檢測熒光標(biāo)記的熒光檢測裝置的最低檢測限來計算單位面積上至少需要有多少個熒光標(biāo)記分子才能使得其被檢測到，然后根據(jù)每個MutS能夠結(jié)合一個帶錯配的雙鏈核酸分子，計算出單位面積上至少需要固定多少個MutS分子才能保證該固相載體能夠用于檢測核酸突變。計算出的最低MutS分子的單位密度即為該熒光檢測裝置對應(yīng)的臨界值，若固相載體上的MutS分子的單位密度小于該臨界值，則過低；若大于等于該臨界值，則說明該固相載體的檢測結(jié)果是可信的。相關(guān)可采用的熒光檢測裝置在市場上有很多種，包括但不限于美國寶特(BioTek)的 FLx800 系列的 FLx800T、FLx800TB、FLx800TBP、FLx800TBI、FLx800TBID,Synergy MxF 系列的 SMT、SMTB, SMTBD, SMTD,或瑞士帝肯(Tecan)的 Infinite F500、Infinite MlOOO或Infinite 200系列的F200和M200等。優(yōu)選的，可采用具有熒光、化學(xué)發(fā)光和光吸收等三種檢測模式的檢測裝置進行步驟C的檢測，例如Infinite F500、InfiniteM1000、Infinite 200 系列的 F200 和 M200 等。當(dāng)然，判定固相載體上MutS的單位密度是否過低，除了上述的絕對值判定法外，還可以采用相對值判定法，即基于多個相同的固相載體(它們具有相同的用于固定MutS的表面積)，制備一系列的固定有不同量的含報告基團的MutS的固相載體(即一系列不同表面密度的固相載體)，然后基于上述固相載體分別對陽性標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，能檢測出突變的最低表面密度的固相載體上的MutS單位密度為臨界值；若固相載體上的固定的MutS的單位密度小于該臨界值，則過低；若大于等于該臨界值，則說明該固相載體的檢測結(jié)果是可信的。這種相對值判定法與絕對值判定法相比，其臨界值是通過實際實驗計算得出的，更貼近實際情況，結(jié)果更為準(zhǔn)確；在實際實驗過程中設(shè)計的密度梯度越多，得到的臨界值越準(zhǔn)確。其中，步驟A中的帶熒光標(biāo)記的待測樣品的獲得可通過多種方式進行。包括但不限于利用特異性引物，通過PCR技術(shù)對源核酸進行擴增，得帶熒光標(biāo)記的待測樣品；或通過對源核酸進行修飾，得帶熒光標(biāo)記的待測樣品。需要說明的是，所述源核酸為單鏈或雙鏈核酸分子，其序列中可能含有與野生型序列不一致的地方，即該源核酸中可能含有突變。所述源核酸可以是直接從生物體、組織或細胞中提取獲得的核酸分子，也可以是對直接從生物體、組織或細胞中提取獲得的核酸分子進行特定區(qū)域特異性擴增的產(chǎn)物。通過PCR技術(shù)獲得帶熒光標(biāo)記的待測樣品的方法中，熒光標(biāo)記的來源可以是特異性引物本身帶有的熒光標(biāo)記，也可以通過在擴增過程中摻入帶熒光標(biāo)記的核苷酸來實現(xiàn)的。通過修飾方式使源核酸獲得熒光標(biāo)記從而得到帶熒光標(biāo)記的待測樣品的方法中，可以利用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)、Klenow Fragment (3’一5’ exo_)的特性，以帶熒光標(biāo)記的核苷酸為底物，使源核酸的3’端帶上熒光標(biāo)記。優(yōu)選的，步驟AO為利用特異性引物，通過PCR技術(shù)對源核酸進行擴增，得帶熒光標(biāo)記的待測樣品。本方案中，在PCR擴增過程中既實現(xiàn)了對源核酸的熒光標(biāo)記，又對源核酸中的可能存在突變的區(qū)域進行了特異性擴增，增加了可能存在突變的區(qū)域的分子數(shù)，使得檢測結(jié)果更為靈敏和準(zhǔn)確。更優(yōu)選的，步驟AO中的特異性引物為5’端帶熒光標(biāo)記的特異性引物。本方案中，所得待測樣品中的熒光標(biāo)記來源于特異性引物本身帶有的熒光標(biāo)記，本方案是通過使用帶熒光標(biāo)記的特異性引物和普通的核苷酸來進行擴增的，與使用普通的特異性引物和帶熒光標(biāo)記的核苷酸相比，成本更低，且獲得的待測樣品中的各個核酸分子所攜帶的熒光標(biāo)記的 數(shù)量和位置非常一致，各核酸分子的熒光信號強度均一，有利于后續(xù)的檢測反應(yīng)。上述任一方案中，所述檢測核酸突變的固相載體上的MutS所包含的報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、親和素、鏈霉親和素或生物素。上述任一方案中，所述固相載體表面的材料包括硝酸纖維素膜、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯和尼龍中的至少一種。優(yōu)選的，所述固相載體表面的材料包括硝酸纖維素膜、聚苯乙烯和尼龍中的至少一種。上述任一方案中，優(yōu)選的，所述步驟C包括
Cl.熒光掃描步驟B的產(chǎn)物，初步確定待測樣品中是否含有突變；
C2.利用顯色試劑對MutS上的報告基團進行檢測，以確定固相載體上MutS的數(shù)量；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應(yīng)并指示固相載體上MutS的數(shù)量；
C3.根據(jù)步驟Cl和C2的結(jié)果確定待測樣品中是否存在突變。需要說明的是，本方案先是通過對與固相載體結(jié)合的退火產(chǎn)物的熒光標(biāo)記的檢測來初步判定待測樣品中是否含有突變，然后進一步通過顯色試劑與報告基團的反應(yīng)來確定固相載體上MutS的數(shù)量，并根據(jù)該固相載體上用于固定MutS的表面積計算出該固相載體上MutS的單位密度,若該固相載體上MutS的單位密度過低，則可判定步驟Cl的結(jié)果可能為假陰性，該待測樣品是否含有突變不確定，需重新檢測。若經(jīng)步驟Cl初步判定待測樣品中不含有突變，經(jīng)步驟C2檢測出的固相載體上MutS的數(shù)量計算出的MutS的單位密度不過低，則可判定該樣品中不含有突變。若經(jīng)步驟Cl初步判定待測樣品中含有突變，經(jīng)步驟C2檢測出的固相載體上MutS的數(shù)量計算出的MutS的單位密度不過低，則可判定該樣品中含有突變。本方案中所述的報告基團為無熒光標(biāo)記基團，且所述無熒光標(biāo)記基團不能直接指示固相載體上MutS的量。本方案中對固相載體上MutS的數(shù)量的檢測是通過化學(xué)顯色試劑來實現(xiàn)的，與通過熒光標(biāo)記基團來實現(xiàn)相比，通過化學(xué)顯色試劑實現(xiàn)固相載體上MutS的數(shù)量的檢測時所檢測的波長與步驟Cl檢測的熒光標(biāo)記的波長相差較大，相互之間不易發(fā)生干擾，且可通過化學(xué)顯示試劑與報告基團的反應(yīng)，將報告基團的信號放大，從而實現(xiàn)對固相載體上MutS數(shù)量的微量檢測，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。另外本方案所需的固相載體與報告基團為熒光標(biāo)記基團的固相載體相比，制備成本更低，因而間接降低了檢測成本。所述報告基團為過氧化物酶時，所述顯色試劑可采用市場上常見的辣根過氧化物酶顯色試劑，包括但不限于天根生化科技(北京)有限公司的可溶型單組分TMB底物溶液(PA107-01)。所述報告基團為堿性磷酸酶顯色試劑時，所述顯色試劑可采用市場上常見的堿性磷酸酶顯色試劑，包括但不限于天根生化科技(北京)有限公司的BCIP/NBT底物顯色試劑盒(PA111)。所述報告基團為生物素時，所述顯色試劑包括與鏈霉親和素偶聯(lián)的過氧化物酶或與生物素偶聯(lián)的堿性磷酸酶，以及相應(yīng)的辣根過氧化物酶顯色試劑或堿性磷酸酶顯色試劑。以下將通過第二具體實施例來進一步說明本發(fā)明的檢測核酸突變的固相載體是如何實現(xiàn)對核酸突變的檢測的。 一、突變檢測前準(zhǔn)備。I.檢測核酸突變的固相載體的制備。按第一具體實施例的方案制備96孔酶標(biāo)板，在包被生物素標(biāo)記的His-TthMutS時，將96孔板按行分成4個區(qū)域，分別為I、II、III、IV區(qū)。其中I區(qū)為第I至2行，加入的帶生物素標(biāo)記的His-TthMutS的量為IOOOng ;其中II區(qū)為第3至4行加入的帶生物素標(biāo)記的His-TthMutS的量為500ng ;其中III區(qū)為第5至6行加入的帶生物素標(biāo)記的His-TthMutS的量為250ng ;其中IV區(qū)為第7至8行加入的帶生物素標(biāo)記的His-TthMutS的量為lOOng。2.陰性對照品的制備。以正常人基因組為模板，利用BRCA2-F1 (SEQ ID NO: 6)、BRCA2_R1 (SEQ ID NO:7)對BRCA2基因進行擴增，所述引物BRCA2-F1、BRCA2-R1的5’端含有Cy3標(biāo)記。擴增體系如下BRCA2-F1(10 μ M)，I μ L ;BRCA2_R1 (10 μ M)，I μ L ;基因組模板，40ng ; 10 X Ex Taq Buffer,2y L ；Ex Taq (5U/μ L), 0. 2 μ L ；dNTP (各 2. 5mM),2y L ；ddH20,up to 20 μ L0PCR反應(yīng)條件如下
95 °C 3min ；
94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ;重復(fù) 29 個循環(huán)；
72 °C 7min。利用E.Z.N.A.
Cycle-Pure Kit (OMEGA BIO-TEK, D6492-01)回收 BRCA2-F1 和 BRCA2-R1 的擴增產(chǎn)物，對回收產(chǎn)物進行測序，顯示其序列為(SEQ ID N0:8)，說明該正常人的BRCA2基因為野生型，上述步驟所得回收產(chǎn)物可作為BRCA2基因突變檢測的陰性對照品，也可作為檢測BRCA2基因突變的試劑盒中的陰性標(biāo)準(zhǔn)品。3.各陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備。參考步驟2中的PCR擴增體系和擴增方法，以步驟2的回收產(chǎn)物為模板，按表I中的引物組合分別對BRCA2基因進行擴增，然后用E.Z.N.A. 8 Cycle-Pure Kit對擴增產(chǎn)物分別進行回收。
權(quán)利要求
1.一種檢測核酸突變的固相載體，其特征在于，所述固相載體表面固定有Muts ;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數(shù)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測核酸突變的固相載體，其特征在于，所述報告基團為熒光標(biāo)記基團或無突光標(biāo)記基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測核酸突變的固相載體，其特征在于，所述無熒光標(biāo)記基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素或鏈霉親和素。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的檢測核酸突變的固相載體，其特征在于，所述固相載體表面為適于包被蛋白的材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測核酸突變的固相載體，其特征在于，所述材料包括天然纖維素、被修飾的纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龍、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、橡膠、金屬、金屬氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一種。
6.一種檢測核酸突變的試劑盒，其特征在于，包括檢測核酸突變的固相載體；所述固相載體表面固定有MutS;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數(shù)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測核酸突變的試劑盒，其特征在于，還包括標(biāo)準(zhǔn)品；所述標(biāo)準(zhǔn)品包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品；所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為含有堿基錯配或由I至4個核苷酸缺失或插入引起的錯配的雙鏈核苷酸分子；所述陰性標(biāo)準(zhǔn)品為完全互補的雙鏈核苷酸分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測核酸突變的試劑盒，其特征在于，還包括用于擴增特定區(qū)域的特異性引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的檢測核酸突變的試劑盒，其特征在于，所述報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素或鏈霉親和素；所述試劑盒還包括顯色試劑；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應(yīng)進而指示固相載體上MutS的數(shù)量。
10.一種基于權(quán)利要求I所述的檢測核酸突變的固相載體檢測核酸突變的方法，其特征在于，所述MutS所含有的報告基團為熒光標(biāo)記基團或無熒光標(biāo)記基團；所述熒光標(biāo)記基團的熒光標(biāo)記與待測樣品攜帶的熒光標(biāo)記不同；所述方法包括以下步驟 A.將帶有熒光標(biāo)記的待測樣品和陰性對照品混合，變性，退火，得帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物；所述陰性對照品為完全互補的雙鏈核酸分子，該核酸分子含有與待測樣品的待檢測區(qū)域的野生型序列完全相同的核酸序列； B.將帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物加至檢測核酸突變的固相載體上，使帶熒光標(biāo)記的退火產(chǎn)物中的存在錯配的退火產(chǎn)物與固相載體上的MutS結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合至固相載體上的退火產(chǎn)物； C.檢測與固相載體結(jié)合的退火產(chǎn)物的熒光標(biāo)記和固相載體上的MutS的報告基團，以確定待測樣品中是否存在突變。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測核酸突變的方法，其特征在于，所述步驟C包括 Cl.熒光掃描步驟B的產(chǎn)物，初步確定待測樣品中是否含有突變； C2.對MutS上的報告基團進行檢測，以確定固相載體上MutS的數(shù)量； C3.根據(jù)步驟Cl和C2的結(jié)果確定待測樣品中是否存在突變。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測核酸突變的方法，其特征在于，步驟A之前包括步驟AO.利用帶熒光標(biāo)記的特異性引物對源核酸進行擴增，得帶熒光標(biāo)記的待測樣品；或利用帶熒光標(biāo)記的核苷酸對源核酸進行末端標(biāo)記，得帶熒光標(biāo)記的待測樣品。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項所述的檢測核酸突變的方法，其特征在于，所述報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素或鏈霉親和素，所述固相載體表面的材料包括硝酸纖維素膜、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯和尼龍中的至少一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的檢測核酸突變的方法，其特征在于，所述步驟C包括 Cl.熒光掃描步驟B的產(chǎn)物，初步確定待測樣品中是否含有突變； C2.利用顯色試劑對MutS上的報告基團進行檢測，以確定固相載體上MutS的數(shù)量；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應(yīng)并指示固相載體上MutS的數(shù)量； C3.根據(jù)步驟Cl和C2的結(jié)果確定待測樣品中是否存在突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法。所述檢測核酸突變的固相載體表面固定有MutS；所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數(shù)量。本發(fā)明還提供了包括上述檢測核酸突變的固相載體的試劑盒，以及基于上述檢測核酸突變的固相載體進行核酸突變檢測的方法。本發(fā)明的檢測核酸突變的固相載體、試劑盒在實際應(yīng)用中能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結(jié)果中的假陰性結(jié)果，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率。本發(fā)明的檢測核酸突變的方法能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結(jié)果中的假陰性結(jié)果，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率。
文檔編號C12Q1/68GK102899399SQ20121032046
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者盛司潼 申請人:深圳市華因康高通量生物技術(shù)研究院