專利名稱:用于提高泛酸產(chǎn)量的微生物和方法
相關申請本申請涉及遞交于2002年1月18日、名稱為“用于提高泛酸產(chǎn)量的微生物和方法”的國際專利專利申請?zhí)朠CT/US02/00925(未決),以及遞交于2000年9月21日、名稱為“用于生產(chǎn)panto-化合物的微生物和方法”的國際專利專利申請?zhí)朠CT/US00/25993(屆滿)。特此將以上提及的申請的全部內(nèi)容并入作為參考。
背景技術:
泛酸,也稱之為遍多酸或維生素B5,為維生素B復合物成員,并且是哺乳動物,包括家畜和人類的必需營養(yǎng)物(如來自食物來源,作為水溶性維生素補充物或作為飼料添加劑)。在細胞中,泛酸主要地用于輔酶A(CoA)和酰基載體蛋白(ACP)的生物合成。這些輔酶在?;糠值拇x中發(fā)揮作用,其中酰基與這些分子的4’-磷酸泛酰巰基乙胺部分的巰基形成硫酯。這些輔酶在所有細胞中都是必不可少的,參與100多種不同的細胞代謝中間反應。
合成泛酸(尤其是生物活性D異構體)的常規(guī)方法是從大量的化學制品進行化學合成,該方法受過高底物耗費以及外消旋中間體旋光拆分需求的阻礙。因此,研究者們近來在尋找能產(chǎn)生在泛酸生物合成過程中有用的酶的細菌或微生物系統(tǒng)(因為細菌本身能夠合成泛酸)。尤其是,生物轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)被評價為泛酸優(yōu)選異構體的有利制備方法。而且,直接微生物合成方法近來經(jīng)檢驗是利于D-泛酸制備的方法。
然而,仍然顯著需要改善的泛酸生產(chǎn)方法,尤其是,有必要優(yōu)化微生物方法以制備更高產(chǎn)量的期望產(chǎn)物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)泛酸的改進方法(如微生物合成)。泛酸生產(chǎn)方法已在相關申請中描述,其公開了例如經(jīng)改造能過表達泛酸生物合成途徑和異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑中的關鍵酶(如參見
圖1)的微生物。改造后這些菌株在標準發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生>50g/L的泛酸(如參見國際出版物No.WO 01/21772和美國專利申請No.60/262,995)。特別是,增加panB、panC、panD和panE1基因以及ilvBNC和ilvD基因表達可以導致菌株將葡萄糖(丙酮酸)轉(zhuǎn)化成具有商業(yè)吸引力的量的泛酸。
為提高例如泛酸的生產(chǎn)水平,已經(jīng)在以上所描述方法基礎上發(fā)展了各種改進措施。例如,美國專利申請系列No.09/667,569中描述了具有修飾的(例如,活性缺失或降低)泛酸激酶的生產(chǎn)菌株。在這些菌株中,通過減少泛酸在輔酶A(“CoA”)合成中的應用而有效提高了泛酸水平。美國專利申請系列No.60/262,995進一步描述了改進的泛酸生產(chǎn)菌株,所述菌株經(jīng)過改造可使各種泛酸生物合成酶和/或異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶和/或它們各自的底物最少地被應用于鑒定為[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的旁路產(chǎn)物的生產(chǎn)。
本發(fā)明詳述了通過調(diào)整生物合成途徑進一步提高泛酸產(chǎn)量的方法,所述生物合成途徑提供用于泛酸生物合成途徑的底物,即亞甲基四氫葉酸(“MTF”)生物合成途徑。特別是,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過修飾MTF生物合成途徑提高MTF的水平可導致泛酸生物合成途徑關鍵中間體(酮泛解酸)水平的提高。酮泛解酸水平的提高又可以在適宜的工程化菌株中導致泛酸生產(chǎn)水平的顯著提高。實質(zhì)上,本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出在過表達如panB、panC、panD、panE1、ilvBNC和ilvD基因的工程化菌株中類泛酸化合物(panto-compounds)(如泛酸)生產(chǎn)的限制步驟,并在此描述了通過修飾MTF生物合成途徑用于克服此限制的方法。
本文至少描述了三種有效的改變MTF生物合成途徑的方法。一方面,已經(jīng)證實,增加產(chǎn)生泛酸的微生物的培養(yǎng)基中的絲氨酸水平可以導致類泛酸化合物產(chǎn)量的提高。也已證實,增加3-磷酸甘油酸脫氫酶(serA基因產(chǎn)物)的合成或活性或增加絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的合成或活性,由此促進在適宜的工程化微生物中絲氨酸和亞甲基四氫葉酸的生物合成,可以增加類泛酸化合物的生產(chǎn)。提高3-磷酸甘油酸脫氫酶(serA基因產(chǎn)物)的合成可以例如,通過利用適當工程化的表達盒過表達serA來實現(xiàn)。提高絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的合成可以例如通過利用適當工程化的表達盒過表達glyA來實現(xiàn)。備選地,絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的水平可以通過改變對glyA基因的調(diào)控來提高。例如,glyA表達的負調(diào)控因子(即,阻遏物)的編碼基因purR,其突變或缺失可有效提高glyA的表達。適用于提高類泛酸化合物生產(chǎn)微生物中的MTF水平的其它方法包括對負責將甘氨酸轉(zhuǎn)化為MTF的酶(如甘氨酸裂解酶)進行去調(diào)節(jié)處理。
因此,在一方面,本發(fā)明涉及用于提高泛解酸和泛酸產(chǎn)量的方法,該方法包括在使泛酸產(chǎn)量得以提高的條件下培養(yǎng)具有修飾的泛酸生物合成酶活性以及具有修飾的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶活性的微生物。在另一方面,本發(fā)明涉及用于提高泛解酸和泛酸產(chǎn)量的方法,該方法包括在使泛酸產(chǎn)量得以提高的條件下培養(yǎng)具有修飾的泛酸生物合成酶活性、具有修飾的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶、以及具有修飾的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶活性的微生物。特別是,本發(fā)明描述了通過提高關鍵中間體酮泛解酸的水平(通過對其生物合成起作用的酶來提高)增加所需產(chǎn)物(如泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)量的方法。優(yōu)選的方法導致培養(yǎng)微生物36小時后泛酸的生產(chǎn)水平高于50、60、70g/L或更多,或培養(yǎng)微生物36小時后至少生成60、70、80、90、100、110、120g/L或更多的泛酸。本發(fā)明也描述了重組微生物和其培養(yǎng)條件。還描述了該微生物產(chǎn)生的組合物。
本發(fā)明的其他特點和優(yōu)勢將在以下詳細的描述和權利要求中彰顯。
附圖簡述圖1為泛酸和異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑的示意圖。泛酸生物合成酶以粗體標出,其相應基因以斜體顯示。異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶以粗斜體標出,其相應的基因以斜體顯示。
圖2為大腸桿菌中(及推測地枯草芽孢桿菌中)的亞甲基四氫葉酸(“MTF”)生物合成途徑的示意圖。
圖3為構建質(zhì)粒pAN665的示意圖。
圖4為構建質(zhì)粒pAN670的示意圖。
圖5為質(zhì)粒pAN004的示意圖。
圖6為質(zhì)粒pAN396的示意圖。
圖7為質(zhì)粒pAN393的示意圖。
圖8為枯草芽孢桿菌purR基因的克隆pAN835F的結構示意圖。
圖9為被設計以安裝斷裂的枯草芽孢桿菌purR基因的質(zhì)粒pAN838F的結構示意圖。
圖10為被設計以缺失部分serA基因、用于卡那霉素抗性選擇的質(zhì)粒pAN821的結構示意圖。
圖11為被設計在serA基因座整合不可擴增的P26serA盒、用于Ser+選擇的質(zhì)粒pAN824的結構示意圖。
圖12為被設計在serA基因座整合并擴增P26serA表達盒的中等拷貝質(zhì)粒pAN395的結構示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生類泛酸化合物(如酮泛解酸、泛解酸和/或泛酸)的改進的方法和應用于該改進方法中的工程化菌株。能夠產(chǎn)生>50g/L泛酸的菌株可按照國際專利申請系列No.WO 01/21772和美國專利申請系列No.60/262,995中的教導進行構建。通過增加panB、panC、panD和panE1基因的表達以及通過增加ilvBNC和ilvD基因的表達,可設計出能將葡萄糖(丙酮酸)轉(zhuǎn)化成具有商業(yè)吸引力的量的泛酸的菌株(如,芽孢桿菌屬菌株)。
但是,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在表達高水平panB基因產(chǎn)物-酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的工程化菌株(如在美國專利申請系列No.09/667,569中描述的PA824和在美國專利申請系列No.60/262,995中描述的PA668-24)中,進一步提高泛酸產(chǎn)量的限制步驟仍是α-酮異戊酸(α-KIV)向酮泛解酸的轉(zhuǎn)化。增加α-KIV合成的方法已在國際專利申請系列No.WO 01/21772和美國專利申請系列No.60/262,995中先期描述過。此處我們公開,可以通過改造類泛酸化合物的生產(chǎn)菌株使得MTF水平或MTF合成速率提高或增加,甚至進一步地提高泛酸的產(chǎn)量。
因此,本發(fā)明涉及用于提高類泛酸化合物生產(chǎn)的方法,包括調(diào)節(jié)亞甲基四氫葉酸(“MTF”)生物合成途徑。具體地,在類泛酸化合物的生產(chǎn)微生物中提高MTF水平是增進酮泛解酸生產(chǎn)的一種有效手段,而這又可以導致適當工程化的重組微生物中泛解酸和/或泛酸產(chǎn)量的提高。
酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化從α-酮異戊酸(“α-KIV”)和MTF產(chǎn)生酮泛解酸(參見,如圖1)。具體地,該酶催化羥甲基基團由MTF轉(zhuǎn)移到α-KIV上生成酮泛解酸。α-KIV和MTF均為該反應的底物,因此可增加它們的合成以提高酮泛解酸的產(chǎn)量。圖2中描述了大腸桿菌(以及枯草芽孢桿菌)中用于MTF生物合成的途徑。MTF由四氫葉酸和絲氨酸合成,該反應由glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化。為提高MTF的合成,細胞需增加兩種底物和glyA基因產(chǎn)物的數(shù)量。
在一個實施方案中,本發(fā)明涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括在可使泛酸產(chǎn)量增加的條件下培養(yǎng)微生物,所述微生物具有(i)去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑(例如,具有一個、兩個、三個或四個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶)以及(ii)去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑(例如,具有至少一個或兩個去調(diào)節(jié)的MTF生物合成酶)。泛酸生物合成酶的示例包括酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、酮泛解酸還原酶、泛酸合成酶和門冬氨酸-α-脫羧酶。MTF生物合成酶的示例包括serA基因產(chǎn)物和glyA基因產(chǎn)物。
在另一實施方案,本發(fā)明涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括在可使泛酸產(chǎn)量提高的條件下培養(yǎng)微生物,所述微生物具有(i)去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑(例如,具有一個、兩個、三個或四個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶),(ii)去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑(例如,具有一個、兩個或三個去調(diào)節(jié)的ilv生物合成酶)和(iii)去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑(例如,具有至少一個或兩個去調(diào)節(jié)的MTF生物合成酶)。ilv生物合成酶的示例包括乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸異構還原酶和二羥酸脫水酶。
在另一實施方案中,本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的ilv生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑的微生物,從而致使在微生物培養(yǎng)36小時后泛酸的產(chǎn)量為至少50g/L,優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)36小時后泛酸的產(chǎn)量為至少60g/L,且更優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)36小時后泛酸的產(chǎn)量為至少70g/L,最優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)36小時之后產(chǎn)生至少80g/L的泛酸、至少90g/L的泛酸、至少100g/L的泛酸、至少110g/L的泛酸或者至少120g/L的泛酸(或者更多)。
在另一實施方案中,本發(fā)明公開了用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的ilv生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑的微生物,所述去調(diào)節(jié)致使在微生物培養(yǎng)48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為70g/L,優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為80g/L,且更優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為90g/L。
在一個例示性的實施方案中,MTF生物合成途徑的去調(diào)節(jié)是通過使類泛酸化合物生產(chǎn)菌株中serA基因產(chǎn)物去調(diào)節(jié)實現(xiàn)的,例如通過組成型表達serA基因,或者通過引入serA的抗反饋等位基因而實現(xiàn)。在另一個例示性的實施方案中,MTF生物合成途徑的去調(diào)節(jié)是通過使類泛酸化合物生產(chǎn)菌株中glyA基因產(chǎn)物去調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的,例如過表達glyA基因或通過突變或破壞purR基因產(chǎn)物來調(diào)節(jié)對glyA基因的阻遏作用。在其它例示性的實施方案中,MTF的生物合成通過增加培養(yǎng)基中的絲氨酸或者使甘氨酸裂解酶去調(diào)節(jié)來調(diào)控。
本發(fā)明進一步涉及如以上所描述的方法,其中通過調(diào)節(jié)泛酸激酶的活性(例如,降低泛酸激酶的活性)進一步提高泛酸的產(chǎn)量。在一個實施方案中,將CoaA缺失且將CoaX下調(diào)。在另一實施方案中,將CoaX缺失且將CoaA下調(diào)。而在另一實施方案中,將CoaX和CoaA均下調(diào)。本發(fā)明還涉及如以上所描述的方法,其中微生物在絲氨酸過量的條件下培養(yǎng)。本發(fā)明進一步涉及如以上所描述的方法,其中微生物的泛酸生物合成途徑被去調(diào)節(jié)致使泛酸的生產(chǎn)不依賴于飼喂β-丙氨酸。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明方法合成的產(chǎn)物,以及包括根據(jù)該方法生產(chǎn)的泛酸的組合物。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明方法中的重組微生物。在一個實施方案中,本發(fā)明涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的重組微生物,所述重組微生物具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑。在另一實施方案中,本發(fā)明涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的重組微生物,該重組微生物具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的ilv途徑。微生物可進一步具有降低的泛酸激酶活性。優(yōu)選的微生物屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),例如枯草芽孢桿菌。
如以上所描述,本發(fā)明的某些方面涉及用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法,所述方法包括培養(yǎng)具有至少去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑的微生物。術語“泛酸生物合成途徑”包括涉及泛酸形成或合成中利用的泛酸生物合成酶(如編碼生物合成酶的基因所編碼的多肽)、化合物(如底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等等的生物合成途徑。術語“泛酸生物合成途徑”包括在微生物中(如,在體內(nèi))引起泛酸合成的生物合成途徑和在體外引起泛酸合成的生物合成途徑。
如這里使用的,“具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)(如,過表達)(兩個術語如這里定義)的泛酸生物合成酶以致使泛酸產(chǎn)量增加(如,與所述微生物在所述生物合成酶去調(diào)節(jié)之前的泛酸產(chǎn)量相比或與野生型微生物相比)的微生物。術語“泛酸(panthothenate)”包括游離酸形式的泛酸,也稱作“泛酸(pantothenicacid)”,以及其任何鹽(如,通過用陽離子,例如鈣、鈉、鉀、銨、鎂替代泛酸的酸性氫得到的鹽),也稱作“泛酸鹽(panthothenate salt)”。術語“泛酸”也包括泛酸的醇衍生物。優(yōu)選的泛酸鹽是泛酸鈣或泛酸鈉。優(yōu)選的醇衍生物是羥泛酸。本發(fā)明的泛酸鹽和/或醇包括可以從這里描述的游離酸通過常規(guī)方法制備的鹽和/或醇。在另一個實施方案中,泛酸鹽由本發(fā)明的微生物直接合成。本發(fā)明的泛酸鹽也可以用常規(guī)方法轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酸形式的泛酸。術語“泛酸”在本文中也縮寫為“pan”。
優(yōu)選,“具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)(如,過表達)的泛酸生物合成酶以致使泛酸產(chǎn)量可以達1g/L或更高的微生物。更優(yōu)選,“具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)(如,過表達)的泛酸生物合成酶以致使泛酸產(chǎn)量可以達2g/L或更高的微生物。更為優(yōu)選地,“具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)的(如,過表達)泛酸生物合成酶以致使泛酸產(chǎn)量可以達10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L或更高的微生物。
術語“泛酸生物合成酶”包括在泛酸生物合成途徑的化合物(如,中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。例如,泛解酸從α-酮異戊酸(α-KIV)通過中間體酮泛解酸合成。酮泛解酸的形成由泛酸生物合成酶PanB或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(panB基因產(chǎn)物)催化。泛解酸的形成由泛酸生物合成酶PanE1或酮泛解酸還原酶(panE1基因產(chǎn)物)催化。從門冬氨酸合成β-丙氨酸由泛酸生物合成酶PanD或門冬氨酸-α-脫羧酶(panD基因產(chǎn)物)催化。從泛解酸和β-丙氨酸(如,縮合)形成泛酸由泛酸生物合成酶PanC或泛酸合成酶(panC基因產(chǎn)物)催化。泛酸生物合成酶也可以執(zhí)行旁路功能作為這里所述的HMBPA生物合成途徑中的酶。
因此,在一個實施方案中,本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有至少一個去調(diào)節(jié)(如,去調(diào)節(jié)以致使泛酸產(chǎn)量增加)的泛酸生物合成酶的微生物,所述酶選自例如PanB(或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或門冬氨酸-α-脫羧酶)、PanE1(或酮泛解酸還原酶)。在另一個實施方案中,本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有至少兩個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶的微生物,所述酶選自例如PanB(或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或門冬氨酸-α-脫羧酶)和PanE1(或酮泛解酸還原酶)。在另一個實施方案中,本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有至少三個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶的微生物,所述酶選自例如PanB(或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或門冬氨酸-α-脫羧酶)和PanE1(或酮泛解酸還原酶)。在另一個實施方案中,本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有至少四個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶的微生物,例如,具有去調(diào)節(jié)的PanB(或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或門冬氨酸-α-脫羧酶)和PanE1(或酮泛解酸還原酶)的微生物。
在另一個方面,本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑的微生物。術語“異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑”包括涉及在丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸或異亮氨酸的形成或合成過程中利用的異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶(如編碼生物合成酶的基因所編碼的多肽)、化合物(如底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等等的生物合成途徑。術語“異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑”包括在微生物中(如,在體內(nèi))引起纈氨酸或異亮氨酸合成的生物合成途徑和在體外引起纈氨酸或異亮氨酸合成的生物合成途徑。
如這里使用的,“具有去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)(如,過表達)(兩個術語如這里定義)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶致使異亮氨酸和/或纈氨酸和/或纈氨酸前體(α-酮異戊酸(α-KIV))產(chǎn)量增加(如,與所述微生物在所述生物合成酶去調(diào)節(jié)之前的異亮氨酸和/或纈氨酸和/或α-KIV產(chǎn)量相比,或與野生型微生物相比)的微生物。圖1包括異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑的圖解表示。異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶以粗斜體描述,其相應基因用斜體字表示。術語“異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶”包括在異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑的化合物(如,中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。根據(jù)圖1,從丙酮酸通過中間體(乙酰乳酸、α,β-二羥基異戊酸(α,β-DHIV)和α-酮異戊酸(α-KIV))合成纈氨酸。從丙酮酸形成乙酰乳酸由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶乙酰羥酸合成酶(ilvBN基因產(chǎn)物,或alsS基因產(chǎn)物)催化。從乙酰乳酸形成α,β-DHIV由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶乙酰羥酸異構還原酶(ilvC基因產(chǎn)物)催化。從α,β-DHIV合成α-KIV由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶二羥酸脫水酶(ilvD基因產(chǎn)物)催化。而且,通過支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶,纈氨酸和異亮氨酸可與它們各自的α-酮化合物進行相互轉(zhuǎn)化。異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶也可以執(zhí)行旁路功能作為這里所述的HMBPA生物合成途徑中的酶。
因此,在一個實施方案中,本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有至少一個去調(diào)節(jié)(如,去調(diào)節(jié)以致使纈氨酸和/或異亮氨酸和/或α-KIV產(chǎn)量增加)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶的微生物,所述酶選自例如IlvBN、AlsS(或乙酰羥酸合成酶)、IlvC(或乙酰羥酸異構還原酶)和IlvD(或二羥酸脫水酶)。在另一個實施方案中,本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有至少兩個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶的微生物,所述酶選自例如IlvBN、AlsS(或乙酰羥酸合成酶)、IlvC(或乙酰羥酸異構還原酶)和IlvD(或二羥酸脫水酶)。在另一個實施方案中,本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有至少三個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶的微生物,例如,所述微生物具有去調(diào)節(jié)的IlvBN或AlsS(或乙酰羥酸合成酶)、IlvC(或乙酰羥酸異構還原酶)和IlvD(或二羥酸脫水酶)。
如本文所提到的,已發(fā)現(xiàn)泛酸生物合成途徑和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑的酶在[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的合成或[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途徑中具有旁路活性。術語“[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途徑”包括涉及傳統(tǒng)上與泛酸生物合成途徑和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑相關的、HMBPA形成或合成中所用的生物合成酶和化合物(如底物等)的旁路生物合成途徑。術語“HMBPA生物合成途徑”包括導致微生物(如體內(nèi))合成HMBPA的生物合成途徑以及導致體外合成HMBPA的生物合成途徑。
術語“HMBPA生物合成酶”包括在HMBPA生物合成途徑的化合物(如,中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。例如,從α-酮異戊酸(α-KIV)合成2-羥基異戊酸(α-HIV)由panE1或panE2基因產(chǎn)物(PanE1這里可替換稱作酮泛解酸還原酶)和/或由ilvC基因產(chǎn)物(這里可替換稱作乙酰羥酸異構還原酶)催化。從β-丙氨酸和α-HIV形成HMBPA由panC基因產(chǎn)物(這里可替換稱作泛酸合成酶)催化。
術語“[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionic acid)(“HMBPA”)”包括游離酸形式的HMBPA,也稱作“[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionate)”,及其任何鹽(如,通過用陽離子,例如,鈣、鈉、鉀、銨、鎂替代3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸的酸性氫得到的鹽),也稱作“3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸鹽(propionic acid salt)”或“HMBPA鹽”。優(yōu)選的HMBPA鹽是HMBPA鈣或HMBPA鈉。本發(fā)明的HMBPA鹽包括可以通過常規(guī)方法從這里所述的游離酸制備的鹽。本發(fā)明的HMBPA鹽也可以通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酸形式的3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸。
在優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明公開了用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法,包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物。術語“亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑”指涉及到在PanB底物(MTF)的形成或合成中應用的MTF生物合成酶(如由編碼生物合成酶的基因編碼的多肽)、化合物(如底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等的生物合成途徑。術語“亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑”指導致體內(nèi)合成MTF的生物合成途徑(如大腸桿菌中的途徑,如在圖2中所示),以及導致體外合成MTF的生物合成途徑。術語“亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶”包括在亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的化合物(如中間體或產(chǎn)物)的形成中所應用的任何酶。
本發(fā)明至少部分基于這樣的發(fā)現(xiàn),即,使某些MTF生物合成酶去調(diào)節(jié)可以導致MTF產(chǎn)量的增加。去調(diào)節(jié)后可以導致MTF產(chǎn)量增加的MTF生物合成酶被稱作為“MTF生物合成增強酶”?!癕TF生物合成增強酶”的示例為serA基因產(chǎn)物(3-磷酸甘油酸脫氫酶)和glyA基因產(chǎn)物(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)?!熬哂腥フ{(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑”的微生物為這樣的微生物,其具有至少一個去調(diào)節(jié)的(如過表達)MTF生物合成增強酶從而使得MTF的生產(chǎn)或生物合成提高(例如,與所述微生物在所述生物合成酶去調(diào)節(jié)之前的MTF產(chǎn)量相比或與野生型微生物中的MTF產(chǎn)量相比)。
在一個實施方案中,本發(fā)明涉及用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法,包括培養(yǎng)如此處所定義的具有去調(diào)節(jié)的“亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑”的微生物。在另一實施方案中,本發(fā)明涉及用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法,包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的MTF生物合成增強酶的微生物。在優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明涉及用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法,所述方法包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的glyA基因產(chǎn)物(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)和/或去調(diào)節(jié)的serA基因產(chǎn)物(3-磷酸甘油酸脫氫酶)的微生物。
而本發(fā)明的另一方面涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括在挑選的利于泛酸產(chǎn)生的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物,例如,通過在培養(yǎng)基中使用過量絲氨酸(glyA底物)培養(yǎng)微生物。術語“過量絲氨酸”包括使絲氨酸水平增加或高于那些常規(guī)用于培養(yǎng)所涉及的微生物的水平。例如,本實施例中描述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在存在約0-2.5g/L絲氨酸的條件下進行。相應地,過量絲氨酸水平可包括大于2.5g/L的絲氨酸水平,例如,大約2.5至10g/L。過量絲氨酸水平可包括大于5g/L的絲氨酸水平,例如,大約5至10g/L。
而本發(fā)明的另一方面涉及在使泛酸產(chǎn)量進一步增加的條件下對此處描述的微生物進行培養(yǎng),例如,增加如此處所定義的泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑前體和/或中間體(例如在過量的β-丙氨酸、纈氨酸和/或α-KIV存在下培養(yǎng)微生物),或備選地,進一步修飾該微生物使其在缺乏β-丙氨酸飼喂的條件下能產(chǎn)生顯著水平的β-丙氨酸(即,β-丙氨酸非依賴性微生物,如在美國專利申請系列No.09/09/667,569中所描述的)。
而本發(fā)明的另一方面涉及進一步對泛酸生產(chǎn)菌株中的泛酸激酶活性進行調(diào)節(jié)以使泛酸產(chǎn)量提高。泛酸激酶為催化從泛酸生成輔酶A(CoA)的關鍵酶(參見如美國專利申請系列No.09/09/667,569)。調(diào)節(jié)泛酸激酶(如降低泛酸激酶的活性或水平)可以減少CoA的產(chǎn)生,從而利于泛酸的積聚。在一個實施方案中,泛酸激酶活性通過缺失CoaA和下調(diào)CoaX活性而降低(在某些微生物中CoaA和CoaX均可催化CoA生物合成的第一個步驟)。在另一實施方案中,泛酸激酶活性通過缺失CoaX和下調(diào)CoaA而降低。而在另外的實施方案中,泛酸激酶活性通過下調(diào)CoaA和CoaX的活性而降低。
本發(fā)明的各方面將在以下分部分中作進一步詳細描述。
I.靶向編碼各種泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)和/或亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶的基因在一個實施方案中,本發(fā)明涉及修飾或增加泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)和/或亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的各種生物合成酶的水平。特別是,本發(fā)明詳述了通過修飾或改變編碼所述生物合成酶的基因而修飾與所述途徑有關的各種酶的活性。
這里使用的術語“基因”包括在生物體中可以通過基因間DNA(即在生物的染色體DNA中天然位于基因側翼和/或分開基因的間插或間隔DNA)與另一個基因或其它基因分開的核酸分子(如,DNA分子或其片段)?;蛘?,一個基因可以些微重疊另一個基因(如,第一個基因的3’端與第二個基因的5’端重疊),這些重疊基因通過基因間DNA與其它基因分開?;蚩梢灾笇富蚱渌鞍追肿雍铣?如,可以包含編碼序列,例如,編碼蛋白的連續(xù)開放閱讀框架(ORF))或本身可以在生物體中起作用。生物體中的基因可以簇集在操縱子(見本文中的定義)中,所述操縱子通過基因間DNA與其它基因和/或操縱子分開。這里使用的“分離的基因”包括基本不含有在該基因所來源的生物體的染色體DNA中天然位于該基因側翼的序列(即,不含編碼第二個或不同蛋白的相鄰編碼序列或相鄰結構序列等)的基因,但該基因可以任選包括5’和3’調(diào)節(jié)序列,例如啟動子序列和/或終止序列。在一個實施方案中,分離的基因主要包括蛋白質(zhì)的編碼序列(如,編碼芽孢桿菌蛋白的序列)。在另一個實施方案中,分離的基因包括編碼蛋白的序列(如,編碼芽孢桿菌蛋白的序列)和來自該基因的來源生物體的染色體DNA的相鄰5’和/或3’調(diào)節(jié)序列(如,相鄰5’和/或3’芽孢桿菌調(diào)節(jié)序列)。優(yōu)選,分離的基因含有少于大約10kb,5kb,2kb,1kb,0.5kb,0.2kb,0.1kb,50bp,25bp或10bp的在該基因的來源生物體的染色體DNA中天然位于該基因側翼的核苷酸序列。
術語“操縱子”包括至少兩個相鄰基因或ORF,它們?nèi)芜x在至少一個基因或ORF的5’或3’端在序列上重疊。術語“操縱子”包括含有與一個或多個相鄰基因或ORF(如,編碼酶,例如,生物合成酶的結構基因)相連的啟動子和可能的調(diào)節(jié)元件的基因表達協(xié)同單位。例如,可以通過與調(diào)節(jié)元件結合的調(diào)控蛋白或通過抗轉(zhuǎn)錄終止協(xié)同調(diào)節(jié)這些基因(如結構基因)的表達。操縱子的基因(如結構基因)可轉(zhuǎn)錄為編碼所有蛋白的單一mRNA。
這里使用的“具有突變的基因”或“突變基因”包括具有包含至少一個改變(如置換、插入、缺失)的核苷酸序列的基因,其中所述改變致使由所述突變體編碼的多肽或蛋白顯示出與野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白不同的活性。在一個實施方案中,具有突變的基因或突變基因編碼的多肽或蛋白與野生型基因編碼的多肽或蛋白相比,當在例如相似條件下測定(如,在相同溫度下培養(yǎng)的微生物中測定)時,具有增加的活性。這里使用的“活性增加”或“酶活性增加”是指比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高5%的活性,優(yōu)選至少高5-10%,更優(yōu)選至少高10-25%,甚至更優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高25-50%,50-75%或75-100%,介于上面引用的值中間的范圍,如75-85%,85-90%,90-95%,也旨在包括在本發(fā)明中。這里使用的“活性增加”或“酶活性增加”也可以包括比野生型基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高1.25倍的活性,優(yōu)選至少高1.5倍,更優(yōu)選至少高2倍,甚至更優(yōu)選比野生型基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高3倍,4倍,5倍,10倍,20倍,50倍,100倍。
在另一個實施方案中,例如,當在相似條件下測定時(如,在相同溫度下培養(yǎng)的微生物中測定時),具有突變的基因或突變基因編碼與野生型基因編碼的多肽或蛋白相比活性降低的多肽或蛋白。突變基因也可不編碼多肽或編碼產(chǎn)量水平降低的野生型多肽。這里使用的“活性降低”或“酶活性降低”是指比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少低5%的活性,優(yōu)選至少低5-10%,更優(yōu)選至少低10-25%,甚至更優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少低25-50%,50-75%或75-100%。介于上面引用的值中間的范圍,如75-85%,85-90%,90-95%,也旨在包括在本發(fā)明中。這里使用的“活性降低”或“酶活性降低”也可以包括活性被消除或“剔除”(如,比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性低大約100%的活性)。
可以根據(jù)任何被很好接受用于測定感興趣的特定蛋白的活性的試驗來確定活性??梢灾苯訙y定或檢測活性,例如,測定粗細胞提取物中的蛋白的活性或從細胞或微生物分離或純化的蛋白的活性。可供選擇地,可在細胞或微生物內(nèi)或細胞外介質(zhì)內(nèi)測定或檢測活性。例如,可以通過使突變基因在微生物例如,具有溫度敏感性酶的突變微生物中表達,然后檢測突變基因彌補溫度敏感性(Ts)突變體的酶活性的能力,對突變基因(例如,所述編碼降低的酶活性的突變體)進行檢測。編碼“增加的酶活性”的突變基因可以是能比例如相應野生型基因更有效地彌補Ts突變體的基因。編碼“降低的酶活性”的突變基因是在彌補Ts突變體方面不如例如相應野生型基因有效的基因。
本領域技術人員明了,與相應野生型多肽或蛋白相比,核酸或基因序列中甚至單一置換(如,在相應氨基酸序列中編碼氨基酸改變的堿基置換)也可能急劇地影響所編碼多肽或蛋白的活性。這里定義的突變基因(如,編碼突變多肽或蛋白)可容易地與編碼蛋白同系物(homologue)的核酸或基因區(qū)別,因為突變基因編碼活性改變的蛋白或多肽,并且任選地導致在表達所述突變基因或產(chǎn)生所述突變蛋白或多肽的微生物(即,突變微生物)中可觀察到與表達野生型基因的相應微生物不同或明顯不同的表型。相反地,蛋白同系物可具有等同或基本相似的活性,任選地導致當在微生物中產(chǎn)生時與表達野生型基因的相應微生物相比無可區(qū)別的表型。因此,不是由例如核酸分子、基因、蛋白或多肽間的序列等同程度來區(qū)分同系物和突變體,而是由所編碼的蛋白或多肽的活性來區(qū)分同系物和突變體同系物可以具有例如低序列等同性(如,30-50%序列等同性)然而具有基本等同的功能活性,而突變體可以例如享有99%序列等同性然而具有大大不同或改變的功能活性。
本領域技術人員也將領會到用于本發(fā)明的核酸分子,基因,蛋白或多肽可來自具有MTF生物合成途徑、ilv生物合成途徑或泛酸生物合成途徑的任何微生物。本領域技術人員可以使用已知技術如同源性篩選,序列比較等等鑒定這種核酸分子,基因,蛋白或多肽,并且本領域技術人員可以對這些核酸分子,基因,蛋白或多肽進行修飾以使其能在重組微生物中表達或產(chǎn)生(如,通過使用適當啟動子、核糖體結合位點、表達或整合載體,修飾基因序列使轉(zhuǎn)錄增加(考慮優(yōu)選密碼子使用)等,根據(jù)這里所述的技術和本領域已知的那些技術來實現(xiàn))。
在一個實施方案中,本發(fā)明的基因來自革蘭氏陽性微生物生物體(如,由于生物體外圍繞存在革蘭氏陽性壁而保持堿性染色,例如,結晶紫的微生物)。術語“來自”(如“來自”革蘭氏陽性微生物)是指在此微生物中天然存在的基因(如革蘭氏陽性微生物的天然基因)。在優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的基因來自屬于選自芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Cornyebacterium)(如谷氨酸棒桿菌(Cornyebacterium glutamicum))、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(lactococci)和鏈霉菌屬(Streptomyces)屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的基因來自芽孢桿菌屬的微生物。在另一個優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明基因來自選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、緩病芽孢桿菌(Bacillus lentimorbus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、泛酸芽孢桿菌(Bacilluspantothenticus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、蘇云金芽孢桿菌(Baciilus thuringiensis)、耐芽孢桿菌(Bacillus halodurans)和其它1組芽孢桿菌種(例如,以16S rRNA型表征的種)的微生物。在另一個優(yōu)選實施方案中,基因來自短芽孢桿菌(Bacillus brevis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。在另一個優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的基因來自選自地衣芽孢桿菌,解淀粉芽孢桿菌,枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的微生物。在特別優(yōu)選的實施方案中,基因來自枯草芽孢桿菌(如,是枯草芽孢桿菌來源的)。術語“來自枯草芽孢桿菌”或“枯草芽孢桿菌來源的”包括在枯草芽孢桿菌微生物中天然發(fā)現(xiàn)的基因。在本發(fā)明范圍內(nèi)包括芽孢桿菌來源的基因(如,枯草芽孢桿菌來源的基因),例如,芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌purR基因,serA基因,glyA基因,coaX基因,coaA基因,pan基因和/或ilv基因。
在另一個實施方案中,本發(fā)明的基因來自革蘭氏陰性(排除堿性染色)微生物。在優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的基因來自屬于選自沙門氏菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)),埃希氏菌屬(Escherichia),克雷伯氏菌屬(Klebsiella),沙雷氏菌屬(Serratia)和變形桿菌屬(Proteus)的屬的微生物。在更優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的基因來自埃希氏菌屬的微生物。在甚至更優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的基因來自大腸桿菌(Escherichia coli)。在另一個實施方案中,本發(fā)明的基因來自酵母屬(Saccharomyces)(如,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
II.重組核酸分子和載體本發(fā)明還涉及包括這里所述的基因(如分離的基因)的重組核酸分子(如重組DNA分子),所述基因優(yōu)選芽孢桿菌基因,更優(yōu)選枯草芽孢桿菌基因,甚至更優(yōu)選枯草芽孢桿菌泛酸生物合成基因和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成基因和/或亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成基因。術語“重組核酸分子”包括經(jīng)改變,修飾或工程化(如一個或多個核苷酸插入、缺失或置換)在核苷酸序列方面不同于其所來源的天然或自然核酸分子的核酸分子(如,DNA分子)。優(yōu)選,重組核酸分子(如,重組DNA分子)包括可操作連接調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明的分離基因。短語“可操作連接調(diào)節(jié)序列”意思是感興趣的基因的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許基因進行表達(如,增強的,增加的,組成的,基礎的,衰減的,減少的或阻礙的表達)的方式,優(yōu)選以允許該基因編碼的基因產(chǎn)物表達(如,當將重組核酸分子包括在如這里定義的重組載體中并導入微生物中時)的方式連接。
術語“調(diào)節(jié)序列”包括影響(如,調(diào)制或調(diào)節(jié))其它核酸序列(即基因)表達的核酸序列。在一個實施方案中,調(diào)節(jié)序列被包括在重組核酸分子中,其相對于感興趣的特定基因的位置和方向與兩者在天然情況下顯示的位置和/或方向相似或等同,如為天然位置和/或方向。例如,感興趣基因可包括在重組核酸分子中與如下調(diào)節(jié)序列可操作連接,所述調(diào)節(jié)序列在天然生物中伴隨或鄰近此感興趣基因(如,可操作連接“天然”調(diào)節(jié)序列(如,連接“天然”啟動子))??晒┻x擇地,感興趣基因可包括在重組核酸分子中與如下調(diào)節(jié)序列可操作連接,該調(diào)節(jié)序列在天然生物中伴隨或鄰近其它(如,不同的)基因??晒┻x擇地,感興趣基因可包括在重組核酸分子中與來自另一生物的調(diào)節(jié)序列可操作連接。例如,可以使來自其它微生物的調(diào)節(jié)序列(如,其它細菌調(diào)節(jié)序列,噬菌體調(diào)節(jié)序列等等)與特定感興趣基因可操作連接。
在一個實施方案中,調(diào)節(jié)序列是非自然或非天然存在的序列(如,已經(jīng)被修飾,突變,置換,衍化,缺失的序列,包括化學合成的序列)。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強子、終止信號、抗終止信號和其它表達控制元件(如,阻遏物或誘導物結合的序列和/或,例如,在轉(zhuǎn)錄的mRNA中,轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)蛋白的結合位點)。例如Sambrook,J.,F(xiàn)ritsh,E.F.和Maniatis,T.Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版.,冷泉港實驗室,冷泉港實驗室出版社,冷泉港,紐約,1989中描述了這種調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括指導核苷酸序列在微生物中組成型表達的那些序列(如,組成型啟動子和強組成型啟動子),指導核苷酸序列在微生物中可誘導表達的那些序列(如,誘導型啟動子,例如,木糖誘導型啟動子)和衰減或阻遏核苷酸序列在微生物中的表達的那些序列(如,衰減信號或阻遏物結合序列如,PurR結合位點)。通過去除或缺失調(diào)節(jié)序列來調(diào)節(jié)感興趣基因的表達也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如,可去除參與轉(zhuǎn)錄負調(diào)節(jié)的序列以使感興趣基因表達增強。
在一個實施方案中,本發(fā)明的重組核酸分子包括可操作地連接啟動子或啟動子序列的編碼至少一個細菌基因產(chǎn)物(如,泛酸生物合成酶,異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶和/或亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶)的核酸序列或基因。本發(fā)明優(yōu)選的啟動子包括芽孢桿菌啟動子和/或噬菌體啟動子(如,感染芽孢桿菌的噬菌體)。在一個實施方案中,啟動子是芽孢桿菌啟動子,優(yōu)選強芽孢桿菌啟動子(如,芽孢桿菌中與生物化學管家基因關聯(lián)的啟動子或芽孢桿菌中與糖酵解途徑基因關聯(lián)的啟動子)。在另一個實施方案中,啟動子是噬菌體啟動子。在優(yōu)選實施方案中,啟動子來自噬菌體SP01。在尤其優(yōu)選實施方案中,啟動子選自P15,P26或Pveg,具有例如下列各序列GCTATTGACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCAAAACTGTGCTCAGTACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGATCCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT(SEQ ID NO1),GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGATGTTTTGTTCTACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGCAGGACGC(SEQ ID NO2),和GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTGAGGTGGATGCAATG (SEQ IDNO3)。其它優(yōu)選的啟動子包括tef(翻譯延伸因子(TEF)啟動子)和pyc(丙酮酸羧化酶(PYC)啟動子),它們可以在芽孢桿菌(如枯草芽孢桿菌)中啟動高水平表達。其它優(yōu)選的啟動子,例如,當用于革蘭氏陽性微生物時,包括但不限于amy和SPO2啟動子。其它優(yōu)選的啟動子,例如,當用于革蘭氏陰性微生物時,包括但不限于cos,tac,trp,tet,trp-tet,lpp,lac,lpp-lac,lacIQ,T7,T5,T3,gal,trc,ara,SP6,λ-PR或λ-PL。
在另一個實施方案中,本發(fā)明的重組核酸分子包括一個或多個終止序列(如,轉(zhuǎn)錄終止序列)。術語“終止序列”包括起終止mRNA轉(zhuǎn)錄作用的調(diào)節(jié)序列。終止序列(或串聯(lián)轉(zhuǎn)錄終止子)可進一步起穩(wěn)定mRNA(如,通過給mRNA添加結構)的作用,以例如,抗核酸酶。
在再一個實施方案中,本發(fā)明的重組核酸分子包括這樣的序列,該序列使得含有它的載體能得以檢測,即,可檢測和/或可選擇標記,例如,編碼抗生素抗性序列或能克服營養(yǎng)缺陷突變的基因,例如,trpC,藥物標記,熒光標記,和/或比色標記(如,lacZ/β-半乳糖苷酶)。在再一個實施方案中,本發(fā)明的重組核酸分子包括人工核糖體結合位點(RBS)或可轉(zhuǎn)錄為人工RBS的序列。術語“人工核糖體結合位點(RBS)”包括mRNA分子內(nèi)(如,DNA內(nèi)編碼的)與核糖體結合(如,以啟動翻譯)的位點,該位點與天然RBS(如,天然基因中發(fā)現(xiàn)的RBS)至少有一個核苷酸不同。優(yōu)選的人工RBS包括大約5-6,7-8,9-10,11-12,13-14,15-16,17-18,19-20,21-22,23-24,25-26,27-28,29-30或更多個核苷酸,其中大約1-2,3-4,5-6,7-8,9-10,11-12,13-15或更多個核苷酸與天然RBS(如,感興趣基因的天然RBS,例如,天然panB RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO4)或天然panD RBS ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG(SEQ ID NO5))不同。
優(yōu)選,對差異核苷酸進行置換使它們等同于最佳比對進行比較時理想RBS中的一個或多個核苷酸。理想RBS包括,但不限于,AGAAAGGAGGTGA(SEQ ID NO6),TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG(SEQ ID NO7),TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG(SEQID NO8),AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG(SEQ ID NO9),和AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG(SEQ ID NO10)。人工RBS可用于替代與特定基因關聯(lián)的天然存在的或天然的RBS。優(yōu)選人工RBS增強特定基因的翻譯。優(yōu)選的人工RBS(如,增加panB,例如,芽孢桿菌panB翻譯的RBS)包括CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG(SEQ IDNO11)和CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO12)。優(yōu)選的人工RBS(如,增加panD,例如,芽孢桿菌panD翻譯的RBS)包括TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG(SEQ ID NO13),TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG(SEQ ID NO14),TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG(SEQ ID NO15),TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG(SEQ ID NO16),ATTCGAGAAAGGAGG TGAATATAATATG(SEQ ID NO17),ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG(SEQ ID NO18)和ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG(SEQ ID NO19)。
本發(fā)明進一步公開了包括這里所述的核酸分子(如,基因或包含所述基因的重組核酸分子)的載體(如重組載體)。術語“重組載體”包括已經(jīng)被改變,修飾或工程化從而含有與此重組載體所來源的天然或自然核酸分子中所包含的序列相比較多,較少或不同的核酸序列的載體(如,質(zhì)粒、噬菌體、噬粒、病毒、粘?;蚱渌兓暮怂彷d體)。優(yōu)選,重組載體包括可操作地連接如這里定義的調(diào)節(jié)序列(例如,啟動子序列,終止序列和/或人工核糖體結合位點(RBS))的編碼生物合成酶的基因或包含所述基因的重組核酸分子。在另一個實施方案中,本發(fā)明的重組載體包括可以增強在細菌中的復制的序列(如,增強復制的序列)。在一個實施方案中,增強復制的序列在大腸桿菌中起作用。在另一個實施方案中,增強復制的序列來自pBR322。
在另一個實施方案中,本發(fā)明的重組載體包括抗生素抗性序列。術語“抗生素抗性序列”包括促進或使宿主生物(如,芽孢桿菌)抵抗抗生素的序列。在一個實施方案中,抗生素抗性序列選自cat(氯霉素抗性)序列,tet(四環(huán)素抗性)序列,erm(紅霉素抗性)序列,neo(新霉素抗性)序列,kan(卡那霉素抗性)序列和spec(壯觀霉素抗性)序列。本發(fā)明的重組載體可進一步包括同源重組序列(如,設計以允許感興趣基因重組到宿主生物的染色體中的序列)。例如,bpr,vpr,或amyE序列可用作同源靶標以實現(xiàn)向宿主染色體中的重組。本領域技術人員也將領會到載體的設計可根據(jù)如選擇的待被遺傳改造的微生物,期望的基因產(chǎn)物表達水平等等因素來進行適應性調(diào)整。
III.重組微生物本發(fā)明進一步涉及包括如這里所述的載體或基因(如,野生型和/或突變基因)的微生物,即重組微生物。這里使用的術語“重組微生物”包括已經(jīng)被遺傳改變、修飾或改造(如遺傳工程化)以致與它所來源的天然微生物相比顯示出改變、修飾或不同的基因型和/或表型(如,當遺傳學修飾影響該微生物的編碼核酸序列時)的微生物(如,細菌、酵母細胞、真菌細胞等)。
在一個實施方案中,本發(fā)明的重組微生物是革蘭氏陽性生物(如,由于存在革蘭氏陽性壁圍繞生物體而保持堿性染色,例如,結晶紫的微生物)。在優(yōu)選實施方案中,重組微生物是屬于選自芽孢桿菌屬、棒桿菌屬(例如,谷氨酸棒桿菌(Cornyebacterium glutamicum)、乳桿菌屬、乳球菌屬和鏈霉菌屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實施方案中,重組微生物是芽孢桿菌屬的微生物。在另一個優(yōu)選實施方案中,重組微生物選自枯草芽孢桿菌,緩病芽孢桿菌,遲緩芽孢桿菌,堅強芽孢桿菌,泛酸芽孢桿菌,解淀粉芽孢桿菌,蠟狀芽孢桿菌,環(huán)狀芽孢桿菌,凝結芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌,巨大芽孢桿菌,短小芽孢桿菌,蘇云金芽孢桿菌,耐芽孢桿菌和其它1組芽孢桿菌種(例如,以16S rRNA型表征的種)。在另一個優(yōu)選實施方案中,重組微生物來自短芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。在另一個優(yōu)選實施方案中,重組微生物選自地衣芽孢桿菌,解淀粉芽孢桿菌,枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。
在另一個實施方案中,重組微生物是革蘭氏陰性(不接受堿性染色)生物。在優(yōu)選實施方案中,重組微生物是選自沙門氏菌屬(例如,鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)),埃希氏菌屬,克雷伯氏菌屬,沙雷氏菌屬和變形桿菌屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實施方案中,重組微生物是埃希氏菌屬的微生物。在甚至更優(yōu)選的實施方案中,重組微生物是大腸桿菌。在另一個實施方案中,重組微生物是酵母屬微生物(如,釀酒酵母)。
本發(fā)明優(yōu)選的“重組”微生物是具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑或酶、去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑或酶和/或修飾的或去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑或酶的微生物。術語“去調(diào)節(jié)的”或“去調(diào)節(jié)”包括改變或修飾微生物的至少一個編碼生物合成途徑中的酶的基因,使微生物中的該生物合成酶的水平或活性改變或變動。優(yōu)選,改變或修飾至少一個編碼生物合成途徑中的酶的基因使基因產(chǎn)物增多或增加。短語“去調(diào)節(jié)的途徑”包括這樣的生物合成途徑,在該途徑中一個以上編碼生物合成途徑中的酶的基因被改變或修飾,以致一個以上的生物合成酶的水平或活性發(fā)生改變或變動。使微生物的生物學途徑“去調(diào)節(jié)”的能力(如同時去調(diào)節(jié)給定生物合成途徑中的一個以上基因)在有些情況下源自微生物的一種特殊現(xiàn)象,即微生物中一個以上的酶(如,兩個或三個生物合成酶)可以由術語稱作“操縱子”(見這里的定義)的連續(xù)基因物質(zhì)上彼此鄰近存在的基因編碼。由于包括在操縱子中的基因被協(xié)同調(diào)節(jié),單一啟動子和/或調(diào)節(jié)元件的改變或修飾即可導致該操縱子編碼的每個基因產(chǎn)物的表達都發(fā)生改變或變動。調(diào)節(jié)元件的改變或修飾可包括,但不限于,去除內(nèi)源性啟動子和/或調(diào)節(jié)元件,添加強啟動子、誘導型啟動子或多個啟動子或去除調(diào)節(jié)序列使基因產(chǎn)物表達被改變,改變基因或操縱子在染色體中的位置,改變與基因或操縱子相鄰的或位于操縱子內(nèi)的核酸序列如核糖體結合位點,增加基因或操縱子的拷貝數(shù)量,修飾參與基因或操縱子轉(zhuǎn)錄和/或基因或操縱子的(一個或多個)基因產(chǎn)物翻譯的蛋白(如,調(diào)節(jié)蛋白、抑制因子、增強子、轉(zhuǎn)錄激活物等等),或本領域中使基因表達去調(diào)節(jié)的任何其它常規(guī)方法(包括但不限于反義核酸分子的使用,例如,以阻斷阻抑蛋白的表達)。去調(diào)節(jié)也可涉及改變一個或多個基因的編碼區(qū),以得到例如可抵抗反饋作用或具有更高或更低的比活性的酶。
在另一個優(yōu)選實施方案中,設計或改造重組微生物使至少一個泛酸生物合成酶、至少一個異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶和/或至少一個MTF生物合成酶過表達。術語“過表達的”或“過表達”包括基因產(chǎn)物(如生物合成酶)的表達水平比該微生物操作前的表達水平高或比未接受操作的可比較微生物中的表達水平高。在一個實施方案中,微生物可被遺傳設計或改造以過表達基因產(chǎn)物,從而使基因產(chǎn)物水平比沒有被改造的可比較微生物中的表達水平高。
遺傳學改造(工程化)可包括,但不限于,改變或修飾與特定基因表達關聯(lián)的調(diào)節(jié)序列或位點(如,添加強啟動子、誘導型啟動子或多個啟動子或去除調(diào)節(jié)序列使表達成為組成型的),改變特定基因的染色體位置,改變與特定基因鄰近的核酸序列如核糖體結合位點,增加特定基因的拷貝數(shù)量,修飾參與特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的蛋白(如,調(diào)節(jié)蛋白、抑制因子、增強子、轉(zhuǎn)錄激活物等等),或本領域中使特定基因表達去調(diào)節(jié)的其它任何常規(guī)方法(包括但不限于反義核酸分子的使用,例如,以阻斷阻抑蛋白的表達)。遺傳學改造也可包括缺失基因,例如,以阻斷生物學途徑或去除阻遏物。
在另一個實施方案中,可從物理上或環(huán)境上操作微生物以過表達基因產(chǎn)物,使基因產(chǎn)物水平高于微生物操作前的表達水平或高于沒有被操作的可比較微生物中的表達水平。例如,可以在存在已知或猜測可以增加特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的試劑時培養(yǎng)微生物或用這些試劑處理微生物,使轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強或增加??晒┻x擇地,可以在能增加特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的選擇溫度下培養(yǎng)微生物,使轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強或增加。
IV.重組微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵術語“培養(yǎng)”包括使本發(fā)明的活微生物維持和/或生長(如,使培養(yǎng)物或菌株維持和/或生長)。在一個實施方案中,在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在另一個實施方案中,在固體或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在優(yōu)選實施方案中,在包含對微生物的維持和/或生長而言必需或有益的營養(yǎng)物質(zhì)(如,碳源或碳底物,例如碳水化合物,碳氫化合物,油,脂,脂肪酸,有機酸和醇;氮源,例如,胨,酵母提取物,肉膏,麥芽汁,大豆粉,大豆面粉,大豆粗磨粉,尿素,硫酸銨,氯化銨,硝酸銨和磷酸銨;磷源,例如,磷酸,其鈉和鉀鹽;微量元素,例如,鎂,鐵,錳,鈣,銅,鋅,硼,鉬,和/或鈷鹽;以及生長因子如氨基酸,維生素,生長促進劑等等)的培養(yǎng)基(如,無菌的液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。
優(yōu)選,在受控pH下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術語“受控pH”包括可以引起期望產(chǎn)物(如,泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生的任何pH。在一個實施方案中,在大約pH7培養(yǎng)微生物。在另一個實施方案中,在6.0和8.5之間的pH培養(yǎng)微生物。期望的pH可以通過本領域技術人員所知的任何方法維持。
也優(yōu)選,在受控通氣下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術語“受控通氣”包括足以導致期望產(chǎn)物(如,泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生的通氣(如,氧氣)。在一個實施方案中,通氣由調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中的氧水平來控制,例如,由調(diào)節(jié)溶解在培養(yǎng)基中的氧量來控制。優(yōu)選,通過攪拌培養(yǎng)物來控制培養(yǎng)物的通氣。攪拌可以用螺旋槳或類似機械攪拌裝置,用旋轉(zhuǎn)或搖動培養(yǎng)容器(如,管或燒瓶)或用各種泵裝置來提供。還可以將無菌空氣或氧氣通入培養(yǎng)基(如,通入發(fā)酵混合物)控制通氣。也優(yōu)選,在沒有過量泡沫(如,通過添加消泡劑)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。
此外,可在受控溫度下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術語“受控溫度”包括可以引起期望產(chǎn)物(如,泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生的任何溫度。在一個實施方案中,受控溫度包括15℃和95℃之間的溫度。在另一個實施方案中,受控溫度包括15℃和70℃之間的溫度。優(yōu)選溫度是20℃至55℃,更優(yōu)選30℃至50℃。
可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(如維持和/或生長)微生物,優(yōu)選利用常規(guī)培養(yǎng)方法如固定培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、搖動培養(yǎng)(如,旋轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng),搖瓶培養(yǎng)等)、通風旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或發(fā)酵,連續(xù)或間斷地培養(yǎng)。在優(yōu)選實施方案中,在搖瓶中培養(yǎng)微生物。在更優(yōu)選實施方案中,在發(fā)酵罐中(如,發(fā)酵方法)培養(yǎng)微生物。本發(fā)明的發(fā)酵方法包括但不限于分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵過程或方法。短語“分批方法”或“分批發(fā)酵”是指培養(yǎng)基、養(yǎng)料、補充添加劑等等的組成在發(fā)酵開始時設定并且在發(fā)酵過程中不進行改變的系統(tǒng),然而,可以嘗試控制如pH和氧氣濃度等因素以防止過度培養(yǎng)基酸化和/或微生物死亡。短語“補料分批方法”或“補料分批”發(fā)酵是指隨著發(fā)酵的進行添加(如,遞增或連續(xù)添加)一種或多種底物或補充物的分批發(fā)酵。短語“連續(xù)方法”或“連續(xù)發(fā)酵”是指這樣的系統(tǒng),其中將規(guī)定的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)添加到發(fā)酵罐中同時移去等量使用過的培養(yǎng)基或“條件”培養(yǎng)基,優(yōu)選用于回收期望產(chǎn)物(如泛解酸和/或泛酸)。已經(jīng)開發(fā)出多種此類方法,且它們是本領域熟知的。
短語“在使期望化合物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)”包括在適宜或足以產(chǎn)生期望化合物或產(chǎn)生期望產(chǎn)量的特定化合物的條件下(如,溫度,壓力,pH,持續(xù)時間等)對微生物進行維持和/或生長。例如,可以使培養(yǎng)持續(xù)足以產(chǎn)生期望量化合物(如,泛解酸和/或泛酸)的時間。優(yōu)選,培養(yǎng)持續(xù)足以基本達到適當化合物產(chǎn)量的時間(如,足以達到適當?shù)姆航馑岷?或泛酸濃度或適當?shù)姆航馑岷?或泛酸HMBPA比率的時間)。在一個實施方案中,持續(xù)培養(yǎng)大約12至24小時。在另一個實施方案中,持續(xù)培養(yǎng)大約24至36小時,36至48小時,48至72小時,72至96小時,96至120小時,120至144小時,或超過144小時。在再一個實施方案中,在可導致大約36小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約5至10g/L化合物,大約48小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約10至20g/L化合物,或大約72小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約20至30g/L化合物的條件下培養(yǎng)微生物。在再一個實施方案中,在可導致大約36小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約5至20g/L化合物,大約48小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約20至30g/L化合物,大約72小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約30至50或60g/L化合物的條件下培養(yǎng)微生物。而在另一實施方案中,在可導致于約36小時內(nèi)至少產(chǎn)生約40到60g/L化合物,或約48小時內(nèi)至少產(chǎn)生約60到90g/L化合物的條件下培養(yǎng)微生物。本領域內(nèi)的技術人員將會理解,通過此處描述的方法也可獲得高于此處所引范圍的上限的數(shù)值,例如,在特定的發(fā)酵程序中或應用特定的工程化菌株。
優(yōu)選地,本發(fā)明的生產(chǎn)方法導致泛酸的生產(chǎn)水平“與適當?shù)膶φ障啾忍岣摺?。術語“適當?shù)膶φ铡?,如此處所定義,包括本領域技術人員公認的適于確定加強的、增加的或提高的所需產(chǎn)物水平的任何對照。例如,當方法涉及培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑的微生物且該微生物進一步具有去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑(即,經(jīng)過改造使至少一個MTF生物合成酶去調(diào)節(jié),例如,過表達)時,適當?shù)膶φ瞻ㄔ诓僮鱉TF酶或途徑之前的微生物或未進行此操作的微生物的培養(yǎng)物(即僅具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑)。同樣,當方法涉及培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的ilv生物合成途徑的微生物且該微生物進一步具有去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑(即經(jīng)過改造使至少一個MTF生物合成酶去調(diào)節(jié),例如,過表達)時,適當?shù)膶φ瞻ㄔ诓僮鱉TF酶或途徑之前的微生物或未進行此操作的微生物(即僅具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑和ilv生物合成途徑)的培養(yǎng)物。不必在根據(jù)本發(fā)明實踐的每一方法中均進行比較。例如,本領域技術人員可通過例如在相同或類似的條件下進行一系列反應(如試管培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、發(fā)酵),根據(jù)經(jīng)驗確定適當?shù)膶φ?。例如,在明了特定菌株的常?guī)生產(chǎn)水平的條件下,本領域技術人員能夠識別較此水平增強的、增加的或提高的生產(chǎn)水平。換言之,與適當對照的比較包括與預先確定的數(shù)值(如預先確定的對照)的比較。
這樣,在一個實施方案中,當適宜的工程化菌株在36小時內(nèi)產(chǎn)生40g/L的泛酸時(在使泛酸產(chǎn)量提高的操作之前),50、60、70g/L或更多的泛酸產(chǎn)量(操作后,例如,在使至少一個MTF生物合成酶過表達的操作之后)則為產(chǎn)量提高的示例。同樣,在一個實施方案中,當適宜的工程化菌株在48小時內(nèi)產(chǎn)生50g/L泛酸(在使泛酸產(chǎn)量提高的操作之前)時,60、70、80、90g/L或更多的泛酸產(chǎn)量(操作后,例如,在使至少一個MTF生物合成酶過表達的操作之后)則為產(chǎn)量提高的示例。
本發(fā)明的方法還可以包括回收期望化合物(如,泛解酸和/或泛酸)的步驟。術語“回收”期望化合物包括從培養(yǎng)基中提取,收獲,分離或純化化合物??筛鶕?jù)本領域已知的任何常規(guī)分離或純化方法回收化合物,這些方法包括但不限于用傳統(tǒng)樹脂處理(如,陰離子或陽離子交換樹脂,非離子吸附樹脂等),用傳統(tǒng)吸附劑處理(如,活性炭,硅酸,硅膠,纖維素,礬土等),改變pH,溶劑提取(如,用常規(guī)溶劑如醇、乙酸乙酯、己烷等等),透析,過濾,濃縮,結晶,重結晶,pH調(diào)節(jié),冷凍干燥等等。例如,從培養(yǎng)基中回收化合物可以通過首先從培養(yǎng)物中移出微生物來進行。然后可以使培養(yǎng)基通過或加載于陽離子交換樹脂上以去除陽離子,然后通過或加至陰離子交換樹脂上以去除無機陰離子和比感興趣化合物具有更強酸性的有機酸。所得化合物可隨后轉(zhuǎn)化成如這里所述的鹽(如,鈣鹽)。
優(yōu)選,“提取”、“分離”或“純化”本發(fā)明的期望化合物使所得制品基本上不含其它培養(yǎng)基成分(如,不含培養(yǎng)基成分和/或發(fā)酵副產(chǎn)物)。短語“基本上不含其它培養(yǎng)基成分”包括其中期望化合物與產(chǎn)生它的培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物已相分離的期望化合物制品。在一個實施方案中,該制品中有多于大約80%的期望化合物(干重)(如,少于大約20%的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物),更優(yōu)選多于大約90%的期望化合物(如,少于大約10%的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物),再更優(yōu)選多于大約95%的期望化合物(如,少于大約5%的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物),和最優(yōu)選多于大約98-99%的期望化合物(如,少于大約1-2%的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)。當期望化合物已經(jīng)衍生為鹽時,優(yōu)選該化合物進一步不含與形成該鹽相關的化學污染物。當期望化合物已經(jīng)衍生為醇時,優(yōu)選該化合物進一步不含與醇形成相關的化學污染物。
在可供選擇的實施方案中,并不從微生物中純化期望化合物,例如,當微生物在生物學上無危險性(如,安全)時。例如,可將全部培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)用作產(chǎn)物(如,粗產(chǎn)物)來源。在一個實施方案中,使用未經(jīng)修飾的培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。在另一個實施方案中,濃縮培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。在另一個實施方案中,干燥或冷凍干燥培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。
而在另一實施方案中,期望化合物被部分純化。術語“部分純化”包括已至少經(jīng)過一些加工,例如,用商用樹脂處理(如批處理)的培養(yǎng)基制品。在優(yōu)選的實施方案中,“部分純化的”制品含有大于約30%(干重)的期望化合物,優(yōu)選地大于約40%的期望化合物,更優(yōu)選地大于約50%的期望化合物,更優(yōu)選地大于約60%的期望化合物,且最優(yōu)選地大于約70%的期望化合物?!安糠旨兓摹敝破芬矁?yōu)選含有80%或少于80%(干重)的期望化合物(即純度小于此處所述的“提取的”、“分離的”或“純化的”制品)。
根據(jù)所操作的生物合成酶或生物合成酶的組合,為了產(chǎn)生期望化合物,可能期望或需要給本發(fā)明微生物提供(如,飼喂)至少一種生物合成前體。術語“生物合成前體”或“前體”包括這樣的試劑或化合物,當提供、接觸微生物,或包括在微生物的培養(yǎng)基中時其起增強或增加期望產(chǎn)物的生物合成的作用。在一個實施方案中,生物合成前體或前體是門冬氨酸。在另一個實施方案中,生物合成前體或前體是β-丙氨酸。優(yōu)選門冬氨酸或β-丙氨酸的添加量可以導致培養(yǎng)基中的濃度足夠增加微生物的生產(chǎn)力(如,足以增加泛解酸和/或泛酸產(chǎn)量的濃度)。本發(fā)明的生物合成前體可以以濃縮溶液或懸浮液形式(如,在適宜溶劑,如水或緩沖液中)或固體形式(如,粉末形式)添加。此外,本發(fā)明的生物合成前體可以以單份額添加,連續(xù)或間斷給予給定的一段時間。術語“β-丙氨酸過量”包括使β-丙氨酸水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所涉及的微生物的水平。例如,本實施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-0.01g/L β-丙氨酸存在下進行。因此,過量β-丙氨酸水平可包括大約0.01-1,優(yōu)選大約1-20g/L的水平。
在另一個實施方案中,生物合成前體是纈氨酸。在另一個實施方案中,生物合成前體是α-酮異戊酸。優(yōu)選,纈氨酸或α-酮異戊酸的添加量可以導致培養(yǎng)基中的濃度足以引起期望化合物(如泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生。術語“α-KIV過量”包括使α-KIV水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所述微生物的水平。例如,本實施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-0.01g/Lα-KIV存在下進行。因此,過量α-KIV水平可包括大約0.01-1g/L,優(yōu)選大約1-20g/Lα-KIV。術語“纈氨酸過量”包括使纈氨酸水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所涉及的微生物的水平。例如,本實施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-0.5g/L纈氨酸存在下進行。因此,過量纈氨酸水平可包括大約0.5-5g/L,優(yōu)選大約5-20g/L纈氨酸。
而在另一實施方案中,生物合成前體為絲氨酸。優(yōu)選地,絲氨酸以導致培養(yǎng)基中的濃度足以引起期望化合物(如泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生的量添加。也可根據(jù)此處描述的生產(chǎn)方法加入過量的絲氨酸(如此處所定義),例如,用于提高泛酸的產(chǎn)量。本領域技術人員將理解,極度過量的生物合成前體可能對微生物產(chǎn)生毒性。生物合成前體這里也稱作“補充的生物合成底物”。
本發(fā)明的另一個方面包括以這里所述的重組微生物為特征的生物轉(zhuǎn)化方法。術語“生物轉(zhuǎn)化方法”,這里也稱作“生物轉(zhuǎn)變方法”,包括導致適當?shù)孜锖?或中間體化合物生成(如,轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)變成)期望產(chǎn)物的生物學方法。
生物轉(zhuǎn)化反應中使用的微生物和/或酶以允許它們執(zhí)行預期功能(如,產(chǎn)生期望化合物)的形式存在。微生物可以是整個細胞,或可以僅僅是獲得期望的最終結果所需的那些細胞部分??梢詫⑽⑸飸腋?如,在適當溶液如緩沖溶液或培養(yǎng)基中),洗滌(如,洗滌以除去培養(yǎng)微生物時的培養(yǎng)基),丙酮干燥,固定(如,用聚丙烯酰胺凝膠或κ-角叉菜膠或在合成載體,例如,珠,基質(zhì)等等上),固著,交聯(lián)或透化處理(如,透化處理膜和/或壁以便化合物,例如,底物、中間體或產(chǎn)物可更容易通過所述膜或壁)。
本發(fā)明進一步由以下實施例作舉例說明,但所述實施例不應視為本發(fā)明的限制。在此申請中的全部參考文獻、專利和出版的專利申請的內(nèi)容均在此引用作為本發(fā)明的參考。
實施例實施例I類泛酸化合物生產(chǎn)菌株在開發(fā)芽孢桿菌菌株用于泛酸生產(chǎn)時,對參與泛酸生物合成途徑和異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑(圖1)的基因和酶實施了多種遺傳操作,如在美國專利申請系列No.09/400,494和美國專利申請系列No.09/667,569中所描述的。例如,具有去調(diào)節(jié)的panBCD操縱子和/或具有去調(diào)節(jié)的panE1的菌株表現(xiàn)出增加的泛酸產(chǎn)量(當在β-丙氨酸和α-酮異戊酸(α-KIV)存在的條件下培養(yǎng)時)。進一步使ilvBNC和ilvD去調(diào)節(jié)的菌株在僅存在β-丙氨酸的條件下即表現(xiàn)出增加的泛酸產(chǎn)量。此外,可以通過進一步去調(diào)節(jié)panD以實現(xiàn)不依賴于β-丙氨酸。
泛酸生產(chǎn)菌株的一個示例PA824為色氨酸原養(yǎng)型,Spec和Tet抗性,在panBCD座位有去調(diào)節(jié)的panBCD,在panE1座位有去調(diào)節(jié)的panE1(在枯草芽孢桿菌基因組中有兩個基因與大腸桿菌的panE同源,即,panE1和panE2,前者編碼參與泛酸生產(chǎn)的主要酮泛解酸還原酶,而panE2對泛酸合成無貢獻(美國專利申請系列No.09/400,494)),在ilvD座位有去調(diào)節(jié)的ilvD,在amyE座位過表達ilvBNC盒子且在bpr座位過表達panD。當根據(jù)標準發(fā)酵方法在14L發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)48小時后,PA824常規(guī)產(chǎn)生約40-50g/L的泛酸(參見如,臨時專利申請系列No.60/263,053或臨時專利申請系列No.60/262,995,在此引用作為參考)。簡言之,在含痕量元素的分批培養(yǎng)基(4.5L)中接種PA824的搖瓶培養(yǎng)物??刂瓢l(fā)酵的溫度(如,43℃)、溶解的O2和pH值,且按葡萄糖限制性分批補料方法進行發(fā)酵。第一批葡萄糖消耗后,葡萄糖的濃度通過連續(xù)補給新鮮流加培養(yǎng)基(FEED medium)維持在約0到1g/L之間。pH值設定在7.2,并進行監(jiān)控和通過加入NH3-或H3PO4-溶液進行維持。溶解氧濃度[pO2]通過調(diào)節(jié)攪動和通氣速率維持在約10-30%。通過加入適當?shù)南輨┛刂婆菽纬?。離心移除細胞后測定(通過HPLC分析)發(fā)酵肉湯中的泛酸滴度。
第二個示例菌株為PA668。PA668為PA824的衍生物,含額外拷貝的在vpr和/或panB座位擴增的P26panB。PA668應用panB表達載體(pAN636)構建,這使得可以應用氯霉素進行多拷貝的篩選。簡言之,連接pAN636的NotI限制性片段(不含載體序列),然后用于轉(zhuǎn)化PA824,用含5μg/ml氯霉素的平板進行篩選。分離可以抗30μg/ml氯霉素的轉(zhuǎn)化體,并在48小時試管培養(yǎng)物中篩選泛酸的產(chǎn)量。此分離株產(chǎn)生比PA824約多10%的泛酸。在10-L的發(fā)酵物中,第一菌株PA668-2A與在類似的條件下培養(yǎng)的PA824產(chǎn)生數(shù)量相當?shù)姆核?如在36小時時為~45-50g/L)。36小時后,當PA824的泛酸產(chǎn)生例行開始減慢時,PA668-2A仍持續(xù)產(chǎn)生相當高水平的泛酸(如在48小時時為~60-65g/L的泛酸)。第二菌株PA668-24產(chǎn)生泛酸的速率甚至更快,48小時后達到60-70g/L。
第三個生產(chǎn)菌株PA721B-39按如下所述改造以進一步含有可擴增的P26panBpanD盒子。首先,構建一單獨的表達盒子,所述盒子能夠使panB和panD整合在bpr座位。兩個基因結合在一個表達盒子中通過消除抗生素抗性標記簡化了所產(chǎn)生的菌株。構建P26panBpanD表達盒子使其含有兩個不同的panD核糖體結合位點(RBS已先期在國際公開No.WO01/21772和美國專利申請No.60/262,995中合成并測試)。盒子進一步包括合成的panB基因核糖體結合位點(RBS1),但此設計允許將來通過簡單的寡核苷酸盒子替換來改變panB RBS。在構建的第一步中,panB基因與兩個panD基因盒子連接,如圖3所示的pAN665的構建。然后,將產(chǎn)生的panBpanD盒子轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌表達載體pOTP61中,見圖4中所示。構建的每一質(zhì)粒(pAN670和pAN674)的基本特征總結在表1中。
表1.含不同枯草芽孢桿菌panBpanD基因表達盒子的質(zhì)粒質(zhì)粒 panD RBS 載體 宿主菌pAN665標準 pASK-1BA3 大腸桿菌pAN670″ pOTP61枯草芽孢桿菌pAN669ND-C2pASK-1BA3 大腸桿菌pAN674″ pOTP61枯草芽孢桿菌這些新質(zhì)粒從單一載體上組合產(chǎn)生額外的PanB和PanD,且相對存在于PA668中的panB表達載體(pAN636),預期其產(chǎn)生水平增高的PanB。在泛酸生產(chǎn)菌株中安裝P26panBpanD載體的策略利用了bpr和panE1間的遺傳連鎖。首先通過用分離自PA930(panE1∷cat)的染色體DNA轉(zhuǎn)化菌株并篩選氯霉素抗性,構建PA824的衍生物,該衍生物的內(nèi)在panD表達盒子被除去。通過對四環(huán)素的敏感性篩選產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株,對兩株名為PA715的Tet敏感性分離株進行保存。該菌株為測試P26panBpanD載體的宿主菌株(參見以下)。為恢復PA715中的P26panE1盒子,用每一載體首先轉(zhuǎn)化PA328菌株,該菌株含P26panE1但不含整合在bpr座位的盒子。PA328確實含有P26panBCD座位,但其未進行過量產(chǎn)生α-KIV的改造。應用來自這兩個載體的適當NotI限制性片段獲得抗四環(huán)素的PA328轉(zhuǎn)化體,產(chǎn)生的菌株命名為PA710和PA714。
下一步是將此盒子轉(zhuǎn)入PA715,以使其可在PA824菌株背景中進行評價。以上通過從菌株PA710和PA714中分離染色體DNA、應用兩種DNA單獨轉(zhuǎn)化PA715并應用四環(huán)素抗性篩選來實現(xiàn)。通過對氯霉素的敏感性來篩選四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化體;這可鑒定出通過與bpr座位的P26panBpanD盒子連鎖還從供體DNA獲得P26panE1基因的期望轉(zhuǎn)化體。獲得了來自轉(zhuǎn)化反應的氯霉素敏感分離株,此反應中PA710或PA714染色體DNA用作供體。保存在試管培養(yǎng)試驗中產(chǎn)生最高泛酸滴度的分離株。這些菌株分別命名為PA717和PA721。重復兩次進行新菌株以及PA824和PA715的試管培養(yǎng),菌株生長在SVY+10g/L門冬氨酸中,43℃培養(yǎng)48小時后測試泛酸、HMBPA和β-丙氨酸。此外,對每一菌株的提取物進行SDS-PAGE膠實驗。試管培養(yǎng)試驗的結果在表2中顯示。
表2.培養(yǎng)在加有10g/L門冬氨酸的SVY中的PA717和PA721菌株的泛酸產(chǎn)量菌株 PanBD盒子[pan] [HMBPA][β-ala](g/L) (g/L) (g/L)PA824-4.9 0.94 2.5″4.6 0.79 2.3PA715無 1.7 <0.1 0.5″ ″ 1.7 <0.1 0.4PA717-24 pAN670 4.8 0.34 1.3″ ″ 4.9 0.40 1.3PA721-35 pAN674 5.7 0.50 1.4″ ″ 5.3 0.40 1.3PA721-39 pAN674 4.1 0.38 2.0″ ″ 4.6 0.40 2.2如預期,每一新菌株產(chǎn)生的泛酸和β-丙氨酸均多于PA715。兩個菌株(PA717-24和PA721-39)與PA824產(chǎn)生的泛酸大約相同,而PA721-35產(chǎn)生的泛酸多于PA824。所有三個新菌株產(chǎn)生的HMBPA均少于PA824。蛋白質(zhì)凝膠分析顯示三個新菌株產(chǎn)生的PanB均多于任何一個對照菌株。
菌株PA717-24、PA721-35和PA721-39也在基于豆粉的培養(yǎng)基中在搖瓶培養(yǎng)中進行了評價。如在表3中顯示,這些具有可擴增的P26panBpanD盒子的菌株產(chǎn)生的泛酸和HMBPA的水平與同時含有獨立的可擴增P26panB和P26panD盒子的PA668-2和PA668-24菌株中觀察到的水平類似。
表3.搖瓶實驗48小時
條件40ml培養(yǎng)基/200ml帶擋板的搖瓶、4X生物防護蓋(Bioshield covers)、300rpm、2.5%接種物(1.0ml)。
大豆培養(yǎng)基20g/l Cargill 200/20豆粉、8g/l(NH4)2SO4、5g/l谷氨酸鹽、1xPSTE、0.1M磷酸鹽pH7.2和0.3M MOPS pH7.2。60g/l葡萄糖或麥芽糖w/10mM鎂和1.4mM鈣。
重復兩次試驗的燒瓶的平均值。
除了產(chǎn)生泛酸(以及其他在圖1和本文中描述的類泛酸化合物),已經(jīng)證明某些用于生產(chǎn)商用數(shù)量的期望類泛酸化合物的工程化菌株也產(chǎn)生鑒定為3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的副產(chǎn)物(此處也稱為“β-丙氨酸2-(R)-羥基異戊酸”、“β-丙氨酸2-羥基異戊酸”、“β-丙氨酰-α-羥基異戊酸”和/或“fantothenate”)。(術語“fantothenate”本文中也簡寫為“fan”。)。
HMBPA是[R]-α-羥基異戊酸(α-HIV)和β-丙氨酸的縮合產(chǎn)物,由PanC酶催化產(chǎn)生。α-HIV是α-KIV還原產(chǎn)生的,該反應是由α-酮還原酶PanE(如,PanE1和/或PanE2)和/或IlvC催化的反應。由此提出,在微生物中存在至少兩個途徑競爭α-KIV(生物合成酶PanB的底物),這兩個途徑即泛酸生物合成途徑和HMBPA生物合成途徑。(競爭α-KIV的第三個和第四個途徑是導致從α-KIV產(chǎn)生纈氨酸或亮氨酸的途徑,如見圖1)。泛酸生物合成途徑和HMBPA生物合成途徑至少還產(chǎn)生競爭酶PanC的底物,即α-HIV和泛解酸。HMBPA的產(chǎn)生可能對泛酸的產(chǎn)生有顯著影響。例如,HMBPA途徑可以與泛酸途徑競爭前體(α-KIV和β-丙氨酸)和一些酶(PanC,PanD,PanE1和/或IlvC)。另外,因為HMBPA的結構與泛酸的結構相似,它可能具有負面調(diào)節(jié)泛酸途徑中的一個或多個步驟的不受歡迎的性能?;贖MBPA的鑒定,美國臨時專利申請系列No.60/262,995教導了,使泛酸生物合成過程與HMBPA生物合成過程相比能更有利地利用底物(α-KIV和β-丙氨酸)和/或酶(PanC,PanD,PanE1和/或IlvC)的任何方法均可改進或優(yōu)化泛酸的制備。
實施例II通過增加絲氨酸利用度提高泛酸產(chǎn)量至少一種優(yōu)化泛酸生產(chǎn)的方法涉及調(diào)節(jié)微生物培養(yǎng)物中的絲氨酸的利用度。特別是,可以證實,增加絲氨酸的利用度可導致泛酸產(chǎn)量的提高(如相對于HMBPA的生產(chǎn)),而降低絲氨酸的利用度可導致泛酸的生產(chǎn)相對于HMBPA的生產(chǎn)有所降低。該方法基于這樣的理解,即源自絲氨酸的化合物-亞甲基四氫葉酸(MTF)在泛酸生物合成反應中將其羥甲基基團交給α-KIV以產(chǎn)生酮泛解酸(如參見圖1和2)。這樣,調(diào)節(jié)絲氨酸水平是調(diào)節(jié)酮泛解酸水平的一個有效方法,而這又可以調(diào)節(jié)在適宜的工程化微生物中泛解酸和/或泛酸的生產(chǎn)。為證實該調(diào)節(jié)作用,將PA824在試管培養(yǎng)基中43℃培養(yǎng)48小時,所述培養(yǎng)基為SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸和±5g/L的絲氨酸。
表4加入或不加入絲氨酸時PA824的泛酸和HMBPA產(chǎn)量
如表4中顯示的數(shù)據(jù)所證實,絲氨酸的加入增加了泛酸的生產(chǎn)水平(而相反降低了HMBP的產(chǎn)量)。
實施例III. 改造細菌細胞以增加絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的量作為飼喂絲氨酸的備選方案,提高絲氨酸水平和/或絲氨酸利用水平(且相應地,亞甲基四氫葉酸水平)以調(diào)節(jié)泛酸生產(chǎn)水平的另一方法是增加3-磷酸甘油酸脫氫酶或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(分別為serA和glyA基因產(chǎn)物)的合成或活性,以由此增加在適宜的工程化微生物中的絲氨酸和亞甲基四氫葉酸的生物合成。
通過用含枯草芽孢桿菌glyA基因的表達盒子轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌細胞來增強glyA基因的表達,在盒子中所述基因克隆在強組成型啟動子的下游。為構建此表達盒子,用在表5中描述的引物RY417和RY418通過PCR從分離自枯草芽孢桿菌PY79的染色體DNA中擴增glyA基因。
表5用于擴增枯草芽孢桿菌的glyA和serA的引物
RY417含有的RBS2合成核糖體結合位點正好位于XbaI位點的下游。然后,用XbaI和BamHI切割擴增的DNA并克隆在載體pAN004(圖5)的XbaI和BamHI位點之間,以生成質(zhì)粒pAN396(圖6;SEQ ID NO24)。pAN004載體在緊接XbaI克隆位點的上游含有噬菌體SP01 P26啟動子以驅(qū)動克隆的glyA基因的表達。恰在表達盒子的下游,pAN396含有可以在枯草芽孢桿菌中行使功能的cat基因。為轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌,從pAN396中分離含P26glyA盒子和cat基因的NotI DNA片段、使其自連接并轉(zhuǎn)化導入枯草芽孢桿菌PY79感受態(tài)細胞中。篩選出幾株氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體并命名為PA1007和PA1008。從每個菌株中分離染色體DNA并用于轉(zhuǎn)化PA721B-39和PA824感受態(tài)細胞以分別產(chǎn)生PA1011和PA1014菌株。對篩選的PA1011和PA1014分離株的細胞提取物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,證實這些菌株與其親本菌株PA721B-39(實施例I中描述)和PA824(在國際公布No.WO 01/21772中描述)相比含有數(shù)量增加的glyA基因產(chǎn)物。為試驗增強glyA表達對泛酸生產(chǎn)的影響,PA1011和PA1014在試管培養(yǎng)基(培養(yǎng)基為SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸)中在43℃培養(yǎng)48小時。如表6中提供的數(shù)據(jù)所顯示,PA1014的泛酸產(chǎn)量(4.5g/L)多于其親本菌株PA824的產(chǎn)量(3.2g/L)。同樣,PA1011的平均泛酸產(chǎn)量(4.35g/L)也多于其親本菌株PA721B-39的產(chǎn)量(4.05g/L)。
表6.比較PA1011和PA1014與PA721B-39和PA824的泛酸和HMBPA產(chǎn)量.
實施例IV.改造細菌細胞以提高其3-磷酸甘油酸脫氫酶(serA基因產(chǎn)物)量。
serA基因產(chǎn)物3-磷酸甘油酸脫氫酶為絲氨酸生物合成途徑中第一個發(fā)揮作用的酶(參見圖2)。由于絲氨酸為MTF合成的底物之一,我們改造了serA基因使其過表達以增加細胞內(nèi)的絲氨酸水平。與實施例III中描述的用于glyA基因的方法類似,通過用含枯草芽孢桿菌serA基因的表達盒子(盒中該基因克隆在強組成型啟動子下游)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌細胞來增強serA基因的表達。為構建表達盒子,用表5中描述的引物RY405和RY406通過PCR從分離自枯草芽孢桿菌PY79的染色體DNA中擴增serA基因。然后用XbaI和BamHI切割擴增的DNA并克隆到載體pAN004(圖5)的XbaI和BamHI位點之間,以生成質(zhì)粒pAN393(圖7,SEQ ID NO25)。為轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌,從pAN393中分離含P26serA盒子和cat基因的NotIDNA片段、自連接并轉(zhuǎn)化導入枯草芽孢桿菌PY79感受態(tài)細胞中。篩選出幾株氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體并命名為PA1004和PA1005。從每個菌株中分離染色體DNA并用于轉(zhuǎn)化PA721B-39和PA824感受態(tài)細胞以分別產(chǎn)生PA1010和PA1013菌株。對篩選的PA1010和PA1013分離株的細胞提取物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,證實這些菌株與其親本菌株PA721B-39和PA824相比含有數(shù)量增加的serA基因產(chǎn)物。
為試驗增強serA表達對泛酸生產(chǎn)的影響,將PA1010和PA1013在試管培養(yǎng)基(此培養(yǎng)基為SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸)中43℃培養(yǎng)48小時。如表7中提供的數(shù)據(jù)所顯示,PA1010的平均泛酸產(chǎn)量(4.7g/L)多于其親本菌株PA721B-39的產(chǎn)量(4.1g/L)。同樣,PA1013的平均泛酸產(chǎn)量(4.1g/L)多于其親本菌株PA824的產(chǎn)量(3.1g/L)。
表7.比較PA1010和PA1013與PA721B-39和PA824的泛酸和HMBPA產(chǎn)量.
實施例V.應用serA和glyA表達增強的菌株進行的搖瓶和發(fā)酵罐實驗。
基于試管試驗的結果,選擇具有可擴增的serA盒子的兩菌株和具有可擴增的gly盒子的兩菌株,其各來自親本菌株PA824和PA721B-39。四株菌與親本一道在搖瓶中培養(yǎng)(表8)。在大豆面粉MOPS葡萄糖(SMG)培養(yǎng)基中,四株菌產(chǎn)生的泛酸均多于其親本菌株。在大豆面粉MOPS麥芽糖(SMM)培養(yǎng)基中,四株菌中的一株表現(xiàn)出優(yōu)于其親本株。
來自各自親本的serA過表達株和glyA過表達株在10升的Chemap臺式發(fā)酵罐中同時培養(yǎng)。glyA過表達株PA1014-3(來源于PA824)在SMM中產(chǎn)生的泛酸滴度最高,而在發(fā)酵罐中也有最佳表現(xiàn)(表9)。在36小時,菌株PA1014-3的培養(yǎng)物上清中的泛酸產(chǎn)量為71g/l且在48小時培養(yǎng)物上清中的泛酸產(chǎn)量為86g/l,與之比較其親本PA824的產(chǎn)量分別為41g/l和46g/l。serA菌株PA1012-4的培養(yǎng)物上清中的泛酸產(chǎn)量也顯著高于PA824對照,在36和48小時時分別為52g/l和60g/l。這些結果清楚地證明增加glyA和serA的有效性。
PA721B-39的serA過表達和glyA過表達衍生物也明顯地較其親本有所改進。二者培養(yǎng)48小時后在培養(yǎng)物上清中均產(chǎn)生約80g/l的泛酸(分別為82g/l和79g/l)。相對于PA824衍生物,PA721B-39衍生物中提高的PanB水平的效應亦顯示在HMBPA的減少上。PA721B-39和其衍生物48小時后產(chǎn)生的HMBPA低于PA824或甚至低于PA668-24。增加GlyA也表現(xiàn)出可減少碳流向HMBPA。
表1
表1表明對于試驗中所有的BF3醚絡合物,膠粘劑均獲得了優(yōu)異的粘接,但是,當醚能夠在膠粘劑固化時揮發(fā)出去則可獲得最好的粘接,尤其是實施例1和例2中的絡合物在固化時揮發(fā)出去?;钠茐氖侵富脑谀z粘劑破壞之前發(fā)生斷裂。粘附破壞是指膠粘劑與基材表面的粘接在一定的剪力強度下發(fā)生斷裂。
實施例4-7這些實施例中的配方與例1-3相同,差別僅在于所有膠粘劑以BF3O(Me)2作為催化劑,且含有環(huán)氧乙烷的單體不同。膠粘劑被涂覆在iPP基材上并在如前所述的室溫下進行試驗。結果列于表2。
表2
表2表明,盡管所有的含有環(huán)氧乙烷的單體都與iPP發(fā)生了很好的粘接,但是使用官能度大于2的單體對基材表面的粘接效果更好?!盎旌系幕?內(nèi)聚”是指基材產(chǎn)生了裂紋,從而引發(fā)膠粘劑的內(nèi)聚破壞(c/a)。
實施例8-13
表9.過表達serA或glyA的泛酸生產(chǎn)菌株用10升發(fā)酵罐評價。
HMBPA(g/l) 泛酸(g/l)運行 菌株親本 加入的 36483648盒子小時 小時 小時 小時P285 PA824 18254146P284 PA1012-4PA824 serA20215260P286 PA1014-3PA824 glyA14167186P259 PA721B-39 4 5 3442P287 PA1010-6PA721B-39 serA4 5 6582P289 PA1011-2PA721B-39 glyA2 3 5679P275 PA668-24PA824 3 9 5572應用的培養(yǎng)基為PFM-222。除以下的變化外與在美國系列No.60/262,995(2001年1月19日提交)中描述的PFM-155培養(yǎng)基相同,所述的變化為(1)在分批材料中沒有Amberex 1003。Cargill 200/20(豆粉)40g/L已改變?yōu)镃argill 20-80(大豆粗磨粉)50g/L,MgSO4·7H2O替換為MgCl2·7H2O,1g/L,且SM-1000X替換為PSTE-1000X(PSTE-1000X=MnCl2·4H2O,2.0g/L;ZnSO4·7H2O,1.5g/L;CoCl2·6H2O,2.0g/L;CuSO4·5H2O,0.25g/L;Na2MoO4·2H2O,0.75g/L)。在補料材料中SM-1000X替換為PSTE-1000X。
提高泛酸產(chǎn)量也可在單一菌株中組合過表達serA和glyA來實現(xiàn),和/或通過引入突變來實現(xiàn),所述突變導致serA或glyA或二者均抵抗反饋作用。
實施例VI.通過突變purR基因提高glyA基因的表達如實施例III和V所述,glyA基因的表達可通過添加其中glyA基因由強組成型啟動子驅(qū)動的一個或多個拷貝的表達盒提高。提高glyA表達的替代方法是改變對其的調(diào)節(jié)。描述glyA∷lacZ融合物的文獻提示glyA啟動子在正常條件下是中等強度的(約400Miller單位),但是如果其負調(diào)控因子purR基因缺失的話,該啟動子能夠被誘導至相對的高水平(1,800Miller單位)(Saxild等(2001)J.Bacteriol.1836175-6183)。因此,進行實驗以確定是否glyA的表達以及由此泛酸產(chǎn)量可通過缺失泛酸生產(chǎn)菌株中的purR而得以提高。
由PY79染色體DNA通過PCR擴增枯草芽孢桿菌purR基因,并將所得片斷克隆到PvuII切割的pGEM5-Zf(+)載體DNA中,以產(chǎn)生質(zhì)粒pAN835F(SEQ ID NO26,圖8)。這個步驟消除了插入物兩端的PvuII位點,留下位于purR開放讀框中間的唯一的PvuII位點。下一步,將來自pAN363F(SEQ ID NO27)的含革蘭氏陽性卡那霉素抗性基因的平端PCRDNA片斷連接到pAN835F的此唯一PvuII位點中,以產(chǎn)生pAN838F(SEQID NO28,圖9)。
然后將pAN838F轉(zhuǎn)化到PY79、PA668-24和PA824中,以10mg/l進行卡那霉素抗性選擇,產(chǎn)生新的菌株系列,分別命名為PA1059、PA1060和PA1061。通過PCR證明所有新分離菌株均含有由雙交換事件所預期的被破壞的purR∷kan等位基因。對幾個PA1060和PA1061分離株在生長于SVY葡萄糖+β-丙氨酸的試管培養(yǎng)物中進行了泛酸產(chǎn)量測試(表10)。衍生自PA668-24的最佳分離株PA1060-2和PA1060-4分別將3.0g/l泛酸提高到5.3至5.1g/l,這是75%的提高。同樣地,衍生自PA824的最佳分離株PA1061-1和PA1061-2將泛酸產(chǎn)量從約3.1g/l提高到5.4g/l,也是75%的增長。這些結果提示glyA基因在這些菌株中通過purR基因的破壞而得以被充分誘導?;蛘?,PA1060和PA1061中泛酸產(chǎn)量的提高可能是由于更為復雜的多效作用引起。在任何情況下,解除purR調(diào)節(jié)子的調(diào)控作用對泛酸生產(chǎn)均具有正面效果。
在其它實施方案中,可以在其它泛酸生產(chǎn)菌株中實施purR破壞,例如那些具有整合的P26serA等位基因或者不止一個拷貝的P26panBCD操縱子的菌株。purR基因也可用作為添加期望的表達盒如P26panB的位點。也可以利用對鳥嘌呤類似物例如8-氮雜鳥嘌呤的抗性作為對purR突變的選擇方法。
表10.在于SVY葡萄糖+5g/l β-丙氨酸中生長的試管培養(yǎng)物中含破壞的purR的PA824和PA668-24衍生物的泛酸和fantothenate產(chǎn)量
b.d.=檢測不到*接種菌落所取自的培養(yǎng)皿中的抗生素濃度實施例VII.由非擴增型盒過表達serA基因本實施例描述了提高絲氨酸產(chǎn)量的另一種方法,其中一個兩步操作將強組成型啟動子(P26)置于染色體serA基因的前面。構建了兩個質(zhì)粒,分別含有來自天然serA基因緊上游區(qū)域的大約700個堿基對的DNA序列。第一個質(zhì)粒pAN821也含有serA編碼區(qū)的3’部分,并且在前述兩序列之間含有卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO30,圖10)。當轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌中時,進行卡那霉素抗性選擇,pAN821將引起serA基因被破壞,導致絲氨酸營養(yǎng)缺陷型。這產(chǎn)生了稱之為ΔserA∷kan等位基因的遺傳序列。
被設計用于引入P26serA結構的第二個質(zhì)粒,通過在pAN395中在P26啟動子5’端插入serA上游序列構建。所得質(zhì)粒pAN824示于圖11(SEQ IDNO31)。質(zhì)粒pAN395類似于實施例IV中所述的pAN393。serA基因的開放讀框利用枯草芽孢桿菌PY79 DNA作為模板通過PCR合成。上游引物含XbaI位點和中等強度的合成核糖體結合位點RBS2。下游引物含BamHI位點。該serA開放讀框被用來取代中等拷貝質(zhì)粒pAN006中的panBCD基因,以產(chǎn)生pAN395(SEQ ID NO29,圖12)。該質(zhì)粒含有自P26啟動子表達的serA基因和RBS2核糖體結合位點。
將來自pAN821的ΔserA∷kan等位基因引入到菌株PA824中以產(chǎn)生PA1026。如預期的那樣,PA1026在基本培養(yǎng)基中不生長。在第二步中,將來自質(zhì)粒pAN824的P26serA盒引入到PA1026中,進行絲氨酸原養(yǎng)型選擇,產(chǎn)生PA1028。幾個PA1028分離株通過診斷性PCR證實具有預期的染色體結構(P26serA)。然后對這些分離株在于SVY+5g/l β-丙氨酸中生長48小時的試管培養(yǎng)物中進行泛酸產(chǎn)量測試(表11)。PA1028分離株(衍生自PA824)使泛酸產(chǎn)量提高10%到25%。如表12所示,在搖瓶實驗中,PA824產(chǎn)生大約7g/l泛酸,而PA1028產(chǎn)生11g/l。
實施例VIII.構建含整合的非擴增型P26serA盒以及擴增型P26glyA盒的泛酸生產(chǎn)菌株因為整合在serA處的非擴增型P26serA盒導致更高的泛酸合成(參見例如表12),并且因為glyA處的氯霉素擴增型P26glyA盒導致高得多的泛酸合成(參見例如PA1014-3,表8),我們提出將兩者組合可能具協(xié)同作用。菌株PA1028-4為PA824的衍生物,其含整合在serA處的非擴增型P26serA盒,利用來自PA1014-3的染色體DNA進行轉(zhuǎn)化以獲得5mg/l的氯霉素抗性,產(chǎn)生命名為PA1038的菌株系列,現(xiàn)在這些菌株含有氯霉素可擴增的P26glyA盒子。利用在SVY+β-丙氨酸中生長的標準試管培養(yǎng)物對PA1038分離株進行泛酸產(chǎn)量測試(表13)。如預期的那樣,PA1038的泛酸產(chǎn)量表現(xiàn)出顯著提高,由PA824的約4.2g/l到PA1038組的6.6至7.5g/l。如表12所示對PA1038-3和PA1038-12分離株進一步在搖瓶中進行了測試。兩者都產(chǎn)生平均13.6g/l的泛酸,相比之下PA824產(chǎn)生7.4g/l的泛酸。
表11.于SVY+5g/l β-丙氨酸中生長48小時的試管培養(yǎng)物中,在serA基因座含單拷貝P26serA的PA824衍生物的泛酸和fantothenate產(chǎn)量
b.d.=檢測不到表12.過表達serA和/或glyA的泛酸生產(chǎn)菌株的搖瓶評價
所有數(shù)據(jù)為一式雙份搖瓶培養(yǎng)物48小時后的平均值。
條件40ml培養(yǎng)基/200ml擋板式搖瓶,4X Bioshield covers,300rpm,2.5%接種物及43℃。
接種物SVY基w/麥芽糖43℃ 24小時。
培養(yǎng)基20g/l Cargill 200/20大豆粉,8g/l(NH4)2SO4,5g/l谷氨酸鹽及1 x PSTE。
緩沖液0.1M磷酸鹽pH7.2和0.3M MOPS pH7.2。
碳源(作為20X貯液單獨滅菌)30g/l麥芽糖,5mM MgCl2和0.7mM CaCl2。
表13.在serA處含非擴增型P26serA盒、而在glyA處含擴增型P26glyA盒的PA824衍生物PA1038的泛酸產(chǎn)量
試管培養(yǎng)物使用SVY葡萄糖+5g/l β-丙氨酸在43℃培養(yǎng)48小時。
實施例IX.通過改變甘氨酸裂解途徑提高MTF產(chǎn)量如上述實施例所證明的那樣,提高細菌中的MTF產(chǎn)量可以提高已通過操縱panBCD和/或panE基因而被工程化以產(chǎn)生更多泛酸的菌株的泛酸產(chǎn)量。已證明泛酸產(chǎn)量可通過提高glyA或serA基因的表達而得以提高。如實施例III到V以及VII到VIII所證明的那樣,可利用更強的啟動子或核糖體結合位點來提高glyA或serA的表達。備選地,如實施例VI所舉例說明的那樣,芽孢桿菌中glyA基因的表達可通過破壞purR阻遏基因而去調(diào)節(jié)。
提高MTF產(chǎn)量的另一種方法是增強甘氨酸裂解途徑中的酶的表達。例如,由gcvT、gcvPA、gcvPB、gcvH及pdhD基因編碼的酶催化甘氨酸裂解為MTF、CO2和NH3。強組成型啟動子例如之前描述過的SP01噬菌體P26啟動子,可克隆到gcvT-gcvPA-gcvPB操縱子前或者gcvH或pdhD基因的前面以增強其表達。除上述方法以外,可額外向培養(yǎng)基中添加便宜的甘氨酸,以進一步提高如本文所述工程化的任何菌株的MTF產(chǎn)量。
等同方案本領域技術人員將認識到,或只需使用常規(guī)試驗即能夠確定本文所述的本發(fā)明具體實施方案的很多等同方案。這些等同方案旨在包括在下列權利要求中。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>用于提高泛酸產(chǎn)量的微生物和方法<130>BGI-154PC<160>31<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>194<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述啟動子序列<220>
<221>-35_signal<222>(136)..(141)<220>
<221>-10_signal<222>(159)..(164)<400>1gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 60tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 120ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 180gcaaccccgc ctgt194<210>2<211>163<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述啟動子序列<220>
<221>-35_signal<222>(34)..(39)<220>
<221>-10_signal<222>(58)..(63)<220>
<221>-35_signal<222>(75)..(80)<220>
<221>-10_signal<222>(98)..(103)<400>3gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat 60aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgta gtgaggtgga 120tgcaatg127<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>4taaacatgag gaggagaaaa catg 24<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>5attcgagaaa tggagagaat ataatatg 28<210>6<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>6agaaaggagg tga 13<210>7<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<220>
<221>misc_feature<222>17,18,19,20<223>n=a,t,c,或g<400>7ttaagaaagg aggtgannnn atg 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<220>
<221>misc_feature<222>16,17,18,19,20<223>n=a,c,t,或g<400>8ttagaaagga ggtgannnnn atg 23<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<220>
<221>misc_feature<222>14,15,16,17,18,19,20<223>n=a,c,t,或g<400>9agaaaggagg tgannnnnnn atg 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<220>
<221>misc_feature<222>14,15,16,17,18,19<223>n=a,c,t,或g<400>10
agaaaggagg tgannnnnna tg 22<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>11ccctctagaa ggaggagaaa acatg25<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>12ccctctagag gaggagaaaa catg 24<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>13ttagaaagga ggatttaaat atg 23<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>14ttagaaagga ggtttaatta atg 23<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>15ttagaaagga ggtgatttaa atg 23<210>16<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>16ttagaaagga ggtgtttaaa atg 23<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>17attcgagaaa ggaggtgaat ataatatg 28<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>18attcgagaaa ggaggtgaat aataatg 27<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結合位點<400>19attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg 28<210>20<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5′PCR引物<223>針對serA基因<400>20ccctctagag gaggagaaaa catgtttcga gtattggtct cagacaaaat g 51<210>21<211>43<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述3′PCR引物<223>針對serA基因<400>21cccggatcca attatggcag atcaatgagc ttcacagaca caa43<210>22<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工列的描述5′PCR引物<223>針對glyA基因<400>22ggatctagag gaggtgtaaa catgaaacat ttacctgcgc aagacgaa 48<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述3′PCR引物<223>針對glyA基因<400>23cggggatccc ccatcaacaa ttacacactt ctattgattc tac43<210>24<211>7926<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述serA過表達<223>質(zhì)粒<400>24gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020tatcttgata ataagggtaa ctattgaatt cggtaccaag agtttgtaga aacgcaaaaa 1080ggccatccgt caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc 1140ctgcccgcca ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg 1200tcctactcag gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg 1260actgagcctt tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctctcgcatg gggagacccc 1320acactaccat cggcgctacg gcgtttcact tctgagttcg gcatggggtc aggtgggacc 1380
accgcgctac tgccgccagg caaattctgt tttatcagac cgcttctgcg ttctgattta 1440atctgtatca ggctgaaaat cttctctcat ccgccaaaac aggatccaat tatggcagat 1500caatgagctt cacagacaca atatcaggga catttgttag ttctttcaca attttatctt 1560ccagatgtct gtcaaaggaa agcatcatga tggcttctcc gcctttttcc ttacggccaa 1620cctgcatagt tgcaatgtta atatcattat ctccgagaat acgtcctact cggccgatga 1680cacctgttgt atcttgatgc tggatataca ccaagtgacc agtcggataa aaatcaatat 1740taaatccatt gatctcgaca attcgttctc cgaaatgagg aatatacgta gccgttacag 1800taaaggtgct gcggtctcct gtcactttta cgctgatgca gttatcgtat ccagattcag 1860aagaggaaat tttttcactg aagctaatgc cgcgttcttt tgcgacaccc ccggcattga 1920cctcattaac agtagagtct acgcgcggtt ttaaaaagcc tgacagaagg gcttttgtaa 1980tgaacgatgt ttcaagttta gcaattgtgc cttcatattg aatggcaaca tcctgtactg 2040gttctttcat gcactgtgat acaaggctgc caatttttcc tgcaatttga tggtaaggct 2100taattttagc aaattcatct tttgtcatgg caggcaggtt gatagctgac atgacaggca 2160ggccttttgc gaactgcaga acttcttctg acacttgggc ggcgacattg agctgtgctt 2220ctttcgttga tgctcccaag tgaggagtgg caatgactaa tggatgatca acaagtttgt 2280tgtcaactgg cggttcgact tcgaaaacgt caagcgctgc tcccgcaaca tgcccgtttt 2340ccaaagcttc gagaagtgct gcttcatcga taattccgcc tcgcgcacag ttaattaagc 2400gaacgccttt tttcgttttt gcaatcgttt ctttattcaa taagcctttt gtttcttttg 2460ttaaaggcgt gtgaacggta atgatatccg cactttcaag cacttcttca aatgtacggc 2520tgtttacgcc gatttttttc gctctttctt ccgttaagaa aggatcaaaa acgtgcacag 2580tcataccgaa cgctcctcga cgctgtgcaa tttcacttcc gattcggcct aatcctacaa 2640taccaagcgt ttttccataa agctctgaac cgacataagc tgtgcggttc cactctctgg 2700atttcactga gatattagcc tgcggaatgt gtctcattaa agaagagatc attgcaaatg 2760tatgctcagc tgtcgaaatg gtgttgccgt tcggagcatt gatcacgatt accccgtgtt 2820tcgtagcctc atcaatatcg atattatcga caccgacacc ggctcttccg acaattttta 2880aagaagtcat tttgttgaaa aggtcttctg ttacttttgt cgcgcttcgc accaaaagag 2940catcaaaagt atgtaattca tcttctgcat ctgctacgtt tttttgaacg atttcaataa 3000agtctgattc aataagtggc tgtaaaccgt cgttgctcat tttgtctgag accaatactc 3060gaaacatgtt ttctcctcct ctagagcgtc ctgctgttgt taagattatt ataccacacc 3120ttgtagataa agtcaacaac tttttgcaaa atttttcagg aattttagca gaggttgttc 3180tggatgtaga acaaaacatc tttccgctct tgtgctgtta ggatatcttt cttggaagct 3240aggtaggcct cgagttatgg cagttggtta aaaggaaaca aaaagaccgt tttcacacaa 3300aacggtcttt ttcgatttct ttttacagtc acagccactt ttgcaaaaac cggacagctt 3360catgccttat aactgctgtt tcggtcgaca agcttcgcga agcggccgca aaattcactg 3420gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3480gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3540tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3600catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3660gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg actatgcttg taaaccgttt 3720tgtgaaaaaa tttttaaaat aaaaaagggg acctctaggg tccccaatta attagtaata 3780taatctatta aaggtcattc aaaaggtcat ccaccggatc agcttagtaa agccctcgct 3840agattttaat gcggatgttg cgattacttc gccaactatt gcgataacaa gaaaaagcca 3900gcctttcatg atatatctcc caatttgtgt agggcttatt atgcacgctt aaaaataata 3960aaagcagact tgacctgata gtttggctgt gagcaattat gtgcttagtg catctaacgc 4020ttgagttaag ccgcgccgcg aagcggcgtc ggcttgaacg aattgttaga cattatttgc 4080cgactacctt ggtgatctcg cctttcacgt agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc 4140gcgaggccaa gcgatcttct tcttgtccaa gataagcctg tctagcttca agtatgacgg 4200gctgatactg ggccggcagg cgctccattg cccagtcggc agcgacatcc ttcggcgcga 4260ttttgccggt tactgcgctg taccaaatgc gggacaacgt aagcactaca tttcgctcat 4320cgccagccca gtcgggcggc gagttccata gcgttaaggt ttcatttagc gcctcaaata 4380gatcctgttc aggaaccgga tcaaagagtt cctccgccgc tggacctacc aaggcaacgc 4440tatgttctct tgcttttgtc agcaagatag ccagatcaat gtcgatcgtg gctggctcga 4500agatacctgc aagaatgtca ttgcgctgcc attctccaaa ttgcagttcg cgcttagctg 4560gataacgcca cggaatgatg tcgtcgtgca caacaatggt gacttctaca gcgcggagaa 4620tctcgctctc tccaggggaa gccgaagttt ccaaaaggtc gttgatcaaa gctcgccgcg 4680ttgtttcatc aagccttacg gtcaccgtaa ccagcaaatc aatatcactg tgtggcttca 4740ggccgccatc cactgcggag ccgtacaaat gtacggccag caacgtcggt tcgagatggc 4800gctcgatgac gccaactacc tctgatagtt gagtcgatac ttcggcgatc accgcttccc 4860tcatgatgtt taactttgtt ttagggcgac tgccctgctg cgtaacatcg ttgctgctcc 4920ataacatcaa acatcgaccc acggcgtaac gcgcttgctg cttggatgcc cgaggcatag 4980actgtacccc aaaaaaacag tcataacaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac 5040cgctgcgttc ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgagcg catacgctac ttgcattaca 5100gcttacgaac cgaacaggct tatgtccact gggttcgtgc cttcatccgt ttccacggtg 5160tgcgtcaccc ggcaaccttg ggcagcagcg aagtcgaggc atttctgtcc tggctggcga 5220acgagcgcaa ggtttcggtc tccacgcatc gtcaggcatt ggcggccttg ctgttcttct 5280acggcaaggt gctgtgcacg gatctgccct ggcttcagga gatcggaaga cctcggccgt 5340cgcggcgctt gccggtggtg ctgaccccgg atgaagtggt tcgcatcctc ggttttctgg 5400
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<223>人工序列的描述glyA過表達<223>質(zhì)粒<400>25gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720
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<223>人工序列的描述質(zhì)粒<400>31ttgcggccgc ttcgaaagct gtaatataaa aaccttcttc aactaacggg gcaggttagt 60gacattagaa aaccgactgt aaaaagtaca gtcggcatta tctcatatta taaaagccag 120tcattaggcc tatctgacaa ttcctgaata gagttcataa acaatcctgc atgataacca 180tcacaaacag aatgatgtac ctgtaaagat agcggtaaat atattgaatt acctttatta 240atgaattttc ctgctgtaat aatgggtaga aggtaattac tattattatt gatatttaag 300ttaaacccag taaatgaagt ccatggaata atagaaagag aaaaagcatt ttcaggtata 360ggtgttttgg gaaacaattt ccccgaacca ttatatttct ctacatcaga aaggtataaa 420tcataaaact ctttgaagtc attctttaca ggagtccaaa taccagagaa tgttttagat 480acaccatcaa aaattgtata aagtggctct aacttatccc aataacctaa ctctccgtcg 540ctattgtaac cagttctaaa agctgtattt gagtttatca cccttgtcac taagaaaata 600aatgcagggt aaaatttata tccttcttgt tttatgtttc ggtataaaac actaatatca 660atttctgtgg ttatactaaa agtcgtttgt tggttcaaat aatgattaaa tatctctttt 720ctcttccaat tgtctaaatc aattttatta aagttcattt gatatgcctc ctaaattttt 780atctaaagtg aatttaggag gcttacttgt ctgctttctt cattagaatc aatccttttt 840taaaagtcaa tattactgta acataaatat atattttaaa aatatcccac tttatccaat 900tttcgtttgt tgaactaatg ggtgctttag ttgaagaata aagaccacat taaaaaatgt 960ggtcttttgt gtttttttaa aggatttgag cgtagcgaaa aatccttttc tttcttatct 1020tgataataag ggtaactatt gaattcggta ccaagagttt gtagaaacgc aaaaaggcca 1080tccgtcagga tggccttctg cttaatttga tgcctggcag tttatggcgg gcgtcctgcc 1140cgccaccctc cgggccgttg cttcgcaacg ttcaaatccg ctcccggcgg atttgtccta 1200ctcaggagag cgttcaccga caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga 1260gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc gcatggggag accccacact 1320accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg gggtcaggtg ggaccaccgc 1380gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt ctgcgttctg atttaatctg 1440tatcaggctg aaaatcttct ctcatccgcc aaaacaggat ccaattatgg cagatcaatg 1500agcttcacag acacaatatc agggacattt gttagttctt tcacaatttt atcttccaga 1560tgtctgtcaa aggaaagcat catgatggct tctccgcctt tttccttacg gccaacctgc 1620atagttgcaa tgttaatatc attatctccg agaatacgtc ctactcggcc gatgacacct 1680gttgtatctt gatgctggat atacaccaag tgaccagtcg gataaaaatc aatattaaat 1740ccattgatct cgacaattcg ttctccgaaa tgaggaatat acgtagccgt tacagtaaag 1800gtgctgcggt ctcctgtcac ttttacgctg atgcagttat cgtatccaga ttcagaagag 1860gaaatttttt cactgaagct aatgccgcgt tcttttgcga cacccccggc attgacctca 1920ttaacagtag agtctacgcg cggttttaaa aagcctgaca gaagggcttt tgtaatgaac 1980gatgtttcaa gtttagcaat tgtgccttca tattgaatgg caacatcctg tactggttct 2040ttcatgcact gtgatacaag gctgccaatt tttcctgcaa tttgatggta aggcttaatt 2100ttagcaaatt catcttttgt catggcaggc aggttgatag ctgacatgac aggcaggcct 2160tttgcgaact gcagaacttc ttctgacact tgggcggcga cattgagctg tgcttctttc 2220gttgatgctc ccaagtgagg agtggcaatg actaatggat gatcaacaag tttgttgtca 2280actggcggtt cgacttcgaa aacgtcaagc gctgctcccg caacatgccc gttttccaaa 2340gcttcgagaa gtgctgcttc atcgataatt ccgcctcgcg cacagttaat taagcgaacg 2400
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權利要求
1.用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括在使泛酸產(chǎn)量提高的條件下培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物。
2.用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括在使泛酸產(chǎn)量提高的條件下培養(yǎng)微生物,所述微生物具有(i)去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑,和(ii)去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑。
3.權利要求2的方法,其中所述微生物具有至少兩個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶。
4.權利要求2的方法,其中所述微生物具有至少三個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶。
5.權利要求2的方法,其中所述微生物具有至少四個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶。
6.權利要求5的方法,其中所述微生物具有去調(diào)節(jié)的酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、去調(diào)節(jié)的酮泛解酸還原酶、去調(diào)節(jié)的泛酸合成酶和去調(diào)節(jié)的門冬氨酸-α-脫羧酶。
7.權利要求1到6任何一項的方法,其中所述微生物還具有去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑。
8.權利要求7的方法,其中所述微生物具有至少兩個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶。
9.權利要求7的方法,其中所述微生物具有至少三個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶。
10.權利要求9的方法,其中所述微生物具有去調(diào)節(jié)的乙酰羥酸合成酶、去調(diào)節(jié)的乙酰羥酸異構還原酶和去調(diào)節(jié)的二羥酸脫水酶。
11.權利要求1到10任何一項的方法,其中微生物具有至少一個去調(diào)節(jié)的MTF生物合成酶。
12.權利要求11的方法,其中微生物具有去調(diào)節(jié)的glyA基因。
13.權利要求11的方法,其中微生物具有去調(diào)節(jié)的serA基因。
14.權利要求11的方法,其中微生物具有去調(diào)節(jié)的glyA基因和去調(diào)節(jié)的serA基因。
15.權利要求12或14的方法,其中微生物具有突變、缺失或破壞了的purR基因。
16.用于提高泛酸產(chǎn)量的方法,包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物,其中所述去調(diào)節(jié)致使泛酸產(chǎn)量得以提高。
17.生產(chǎn)泛酸的方法,包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物,使得在培養(yǎng)該微生物36小時后泛酸產(chǎn)量至少為50g/L。
18.權利要求17的方法,包括培養(yǎng)所述微生物使得在培養(yǎng)該微生物36小時后泛酸的產(chǎn)量至少為60g/L。
19.權利要求17的方法,包括培養(yǎng)所述微生物使得在培養(yǎng)該微生物36小時后泛酸的產(chǎn)量至少為70g/L。
20.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物,從而使得在培養(yǎng)該微生物48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為60g/L。
21.權利要求20的方法,包括培養(yǎng)所述微生物使得在培養(yǎng)該微生物48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為70g/L。
22.權利要求20的方法,包括培養(yǎng)所述微生物使得在培養(yǎng)該微生物48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為80g/L。
23.前述任何一項權利要求的方法,其中通過調(diào)節(jié)泛酸激酶的活性進一步提高泛酸的產(chǎn)量。
24.權利要求23的方法,其中泛酸激酶的活性被降低。
25.權利要求24的方法,其中缺失CoaA并下調(diào)CoaX。
26.權利要求24的方法,其中缺失CoaX并下調(diào)CoaA。
27.權利要求24的方法,其中CoaX和CoaA均被下調(diào)。
28.以上任何一項權利要求的方法,其中所述微生物在絲氨酸過量的條件下培養(yǎng)。
29.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括在絲氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑的微生物,使泛酸產(chǎn)生。
30.以上任何一項權利要求的方法,其中所述微生物的泛酸生物合成途徑被去調(diào)節(jié)以致泛酸的產(chǎn)生不依賴于β-丙氨酸的飼喂。
31.以上任何一項權利要求的方法,其中微生物為革蘭氏陽性微生物。
32.以上任何一項權利要求的方法,其中微生物為芽孢桿菌屬微生物。
33.以上任何一項權利要求的方法,其中微生物為枯草芽孢桿菌。
34.根據(jù)以上任何一項權利要求的方法合成的產(chǎn)物。
35.包含根據(jù)以上任何一項權利要求的方法生產(chǎn)的泛酸的組合物。
36.用于提高泛酸產(chǎn)量的重組微生物,所述微生物具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑。
37.用于提高泛酸產(chǎn)量的重組微生物,所述微生物具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑。
38.權利要求36或37的微生物,其還具有降低的泛酸激酶活性。
39.權利要求36-38任何一項的微生物,所述微生物為革蘭氏陽性微生物。
40.權利要求36-38任何一項的微生物,所述微生物屬于芽孢桿菌屬。
41.權利要求36-38任何一項的微生物,所述微生物為枯草芽孢桿菌。
42.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括在致使微生物于培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少30g/l泛酸的條件下培養(yǎng)重組微生物,其中所述重組微生物具有(a)去調(diào)節(jié)的panB基因;(b)去調(diào)節(jié)的panD基因;和(c)至少一個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶編碼基因。
43.權利要求42的方法,其中所述微生物還具有去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑,且所述微生物在可使微生物于培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸的條件下培養(yǎng)。
44.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括在絲氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因;和(b)去調(diào)節(jié)的panD基因;從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
45.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因;(b)去調(diào)節(jié)的panD基因;和(c)去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑;從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
46.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因;(b)去調(diào)節(jié)的panD基因;和(c)去調(diào)節(jié)的glyA基因;從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
47.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因;(b)去調(diào)節(jié)的panD基因;和(c)突變、缺失或破壞了的purR基因;從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
48.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因;(b)去調(diào)節(jié)的panD基因;和(c)去調(diào)節(jié)的serA基因;從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
49.用于生產(chǎn)泛酸的方法,包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因;(b)去調(diào)節(jié)的panD基因;(c)去調(diào)節(jié)的serA基因;(d)去調(diào)節(jié)的glyA基因;從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用具有修飾的泛酸生物合成酶活性以及具有修飾的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶活性的微生物提高泛解酸和泛酸產(chǎn)量的改良方法。尤其是,本發(fā)明公開了通過增加直接或間接有助于關鍵性中間體酮泛解酸合成的酶或底物藉以提高酮泛解酸的水平,從而來提高期望產(chǎn)品的產(chǎn)量的方法。也公開了重組微生物和用于培養(yǎng)所述微生物的條件。此外還公開了由此類微生物產(chǎn)生的組合物。
文檔編號C12N1/20GK1639349SQ02829266
公開日2005年7月13日 申請日期2002年7月3日 優(yōu)先權日2002年7月3日
發(fā)明者R·R·約卡姆, T·A·帕特森, J·G·佩羅, T·赫爾曼 申請人:巴斯福股份公司