專(zhuān)利名稱(chēng)：柯薩奇病毒a10核酸檢測(cè)用引物、探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)涉及柯薩奇病毒AlO核酸檢測(cè)用引物、探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒AlO (coxsackievirusAlO,簡(jiǎn)稱(chēng)CVA10)為單股正鏈RNA病毒，屬小RNA病毒科(Picoranviridae),根據(jù)其分子遺傳特征，CVAlO屬于人類(lèi)腸道病毒A類(lèi)(humanenterovirus A,簡(jiǎn)稱(chēng)HEV-A)。CVAlO作為人類(lèi)感染性疾病的一種病原，能引起多種疾病，如手足口病、皰疹性咽峽炎及脫甲病等。手足口病的一種主要病原體人類(lèi)腸道病毒71 (humanenterovirus 71,簡(jiǎn)稱(chēng)HEV71)已在亞太地區(qū)流行了十多年,在中國(guó)大陸自1998年以來(lái)一直以C4基因型循環(huán)傳播。然而，在近幾年爆發(fā)的幾起手足口病中，除了主要病原體HEV71外，還有多種人類(lèi)腸道病毒參與感染，其中CVAlO就是常見(jiàn)的一種。并且，近幾年CVAlO開(kāi)始在 歐洲流行，且有在全球流行并引起流行病爆發(fā)的可能。如2008芬蘭爆發(fā)的手足口病，2010法國(guó)爆發(fā)的皰疹性咽峽炎和手足口病都以CVAlO和CVA6為主，CVAlO還引起了 2008年西班牙的手足口病的流行，并引發(fā)了脫甲病。另外，健康人群人類(lèi)腸道病毒隱性感染的調(diào)查結(jié)果顯示HEV-A表現(xiàn)出高度的流行，其中CVAlO是其中之一。我國(guó)深圳地區(qū)近幾年手足口病的病原學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，CVAlO的感染比例表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。CVAlO的感染一年四季均可發(fā)生，其主要通過(guò)糞-口途徑在人群中傳播,帶毒的糞便可通過(guò)污染的手、餐具、食物經(jīng)口進(jìn)入人體，咳嗽、打噴嚏形成的飛沫可直接或間接進(jìn)行傳播，另外，接觸病人破潰的皰疹液等也受到感染。CVAlO作為一種潛在的威脅，為了更好地應(yīng)對(duì)CVAlO的感染所引發(fā)的疾病流行，提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)顯的尤為重要。本發(fā)明選擇柯薩奇病毒AlO的VPl基因設(shè)計(jì)用于熒光RT-PCR檢測(cè)的引物及探針序列，建立了柯薩奇病毒AlO熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，反應(yīng)結(jié)束即可根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)判定是否感染柯薩奇病毒A10。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于柯薩奇病毒AlO實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物、探針及試劑盒。本發(fā)明在分析已報(bào)道的柯薩奇病毒AlOVPl基因序列基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)引物及熒光探針，所述的引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列分別如SEQ ID No: I和SEQID No:2 所示。本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，該探針一端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料。其中，報(bào)告熒光染料可以采用下列熒光基團(tuán)中的任意一種FAM、HEX、TET, JOE、ROX和CY5，淬滅熒光染料可采用下列熒光基團(tuán)中的任意一種TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2 和 BHQ3。根據(jù)TaqMan技術(shù)，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記有兩個(gè)熒光染料基團(tuán)的核苷酸探針，例如將報(bào)告熒光染料標(biāo)記在探針的5’端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3’端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報(bào)告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用減弱，報(bào)告熒光染料信號(hào)增強(qiáng)。在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中，探針同模板上的目的擴(kuò)增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴(kuò)增延伸階段將探針切斷，淬滅突光染料的抑制作用消失，報(bào)告突光染料信號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)柯薩奇病毒AlO核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述正向弓丨物和反向引物。優(yōu)選地,試劑盒還包括上述探針。優(yōu)選地，試劑盒還包括實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)液，與所述正向引物、反向引物和探針共同構(gòu)成實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系，25 μ I所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系的配置為2XOneStep RT-PCR Buffer 12. 5 μ 1，10 μ M 所述正向引物 I. 5 μ 1，10 μ M 所述反向引物 1·5μ 1，10μΜ 所述探針 0·5μ 1，Rox Reference Dye II (50 X) 0· 5 μ 1，5U/μ I Ex TaqHS O. 5 μ 1,40U/ μ IPrimeScript RT enzyme Mix O. 5 μ I, RNA 5 μ I, RNase Free dH202· 5 μ I。優(yōu)選地，試劑盒的檢測(cè)反應(yīng)條件為50°C反轉(zhuǎn)錄20min，95 V變性3min，以950C 15s，60°C 40s (收集熒光信號(hào)FAM)擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。當(dāng)然，可以根據(jù)本發(fā)明給出的引物對(duì)或者其擴(kuò)增產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)其他類(lèi)型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測(cè)。本發(fā)明根據(jù)柯薩奇病毒AlOVPl基因序列設(shè)計(jì)引物及熒光探針，該引物特異性強(qiáng)，用于熒光PCR檢測(cè)的靈敏度高。用本發(fā)明引物及探針，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，能夠快速簡(jiǎn)單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A10,而且檢測(cè)準(zhǔn)確性高、靈敏度高，因此能夠?yàn)榭滤_奇病毒AlO感染的相關(guān)疾病診斷提供科學(xué)依據(jù)。


圖I是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)柯薩奇病毒AlO核酸檢測(cè)的特異性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :引物及探針的設(shè)計(jì)和合成比對(duì)并分析GenBank中分離自全球的柯薩奇病毒AlO的同源VPl基因序列，利用生物軟件01igo7. O分別在其保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和Taqman探針,利用在線(xiàn)的OligoAnalyzer
3.I分析其Hairpin, Self-Dimer和AG值,并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast程序進(jìn)行特異性驗(yàn)證。所設(shè)計(jì)的引物及探針序列為CVA10-F457 (正向引物)5，-ATGTACGTGCCCCCTGGTGCC-3，；即 SEQ ID No: ICVA10-R705 (反向引物)5’ -TCGCACTGCAAAGGTGCCCATCAT-3’ ；即 SEQ ID No:2CVA10-P493 (探針)FAM-AGGGATGCCTTTCAATGGCAAACAGCAAC-TAMRA ；即 SEQ IDNo :3 ;該探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料TAMRA。實(shí)施例2 =RNA的提取病毒樣品RNA的抽提使用High Pure Viral RNA KU，步驟按其操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體的操作步驟如下I)向200 μ I的上清液中加入400 μ I的Binging Buffer,混勻后將混合液轉(zhuǎn)入裝有過(guò)濾管的收集管，8000 Xg離心15s ；2)將過(guò)濾管置于新的收集管中，向?yàn)V管中加500 μ I Inhibitor Removal Buffer,8000 X g 離心 Imin ；3)將過(guò)濾管置于新的收集管中，向?yàn)V管中加450 μ I Wash Buffer，8000X g離心Imin ；4)將過(guò)濾管置于新的收集管中，再一次向?yàn)V管中加450 μ I Wash Buffer, 8000X g離心Imin ； 5)將過(guò)濾管置于新的收集管中，9300 Xg離心15s ；6)將過(guò)濾管置于新的離心管中，向離心管中加入50μ I的Elution Buffer,8000 X g離心Imin從而得到純凈的病毒RNA。病毒細(xì)胞培養(yǎng)物和皰疹液按上述方法直接提??；糞便樣品、肛拭子和咽喉拭子需經(jīng)過(guò)預(yù)處理，在抽提前需加O. OlM PBS, PH7. 5，其中，O. 5g糞便樣品(O. 5ml液態(tài)糞便)加5mLPBS，然后將懸液12000 Xg離心lOmin，取上清液進(jìn)行RNA抽提，用50 μ I DEPC水洗脫，于-80°C保存。實(shí)施例3 :Real-timeRT-PCR擴(kuò)增方法的建立I、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系以RNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)用試劑購(gòu)自TaKaRa)。熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系如下表
_Μ_25μ1體積終濃度
2xOne Step RT-PCR Buffer12.5,Li!Ix
正向引物和反向引物(10 μΜ)各1.5μ1各0.6μΜ
探計(jì)(ΙΟμΜ)0.5μ 0.2 μΜRox Reference Dye !I (50χ)0.5μ1Ix
Ex Taq HS{5 U/μΙ)0.5μ 2.5U
PrimeScript RT enzyme Μ χ(40 /μ!)0.5μ120 U
_RNA_5μΙ_
RNase FreedH2O Ιμ\2、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)條件將樣品管放入ABI公司7500熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)50°C反轉(zhuǎn)錄20min，95°C變性3min,以95°C 15s，60。。40s (收集熒光信號(hào)FAM)擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)判定結(jié)果。實(shí)施例4 :柯薩奇病毒AlO核酸Real-time RT-PCR方法的特異性確定選取4株已確定型別的CVA10毒株和8株其他腸道病毒血清型(HEV71、coxsackievirusA6> coxsackievirus A 16、 coxsackievirus A5、 coxsackievirus A4、coxsackievirus A2> coxsackievirus BI 和 echoviurs 16),利用建立起的突光 RT-PCR 反應(yīng)體系對(duì)這12株毒株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖I所示，4株CVAlO病毒(編號(hào)為CVA10-SZ73，CVA10-SZ75, CVA10-SZ89，CVA10-SZ94)均出現(xiàn)相應(yīng)的特異性熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)，而其他8株人類(lèi)腸道病毒則均沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生，在圖I中顯示為一平直的線(xiàn)，判為陰性。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物探針只對(duì)目的病毒(即，CVA10)特異，與其它檢測(cè)對(duì)象無(wú)交叉反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果以柯薩奇病毒AlO的RNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)可觀察到明顯的熒光強(qiáng)度變化，而其他病毒的熒光強(qiáng)度沒(méi)有變化。實(shí)施例5 :靈敏度實(shí)驗(yàn)將柯薩奇病毒AlO體外轉(zhuǎn)錄RNA用DEPC處理的水分別稀釋?zhuān)M(jìn)行相對(duì)靈敏度檢測(cè)，在25 μ I反應(yīng)體系中，RNA分別被稀釋成I. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. OX IO2、 I.OX IO1拷貝數(shù)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，可以看出，檢測(cè)限度低至為10個(gè)模板拷貝數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種柯薩奇病毒AlO核酸檢測(cè)用引物，由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列分別如 SEQ ID No: I 和 SEQ ID No:2 所示。
2.一種與權(quán)利要求I所述引物配合使用的探針，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，該探針一端標(biāo)記有報(bào)告突光染料，另一端標(biāo)記有淬滅突光染料。
3.如權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于該探針5’端標(biāo)記有FAM熒光染料，3’端標(biāo)記有TAMRA熒光染料。
4.含有權(quán)利要求I所述正向引物和反向引物的試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于還包括權(quán)利要求2或3所述的探針。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還包括實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)液，與所述正向引物、反向引物和探針共同構(gòu)成實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系，25 μ I所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系的配置為2XOne Step RT-PCR Buffer 12. 5 μ 1，10 μ M所述正向引物I. 5 μ 1，10 μ M所述反向引物 I. 5 μ 1，10 μ M所述探針O. 5 μ I, Rox Reference Dye II (50X)0. 5 μ 1，5U/μ I Ex Taq HS 0. 5 μ 1,40U/μ I PrimeScript RT enzyme Mix O. 5 μ I,RNA 5 μ I,RNaseFree dH20 2· 5 μ I。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測(cè)反應(yīng)條件為50°C反轉(zhuǎn)錄 20min，95°C變性 3min,以 95V 15s，60。。40s 擴(kuò)增 45 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒A10核酸檢測(cè)用引物、探針及試劑盒，所述引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。所述試劑盒包括所述正向引物和反向引物。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物特異性好，靈敏度高，用本發(fā)明引物及探針，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，能夠快速簡(jiǎn)單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A10，而且檢測(cè)準(zhǔn)確性高、靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102827952SQ20121031971
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者何雅青, 陳龍 申請(qǐng)人:何雅青, 陳龍