專利名稱：：流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種rRT-PCR檢測技術，尤其涉及一種流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法。
背景技術：
：流感病毒基因組由8條負鏈RNA節(jié)段構成。根據(jù)核蛋白(NP)和基質蛋白(M)不同分為A型、B型、C型。A型流感病毒根據(jù)表面血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同分為16個HA亞型和9個NA亞型；B型和C型流感病毒不分亞型。A型常引起世界性大流行；B型、C型則以局部暴發(fā)和散發(fā)流行為特征。2009年3月，墨西哥和美國先后發(fā)現(xiàn)了甲型H1N1流感病毒感染病例，至2009年5月21日，全球己經有42個國家出現(xiàn)甲型H1N1流感確診病例，確診病例超過l萬，感染人數(shù)呈不斷上升趨勢。目前的數(shù)據(jù)顯示，該病毒已經具備了人際傳播的能力，人群對該病毒的免疫低下，因此病毒在人際之間的傳播能力較普通流感病毒強。甲型H1N1流感潛伏期一般1至7天，早期癥狀與普通流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等，有些還會出現(xiàn)腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等。部分患者病情來勢兇猛、突然高熱、體溫超過39'C，甚至繼發(fā)嚴重肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、休克及Reye綜合征、呼吸衰竭及多器官損傷，最后導致死亡。甲型流感H1N1亞型病毒的基因核酸序列與季節(jié)性流感病毒H1N1接近，病原的診斷需要采用較為復雜和繁瑣的基因序列測定，難以在普通實驗室進行。現(xiàn)有技術中，采用的流感病毒檢測方法為雞胚病毒分離培養(yǎng)方法，靈敏度高。上述現(xiàn)有技術至少存在以下缺點操作費時、需3周時間，而且對實驗室的要求也比較高。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、應用方便的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，包括以下一種或多種引物和探針甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性弓I物和探針；所述甲型流感病毒特異性引物和探針針對甲型流感病毒M基因相對保守區(qū)；所述兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針針對新甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)；所述新甲型流感病毒特異性引物和探針針對新甲型流感病毒NP基因相對保守區(qū)。本發(fā)明的應用上述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR試劑盒加入所述引物和探針進行核酸擴增；之后，根據(jù)Ct值判斷rRT-PCR檢測結果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。由上述本發(fā)明提供的技術方案可以看出，本發(fā)明所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法，由于包括針對甲型流感病毒M基因、新甲型H1N1流感病毒HA基因、新甲型流感病毒NP基因相對保守區(qū)引物和探針，可以通過rRT-PCR法檢測流感病毒，操作簡單、應用方便。具體實施例方式本發(fā)明的流感病毒rRT-PCR(real-timeRT-PCR)檢測引物和探針，其較佳的具體實施方式是，包括以下一種或多種引物和探針甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性引物和探針；所述甲型流感病毒特異性引物和探針針對甲型流感病毒M基因相對保守區(qū)；所述兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針針對新甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)；所述新甲型流感病毒特異性引物和探針針對新甲型流感病毒NP基因相對保守區(qū)。所述引物和探針可以包括長度為1928bp的寡核苷酸片段；其中，針對M基因和HA基因的探針與目的基因負鏈的堿基序列一致，針對NP基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。所述甲型流感病毒特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3，；5，-GGGCATTYTGGACMAKCGTCTACG-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMARA3，；第一組所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-ACATTCGAAGCAACTGGAAA-3，；5，-GTRTTRCAATCGTGGACTGG-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TCCATTGCGAAKGCATATCTCGG-BHQ1-3';第二組所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-GGGTAAARCTGGAATCRACAA-3，；5，-CCAGGGAGACTAMCAGTACCA-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TTGGCGATCTAYTCAACTGYCGCC--朋Ql-3，；一所述新甲型流感病毒特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-TCMGACATGCGAACRGAAGTT-3，；5，-GGGYTCGTTGCCTTTTCGT-3，；探針序列5，HEX-CCAGAAGATTTGTCCTTCCA--BHQ1-3，。上述探針序列兩端的標記FAM、TAMARA、BHQ1、HEX為熒光素標記。本發(fā)明應用上述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，其較佳的具體實施方式是，包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR試劑盒加入所述引物和探針進行核酸擴增；所述流感病毒可以包括以下一種或多種病毒甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。本發(fā)明中的引物和探針序列(5'—3')及其檢測的靶片段如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具體實施例包括了寡核苷酸引物的設計、待檢樣本的處理、檢測和分析。為進一步說明流感病毒rRT-PCR檢測引物及應用方法，參照下列實施例進行說明實施例一甲型流感病毒H1N1rRT-PCR寡核苷酸引物的設計與合成GenBank數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/ge畫es/FUJ/FLU.html)中禾口中國國家流感中心病毒序列數(shù)據(jù)庫中下載豬源流感病毒H1N1和甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1等亞型M基因、NP基因和HA基因全序列，軟件比對分析所有甲型流感病毒M基因序列的一致性，選擇相對保守區(qū)設計引物和探針；將豬源H1N1、新甲型H1N1和季節(jié)性甲型流感病毒H1N1所有NP基因和HA基因序列放在一起比對，選擇相對保守區(qū)設計引物和探針。引物和探針設計中允許同一變異位點允許2個及2個以下簡并堿基。將所提取的備選引物滿足以下要求進行篩選①探針長度L在1928bp之間；②Tm值在4259'C之間；③GCM在2575%之間；④polyN《4bp;⑤Hairpin《4bp;覆蓋率>90%;⑦進行BLAST篩選，特異性分數(shù)〉LX0.4。最佳Tm值設定在47'C，最佳探針長度為20-25bp。實施例二本發(fā)明檢測未知病毒的應用舉例1.病毒RNA的提取取病毒采樣液200uL，加入500uL裂解液，按RNeasyMiniKit(Qiagen公司，catalogtt74104)說明書提取病毒RNA50uL。2.rRT-PCR反應1)體系配置使用QIAGENQuantiTectTMProberRT-PCRKit(catalog#20443)反應液組分體(Hi)積2xQuantiTectProbeRT-PCRMasterMix上游引物(40uM)下游引物(40uM)Probe(10pM)QuantiTectRTMix病毒核酸/RNARNaseFreeH2012.50.50.50.50.255.0Upto252)rRT-PCR:將加好上述反應體系的反應管放于PCR儀進行rRT-PCR，反應程序如下6(TC作用5分鐘；5(TC作用30分鐘；95。C作用15分鐘；9fC變性15秒；50。C退火30秒；72。C延伸30秒；回到第5步，45個循環(huán)。3.結果判斷陰陽對照結果成立的情況下判斷結果，及陰性參照沒有Ct值，而陽性參照有Ct值。一般情況的下Ct小于38的可以判斷為陽性。本發(fā)明提供了4套用于甄別甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒的特異性寡核苷酸引物及探針序列；并提供了rRT-PCR的檢測體系及其在流感病毒快速檢測中的應用。檢測評價特異性評價共選取國內近三年流行季節(jié)性流感病毒H1N1亞型20株進行檢測，qFluA均能檢出，而qSW-m-1、qSW-Hl-2和qS麗P均不能檢出；選取10株豬流感病毒H1N1亞型、2株新甲型流感病毒H1N1亞型進行檢測，四對引物和探針均能檢出；選取甲型流感病毒H3N2進行檢測，除qFluA檢測為陽性外，其余三對檢測均為陰性；選取B型流感病毒進行檢測，四對引物檢測均為陰性。靈敏性評價用來自美國血凝單位為32HA/50WL的H1N1毒株(A/California/09/2009)200uL提取RNA50uL，10倍梯度稀釋顯示靈敏性達到10—5-10—7稀釋度。本發(fā)明可以將rRT-PCR技術應用于新甲型H1N1流感病毒(豬流感)的甄別、檢測體系中。為新甲型H1N1流感病毒的實驗室診斷提供了有效的檢測技術，為新甲型H1N1流感病毒的早發(fā)現(xiàn)、早預防和早治療以及公共衛(wèi)生策略的制定提供技術手段和檢測依據(jù)。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內?！?10〉中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所<120〉流感病毒RT-PCR檢測引物及檢測流感病毒的方法〈160〉12〈210〉1<211〉22<212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉甲型流感病毒特異性引物〈400〉1gaccratcctgtcacctctgac〈210>2〈211〉25〈212〉■〈213>人工序列〈220〉〈223〉甲型流感病毒特異性引物〈400〉2gggcattytggacaaakcgtctacg<210〉3〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220>〈223〉甲型流感病毒特異性探針〈400〉3tgcagtcctcgctcactgggcacg〈210〉4〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物<400>4acattcgaagcaactggaaa〈210〉5<211>20〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物〈400〉5gtrttrcaatcgtggactgg〈210〉6〈211〉23<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性探針<400〉6tccattgcgaakgcata/tctcgg<210>7<211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物〈400>7gggt333rctgg33tCr3C33<210>8<211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220><223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物<400〉8ccagggagactamcagtacca〈210>9<211>24<212〉麗A<213〉人工序列<220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性探針〈400〉9ttggcgatctaytcaactgycgcc〈210〉10<211〉21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223>新甲型流感病毒特異性引物〈400〉10tcmgacatgcgaacrgaagtt〈210〉11〈211〉19<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉新甲型流感病毒特異性引物<400>11gggytcgttgccttttcgt〈210〉12〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型流感病毒特異性探針<400〉12ccagaagatttgtccttcca09-05-22關閉窗權利要求1、一種流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，包括以下一種或多種引物和探針甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性引物和探針；所述甲型流感病毒特異性引物和探針針對甲型流感病毒M基因相對保守區(qū)；所述兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針針對新甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)；所述新甲型流感病毒特異性引物和探針針對新甲型流感病毒NP基因相對保守區(qū)。2、根據(jù)權利要求1所述的流感病毒RT-PCR檢測引物，其特征在于，所述引物和探針包括長度為1928bp的寡核苷酸片段；其中，針對M基因和HA基因的探針與目的基因負鏈的堿基序列一致，針對NP基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。3、根據(jù)權利要求2所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于所述甲型流感病毒特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3，；5，-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMARA3，；第一組所述新甲型HlNl流感病毒m特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-ACATTCGAAGCAACTGGAAA-3，；5，-GTRTTRCAATCGTGGACTGG-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TCCATTGCGAAKGCATATCTCGG-BHQ1-3，；第二組所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-GGGTAAARCTGGAATCRACAA-3，；5，-CCAGGGAGACTAMCAGTACCA-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TTGGCGATCTAYTCAACTGYCGCC—BHQ1-3，；所述新甲型流感病毒特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5'-TCMGACATGCGAACRGAAGTT-3，；5，-GGGYTCGTTGCCTTTTCGT-3';探針序列5，HEX-CCAGAAGATTTGTCCTTCCA—BHQl-3，。4、根據(jù)權利要求3所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，所述探針序列兩端的標記FAM、TAMARA、BHQ1、HEX為熒光素標記。5、一種應用權利要求l至4任一項所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，其特征在于，包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR試劑盒加入所述引物和探針進行核酸擴增；之后，根據(jù)Ct值判斷rRT-PCR檢測結果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。6、根據(jù)權利要求5所述的檢測流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一種或多種病毒甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。全文摘要本發(fā)明公開了一種流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法，包括甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性引物和探針等，4種共12條寡核苷酸引物和探針序列，同時公開了待檢樣本的處理、rRT-PCR反應體系及反應條件、結果分析。能快速有效的甄別甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。操作簡單、應用方便，為臨床診斷、檢驗檢疫等領域的流感疫情早期預警機制提供了可行的技術支持。文檔編號C12R1/93GK101560574SQ20091008547公開日2009年10月21日申請日期2009年5月22日優(yōu)先權日2009年5月22日發(fā)明者李德新,李曉丹,溫樂英,偉王,王大燕,舒躍龍,高榮保申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所