專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)染色體易位的寡核苷酸探針和引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)使用核酸探針進(jìn)行的核酸的檢測(cè)。
通過(guò)使用特定的核酸(RNA或DNA)探針，可檢測(cè)明顯感染的核酸分子和其它疾病狀態(tài)。某些遺傳疾病的特征是存有在正常組織中不應(yīng)存有的基因。其它病理狀態(tài)的特征是表達(dá)在正常細(xì)胞中不表達(dá)的RNAs或RNA轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物(即肽或蛋白)。某些疾病狀態(tài)的特征是缺少某些基因或基因部份，或者缺少或交替表達(dá)基因產(chǎn)物或蛋白。
一種特別重要的細(xì)胞是由染色體易位造成的已經(jīng)成為畸變細(xì)胞(可能是癌)的正常細(xì)胞。因此希望能夠檢測(cè)具有染色體易位的細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)染色體組型技術(shù)能鑒別已發(fā)生染色體易位的細(xì)胞。然而，通過(guò)原位雜交的方法來(lái)完成鑒定是有利的，因?yàn)檫@通過(guò)流式細(xì)胞光度術(shù)可使大量細(xì)胞得到較快的分析。這種雜交技術(shù)需要專(zhuān)用于只有當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生易位時(shí)才存在的核酸的探針、護(hù)增引物或引物組。實(shí)際上，核酸技術(shù)已經(jīng)用于檢測(cè)由染色體易位而產(chǎn)生的核酸(M.J.Embleton等人;上述引證;Fritsch等人，U.S.P.4725536;Stephenson等人U.S.P.4681840)。
當(dāng)探針靶是DNA時(shí)，該靶通常是雙鏈靶一個(gè)“反義”鏈，由該鏈RNA(如mRNA)被轉(zhuǎn)錄，另一個(gè)“有意義鏈”，它在堿基序列中對(duì)反義鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。這樣就可以假定，對(duì)于所給定數(shù)量的細(xì)胞DNA靶，采用包括針對(duì)靶的有意義鏈和反義鏈的兩個(gè)探針，可加倍由靶結(jié)合探針產(chǎn)生的信號(hào)。
然而一般說(shuō)來(lái)，如果探針群體不僅含有與靶的一個(gè)鏈互補(bǔ)的分子而且還含有與靶的另一個(gè)鏈互補(bǔ)的分子，則存在雜交效率(加到試驗(yàn)體系中每μg探針?biāo)玫降陌薪Y(jié)合探針量)降低的趨勢(shì)。在努力于盡可能短時(shí)間內(nèi)達(dá)到靶飽和的過(guò)程中，一個(gè)特別可行的途徑是增加總的探針濃度，這種效率降低顯然主要是由于存在探針?lè)肿酉嗷ルs交的傾向，因此產(chǎn)生高分子量聚集體。在本發(fā)明中，進(jìn)行了適當(dāng)?shù)臏y(cè)量，結(jié)果是當(dāng)探針群體具有針對(duì)有意義鏈探針和針對(duì)反義鏈探針時(shí)，雜交效率幾乎不或根本不降低。
適用于設(shè)計(jì)向雙鏈靶雜交的探針群體的一些原則也適用于設(shè)計(jì)僅向存在于已發(fā)生染色體易位的細(xì)胞中的RNA或DNA分子雜交的探針?lè)肿踊蛞锓肿?。這類(lèi)探針利用了由于產(chǎn)生易位接合點(diǎn)而存在的新的堿基序列的優(yōu)越性，在該接合點(diǎn)處，兩個(gè)正常染色體片段已連接形成易位染色體。
一方面，本發(fā)明涉及專(zhuān)門(mén)雜交于RNA或DNA的核酸探針或引物，該RNA或DNA跨越已發(fā)生染色體易位的細(xì)胞中的核酸易位接合點(diǎn)。
本發(fā)明的另一方面，形成一種核酸探針群體，使得盡管某些探針?lè)肿幽軌螂s交于雙鏈靶的一個(gè)鏈且其它的探針?lè)肿幽軌螂s交于該靶的另一個(gè)鏈，但探針?lè)肿硬粫?huì)相互雜交。最佳的是有一系列可在該靶的各鏈上以端對(duì)端方式雜交的探針。通過(guò)限制探針?lè)肿拥拇笮〔⑾拗迫我鈨蓚€(gè)探針?lè)肿娱g互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度來(lái)避免探針群體的自雜交。


圖1標(biāo)記了Gen Bank序列HUMREPA84核苷酸101-400，且表明核苷酸101位于該序列的5′端而核苷酸400位于3′端。與核苷酸101-400之間的序列互補(bǔ)的序列中的核苷酸示于被補(bǔ)充的那些核苷酸之下。該圖給出了五個(gè)探針(H18-100L、H18-100R、H18-110R、H18-10和H18-11)的核苷酸序列。
圖2為表示用于實(shí)施例3中的探針間的關(guān)系圖。
圖3a為用實(shí)施例4中探針HYR-7-25所得結(jié)果的顯微相片。
圖3b為用實(shí)施例4中探針HYR-7-12所得結(jié)果的顯微相片。
定義“分析物分子”為設(shè)計(jì)檢測(cè)試驗(yàn)的分子。
“擴(kuò)增分子”為使用擴(kuò)增方法生成的核酸分子(如，PCR、3SR、TAS)。其或具有與全部或部分RNA分析物分子互補(bǔ)的堿基序列或具有與全部或部分RNA分析分子相同的堿基序列。
“探針”為一含有寡核苷酸且通常還含有報(bào)導(dǎo)物部分的分子，該報(bào)導(dǎo)物可被檢測(cè)，該寡核苷酸可雜交于一擴(kuò)增RNA分子。報(bào)導(dǎo)物部分(也稱(chēng)為可檢測(cè)標(biāo)記)可放射性的、熒光的、化學(xué)發(fā)光的、酶(如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、或其它催化比色反應(yīng)的酶)、或?yàn)榭蓪?zhuān)門(mén)與直接連接到可檢測(cè)部分的配體特性結(jié)合分子(諸如抗生蛋白鏈菌素)反應(yīng)的配體(諸如生物素或半抗原，可與抗體反應(yīng)的地谷新配基)，該可檢測(cè)部分例如為放射性的、熒光的、化學(xué)發(fā)光的，或酶。
如果“Watson-Crick”堿基配對(duì)規(guī)則限定了兩個(gè)核苷酸序列間的關(guān)系即無(wú)論何處，在一個(gè)序列中有一鳥(niǎo)嘌呤(G)而在另一序列中有一胞嘧啶(C)，且無(wú)論何處，在一個(gè)序列中有一腺嘌呤(A)而在另一序列中或有一胸腺嘧啶(T)或有一尿嘧啶(V)，則第一核苷酸序列與第二核苷酸序列“互補(bǔ)”。
“雜種”是由兩個(gè)核酸分子形成的一個(gè)雙鏈的(或部分雙鏈的)分子，其中一個(gè)核酸分子具有與另一分子中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
當(dāng)由兩個(gè)因易位會(huì)合的染色體片段形成一新的染色體時(shí)，這兩個(gè)片段會(huì)合所在點(diǎn)為“染色體易位接合點(diǎn)”。
“核苷酸序列”一詞意在包括這樣一序列，其中存在有某種非磷原子(如硫)處于核苷間磷通常出現(xiàn)的一些位置。
“易位跨越接合點(diǎn)細(xì)胞RNA分子”為含有兩個(gè)核苷酸序列的細(xì)胞RNA分子(諸如hnRNA或mRNA分子)，這兩個(gè)序列是鄰接的且連接在該分子的RNA易位接合點(diǎn)處，一個(gè)核苷酸序列由染色體易位接合點(diǎn)一側(cè)的一部分染色體轉(zhuǎn)錄，而第二個(gè)核苷酸序列由該染色體接合點(diǎn)另一側(cè)的一部分染色體轉(zhuǎn)錄。例如，采用易位跨越接合點(diǎn)hnRNA分子的細(xì)胞處理便可在細(xì)胞中產(chǎn)生易位跨越接合點(diǎn)mRNA分子。
“易位跨越接合點(diǎn)細(xì)胞RNA片段”為含有兩個(gè)核苷酸序列的細(xì)胞RNA分子(諸如hnRNA或mRNA分子)片段，這兩個(gè)序列相鄰接且連接在該分子的RNA易位接合點(diǎn)處，一個(gè)核苷酸序列由染色體易位接合點(diǎn)一側(cè)的一部分染色體轉(zhuǎn)錄，而第二個(gè)核苷酸序列由該染色體接合點(diǎn)另一側(cè)的一部分染色體轉(zhuǎn)錄。
“易位跨越接合點(diǎn)細(xì)胞DNA分子”為含有兩個(gè)核苷酸序列的細(xì)胞DNA分子，這兩個(gè)序列相互對(duì)接以使形成的序列長(zhǎng)度等于它們各自的長(zhǎng)度之和，一個(gè)核苷酸序列位于其易位接合這一側(cè)的部分染色體上，而第二核苷酸序列位于該接合點(diǎn)另一側(cè)的部分染色體上。
“易位跨越接合細(xì)胞DNA片段”為細(xì)胞DNA分子片段，該片段具有兩個(gè)核苷酸序列，這兩個(gè)序列彼此對(duì)接以使形成的序列長(zhǎng)度等于它們各自的長(zhǎng)度之和，一個(gè)核苷酸序列位于其易位接合點(diǎn)一側(cè)的部分染色體上，而第二核苷酸序列位于該接合點(diǎn)另一側(cè)的那部分染色體上。
在詞組“易位跨越接合點(diǎn)細(xì)胞核酸片段或其擴(kuò)增復(fù)本”中，“擴(kuò)增復(fù)本”包括具有與所述核酸片段的堿基序列等同(將U看做RNA，同樣將T看做DNA)或互補(bǔ)的堿基序列的片段。
“易位跨越接合點(diǎn)擴(kuò)增核苷酸分子”為含有一與跨越接合點(diǎn)細(xì)胞核酸分子或片段互補(bǔ)的核苷酸序列的擴(kuò)增核酸分子。
“易位跨越接合點(diǎn)細(xì)胞核酸分子”或?yàn)椤耙孜豢缭浇雍宵c(diǎn)細(xì)胞RNA分子”或?yàn)榭缭浇雍宵c(diǎn)細(xì)胞DNA分子”。
“易位跨越接合點(diǎn)細(xì)胞核酸片段”或?yàn)椤耙孜豢缭浇雍宵c(diǎn)細(xì)胞RNA片段”或?yàn)椤翱缭浇雍宵c(diǎn)細(xì)胞DNA片段”的分子片段。
“引物”為被諸如DNA聚合酶的酶(如，在聚合酶鏈反應(yīng)中，“RCR”)或逆轉(zhuǎn)錄酶(如，3SR法，Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，vol87，pp 1874-1878(1990))擴(kuò)展成較長(zhǎng)分子的寡核苷酸。
“易位跨越接合點(diǎn)引物”為具有與跨越接合點(diǎn)RNA片段互補(bǔ)或相同的核苷酸序列的引物。
“原位”一詞用來(lái)描述發(fā)生在細(xì)胞或基本完整的病毒內(nèi)部的過(guò)程(如，諸如PCR或3SR的雜交或擴(kuò)增);該細(xì)胞或病毒常常已經(jīng)過(guò)交聯(lián)或沉淀固定劑處理，其中許多(而不是全部)在本文中有命名。
“易位跨越接合點(diǎn)探針”為具有與跨越接合點(diǎn)RNA片段互補(bǔ)或相同的核苷酸序列的探針。
用于本文中的“生物實(shí)體”或?yàn)榧?xì)胞，或?yàn)椴《尽?br> “分子群體”指許多分子。由于探針及引物分子長(zhǎng)度可小至20-50個(gè)核苷酸，且其加入反應(yīng)混合物的濃度在100ng-10μg或(若有必要?jiǎng)t)更高的范圍內(nèi)，故該分子數(shù)量常常很大。
“分子均質(zhì)群體”指在群體中的每一分子與其它各分子相同。
短語(yǔ)“含有一核苷酸序列的分子，該核苷酸序列與或?yàn)橐孜豢缭浇雍宵c(diǎn)細(xì)胞核酸片段的或?yàn)槠鋽U(kuò)增復(fù)本的核苷酸序列20-50核苷酸但不大于20-50的核苷酸互補(bǔ)”指的是，那些不為跨越接合點(diǎn)序列部分的序列可為該分子的一部分。
跨越接合點(diǎn)探針或引物的設(shè)計(jì)在本發(fā)明中，當(dāng)跨越接合點(diǎn)引物或探針雜交于細(xì)胞中一跨越接合RNA分子時(shí)，便在該探針不會(huì)與非跨越接合分子雜交的條件下(溫度、時(shí)間、離子強(qiáng)度等)發(fā)生了雜交作用。通過(guò)適當(dāng)選擇該引物或探針的長(zhǎng)度，并按照下面的規(guī)則選擇適當(dāng)?shù)碾s交條件，可實(shí)現(xiàn)這一選擇性雜交過(guò)程。該規(guī)則為對(duì)任意一對(duì)單鏈分子來(lái)說(shuō)，若一個(gè)分子自身內(nèi)部具有與該第二分子內(nèi)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且那兩個(gè)核苷酸序列都為N核苷酸長(zhǎng)(二者分子的總長(zhǎng)度可大于N)，則僅當(dāng)N長(zhǎng)于某臨界值時(shí)，該分子會(huì)形成雜種。該臨界值部分取決于雜交條件(溫度、所選溶劑等)且部分取決于該互補(bǔ)序列的核苷酸組成。
變換雜交條件和/或該探針?lè)肿拥膲A基序列，便可變換N的臨界值。采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可確定任意雜交條件與靶序列組合態(tài)下的臨界值，從而實(shí)施本發(fā)明的方法。
N必須超過(guò)一鄰界值的事實(shí)構(gòu)成了檢測(cè)包含結(jié)合點(diǎn)的核酸序列的基礎(chǔ)。正常細(xì)胞的核酸應(yīng)具有這一序列的雙重部分，但這兩部分不連接。因此，若該探針與接合點(diǎn)一側(cè)的不大于N-1核苷酸的序列(或者優(yōu)選不大于N-3核苷酸的序列)互補(bǔ)并與該接合點(diǎn)另一側(cè)的不大于N-1核苷酸的序列(或優(yōu)選為不大于N-3核苷酸的序列)互補(bǔ)，該探針便不會(huì)與正常細(xì)胞核苷酸雜交。
優(yōu)選的是，易位跨越接合點(diǎn)的探針或引物具有與長(zhǎng)度為20-50核苷酸(更佳長(zhǎng)度為20-35核苷酸)的易位跨越接合點(diǎn)片段的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。較佳的是，對(duì)采用如下所述的探針L6-26和K28-26的情形而言，與該探針或引物互補(bǔ)的一半跨越接合點(diǎn)片段應(yīng)在含該片段的易位接合點(diǎn)的一側(cè)(意為其另一半應(yīng)在該接合點(diǎn)的另一側(cè))。
重疊探針應(yīng)用規(guī)則來(lái)建立能夠與分析物分子的雙鏈形成雜種的探針群體。
應(yīng)考慮到，對(duì)任一對(duì)單鏈分子來(lái)說(shuō)，如果在一個(gè)分子自身內(nèi)部具有與第二分子內(nèi)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且這兩個(gè)核苷酸序列均為N核苷酸長(zhǎng)(二者分子的總長(zhǎng)主工可大于N)，則僅當(dāng)N大于某一臨界值時(shí)該分子會(huì)形成雜種。該臨界值部分取決于雜交條件(溫度、溶劑選擇等)還部分取決于互補(bǔ)序列的核苷酸組成。
可看出，下面實(shí)施例列舉的實(shí)驗(yàn)中的該臨界值介于12-23之間。在這些實(shí)施例中，通過(guò)使探針?lè)肿拥拈L(zhǎng)度為約24核苷酸且不使任一對(duì)探針?lè)肿拥腘超過(guò)12，便獲得用于雜交到雙鏈靶上的有效探針群體。該群體所以有效，是因?yàn)槠淇色@得雙倍于用只向單鏈雜交的探針?biāo)@得的那樣大的信號(hào)。
變換雜交條件和/或該探針?lè)肿拥膲A基序列，便可變換N的臨界值。這可從本文所包括的實(shí)施例中證實(shí)。然而，采用按照下面給出的規(guī)則所做的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可以確定任意組雜交條件下的臨界值，從而實(shí)施本發(fā)明的方法。
一方面，本發(fā)明為一種用于檢測(cè)雙鏈核酸靶的方法，該方法包括的步驟為(1)使該靶鏈充分分離以使其各自與互補(bǔ)核苷酸序列的核酸探針雜交;
(2)將充分分離的靶鏈與一核酸探針群體共培養(yǎng)，該核酸探針群體包含與一個(gè)靶鏈呈核苷酸序列互補(bǔ)的分子和與另一個(gè)靶鏈呈核苷酸序列互補(bǔ)的分子;及(3)檢測(cè)與靶分子雜交的核酸探針?lè)肿舆M(jìn)行步驟(2)所處的條件應(yīng)使得各靶鏈與與該呈核苷酸序列互補(bǔ)的核酸探針?lè)肿有纬呻s種;
要使得對(duì)于每一核酸探針?lè)肿拥暮塑账嵝蛄衼?lái)說(shuō)，在靶內(nèi)存有全部的互補(bǔ)序列;
要使得每一核酸探針?lè)肿优c至少一個(gè)另外的核酸探針?lè)肿映屎塑账嵝蛄械牟糠只パa(bǔ);
要使得不應(yīng)有兩個(gè)核酸探針?lè)肿颖舜说暮塑账嵝蛄型耆パa(bǔ);
要使得在一個(gè)核酸探針?lè)肿拥囊徊糠峙c另一核酸探針?lè)肿映屎塑账嵝蛄谢パa(bǔ)之處，那一部分的長(zhǎng)度短到在步驟(2)的條件下不能與其它核酸探針?lè)肿与s交。
“核苷酸序列”一詞意在包括有在核苷間磷通常出現(xiàn)的一些位置存在一些非磷原子(如硫)的部分的序列。在這一狀況下，與核苷酸序列互補(bǔ)的兩個(gè)分子可替換為與核苷序列互補(bǔ)或與核苷酸序列互補(bǔ)。
通常用可檢測(cè)標(biāo)記(如放射性32P、諸如熒光素的染料分子、或可進(jìn)入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的部分)來(lái)標(biāo)記探針?lè)肿印?br> 在本方法的一個(gè)總實(shí)施方案中，兩個(gè)靶鏈位于或?yàn)榧?xì)胞或?yàn)椴《镜纳飳?shí)體中。該細(xì)胞或病毒可懸浮于溶液中但不固定在固體承載物上。另一方面，該細(xì)胞或病毒可固定在固體承載物上。該細(xì)胞或病毒可為部分組織切片。
含有靶核酸分子的細(xì)胞可為真核細(xì)胞(如人體細(xì)胞)、原核細(xì)胞(如細(xì)菌)、植物細(xì)胞、或其它類(lèi)型細(xì)胞。它們可為諸如酵母的簡(jiǎn)單真核生物或可衍生物復(fù)雜真核生物(諸如人體)。
核酸的靶鏈可在無(wú)包被病毒或包被病毒(具有諸如脂質(zhì)蛋白膜的無(wú)包被膜)中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，探針群中的多個(gè)分子或直接地或通過(guò)交聯(lián)劑分子各個(gè)共價(jià)連接到一熒光染料分子上。
在該方法中，兩個(gè)靶鏈可為純化核酸。他們可能取自病毒、細(xì)胞或多細(xì)胞機(jī)體。
在該方法的步驟(2)中可將兩靶鏈固定在固體承載物(諸如硝化纖維素紙或尼龍片)上。任選地，該靶鏈也可在溶液中而不固定在固體承載物上。
在該方法中，靶鏈可為DNA。靶鏈也可為RNA，如對(duì)其中在一個(gè)單細(xì)胞內(nèi)可同時(shí)存在互補(bǔ)RNA鏈的病毒(如人體免疫缺乏病毒)的情形即是如此。
病毒核酸靶可為部分病毒，在此情形下該病毒可在或可不在細(xì)胞內(nèi)部。任選地，病毒核酸靶可不為病毒部分，但可在細(xì)胞內(nèi)部。
在本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，探針?lè)肿泳哂泻塑账嵝蛄校允沟萌粼摪墟湹囊粋€(gè)鏈為探針?lè)肿铀柡?，則在探針?lè)肿又g不含有形成缺隙的未雜交的靶鏈序列。
優(yōu)選的是，每一探針?lè)肿优c存在于至少一個(gè)另外的探針?lè)肿又械拈L(zhǎng)度不小于約12核苷酸而不大于約100核苷酸的一個(gè)序列互補(bǔ)。
更佳的是，每一探針?lè)肿优c存在于至少一個(gè)其它的探針?lè)肿又械拈L(zhǎng)度不小于約12核苷酸而不多于約20核苷酸的一個(gè)序列互補(bǔ)。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，每一探針?lè)肿优c存在于至少一個(gè)其它探針?lè)肿又械募s12核苷酸長(zhǎng)度的序列互補(bǔ)。
優(yōu)選每一探針的長(zhǎng)度介于約15-100核苷酸。更佳的是，每一探針的長(zhǎng)度介于約15-40核苷酸。
該方法中，與另一探針?lè)肿踊パa(bǔ)的探針?lè)肿硬糠值拈L(zhǎng)度優(yōu)選不少于約12核苷酸而不大于約100核苷酸。更佳的是，與另一探針?lè)肿踊パa(bǔ)的探針?lè)肿硬糠值拈L(zhǎng)度不少于約12核苷酸而不多于約20核苷酸。在本方法的一個(gè)最為優(yōu)選的實(shí)施方案中，該與另一探針?lè)肿踊パa(bǔ)的探針?lè)肿硬糠旨s為12核苷酸長(zhǎng)。
在上述方法的具體實(shí)施方案中，該雙鏈靶具有第一靶鏈和第二靶鏈，且其中在核苷酸序列中與第一靶鏈互補(bǔ)的探針?lè)肿泳哂薪Y(jié)構(gòu)不同于與第二靶鏈互補(bǔ)的探針?lè)肿由系目蓹z測(cè)標(biāo)記的可檢測(cè)標(biāo)記。例如，在于核苷酸序列中與第一靶鏈互補(bǔ)的探針?lè)肿由系目蓹z測(cè)標(biāo)記可為熒光染料，而在與第二鏈互補(bǔ)的探針?lè)肿由系目蓹z測(cè)標(biāo)記也可為熒光染料。在一特殊的實(shí)施方案中，其中雙鏈靶為DNA靶，在核苷酸序列中與第一靶鏈互補(bǔ)的探針?lè)肿右苍诤塑账嵝蛄兄信c細(xì)胞的RNA分子互補(bǔ)。表明后一特殊實(shí)施方案有效的實(shí)施例中，在所關(guān)心的靶細(xì)胞內(nèi)可能有一雙鏈DNA病毒染色體組(或-RNA病毒染色體組的逆轉(zhuǎn)錄酶DNA復(fù)制)，且若確實(shí)存在有這樣一染色體組，則可能有或可能沒(méi)有從這一染色體組轉(zhuǎn)錄的RNA。從臨床的觀(guān)點(diǎn)看，不僅了解DNA染色體組是否存在具有意義，而且了解該染色體組是否被表達(dá)為mRNA或染色體組的其它RNA復(fù)制也具有臨床意義。若沒(méi)有病毒mRNA(或其它RNA)存在，則由作用于反意義鏈的探針檢測(cè)的核酸的量應(yīng)等于由作用于意義鏈的探針檢測(cè)的核酸量。若還存在有病毒mRNA，則由作用于DNA意義鏈的探針檢測(cè)的核酸量超過(guò)由作用于DNA反意義鏈的探針檢測(cè)的核酸量。這種超額是因?yàn)橛衜RNA的存在。確實(shí)，通過(guò)標(biāo)定作用于已知量的病毒RNA及病毒DNA的探針，便可得知由給定量的雜交探針?lè)懦龅臒晒饬?，便可用這一結(jié)果計(jì)算存在于試驗(yàn)樣品中的病毒RNA及病毒DNA的量(總質(zhì)量)，且還可根據(jù)RNA及DNA靶的分子量計(jì)算每一試驗(yàn)樣品繼而每一細(xì)胞的RNA分子復(fù)制數(shù)目及病毒DNA的復(fù)制數(shù)目。
如果實(shí)施例4和7的計(jì)劃接續(xù)使用各帶四個(gè)氟的30鏈節(jié)，且如果在載玻片上與細(xì)胞雜交，并且如果用足夠的30鏈節(jié)覆蓋靶的雙鏈，則應(yīng)該能夠檢測(cè)單細(xì)胞中靶的單復(fù)制，即使該靶短至750堿基對(duì)，可用眼睛通過(guò)顯微鏡觀(guān)察到熒光，或當(dāng)靶短至75-150堿基對(duì)時(shí)用象分析裝置觀(guān)測(cè)到。
該雙鏈靶可為細(xì)胞DNA、細(xì)胞RNA、病毒DNA、或病毒RNA。
本發(fā)明除具有多種方法外，在此還涉及核酸探針群體，包括所有具體的及優(yōu)選的實(shí)施方案，均公開(kāi)在這些方法的使用當(dāng)中。
相關(guān)的發(fā)明為用于本發(fā)明上述方法中的探針群體。此處的核酸探針群體為一例，其中
1)每一探針?lè)肿娱L(zhǎng)度在約15核苷酸至約100核苷酸之間。
2)在核苷酸序列中沒(méi)有完全與其它探針?lè)肿踊パa(bǔ)的探針?lè)肿?，以?)在核苷酸序列中每個(gè)探針?lè)肿优c至少1個(gè)其它探針?lè)肿邮遣糠莼パa(bǔ)的。
使用跨越接合點(diǎn)的探針可檢測(cè)的疾病和易位實(shí)例表A是可使用本發(fā)明檢測(cè)的疾病類(lèi)型的說(shuō)明。但這并不是試圖限制能用本發(fā)明檢測(cè)的疾病和易位的類(lèi)型。
易位的跨越接合點(diǎn)的核苷酸序列或是已公開(kāi)，或是可通過(guò)使用用于已公開(kāi)序列的技術(shù)而被確定。
表A公知易位的實(shí)例t(2;8)(p11;q24)Burkitt淋巴瘤(Fujino et al.,Jpn. J. CancerRes.,vol 77,pp 24-77(1986)t(11;14)(q13;q32) 慢性淋巴細(xì)胞白血病(Y.Tsujimoto et al.,NAture,vol 315,pp 340-343(1985)t(7;9)(q34;q34.3)急性T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病(T.C.Reynoldset al.,Cell,vol 50,107-117(1987)t(14;14)(q11;q32) T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(M.P.Davey etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol 85,pp9287-9291(1988)t(8;14)(q24;q32)Burkitt 淋巴瘤(F.G.Haluska et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.,USA,vol 84,pp 6835-6839(1987))t(10;14)(q24;q11) T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(M.Zutter etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol 87,pp 3161-3165(1990)
t(9;14)(p13;q32) 擴(kuò)散大細(xì)胞淋巴瘤(H.Ohmo et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,vol 87,pp 628-632(1990))t(1;14)(p33;q11) 白血病細(xì)胞(8)(C.G.Begley et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,vol 86,pp 2031-2035(1989))t(X;18)(p11.2;q11.2) 滑膜肉瘤(X-Y易位) X連鎖的隱性軟骨發(fā)育異常點(diǎn)(punctata)(47,XY,+del(s)(q12,q34),t(15;21)(q21;q22) 急性成髓細(xì)胞白血病(AML)47,XY,+del(s)(q12,q34) 急性非淋巴細(xì)胞性白血病(ANLL)t(8;14)(q24;q11) 急性淋巴母細(xì)胞白血病(T-ALL)t(8;14)(q24;q11) 白血病/淋巴瘤13(q11) 其它各ALL(近基的de115q) Prader-Willi綜合征t(1;15)(p36.2;p11.2) 擴(kuò)散性肌肉張力減退(X;5)(p11.2;q35.2) 色素失調(diào)癥(2q13) 橫紋肌肉瘤t(16;21)(q11;p11) 三體性16pt(1;19) 前B細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病t(15;17) 急性前髓細(xì)胞白血病(APL)t(1;7)(p11;p11) 急性骨髓白血病或脊髓發(fā)育不良(8q24 14q32) Burkitt's淋巴瘤Bcl-2t(11;14)(q13;q32) Bcl-1t(14;18)(q32;q21) Hodgkin淋巴瘤(NHL)
t(8;14)(q24;q32) 淋巴小結(jié)組織學(xué)型t(3;22)(q24;q11) 類(lèi)Burkitt淋巴瘤t(11;14)(q13;q32) 擴(kuò)散的大細(xì)胞淋巴瘤t(9;22)(q34;q11) 慢性骨髓單核細(xì)胞白血病W/(Ph)t(4;6)(p15;p12) 慢性骨髓單核細(xì)胞白血病W/(Ph)inv(3)(q21;q26) 頑固性貧血t(3;3)(q21;q26) RAEB-Tinv(3)(q21 q26) 伴隨骨髓外化生的骨髓纖維變性(MMM)3p上損傷 腎細(xì)胞癌(RCC)(3;21)(q26;q22) 繼發(fā)性白血病t(3;21)(q26.3;q22) 急性骨髓白血病5q35 兒童期Malignant組織細(xì)胞增多病t(5;6)(q35;q21)t(2;13)(q37;q14) 橫紋肌肉瘤(RMS)(Y;11)(q11.2;q24) Jacobsen綜合征t(X;18)(p11;q11) 二階級(jí)和一階段滑膜肉瘤t(X;15;18)(p11;q15;q11) "t(X;7)(q11-12;q32) "14q32(28%)或14q11(14%) 成人期T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤t(19;22)(q13.3;p11.2) 遠(yuǎn)基19q在染色體*11和22之間*易位* 神經(jīng)上皮瘤+der(1q9p) 骨髓組織增殖紊亂切斷點(diǎn)在Xp22和Xq28 平衡的X-常染色體11q23 成人期急性骨髓白血病
13q的畸變或三體性13 7q和1q三體性1 1qt(8;14)(q24;q32) Burkitt型白血病t(9;22)(q34;q11) Philadelphia+All(PhL+ALL)X;6 q15-16 先天性急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)(8;21) 頑固性貧血46,XY,der(5)t(5;11)(p15.2;p14)[11p15]Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)11p15,fus(14p;21p),以及fus(15p;21p)骨巨細(xì)胞瘤(GCT)11q13 多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤形成1型(MEN1)t(7;22)(p22;q13) 與inv(16)(p13q22)急性非淋巴細(xì)胞性白血病相關(guān)(M4)46,XY/46,XY,t(7;19)(q22;p13.3) 急性骨髓單核細(xì)胞白血病(FAB M4)46,XY/46,XY,t(7;19)(q11;q13) 兒童期A(yíng)LL46,XY,t(3q;11q),t(7q;19p),t(15;17)(q26;q22)ANLL(FABM3)'2探針核酸探針可以是DNA，RNA，或寡核苷酸或由DNA或RNA組成的多核苷酸。該DNA或RNA主要成份可為腺苷，尿苷，胸苷，鳥(niǎo)嘌呤，胞嘧啶或其任何天然可人造化學(xué)衍生物。該探針能夠通過(guò)一種或多種化學(xué)鍵，通常通過(guò)氫鍵形式連接到互補(bǔ)的或鏡象靶細(xì)胞的遺傳序列上。
核酸探針在加入雜交溶液之前可以被可檢測(cè)地標(biāo)記。也就是說(shuō)，可選擇連接到雜交產(chǎn)物上的可檢測(cè)標(biāo)記。探針可用任何用于實(shí)施本發(fā)明的可檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記。這種可檢測(cè)基團(tuán)可以是任何具有可檢測(cè)物理或化學(xué)特性的物質(zhì)。這種可檢測(cè)標(biāo)記在免疫學(xué)領(lǐng)域中已被深入地研究，并且一般說(shuō)來(lái)多數(shù)用于這些方法的任何標(biāo)記均可用于本發(fā)明。特別有用的是酶活性基團(tuán)，例如酶(參看Clin，Chem.，22∶1243(1976))，酶底物(見(jiàn)British Pat.Spec.1548741)，輔酶(見(jiàn)U.S.Patents Nos.4230797和4238565)和酶抑制物(見(jiàn)U.S.Patent No 4134792);熒光劑(見(jiàn)Clin.Chem.，25∶353(1979));發(fā)色團(tuán);發(fā)光劑例如化學(xué)發(fā)光劑和生物發(fā)光劑(見(jiàn)Clin.Chem.，25∶512(1979));特定可連接配體;近端的相互作用對(duì);以及放射性同位素如3H，35S，32P，125I和14C。術(shù)語(yǔ)“核酸探針”被認(rèn)為是包括以任何方式，包括以上述方式被標(biāo)記的核酸。
生物素標(biāo)記的核苷酸可通過(guò)斷口轉(zhuǎn)譯，酶解法或化學(xué)方法摻入DNA或RNA。生物素化的探針在雜交后使用抗生物素蛋白/鏈狀抗生物素蛋白，熒光的，酶解的或膠態(tài)金接合加以檢測(cè)。核酸還可以用其它熒光化合物，用可免疫檢測(cè)的熒光衍生物或用生物素的類(lèi)似物標(biāo)記。核酸也可借助于連接蛋白質(zhì)來(lái)標(biāo)記。還可使用交聯(lián)到放射性或熒光組蛋白HI上，酶(堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶)上，或單鏈結(jié)合(ssB)蛋白質(zhì)上的核酸。為了提高檢測(cè)膠態(tài)金或過(guò)氧化物酶產(chǎn)物的敏感性，可使用一些采用銀溶液的強(qiáng)化或擴(kuò)增步驟。
也可利用間接的熒光免疫細(xì)胞化學(xué)步驟(Rudkin and Stollar(1977)Nature 265∶472;Van Prooijen等人(1982)Exp.Cell.Res.141∶397)。通過(guò)向動(dòng)物注射多(rA)-多(dT)增高了多克隆抗體抗RNA-DNA雜種的能力。將DNA探針原位雜交到細(xì)胞上，而雜種通過(guò)用抗RNA-DNA雜種的抗體進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)。
探針的光生物素TM標(biāo)記對(duì)于生物素標(biāo)記而言是較佳的。
核酸探針可用來(lái)針對(duì)各種病毒的、原核的和真核的核酸靶子。這些發(fā)明的探針群體的靶子通常是DNA靶子，例如基因(如致癌基因)，控制成份(如啟動(dòng)子，阻遏物，或強(qiáng)化因子)，染色體的易位連接點(diǎn)，或?qū)说鞍左wRNA、轉(zhuǎn)移RNA或RN酶P編碼的序列。任選地，該靶子可以是任何核酸靶子，或是RNA或是DNA，它包括兩個(gè)互補(bǔ)的靶核苷酸序列中的一個(gè);它例如在希望用特性序列或其補(bǔ)體檢測(cè)任何DNA或mRNA分子的場(chǎng)合就是該種情況。如在易位的跨越接合點(diǎn)的分子的情況下，或病毒RNA序列及其RNA補(bǔ)體在同一細(xì)胞中存在的情況下，該靶子可以是RNA。
由各實(shí)施例可以看出，任何所希望序列的探針均可制作。
當(dāng)靶子是提純的核酸時(shí)提純的核酸在本文中被認(rèn)為是已從細(xì)胞提取，或認(rèn)為是已在異位的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中合成。為將探針雜交到該提純的核酸上，已公開(kāi)了許多方法。在通常情況下，如果靶子是DNA分子，那么在雜交步驟發(fā)生之前通過(guò)加熱或其它方法將其鏈分離。雜交可采取良好制定的步驟用固定在固態(tài)載體(如DNA用硝化纖維素紙，RNA用尼龍)上的靶子進(jìn)行。該探針可以以與下述原位實(shí)驗(yàn)標(biāo)記探針相同的方法而被標(biāo)記;或以其它可檢測(cè)的方法對(duì)它們進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于實(shí)驗(yàn)這些實(shí)驗(yàn)而言，標(biāo)記的方法不限。如果已知一標(biāo)記步驟適用于針對(duì)提純核酸靶的探針，則可預(yù)料該標(biāo)記步驟適用于打向雙鏈的情況下的探針群。
在細(xì)胞，組織和流體中的靶子對(duì)于在液態(tài)懸浮液中的，在玻片或其它固態(tài)載體上的細(xì)胞中的，在組織培養(yǎng)細(xì)胞中的，以及在組織切片中的生物實(shí)體內(nèi)的靶子可進(jìn)行雜交試驗(yàn)。當(dāng)生物實(shí)體是細(xì)胞時(shí)，它可取自固態(tài)組織(例如骨髓，神經(jīng)，肌肉，心臟，皮膚，肺，腎，胰，脾，淋巴結(jié)，睪丸，子宮頸，以及腦)或存在于襯在各種道，導(dǎo)管和腔體(例如胃腸道，尿道，輸精管，子宮腔，子宮管，陰道，呼吸道，鼻腔，口腔，咽，喉，氣管，支氣管和肺)的膜內(nèi)的細(xì)胞或有機(jī)體流體(例如尿，胃液，痰，血液和淋巴液)或糞便中的細(xì)胞。
當(dāng)靶子在生物實(shí)體中時(shí)可能的雜交條件的兩份很有用的說(shuō)明記載在
發(fā)明者N·普拉沙, M·布里克, M·L·庫(kù)比治, M·阿斯加里, C·L·里丁, W·D·韋伯, S·-C·祝, J·布里澤 申請(qǐng)人:阿普羅精內(nèi)斯有限公司, 得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)評(píng)議會(huì)