專利名稱：用白細(xì)胞介素-4抑制人免疫缺陷病毒復(fù)制的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用白細(xì)胞介素-4抑制HIV在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞中復(fù)制的方法。
人免疫缺陷病毒(HIV)在1983年最早被鑒定為獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)的病原體。隨后對該病毒的結(jié)構(gòu)和功能有了很多的了解。此外，已證明HIV定居在T輔助淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞中[Ho等，NewEngl.J.Med.321(24)1621(1989)]。遭受HIV感染到艾滋病發(fā)作之間的平均間隔時間約為8-11年[Lifson等，J.Infect.Dis.1581360(1988)]。這么長的潛伏期表明HIV的復(fù)制至少部分受限于宿主因子。
單核巨噬細(xì)胞在艾滋病的發(fā)病機(jī)理中起顯著作用。這些細(xì)胞屬于最先受到HIV感染的細(xì)胞。它們還是病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺及淋巴結(jié)中的主要貯主;是病毒在被感染的患者體內(nèi)不同組織間和各個體間傳播的潛在載體;是控制疾病進(jìn)展速度和程度的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞[Gendelman等，AIDS3475(1989)]。影響病毒在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的宿主因子(例如干擾素，IFN)，可能是限制病毒生長和延緩HIV疾病發(fā)生的主要因素。
巨噬細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺和淋巴結(jié)中的主要病毒貯主，這一事實表明，抑制病毒在這些特定細(xì)胞中復(fù)制的治療方法可能對病毒的數(shù)量和疾病的進(jìn)展有重大影響[Gendelman等，J.Immunol.1452669(1990)]。
白細(xì)胞介素-4(IL-4)是一種淋巴因子，它所具有的性質(zhì)代表了免疫識別誘導(dǎo)型淋巴因子的許多特征[Paul，Blood77(9)1859(1991)]。IL-4在小鼠體內(nèi)主要負(fù)責(zé)對各種誘發(fā)Ig類而啟動所說Ig類表達(dá)的刺激物作出反應(yīng)而產(chǎn)生IgE[Finkelman等，Ann.Rev.Immunol.8303(1990)]。對IL-4的最早描述是基于它能夠增強(qiáng)受抗IgM抗體刺激的純化靜止小鼠B淋巴細(xì)胞的DNA合成[Howard等，J.Exp.Immunol.155914(1982)]。
亦已證實，IL-4作用于靜止B細(xì)胞而誘導(dǎo)Ⅱ類MHC分子的表達(dá)[Noelle等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816149(1984)]，并增強(qiáng)該細(xì)胞對抗IgM抗體的后續(xù)反應(yīng)性[Rabin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA822935(1985);Oliver等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA822465(1985)]。
人IL-4是以分子量為15，000～19，000道爾頓的各種不同形式存在的糖蛋白?，F(xiàn)已獲得了編碼小鼠和人IL-4的cDNA[Lee等，同上;Noma等，同上;Yokota等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA835894(1986)]。
IL-4對T淋巴細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞有強(qiáng)烈的效應(yīng)。經(jīng)IL-4處理的靜止T細(xì)胞可在培養(yǎng)物中存活而不發(fā)生分裂[Hu-Li等，J.Exp.Med.165157(1987)]。IL-4還以各種方式作用于非淋巴樣造血細(xì)胞。已證明IL-4抑制巨噬細(xì)胞的生長[McInnes等，J.Exp.Med.167598(1988);Jansen等，J.Exp.Med.170577(1989)]并增加這些細(xì)胞對某些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性[Crawford等，J.Immunol.139135(1987)]。
已經(jīng)證明目前用AZT、ddI和ddC治療HIV感染的方法不是很有效。因此，需要有更好的方法治療HIV感染。
本發(fā)明通過提供這樣一種方法而滿足了上述需要。更具體地說，本發(fā)明提供了一種治療HIV感染的方法，包括給感染HIV的病人施用治療有效量的IL-4。
附

圖1是用各種劑量的IL-4抑制單核細(xì)胞中HIV復(fù)制的圖示說明，參考圖1則更易于理解本發(fā)明。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)都全文并入本文作參考。
本發(fā)明涉及HIV感染和由HIV感染引起的所有病癥(例如艾滋病)的治療方法。能夠用本發(fā)明方法進(jìn)行治療的病癥在本文中定義為包括由表現(xiàn)為一項或多項下列標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)病狀態(tài)和發(fā)病程度(1)HIV病毒(和/或HIV抗體)血清陽性，或者是利用顯微鏡評估能在白細(xì)胞分離物中鑒別出存在細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒;(2)本領(lǐng)域中普遍理解的慢性淋巴結(jié)病;(3)血液T輔助細(xì)胞計數(shù)＜400/mm3;(4)在遲發(fā)性超敏反應(yīng)方面存在可證實的部分缺陷;(5)對遲發(fā)性超敏皮膚試驗完全不發(fā)生反應(yīng)和/或出現(xiàn)鵝口瘡。
除了滿足上述條件外，當(dāng)病人對機(jī)會感染如隱球菌性腦膜炎、組織胞漿菌病、結(jié)核病、弓形體病或PCP(卡氏肺囊蟲性肺炎)敏感時，則認(rèn)為病人已發(fā)展到“艾滋病”階段。[Redfield等，“HIVInfectionTheClinicalPicture”，TheScienceofAIDS，同上，p63-73]。
上面列出的癥狀是說明將用于確定所提出的候選治療方法的具體選擇標(biāo)準(zhǔn)。治療效果可通過監(jiān)測上述疾病的臨床表現(xiàn)的減輕來進(jìn)行評估。此外，通過測定感染細(xì)胞分離物上清液中的反轉(zhuǎn)錄酶含量可監(jiān)測病毒復(fù)制的抑制作用，這種抑制作用可以預(yù)示疾病的進(jìn)展。據(jù)確認(rèn)，急性期感染表現(xiàn)為病毒顆粒的高血清滴度[Coombs等，NewEngl.J.Med.321(24)1626(1989)]。
本文所用的術(shù)語“HIV”定義為包括HIV-1和HIV-2兩者。
如本文所示，本發(fā)明的方法抑制了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞中的HIV復(fù)制。但是，對其它類型細(xì)胞中的病毒復(fù)制可能也有影響，還可能影響免疫系統(tǒng)或其它系統(tǒng)。理解IL-4作用的確切機(jī)理對于本發(fā)明不是必要的。
IL-4可以從許多商業(yè)來源獲得，例如購自GenzymeCorporation，Cambridge，MA.，也可以通過已知方法利用天然來源或重組DNA技術(shù)制備IL-4[Sheehan等，Immunol.142884(1989);Starnes等，J.Immunol.1454185(1990)]。
另外，以已知的IL-4核苷酸順序為基礎(chǔ)的寡核苷酸探針混合物可以用于鑒別用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的基因組或cDNA文庫中的編碼IL-4的DNA。如此鑒別的DNA可用限制性核酸內(nèi)切酶裂解法從文庫中切除，或利用適當(dāng)?shù)囊锖途酆厦告湻磻?yīng)(PCR)法制備[Saiki等，Science239487(1988)]，然后測序，并在真核表達(dá)系統(tǒng)或(如果需要的話用標(biāo)準(zhǔn)方法缺失內(nèi)含子后)在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。當(dāng)然，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)克隆法而不是應(yīng)用寡核苷酸探針或PCR可對cDNA和基因組DNA文庫進(jìn)行篩選。如此產(chǎn)生的IL-4通過已知方法如免疫化學(xué)法或生物測定法進(jìn)行檢測。
所用的IL-4優(yōu)選人重組IL-4。也可以優(yōu)選應(yīng)用糖基化的IL-4(例如，在真核表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組IL-4)。
本發(fā)明的一些實施方案中，IL-4與一種或多種已知對HIV有效的其它藥劑配伍給藥，這些藥劑的例子有3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧胸腺嘧啶核苷(AZT)、2′，3′-二脫氧胞嘧啶核苷(ddC)或2′，3′-二脫氧肌苷(ddI)。
本發(fā)明使用的藥物組合物可以凍干形式供應(yīng)，然后在臨用前在可藥用載體如磷酸鹽緩沖鹽溶液或任何其它公知載體中復(fù)原。本發(fā)明的藥物組合物可以用靜脈注射法、或通過靜脈點滴液如林格氏乳酸鹽，直接注入血流中?？梢詰?yīng)用的非胃腸制劑包括無菌溶液或混懸液。這些制劑可用常規(guī)的可藥用賦形劑和添加劑(如穩(wěn)定劑和載體)制備。待用溶液可以由凍干粉復(fù)原而來，這些凍干粉可能還含有如防腐劑、緩沖劑和分散劑。組合物優(yōu)選通過靜脈注射施用。
根據(jù)本發(fā)明，對需要進(jìn)行HIV感染治療的病人施用有效量的IL-4以獲得上述結(jié)果?？墒┯玫娜談┝渴羌s0.001μg/kg體重至約50μg/kg體重。更優(yōu)選的日劑量范圍是約0.01-10μg/kg體重，最優(yōu)選的日劑量范圍是約0.05-2μg/kg體重。IL-4的精確用量將由主治醫(yī)生在考慮疾病的病因和疾病嚴(yán)重程度、病人的狀況、年齡及其它因素后決定。
實施例本發(fā)明將通過下面的非限制性實施例進(jìn)行說明。
方法與材料從HIV和乙型肝炎血清陰性供體取出白細(xì)胞后，從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中回收單核細(xì)胞，并通過對血細(xì)胞的富含單核白細(xì)胞部分進(jìn)行對流離心淘析而純化單核細(xì)胞。通過Wright染色的細(xì)胞涂片的細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)、顆粒狀過氧化物酶和非特異性酯酶，測知所得細(xì)胞懸液有＞98%的單核細(xì)胞。單核細(xì)胞作為粘附細(xì)胞單層(7.5×10-5/24mm組織培養(yǎng)孔)在添加了10%熱失活A(yù)+人血清、50μg/kg慶大霉素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和1000單位/ml重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)(Cetus Corp.，Emeryville，CA)的0.5ml DMEM(78-176AJ配方，GIBCO，Grand Island，NY)中培養(yǎng)。利用Ficoll-diatrizoate(Pharmacia LKB，Piscataway，NJ)密度梯度離心從全血中分離出的PBMC以1×106個活細(xì)胞/ml的密度在加有5μg/ml植物血凝素(PHA)(Sigma)、10%純化的人IL-2(Advanced Biotechnologies Inc.，Columbia，MD)和15%熱失活胎牛血清(FCS)(Sterile Systems，Logan，UT)的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)中培養(yǎng)。
經(jīng)PHA/IL-2處理的單核細(xì)胞，以0.01細(xì)胞培養(yǎng)物ID50/靶細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)，與最初在單核細(xì)胞(AIDS Research and Reference Regeant Program，AIDS Program，NAID，NIH)中分離和傳代的4個HIV臨床株(GG、YU-2、SM和ADA)接觸。經(jīng)M-CSF處理的單核細(xì)胞在用作靶細(xì)胞之前以粘附單層形式培養(yǎng)7-10天。所有培養(yǎng)物都每2-3天更換一次新鮮培養(yǎng)基。
為了測定反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性，將培養(yǎng)上清液的雙份平行樣本加入到NONIDET P-40(Sigma)、多聚(rA)寡聚(dT)(Pharmacia，Piscataway，NJ)、二硫蘇糖醇(Pharmacia)、MgCl2和[α-32P]dTTP(400居里/毫摩爾，Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)的反應(yīng)混合物中，于37℃反應(yīng)24小時。將混合物加到色譜紙上，空氣中干燥，用0.3M NaCl-0.03M檸檬酸鈉(pH7.4)洗5次，再用95%乙醇洗2次。干燥并分割色譜紙，用液體閃爍計數(shù)法進(jìn)行放射性計數(shù)。用HTL VⅢB作為RT活性的陽性對照。
未感染或HIV感染的PBMC在存在或不存在IL-4的情況下于塑料基質(zhì)上培養(yǎng)。根據(jù)與質(zhì)膜相連的和液泡內(nèi)的HIV篩選細(xì)胞，以確定培養(yǎng)物中HIV感染的存在。在培養(yǎng)物上清液的等份試樣中也如上所述測定RT活性。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，對HIV感染細(xì)胞進(jìn)行IL-4處理導(dǎo)致感染后病毒復(fù)制出現(xiàn)劑量依賴性降低。這可由圖1看出，其中的病毒復(fù)制抑制作用表現(xiàn)為，與未處理的感染培養(yǎng)物(對照)相比，經(jīng)IL-4處理的培養(yǎng)物上清液中的放射標(biāo)記RT的出現(xiàn)減少。在21天培養(yǎng)期間的許多個時間點測定RT水平。感染21天后，10單位/mlIL-4顯著抑制RT活性。該作用通過培養(yǎng)物上清液中可測出的RT活性的降低來確定。
IL-4的抑制作用是自由可逆的。從培養(yǎng)體系中除去IL-4，病毒復(fù)制水平(RT活性)就上升至未處理的HIV感染單核細(xì)胞所達(dá)到的水平。
通過用抗IL-4的單克隆抗體進(jìn)行預(yù)處理，證實了IL-4對病毒復(fù)制抑制作用的特異性(數(shù)據(jù)未示出)。在這些實驗中，用抗IL-4抗體預(yù)處理的培養(yǎng)物中未觀察到對病毒復(fù)制的抑制作用。還注意到，用培養(yǎng)基中的人血清成分代替胎牛血清導(dǎo)致抗病毒反應(yīng)降低，這可能是因為胎牛血清含有大量已知能上調(diào)節(jié)HIV基因表達(dá)的其它組成成分，而這些成分在人血清中沒有發(fā)現(xiàn)。
在不違背本發(fā)明要旨和范圍的情況下可對本發(fā)明作出許多修改和變動，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。本文所描述的具體實施方案僅僅是舉例，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的限定。
權(quán)利要求
1.一種治療HIV感染的方法，該方法包括給感染HIV的患者施用有效量的IL-4。
2.一種制備用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，該方法包括將IL-4與一種可藥用載體混合。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中IL-4是重組人IL-4。
4.一種用于治療HIV感染的藥物組合物，該組合物包含IL-4和一種可藥用載體。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中IL-4是重組人IL-4。
6.IL-4在治療HIV感染中的用途。
7.IL-4在制備用于治療HIV感染的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求6或7的用途，其中IL-4是重組人IL-4。
全文摘要
本發(fā)明提供治療患者HIV感染的方法，包括給感染了HIV的患者施用治療有效量的IL-4。
文檔編號C12N15/24GK1086437SQ9311643
公開日1994年5月11日 申請日期1993年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月19日
發(fā)明者J·許瓦茲 申請人:先靈公司