專利名稱：一種抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
囊膜病毒侵染細(xì)胞時，首先必須將病毒的囊膜和宿主細(xì)胞膜融合才能將其自身的遺傳物質(zhì)釋放到細(xì)胞中。囊膜病毒的膜融合過程是由病毒囊膜上的融合蛋自介導(dǎo)完成的。融合蛋白根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)特點可以分為I類融合蛋白和II類融合蛋白，其中含I類融合蛋白的病毒較為常見，包括正粘病毒，副粘病毒，冠狀病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒以及纖絲病毒等。I類融合蛋白在結(jié)構(gòu)上都有兩段稱為七肽重復(fù)(heptad repeat，HR)序列的區(qū)域，N端的七肽重復(fù)序列為HR1，C端的七肽重復(fù)序列為HR2。這兩段序列在I類融合蛋白發(fā)揮膜融合活性時起重要作用。在融合過程中，三個HR2以反向平行的方式附著到三個HR1所形成的中心三聚體的溝槽中，形成一種穩(wěn)定的六螺旋束或稱發(fā)卡三聚體的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的形成標(biāo)志著膜融合的發(fā)生。目前許多研究還表明外源加入的HR1和HR2多肽都能競爭性地和病毒融合蛋白上的HR2或HR1結(jié)合從而阻斷了病毒融合蛋白自身的HR1和HR2之間的相互作用，使得病毒融合蛋白的發(fā)卡三聚體結(jié)構(gòu)不能形成，即抑制了病毒囊膜和細(xì)胞膜的融合，達(dá)到阻止病毒進入細(xì)胞的目的。囊膜病毒包括了許多引起人類重大疾病的病毒，如引起艾滋病的I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)，SARS冠狀病毒(SARS-CoV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)、麻疹病毒(measles virus)和Menangle病毒等。目前，HIV-1融合蛋白gp41上的HR2多肽T-20已于2003年3月通過美國食品和藥物檢驗局(FDA)“快通道”批準(zhǔn)，成為第一個阻止HIV-1進入細(xì)胞的抗艾滋病的多肽藥物，其治療效果良好。然而這類多肽藥物人工合成成本很高，在美國注射T-20一年要花費兩萬美元，在歐洲一年要花費兩萬五千美元，昂貴的藥費使得T-20的應(yīng)用受到了限制。因此，尋找一種具有這種多肽抑制活性，但制備成本低廉的藥物是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白，是所述囊膜病毒I類融合蛋白七肽重復(fù)(heptad repeat，HR)序列HR1和HR2通過連接肽Linker1和Linker2連接得到的三螺旋蛋白或五螺旋蛋白；所述三螺旋蛋白的排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH(H121)或NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH(H212)；所述五螺旋蛋白的排列順序為NHHR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH(H12121)；
所述連接肽Linker1和Linker2為由5-7個氨基酸殘基組成的多肽。
所述連接肽Linker1和Linker2由甘氨酸和絲氨酸酸殘基組成。
所述Linker1和Linker2的氨基酸序列可以相同，也可以不同。
所述Linker1優(yōu)選為具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列，所述Linker2優(yōu)選為具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
所述囊膜病毒為I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白(HIV-1-H121)是具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白(HIV-1-H212)是具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白(HIV-1-H12121)是具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白質(zhì)。
所述囊膜病毒為人呼吸道合胞病毒(HRSV)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白(HRSV-H121)是具有序列表中序列6的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白(HRSV-H212)是具有序列表中序列7的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白(HRSV-H12121)是具有序列表中序列8的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白質(zhì)。
所述囊膜病毒為新城疫病毒(NDV)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白(NDV-H121)是具有序列表中序列9的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2CO0H的三三螺旋蛋白(NDV-H212)是具有序列表中序列10的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?0的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白(NDV-H12121)是具有序列表中序列11的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白質(zhì)。
上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過十氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。如取代和/或缺失和/或添加所述連接肽Linker1和Linker2中的氨基酸殘基。
上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
當(dāng)所述囊膜病毒為I型人免疫缺陷病毒時所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列12的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No12限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列13的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No4蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No13限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列14的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No14限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
當(dāng)所述囊膜病毒為人呼吸道合胞病毒時所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列15的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No15限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No15限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列16的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No7蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No16限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列17的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No8蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No17限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No17限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
當(dāng)所述囊膜病毒為新城疫病毒時所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列18的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No9蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No18限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No18限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列19的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No10蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No19限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No19限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列20的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No11蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ IDNo20限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No20限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
含有上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白編碼基因的表達(dá)載體，細(xì)胞系和宿主菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的衍生物也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的衍生物可為所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白與GST形成的融合蛋白。
可利用任何一種可引導(dǎo)外源基因在大腸桿菌或酵母中表達(dá)的載體，將上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白編碼基因或上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白衍生物的編碼基因?qū)氪竽c桿菌或酵母中，篩選得到可表達(dá)本發(fā)明的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白或其衍生物的工程菌，培養(yǎng)工程菌，得到抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制囊膜病毒感染的藥物。
本發(fā)明所提供的抑制囊膜病毒感染的藥物，它的活性成分是上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物。
其中，所述囊膜病毒為I型人免疫缺陷病毒或人呼吸道合胞病毒或新城疫病毒。所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的衍生物可為所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白與GST的融合蛋白。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液，藥物可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為100-800mg/kg體重/天，療程為10至20天。
本發(fā)明分別利用HIV-1，HRSV和NDV這三種病毒融合蛋白上的兩段七肽重復(fù)(heptadrepeat，HR)序列1和2(HR1和HR2)設(shè)計并構(gòu)建了兩種三螺旋蛋白-HR121和HR212和一種五螺旋蛋白-HR12121。其中HR121和HR212的結(jié)構(gòu)和在溶液中的構(gòu)象示意圖如圖1a和圖1b所示，HR121和HR212在溶液中一般聚集成三聚體，形成一種含有游離的HR1或HR2多肽的六螺旋束結(jié)構(gòu)。HR121和HR212不但能形成六螺旋束結(jié)構(gòu)，而且還含有游離的HR1或HR2。這種特性使得HR121具有類似HR1的活性，HR212類似于HR2的活性。但由于這些游離的HR1和HR2連接在六螺旋束結(jié)構(gòu)上，所以穩(wěn)定性很高。HR12121(圖1C)和六螺旋束結(jié)構(gòu)相比，少了一個HR2多肽。這種特性使得HR12121能特異性地結(jié)合一個HR2多肽，具有類似HR1的活性。這種設(shè)計策略也適用于其他具有I類融合蛋白的囊膜病毒。
實驗證明，HIV-1的三種多螺旋蛋白均能夠在納摩爾濃度范圍內(nèi)阻斷病毒進入細(xì)胞，其它二種病毒的三種多螺旋蛋白亦能在微摩爾濃度范圍內(nèi)阻斷病毒進入細(xì)胞，這些結(jié)果說明人工構(gòu)建的七肽重復(fù)序列多螺旋蛋白能夠阻斷囊膜病毒對細(xì)胞的感染。本發(fā)明的以上述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物(如與GST所形成的融合蛋白)為活性成分的藥物將在預(yù)防和/或治療具有I類融合蛋白的囊膜病毒感染中起到重要作用。
本發(fā)明的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白在大腸桿菌和酵母中即可表達(dá)，且表達(dá)量較高，在大腸桿菌中的表達(dá)量可達(dá)50mg/L培養(yǎng)液。其制備成本遠(yuǎn)低于化學(xué)合成的HR多肽且具有更高的穩(wěn)定性。


圖1A為多螺旋蛋白HR12121，HR121和HR212的結(jié)構(gòu)示意1B為多螺旋蛋白HR121和HR212在溶液中的構(gòu)象示意1C為多螺旋蛋白HR12121在溶液中的結(jié)構(gòu)示意2為HIV-1的HR12121，HR121和HR212基因的引物設(shè)計圖3為利用搭橋PCR方法擴增HIV-1的HR12121、HR121和HR212基因的過程示意4為HIV-1-HR12121、HIV-1-HR121和HIV-1-HR212抑制HIV-1侵染細(xì)胞活性的測定曲線圖5A-圖5F為HRSV的多螺旋蛋白抑制HRSV侵染細(xì)胞活性的測定照片圖6A為NDV-HR212或NDV-GST-HR212在高濃度時能夠完全抑制NDV F48E9強毒株對Hela細(xì)胞的感染照片圖6B為NDV-HR121或NDV-HR12121不能抑制NDV F48E9強毒株對Hela細(xì)胞的感染照片圖6C為NDV-HR121，NDV-HR212或NDV-HR12121在高濃度時抑制NDV clone30感染Hela細(xì)胞的照片圖6D為未加任何蛋白樣品處理的NDV F48E9所介導(dǎo)形成的合胞體照片具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、HIV-1多螺旋蛋白的構(gòu)建及融合抑制活性的測定1、HIV-1多螺旋蛋白的表達(dá)(1)HIV-1多螺旋蛋白編碼基因的構(gòu)建根據(jù)HIV-1的HR1和HR2的氨基酸序列HR1SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARHR2WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL設(shè)計了如圖2所示的10條引物，R1，P1，A2，B1，B2，A1，P2，R2，D1和C2用于構(gòu)建三螺旋蛋白HR121和HR212的基因，以及五螺旋蛋白HR12121基因。其中R1和R2分別是從長引物P1和P2上截取的與HR基因無關(guān)的序列。
P15’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCTCTGGTATAGTGCAGCAG3’A25’ACCTCCAGAGGAACCTCTTGCCTGGAGCTGCTT3’B15’GGTTCCTCTGGAGGTTGGATGGAGTGGGACAGA3’B25’TCCACCAGAACCACCCAATAATTCTTGTTCATT3’A15’GGTGGTTCTGGTGGATCTGGTATAGTGCAGCAG3’P25’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTATCTTGCCTGGAGCTGCTT3’D15’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCTGGATGGAGTGGGACAGA3’C25’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTACAATAATTCTTGTTCATT3’R15’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCA3’R25’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCA3’如圖3所示，利用搭橋PCR方法擴增HR121、HR212和HR12121基因。以P1、A2為引物，編碼HIV-1融合蛋白env的質(zhì)粒pMT3-HXB-2(該質(zhì)粒的構(gòu)建參照文獻(xiàn)Ferrer，etal.Nature structural biology，1999(6)953-960)為模板擴增得到R1HR1linker1基因①；以B1、B2為引物，pMT3-HXB-2為模板擴增得到linker1HR2linker2基因②；以A1、A2為引物pMT3-HXB-2為模板擴增得到linker2HR1linker1基因③；以A1、P2為引物，pMT3-HXB-2為模板擴增得到linker2HR1R2基因④；以B1、C2為引物，pMT3-HXB-2為模板擴增得到linker1HR2R2基因⑤；以D1、B2為引物，pMT3-HXB-2為模板擴增得到R1HR2linker2基因⑥；以R1、B2為引物，R1HR1linker1①和linker1HR2linker2②為模板擴增得到R1HR1linker1HR2linker 2⑦；以B1、R2為引物，linker1HR2linker2②和linker2HR1R2④為模板擴增得到linker1HR2linker2HR1R2⑧；以A1、R2為引物，linker2HR1linker1③和linker1HR2R2⑤為模板擴增得到linker2HR1linker1HR2R2⑨；以R1、A2為引物，R1HR1linker1HR2linker2⑦和linker2HR1linker1③為模板擴增得到R1HR1linker1HR2linker2HR1linker1⑩；以R1、R2為引物，R1HR2linker2⑥和linker2HR1linker1HR2R2⑨為模板擴增得到R1HR2linker2HR1linker1HR2R2，即HR212基因片段；以R1、R2為引物，R1HR1linker1①和1inker1HR2linker2HR1R2⑧為模板擴增得到R1HR1linker1HR2linker2HR1R2，即HR121基因片段。以R1、R2為引物，R1HR1linker1HR2linker2HR1linkerl⑩和linker1HR2linker2HR1R2⑧為模板擴增得到R1HR1linker1HR2linker2HR1linker1HR2linker2HR1R2，即HR12121基因片段，在這一PCR反應(yīng)中有許多非特異產(chǎn)物，同樣根據(jù)目的產(chǎn)物的分子量用瓊脂糖電泳回收目的片段。
其中，上述PCR擴增的溫度條件為94℃，3分鐘，一個循環(huán)。94℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，2分鐘，30個循環(huán)。72℃，10分鐘，一個循環(huán)。
將所構(gòu)建的HR121，HR212，HR12121基因片段用EcoR I和Xho I雙酶切后無水乙醇沉淀回收，向酶切產(chǎn)物中加入1/10酶切產(chǎn)物體積的3mol/L醋酸鈉，2.5倍酶切產(chǎn)物體積的無水乙醇，-20℃沉淀30-60分鐘，12000rpm離心10分鐘，再用75％乙醇洗滌一次，12000rpm離心10分鐘，自然干燥，然后與相同的雙酶切后瓊脂糖電泳回收的pGEX-6p-1(Amersham Biosciences)載體連接，在16℃連接12h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；隨機挑選轉(zhuǎn)化菌單菌落接種液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，能夠獲得與目的片段分子量一致的質(zhì)粒為候選陽性克隆，對所得候選陽性質(zhì)粒進行DNA測序篩選出陽性克隆含有HR121基因的pGEX-6p-1/HIV-1-HR121，該HR121基因具有序列表中序列12的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的三螺旋蛋白HIV-1-HR121；含有HR212基因的pGEX-6p-1/HIV-1-HR212，該HR212基因具有序列表中序列13的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列的三螺旋蛋白HIV-1-HR212；含有HR12121基因的pGEX-6p-1/HIV-1-HR12121，該HR12121基因具有序列表中序列14的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列的五螺旋蛋白HIV-1-HR12121。
按照常規(guī)方法將HIV-1的HR1和HR2的基因分別克隆到pET-30a的BamH I和Xho I多克隆位點間，篩選得到含有HR1基因的質(zhì)粒pET-HIV-1-HR1和含有HR2基因的質(zhì)粒pET-HIV-1-HR2。
(2)多螺旋蛋白HIV-1-HR121，HIV-1-HR212，HIV-1-HR12121與GST形成的融合蛋白的表達(dá)將經(jīng)DNA測序的pGEX-6p-1/HIV-1-HR121，pGEX-6p-1/HIV-1-HR212和pGEX-6p-1/HIV-1-HR12121分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，接種含氨卞青霉素(100μg/ml)的2×YT液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，水1000ml)中，37℃搖振培養(yǎng)12h作為種子液；將種子液按1/100(V/V)接種量接種新鮮2×YT液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，水1000ml)，37℃搖振培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度1mM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時；5000rpm離心15分鐘收集菌體，用PBS緩沖液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)懸浮菌體，超聲波裂解菌體，超聲波裂解后加入終濃度為1％的TritonX-100，冰浴30min，12000rpm，4℃離心15min，取上清；將超聲波裂解上清通過經(jīng)PBS平衡的谷胱甘肽4B親和層析柱，再用PBS洗滌親和柱至少十個柱體積；用至少三個柱體積的還原型谷胱甘肽reduced glutathione溶液(10mM還原型谷胱甘肽，50mMTris-HCl pH8.0)洗脫，收集洗脫液得到GST-HR蛋白，經(jīng)12％SDS-PAGE鑒定所得蛋白分子量與預(yù)期相符，其中GST-HIV-1-HR121為39kDa，GST-HIV-1-HR212為39kDa，GST-HIV-1-HR12121為48kDa；用Superdex G50脫鹽柱(Pharmacia公司)將GST-HR溶解在酶切緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.0；150mM NaCl；1mM DTT；1mM EDTA，pH8.0)，加入過量的PreScissionTM蛋白酶(Pharmacia)5℃酶切16h；酶切產(chǎn)物再用谷胱甘肽4B親和層析柱親和除去酶切下的GST和PreScissionTM，收集穿透液得到HIV-1-HR121或HIV-1-HR212或HIV-1-H12121，用截流分子量為10kDa的超濾管濃縮至適當(dāng)濃度，利用分子篩進一步純化，-70℃凍存?zhèn)溆?。所用蛋白樣品均?2％SDS-PAGE鑒定，濃度用Bio-Rad DC蛋白試劑盒來確定。結(jié)果表明HIV-1-HR121的表達(dá)量為40mg/L培養(yǎng)液；HIV-1-HR212的表達(dá)量為50mg/L培養(yǎng)液；HIV-1-H12121的表達(dá)量為40mg/L培養(yǎng)液。
pET-HIV-1-HR1和pET-HIV-1-HR2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，接種含硫酸卡那霉素(100μg/m1)的2×YT液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，水1000ml)中，37℃搖振培養(yǎng)12h作為種子液；將種子液按1/100(V/V)接種量接種新鮮2×YT液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，水1000ml)，37℃搖振培養(yǎng)至0D600為0.8-1.0，加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度1mM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時；5000rpm離心15分鐘收集菌體，用PBS緩沖液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)懸浮菌體，超聲波裂解菌體，超聲波裂解后加入終濃度為1％的TritonX-100，冰浴30min，12000rpm，4℃離心15min，取上清，按照文獻(xiàn)(Wang et al.Biochemical and Biophysical Research Communications，302(2003)469-475)的方法純化，得到在HIV-1的HR1的N端添加了pET-30a載體上的50個氨基酸的HIV-1-HR1-30a和HR2的N端添加了pET-30a載體上的50個氨基酸殘基的HIV-1-HR2-30a(HR1和HR2在大腸桿菌中以His-tag融合的方式表達(dá)，在它們的N端均添加了pET-30a載體上的50個氨基酸，分別命名為HIV-1-HR1-30a和HIV-1-HR2-30a)。
將經(jīng)分子篩純化的HR121、HR212或HR12121蛋白用PBS緩沖液將蛋白濃度調(diào)整到約10μM。用Jasco J-715分光光度計進行圓二色譜分析，結(jié)果表明這三種多螺旋蛋白均富含α螺旋結(jié)構(gòu)。
2、HIV-1七肽重復(fù)序列的多螺旋蛋白HIV-1-HR121，HIV-1-HR212和HIV-1-H12121體外結(jié)合活性的測定分別將親和層析純化的GST-HIV-1-HR121或GST-HIV-1-H12121蛋白與純化的HIV-1的HIV-1-HR2-30a蛋白混合，GST-HIV-1-HR212蛋白與HIV-1的HIV-1-HR1-30a蛋白混合后，加入經(jīng)PBS平衡的谷胱甘肽4B親和填料，輕輕震蕩混勻，室溫作用1小時，中間不斷震蕩以防止填料沉淀；500g離心15分鐘，棄上清，填料用PBS至少洗滌三次，最后用二倍填料體積的還原型谷胱甘肽溶液(10mM還原型谷胱甘肽，50mM Tris-HCl pH8.0)洗滌填料，500g離心15分鐘，取上清進行12％SDS-PAGE分析，同時設(shè)陰性對照(將GST-HIV-1-HR121蛋白與HIV-1-HR1-30a混合，GST-HIV-1-H12121蛋白與HIV-1-HR1-30a混合，GST-HIV-1-H212蛋白與HIV-1-HR2-30a混合，進行上述相同處理，作為陰性對照)。結(jié)果表明GST-HIV-1-HR121或GST-HIV-1-H12121能特異性地結(jié)合HIV-1-HR2-30a蛋白，而GST-HIV-1-HR212則能特異性地結(jié)合HIV-1-HR1-30a蛋白，說明GST-HIV-1-HR121或GST-HIV-1-H12121能特異性地結(jié)合HR2，而GST-HIV-1-HR212則能特異性地結(jié)合HR1。
3、HIV-1七肽重復(fù)序列的多螺旋蛋白及其衍生物抑制HIV-1假病毒感染細(xì)胞抑制活性的測定接毒前24小時，消化GHOST-CXCR4細(xì)胞(Mckesson BioServices Corporation)并傳至24孔板中。將純化得到的HIV-1-HR121，HIV-1-HR212和HIV-1-HR12121分別溶于PBS緩沖液中，過濾除菌，5倍梯度稀釋后分別與等量的HIV-1假病毒(HIV-1假病毒的制備參照文獻(xiàn)Deng，et al.Nature，388(1997)296-300)混合。同時以GST作為陰性對照，以HIV-1-HR2-30a為陽性對照。然后將這種蛋白病毒混合物分別加入到細(xì)胞中(80％鋪滿)，待病毒吸附細(xì)胞2h后，吸棄病毒和蛋白的混合物，加入新鮮培養(yǎng)基(DMEM，90％；胎牛血清，10％；G418，500μg/ml；潮霉素，100μg/ml；嘌呤霉素，1μg/ml。其中的百分含量為質(zhì)量百分含量)繼續(xù)培養(yǎng)，每個稀釋度做8個重復(fù)，48-72后收獲并裂解細(xì)胞，通過測定細(xì)胞上清中螢火蟲熒光酶的活性來計算這三種多螺旋蛋白阻斷HIV-1gp41介導(dǎo)的膜融合。結(jié)果表明，HIV-1的三種多螺旋蛋白均能夠在nM濃度范圍內(nèi)阻斷病毒進入細(xì)胞。其中HIV-1-HR121、HIV-1-HR212和HIV-1-HR12121的抑制活性如圖4所示，HIV-1多螺旋蛋白HIV-1-HR121，HIV-1-HR212和HIV-1-HR12121的半數(shù)抑制濃度分別是16.2±2.76，2.3±0.62和7.2±1.6nmol/L。
實施例2、HRSV七肽重復(fù)序列的多螺旋蛋白的構(gòu)建及融合抑制活性的測定1、HRSV多螺旋蛋白的表達(dá)(1)HRSV多螺旋蛋白編碼基因的構(gòu)建根據(jù)HRSV的HR1和HR2的氨基酸序列HR1KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLHLKNYIDKQFLHR2SDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTN設(shè)計如下10條引物，用于構(gòu)建三螺旋蛋白HRSV-HR121和HRSV-HR212的基因，以及五螺旋蛋白HRSV-HR12121的基因。其中R1和R2分別是從長引物P1和P2上截取的與HR基因無關(guān)的序列。
R15’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCA3’R25’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCA3’P15’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCAAGGTCCTACACCTAGAA3’P25’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTATAAGAACTGTTTATC3’A15’GGTGGTTCTGGTGGA AAGGTCCTACACCTAGAA3’A25’ACCTCCAGAGGAACCTAAGAACTGTTTATC3’B15’GGTTCCTCTGGAGGTTCTGATGAATTTGATGCA3’B25’TCCACCAGAACCACCATTTGTGGTGGATTTACC3’D15’CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCATCTGATGAATTTGATGCA3’C25’TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTAATTTGTGGTGGATTTACC3’按照實施例1中的PCR擴增HR121，HR212，HR12121基因片段的方法擴增得到HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121基因片段。其中，擴增R1HR1linker1基因①，linker1HR2linker2基因②，linker2HR1linker1基因③，linker2HR1R2基因④，linker1HR2R2基因⑤，R1HR2linker2基因⑥的模板均為編碼HRSV融合蛋白F的質(zhì)粒pTZ18R-F(該質(zhì)粒的構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)孫曉鷗等.中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志，1998，18295-300)。
將所構(gòu)建的HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121基因片段用EcoR I和Xho I雙酶切后無水乙醇沉淀回收，向酶切產(chǎn)物中加入1/10酶切產(chǎn)物體積的3mol/L醋酸鈉，2.5倍酶切產(chǎn)物體積的無水乙醇，-20℃沉淀30-60分鐘，12000rpm離心10分鐘，再用75％乙醇洗滌一次，12000rpm離心10分鐘，自然干燥，然后與相同的雙酶切后瓊脂糖電泳回收的pGEX-6p-1載體連接，在16℃連接12h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；隨機挑選轉(zhuǎn)化菌單菌落接種液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，能夠獲得與目的片段分子量一致的質(zhì)粒為候選陽性克隆，對所得候選陽性質(zhì)粒進行DNA測序篩選出陽性克隆含有HRSV-HR121基因的pGEX-6p-1/HRSV-HR121，該HRSV-HR121基因具有序列表中序列15的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列6的氨基酸殘基序列的三螺旋蛋白HRSV-HR121；含有HRSV-HR212基因的pGEX-6p-1/HRSV-HR212，該HRSV-HR212基因具有序列表中序列16的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列7的氨基酸殘基序列的三螺旋蛋白HRSV-HR212；含有HRSV-HR12121基因的pGEX-6p-1/HRSV-HR12121，該HRSV-HR12121基因具有序列表中序列17的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列8的氨基酸殘基序列的五螺旋蛋白HRSV-HR12121。
(2)GST融合的HRSV多螺旋蛋白的表達(dá)和HRSV多螺旋蛋白的純化HRSV多螺旋蛋白HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121的表達(dá)純化方法同實施例1的步驟1(2)。經(jīng)12％SDS-PAGE鑒定所得蛋白分子量與預(yù)期相符，其中GST-HRSV-HR121為43kDa，GST-HRSV-HR212為42kDa，GST-HRSV-HR12121為54kDa。用PreScissionTM蛋白酶切除GST，得到HRSV-HR121或HRSV-HR212或HRSV-HR12121。結(jié)果表明HRSV-HR121的表達(dá)量為5mg/L培養(yǎng)液；HRSV-HR212的表達(dá)量為50mg/L培養(yǎng)液；HRSV-H12121的表達(dá)量為10mg/L培養(yǎng)液。
Jasco J-715分光光度計的圓二色譜分析結(jié)果表明這三種多螺旋蛋白均富含α螺旋結(jié)構(gòu)。
2、HRSV多螺旋蛋白及其衍生物體外結(jié)合活性的測定分別將親和層析純化的GST-HRSV-HR121或GST-HRSV-H12121蛋白與純化的HRSV的HR2-30a蛋白(蛋白的構(gòu)建和純化參照文獻(xiàn)Wang et al.Biochemical and BiophysicalResearch Communications，302(2003)469-475)混合，GST-HRSV-HR212蛋白與HRSV的HR1-30a蛋白(蛋白的構(gòu)建和純化參照文獻(xiàn)Wang et al.Biochemical and BiophysicalResearch Communications，302(2003)469-475)混合；同時設(shè)陰性對照(將GST-HRSV-HR121蛋白與HRSV的HR1-30a混合，GST-HRSV-H12121蛋白與HRSV的HR1-30a混合，GST-HRSV-H212蛋白與HRSV的HR2-30a混合，作為陰性對照)按照實施例1步驟2的方法測定它們的體外結(jié)合活性，結(jié)果表明GST-HRSV-HR121或GST-HRSV-H12121能特異性地結(jié)合HRSV的HR2-30a蛋白，而GST-HRSV-HR212則能特異性地結(jié)合HRSV的HR1-30a蛋白，說明GST-HRSV-HR121或GST-HRSV-H12121能特異性地結(jié)合HRSV的HR2，而GST-HRSV-HR212則能特異性地結(jié)合HRSV的HR1。
3、HRSV七肽重復(fù)序列的多螺旋蛋白及其衍生物抑制HRSV感染Hep-2細(xì)胞抑制活性的測定接毒前24小時，消化Hep-2細(xì)胞(人喉上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系)并傳至24孔板中。將純化得到的HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121分別溶解于PBS緩沖液中，過濾除菌；將HRSV的HR2-30a和HRSV的HR1-30a也分別溶解于PBS緩沖液中，過濾除菌。分別將HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121倍比稀釋后與100倍空斑形成單位(PFU)的HRSV B65株(北京首都兒科研究所)混合。將等摩爾濃度(均為10μmol/L)的HRSV-HR121和HRSV的HR2-30a的混合物、等摩爾濃度(均為10μmol/L)的HRSV-HR12121和HRSV的HR2-30a的混合物、等摩爾濃度(均為10μmol/L)的HRSV-HR212和HRSV的HR1-30a的混合物分別與100PFU的HRSV B65株混合。同時以GST作為陰性對照。然后將這種蛋白病毒混合物加入到細(xì)胞中(80％鋪滿)，待病毒吸附細(xì)胞2h后，吸棄病毒和蛋白的混合物，加入新鮮培養(yǎng)基(DMEM，90％(質(zhì)量百分含量)；胎牛血清，10％(質(zhì)量百分含量))繼續(xù)培養(yǎng)，每個稀釋度做8個重復(fù)，72h后結(jié)晶紫染色觀察，通過合胞體的數(shù)量計算其抑制活性。計算這三種多螺旋蛋白阻斷HRSV F蛋白介導(dǎo)的膜融合。結(jié)果表明三種多螺旋蛋白能夠在μmol/L濃度水平抑制HRSV B65株進入Hep-2細(xì)胞。HRSV-HR121，HRSV-HR212和HRSV-HR12121的半數(shù)抑制濃度分別是3.74μmol/L、7.95μmol/L和3.36μmol/L。
等摩爾濃度的HRSV-HR121和HRSV的HR2-30a的混合物、等摩爾濃度的HRSV-HR12121和HRSV的HR2-30a的混合物、等摩爾濃度的HRSV-HR212和HRSV的HR1-30a的混合物均不能抑制HRSV B65株進入Hep-2細(xì)胞；各種濃度的GST均不能抑制HRSV B65株進入Hep-2細(xì)胞。其中，作為空白對照的未接種HRSV的Hep-2細(xì)胞如圖5A所示；HRSV-HR121、HRSV-HR212和HRSV-HR12121抑制合胞體的形成的結(jié)果如圖5B所示；作為陰性對照的GST的抑制活性結(jié)果如圖5C所示，它不能抑制合胞體的形成；等摩爾濃度的HRSV-HR121和HRSV的HR2-30a的混合物或HRSV-HR12121和HRSV的HR2-30a的混合物不能抑制HRSV侵染細(xì)胞(圖5D)；等摩爾的HRSV-HR212和HRSV的HR1-30a的混合物也不能抑制合胞體的形成(圖5E)；未經(jīng)上述任何蛋白處理的HRSV侵染Hep-2細(xì)胞后所形成的合胞體如圖5F所示。
實施例3、NDV七肽重復(fù)序列的多螺旋蛋白的構(gòu)建及融合抑制活性的測定1、NDV多螺旋蛋白的表達(dá)(1)NDV多螺旋蛋白編碼基因的構(gòu)建根據(jù)NDV的HR1和HR2的氨基酸序列HR1ALIQANQNAANILRLKESIAATNEAVHEVTDGLSQLAVHR2LGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTGTSALI設(shè)計如下10條引物，用于構(gòu)建三螺旋蛋白NDV-HR121和NDV-HR212的基因，以及五螺旋蛋白NDV-HR12121的基因。其中R1和R2分別是從長引物P1和P2上截取的與HR基因無關(guān)的序列。
P15’CTG GGT ACC TTG GAA GTT CTA TTC CAG GGT CCA GGA TCC ATG GCT CTG ATACAA GCC AAC CA 3’
R15’CTG GGT ACC TTG GAA GTT CTATTC CAG GGT CCA 3’A25’ACC TCC TCG TCC ACC AGA CAC TGC TAG TTG CGA TAA TC 3’B15’TCT GGT GGA CGA GGA GGT CTT GGG AAT GTC AAC AAC CTC 3’B25’TAT CAG AGC TCC GCC AGA ACC GCC AAT GAG AGC AGA CGT 3’A15’CT CTC ATT GGC GGT TCT GGC GGA GCT CTG ATA CAA GCC AA 3’C25’TGG TGA TGG TGG TGA TGC TCG AGT CA AAT GAG AGC AGA CGT GCC G 3’D15’CTG GGT ACC TTG GAA GTT CTA TTC CAG GGT CCA GGA TCC ATG GGC AAT CTCAAT ATC TCA ACT GAA C 3’P25’TGG TGA TGG TGG TGA TGC TCG AGT CA AAT GAG AGC AGA CGT GCC G 3’R25’TGG TGA TGG TGG TGA TGC TCG AGT CA 3’按照實施例1中的PCR擴增HR121，HR212，HR12121基因片段的方法擴增得到NDV-HR121，NDV-HR212和NDV-HR12121基因片段。其中，擴增R1HR1linker1基因①，linker1HR2linker2基因②，linker2HR1linker1基因③，linker2HR1R2基因④，linker1HR2R2基因⑤，R1HR2linker2基因⑥的模板均為編碼NDV融合蛋白F的質(zhì)粒pGEM-5f(該質(zhì)粒的構(gòu)建參照文獻(xiàn)，梁榮等.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000(5)351-354)將所構(gòu)建的NDV-HR121，NDV-HR212和NDV-HR12121基因片段用EcoR I和Xho I雙酶切后無水乙醇沉淀回收，向酶切產(chǎn)物中加入1/10酶切產(chǎn)物體積的3mol/L醋酸鈉，2.5倍酶切產(chǎn)物體積的無水乙醇，-20℃沉淀30-60分鐘，12000rpm離心10分鐘，再用75％乙醇洗滌一次，12000rpm離心10分鐘，自然干燥，然后與相同的雙酶切后瓊脂糖電泳回收的pGEX-6p-1載體連接，在16℃連接12h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；隨機挑選轉(zhuǎn)化菌單菌落接種液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，能夠獲得與目的片段分子量一致的質(zhì)粒為候選陽性克隆，對所得候選陽性質(zhì)粒進行DNA測序篩選出陽性克隆含有NDV-HR121基因的pGEX-6p-1/NDV-HR121，該NDV-HR121基因具有序列表中序列18的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列9的氨基酸殘基序列的三螺旋蛋白NDV-HR121；含有NDV-HR212基因的pGEX-6p-1/NDV-HR212，該NDV-HR212基因具有序列表中序列19的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列10的氨基酸殘基序列的三螺旋蛋白NDV-HR212；含有NDV-HR12121基因的pGEX-6p-1/NDV-HR12121，該NDV-HR12121基因具有序列表中序列20的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列11的氨基酸殘基序列的五螺旋蛋白NDV-HR12121。
按照常規(guī)方法將NDV的HR1和HR2的基因分別克隆到pET-30a的BamH I和Xho I多克隆位點間，篩選得到含有HR1基因的質(zhì)粒pET-NDV-HR1和含有HR2基因的質(zhì)粒pET-NDV-HR2。
(2)NDV多螺旋蛋白及其衍生物的表達(dá)NDV多螺旋蛋白NDV-HR121，NDV-HR212和NDV-HR12121的表達(dá)純化方法同實施例1的步驟1(2)。經(jīng)12％SDS-PAGE鑒定所得蛋白分子量與預(yù)期相符，其中GST-NDV-HR121為39kDa，GST-NDV-HR212為39kDa，GST-NDV-HR12121為47kDa。用PreScissionTM蛋白酶切除GST，得到NDV-HR121或NDV-HR212或NDV-H12121。NDV-HR121的表達(dá)量為5mg/L培養(yǎng)液；NDV-HR212的表達(dá)量為50mg/L培養(yǎng)液；NDV-H12121的表達(dá)量為10mg/L培養(yǎng)液。
按照實施例1中HIV-1-HR1-30a和HIV-1-HR2-30a的表達(dá)純化方法，將pET-NDV-HR1和pET-NDV-HR2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到在NDV的HR1的N端添加了pET-30a載體上的50個氨基酸的NDV-HR1-30a和HR2的N端添加了pET-30a載體上的50個氨基酸殘基的NDV-HR2-30a。
Jasco J-715分光光度計的圓二色譜分析結(jié)果表明這三種多螺旋蛋白均富含α螺旋結(jié)構(gòu)。
2、NDV多螺旋蛋白及其衍生物體外結(jié)合活性的測定分別將親和層析純化的GST-NDV-HR121或GST-NDV-H12121蛋白與純化的NDV-HR2-30a蛋白混合，GST-NDV-HR212蛋白與NDV-HR1-30a蛋白混合；同時設(shè)陰性對照(將GST-NDV-HR121蛋白與NDV-HR1-30a混合，GST-NDV-H12121蛋白與NDV-HR1-30a混合，GST-NDV-H212蛋白與NDV-HR2-30a混合，作為陰性對照)，按照實施例1步驟2的方法測定它們的體外結(jié)合活性，結(jié)果表明GST-NDV-HR121或GST-NDV-H12121能特異性地結(jié)合NDV-HR2-30a蛋白，而GST-NDV-HR212則能特異性地結(jié)合NDV-HR1-30a蛋白，這說明GST-NDV-HR121或GST-NDV-H12121能特異性地結(jié)合NDV的HR2，而GST-NDV-HR212則能特異性地結(jié)合NDV的HR1。
3、NDV七肽重復(fù)序列的多螺旋蛋白及其衍生物抑制NDV感染Hela細(xì)胞抑制活性的測定(1)NDV F48E9合胞體形成抑制試驗NDV F48E9(從中國獸藥監(jiān)察所購買)接種9-10日齡SPF雞胚制備新鮮的病毒液，將病毒接種在48孔板上生長成單層的Hela T4細(xì)胞，接種量為100PFU，同時分別加入倍比稀釋的NDV-HR212、GST-NDV-HR212、NDV-HR121或NDV-H12121蛋白(均50μl/孔)，以GST蛋白作為對照，37℃，CO2溫箱孵育1h，吸棄病毒和蛋白的混合液，加入0.3ml含2％(V/V)FCS的DMEM營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12h后用0.5％結(jié)晶紫甲醇溶液染色1-2min，水洗后鏡檢，計算每孔合胞體的數(shù)目，每個試驗每次做6孔重復(fù)，至少重復(fù)3次。結(jié)果表明NDV-HR212或NDV-GST-HR212在高濃度(＞25μmol/L)時能夠完全抑制NDV F48E9強毒株對Hela細(xì)胞的感染(圖6A)，而NDV-HR121或NDV-HR12121則沒有抑制活性(圖6B)。作為空白對照，未加任何蛋白樣品處理的NDV F48E9所介導(dǎo)形成的合胞體如圖6D所示。
(2)NDV clone30合胞體形成抑制試驗NDV clone30(從中國獸藥監(jiān)察所購買)接種9-10日齡SPF雞胚制備新鮮的病毒液，將病毒接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板生長成單層的Hela T4細(xì)胞，接種量為100PFU，37℃作用1h后吸棄病毒，加入含2％(V/V)FCS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)12h，同時分別加入倍比稀釋的NDV-HR212、NDV-HR212或NDV-H12121蛋白，以GST蛋白對照，每隔3h換一次含蛋白樣品(NDV-HR121、NDV-HR212、NDV-H12121或GST蛋白)的DMEM維持液，感染12h后用無血清DMEM洗滌三次，加入含10ug/ml乙?；鹊鞍酌傅臒o血清DMEM室溫作用10min后用含20ug/ml胰蛋白酶抑制劑的DMEM洗滌三次，再加入含蛋白樣品(NDV-HR212、NDV-HR212、NDV-H12121或GST蛋白)的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)12h后結(jié)晶紫染色并計算每孔合胞體的數(shù)目。結(jié)果表明NDV-HR121，NDV-HR212，NDV-HR12121分別在50,60和70μmol/L濃度時，能夠完全抑制合胞體的形成(圖6C)。
上述結(jié)果說明NDV-HR212能夠抑制NDV強毒株的細(xì)胞融合，而NDV-HR121NDV-HR12121則沒有抑制NDV強毒株的細(xì)胞融合活性(NDV的HR1多肽本身不具有抑制活性)；但NDV-HR212或NDV-HR121或NDV-HR12121如果在F0蛋白裂解前加入都能夠抑制NDV弱毒株介導(dǎo)的細(xì)胞融合。
序列表<160>20<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gly Ser Ser Gly Gly1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Gly Gly Ser Gly Gly1 5<210>3<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>3Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala1 5 10 15Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln20 25 30Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn35 40 45Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu G1u Ser Gln Asn Gln50 55 60Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln85 90 95His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg100 105 110<210>4<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Hisl 5 10 15Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu20 25 30Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn35 40 45Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val50 55 60Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly Trp Met65 70 75 80Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu85 90 95Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu100 105 110<210> 5<211>190<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>5Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala1 5 10 15Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln20 25 30Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn35 40 45Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln
50 55 60Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln85 90 95His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg100 105 110Gly Ser Ser Gly Gly Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr115 120 125Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu130 135 140Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Val145 150 155 160Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu165 l70 175Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg180 185 190<210>6<211>148<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>6Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu1 5 10 15Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val20 25 30Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Phe35 40 45Leu Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln50 55 60Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp65 70 75 80Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Gly Gly85 90 95Ser Gly Gly Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys100 105 110Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly115 120 125Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp130 135 140Lys Gln Phe Leu145
<210>7<211>139<212>PRT<213>工序列<220>
<223>
<400>7Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn1 5 10 15Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val20 25 30Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Gly Gly Ser Gly Gly Lys Val Leu35 40 45His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr50 55 60Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser65 70 75 80Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Phe Leu Gly Ser85 90 95Ser Gly Gly Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu100 105 110Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu115 120 125His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn130 135<210>8<211>247<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>8Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu1 5 10 15Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val20 25 30Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Phe35 40 45Leu Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln50 55 60
Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp65 70 75 80Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Gly Gly85 90 95Ser Gly Gly Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys100 105 110Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly115 120 125Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn Tyr Ile Asp130 135 140Lys Gln Phe Leu Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser145 150 155 160Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg165 170 175Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr180 185 190Asn Gly Gly Ser Gly Gly Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn195 200 205Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu210 215 220Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu His Leu Lys Asn225 230 235 240Tyr Ile Asp Lys Gln Phe Leu245<210>9<211>122<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>9Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys1 5 10 15Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly20 25 30Leu Ser Gln Leu Ala Val Gly Ser Ser Gly Gly Leu Gly Asn Val Asn35 40 45Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys50 55 60Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Ile Gly65 70 75 80Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile85 90 95Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu
100 105 110Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val115 120<210>10<211>120<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>10Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys Leu Glu1 5 10 15Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Gly Thr20 25 30Ser Ala Leu Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln35 40 45Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn50 55 60Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val Gly65 70 75 80Ser Ser Gly Gly Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu85 90 95Asp Lys Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys100 105 110Leu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Ile115 120<210>11<211>206<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>11Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys1 5 10 15Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly20 25 30Leu Ser Gln Leu Ala Val Gly Ser Ser Gly Gly Leu Gly Asn Val Asn35 40 45Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys
50 55 60Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Gly Thr Ser Ala Leu Ile Gly65 70 75 80Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile85 90 95Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu100 105 110Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val Gly Ser Ser Gly Gly Leu115 120 125Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys Leu Glu Glu130 135 140Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Gly Thr Ser145 150 155 160Ala Leu Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn165 170 175Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu180 185 190Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val195 200 205<210>12<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg60ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaggttcctc tggaggttgg120atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa180tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg gtggttctgg tggatctggt240atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa300ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag gcaagatag 339<210>13<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct taatacactc cttaattgaa60gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat tgggtggttc tggtggatct120ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg180caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagag gttcctctgg aggttggatg240gagtgggaca gagaaattaa caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg300caaaaccagc aagaaaagaa tgaacaagaa ttattgtag 339<210>14<211>573<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg60ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaggttcctc tggaggttgg120atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa180tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg gtggttctgg tggatctggt240atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa300ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag gcaagaggat cctctggagg ttggatggag360tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa420aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttgggtggtt ctggtggatc tggtatagtg480cagcagcaga acaatttgct gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca540gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga tag 573<210>15<211>447<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15aaggtcctac acctagaagg ggaagtgaac aaaatcaaaa gtgctctact atccacaaac60aaggctgtag tcagcttatc aaatggagtc agtgtcttaa ccagcaaagt gttacatctc120aaaaactata tagataaaca gttcttaggt tcctctggag gttctgatga atttgatgca180tcaatatctc aagtcaatga gaagattaac cagagtctag catttattcg taaatcagat240gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa tccaccacaa atggtggatc cggtggaaag300gtcctacacc tagaagggga agtgaacaaa atcaaaagtg ctctactatc cacaaacaag360gctgtagtca gcttatcaaa tggagtcagt gtcttaacca gcaaagtgtt acatctcaaa420
aactatatag ataaacagtt cttatag447<210>16<211>420<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16tctgatgaat ttgatgcatc aatatctcaa gtcaatgaga agattaacca gagtctagca60tttattcgta aatcagatga attattacat aatgtaaatg ctggtaaatc caccacaaat120ggtggttctg gtggaaaggt cctacaccta gaaggggaag tgaacaaaat caaaagtgct180ctactatcca caaacaaggc tgtagtcagc ttatcaaatg gagtcagtgt cttaaccagc240aaagtgttac atctcaaaaa ctatatagat aaacagttct taggttcctc tggaggttct300gatgaatttg atgcatcaat atctcaagtc aatgagaaga ttaaccagag tctagcattt360attcgtaaat cagatgaatt attacataat gtaaatgctg gtaaatccac cacaaattag420<210>17<211>744<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>17aaggtcctac acctagaagg ggaagtgaac aaaatcaaaa gtgctctact atccacaaac60aaggctgtag tcagcttatc aaatggagtc agtgtcttaa ccagcaaagt gttacatctc120aaaaactata tagataaaca gttcttaggt tcctctggag gttctgatga atttgatgca180tcaatatctc aagtcaatga gaagattaac cagagtctag catttattcg taaatcagat240gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa tccaccacaa atggtggatc cggtggaaag300gtcctacacc tagaagggga agtgaacaaa atcaaaagtg ctctactatc cacaaacaag360gctgtagtca gcttatcaaa tggagtcagt gtcttaacca gcaaagtgtt acatctcaaa420aactatatag ataaacagtt cttaggttcc tctggaggtt ctgatgaatt tgatgcatca480atatctcaag tcaatgagaa gattaaccag agtctagcat ttattcgtaa atcagatgaa540ttattacata atgtaaatgc tggtaaatcc accacaaatg gtggttctgg tggaaaggtc600ctacacctag aaggggaagt gaacaaaatc aaaagtgctc tactatccac aaacaaggct660gtagtcagct tatcaaatgg agtcagtgtc ttaaccagca aagtgttaca tctcaaaaac720tatatagata aacagttctt atag 744<210>18<211>369
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>18gctctgatac aagccaacca gaatgctgcc aacatcctcc ggcttaaaga gagcattgct60gcaactaatg aagctgtaca tgaagtcact gacggattat cgcaactagc agtgggttcc120tctggaggtc ttgggaatgt caacaactcg ataagtaatg ctttggataa gttagaggaa180agcaatagca aacttgacaa agtcaatgtc aagctgaccg gcacgtctgc tctcattggt240ggatccggtg gagctctgat acaagccaac cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaaa300gagagcattg ctgcaactaa tgaagctgta catgaagtca ctgacggatt atcgcaacta360gcagtgtga369<210>19<211>363<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>19cttgggaatg tcaacaactc gataagtaat gctttggata agttagagga aagcaatagc60aaacttgaca aagtcaatgt caagctgacc ggcacgtctg ctctcattgg tggatccggt120ggagctctga tacaagccaa ccagaatgct gccaacatcc tccggcttaa agagagcatt180gctgcaacta atgaagctgt acatgaagtc actgacggat tatcgcaact agcagtgggt240tcctctggag gtcttgggaa tgtcaacaac tcgataagta atgctttgga taagttagag300gaaagcaata gcaaacttga caaagtcaat gtcaagctga ccggcacgtc tgctctcatt360tga 363<210>20<211>621<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>20gctctgatac aagccaacca gaatgctgcc aacatcctcc ggcttaaaga gagcattgct60gcaactaatg aagctgtaca tgaagtcact gacggattat cgcaactagc agtgggttcc120tctggaggtc ttgggaatgt caacaactcg ataagtaatg ctttggataa gttagaggaa180
agcaatagca aacttgacaa agtcaatgtc aagctgaccg gcacgtctgc tctcattggt240ggatccggtg gagctctgat acaagccaac cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaaa300gagagcattg ctgcaactaa tgaagctgta catgaagtca ctgacggatt atcgcaacta360gcagtgggtt cctctggagg tcttgggaat gtcaacaact cgataagtaa tgctttggat420aagttagagg aaagcaatag caaacttgac aaagtcaatg tcaagctgac cggcacgtct480gctctcattg gtggatccgg tggagctctg atacaagcca accagaatgc tgccaacatc540ctccggctta aagagagcat tgctgcaact aatgaagctg tacatgaagt cactgacgga600ttatcgcaac tagcagtgtg a 62權(quán)利要求
1.一種抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白，是所述囊膜病毒I類融合蛋白七肽重復(fù)序列HR1和HR2通過連接肽Linker1和Linker2連接得到的三螺旋蛋白或五螺旋蛋白；所述三螺旋蛋白的排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH或NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH；所述五螺旋蛋白的排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH；所述連接肽Linker1和Linker2為由5-7個氨基酸殘基組成的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多螺旋蛋白，其特征在于所述連接肽Linker1和Linker2由甘氨酸和絲氨酸酸殘基組成；所述囊膜病毒為I型人免疫缺陷病毒；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白是具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制I型人免疫缺陷病毒感染作用的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多螺旋蛋白，其特征在于所述連接肽Linker1和Linker2由甘氨酸和絲氨酸酸殘基組成；所述囊膜病毒為人呼吸道合胞病毒；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列6的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列7的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白是具有序列表中序列8的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制人呼吸道合胞病毒感染作用的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多螺旋蛋白，其特征在于所述連接肽Linker1和Linker2由甘氨酸和絲氨酸酸殘基組成；所述囊膜病毒為新城疫病毒；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列9的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白是具有序列表中序列10的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?0的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白質(zhì)；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白是具有序列表中序列11的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)⑿蛄?1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制新城疫病毒感染作用的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的編碼基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的編碼基因，其特征在于所述囊膜病毒為I型人免疫缺陷病毒；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列12的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №12限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列13的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №4蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №13限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列14的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID№14限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的編碼基因，其特征在于所述囊膜病毒為人呼吸道合胞病毒；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列15的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№15限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №15限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列16的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №7蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №16限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列17的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №8蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №17限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №17限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的編碼基因，其特征在于所述囊膜病毒為新城疫病毒；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列18的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №9蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№18限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No18限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR2-Linker2-HR1-1inker1-HR2COOH的三螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列19的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №10蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№19限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №19限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；所述排列順序為NH2HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1COOH的五螺旋蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)具有序列表中序列20的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №11蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №20限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №20限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
9.一種以權(quán)利要求1-4中任一所述的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其衍生物為活性成分的抑制囊膜病毒感染的藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述囊膜病毒為I型人免疫缺陷病毒或人呼吸道合胞病毒或新城疫病毒；所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白的衍生物為所述抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白與GST形成的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抑制囊膜病毒感染的多螺旋蛋白，是所述囊膜病毒I類融合蛋白七肽重復(fù)序列HR1和HR2通過連接肽Linker1和Linker2連接得到的三螺旋蛋白或五螺旋蛋白；所述三螺旋蛋白的排列順序為NH
文檔編號C07K19/00GK1709912SQ200510064469
公開日2005年12月21日 申請日期2005年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月18日
發(fā)明者田波, 高福, 倪凌 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所