專利名稱：來源于干旱壓力耐受性茶樹的基因和引入水分壓力耐受性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對生物系統(tǒng)的水分壓力耐受性有用的三個(gè)新基因SEQ ID No.1-3，所述基因在干旱條件下，在茶樹中差異性表達(dá)；以及引入所述基因到生物系統(tǒng)中幫助形成水分壓力耐受性的方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物表型對于很多生物和非生物因素敏感，例如，干旱壓力是限制產(chǎn)量的重要決定因素。本發(fā)明中干旱壓力是指植物中的水分含量不足以滿足植物蒸騰作用的需求，從而導(dǎo)致表觀癥狀發(fā)生改變，例如樹葉卷曲。干旱可以通過一種重要的生理學(xué)參數(shù)——樹葉水勢(樹葉組織中水分狀態(tài)的測量)來量化。植物對水分缺乏的反應(yīng)依賴于水分損失的量、損失的比例、干旱壓力持續(xù)的時(shí)間、考慮的植物種類/物種、植物的發(fā)育階段和其他環(huán)境變量，例如溫度，相對濕度等等。
壓力影響許多代謝途徑和結(jié)構(gòu)，這可能是某些基因上調(diào)或下調(diào)的結(jié)果。很多水分缺乏能誘導(dǎo)基因編碼基因產(chǎn)品以預(yù)先保護(hù)細(xì)胞功能。經(jīng)常能注意到的植物反應(yīng)是大量積累代謝相容物，例如脯氨酸、甘氨酸三甲內(nèi)鹽、松醇、肉堿、甘露醇、山梨醇、多羥基化合物、海藻糖、蔗糖、寡多糖、果聚糖。這些物質(zhì)是不同的化學(xué)物質(zhì)，且不位于蛋白表面，因而這些蛋白優(yōu)先水合。這些化合物的積累導(dǎo)致水勢下降，以利水分移到細(xì)胞中，保持組織膨壓(一種防御水分不足的機(jī)制)。
這些化合物能夠穩(wěn)定膜和其他大分子例如核酸和蛋白，能作為自由基的清道夫。事實(shí)上，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)負(fù)責(zé)這些化合物合成的基因的轉(zhuǎn)基因植物比野生型植物在水分缺乏條件下的更具耐受性。典型的研究包括(a)過量表達(dá)枯草桿菌(枯草桿菌)SacB基因(編碼果聚糖-蔗糖酶)的轉(zhuǎn)基因煙草積累了幾倍的果聚糖，顯示在干旱壓力下顯著性的高生長和干重積累((Pilon-Smits，E.A.H.，Ebskamp，M.J..M.，Paul，M.J.，Jeuken，M.J.W.，Weisbeek，P.J.和Smeekens，S.C.M.(1995)Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco underdrought stress.Plant Physiol.107125-130)；(b)過量表達(dá)豇豆(Vignaaconitifolia)P5CS(D-吡咯啉-5-碳酸鹽合成酶，該酶參與從L-谷氨酸鹽通過D-脯氨酸-5-碳酸鹽生物合成脯氨酸)的轉(zhuǎn)基因煙草導(dǎo)致脯氨酸含量增加10-18倍，顯示比野生型在水分壓力條件下更好的生長(Kavi，K.P.B.，Hong，Z.，Miao，G-H.，Hu C.A.A.和Verma，D.P.S.(1995)Plant Physiol.1081387-1394)；(c)表達(dá)酵母TPS1基因(合成海藻糖-6-磷酸鹽合成酶)的轉(zhuǎn)基因煙草積累海藻糖，并顯示比野生型有更好的干旱耐受性(Holmstorm，K.O.，Mantyla，E.，Mandal，W.A.，Palva，E.T.，Tunnela，O.E.and Londesborough J.(1996)Droughttolerence in tobacco.Nature.379683-684)；(d)過量表達(dá)大腸桿菌(E.coli)betB基因(合成三甲銨乙內(nèi)酯乙醛脫氫酶)的轉(zhuǎn)基因煙草顯示在滲透壓下有更好的性狀(Holmstrom，K.O.，Welin，B.and Mandal，A.(1994)Production of the Escherichia coli betaine-aldehyde dehydrogenasean enzyme required for the synthesis of the osmoprotectant glycine betaine，in transgenic plants.Plant J.6749-758)；(e)表達(dá)冰葉午時(shí)花(Mesembryanthemum crystalminum)imt1基因(合成肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶，參與D-芒丙醇生物合成)的轉(zhuǎn)基因煙草顯示更適于水分壓力(Sheveleva，E.，Chmara，W.，Bohnert，H.J.和Jensen，R.G.(1997)Increased salt and drought tolerance by D-Ononitol production intransgenic Nicotiana tabacum.Plant Physiol.51211-1219)；(f)通過植物激素脫落酸(abscisic acid，ABA)介導(dǎo)，在干旱壓力下產(chǎn)生這些滲透-保護(hù)劑。
最近發(fā)現(xiàn)，在8天齡的豇豆植物中，參與ABA合成的9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene，NCED)在水分缺乏條件下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)(luchi，S.，Kobayashi.，Yamaguchi-Shinozaki，K和Shinozaki，K.(2000)A stress-inducible genefor 9-cis-epoxycarotenoid dioygenase involved in abscisic acidbiosynthesis under water stress in drought-tolerant cowpea.Plant physiol.123553-562)。發(fā)現(xiàn)在水分壓力下，馬鈴薯的葉和根中的NCEB mRNA都增高(Thompson，A.J.，Jackson，A.C.，Parker，R.A.，Morpeth，D.R.，Burbidge，A.and Taylor，I.B.(2000)Abscisic acid biosynthesis in tomatoregulation of dioxygenase mRNA by light/dark cycles，water stress andabscisic acid.Plant.Mol.Biol.42833-845)。
除了幫助保持水合狀態(tài)的滲壓劑外，干旱或滲透壓力的植物會合成一些基因，該基因產(chǎn)生水通道蛋白和水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如aquaporins家族的膜蛋白，該蛋白能夠改變細(xì)胞的水勢，因此防止水分缺乏(Chrispeels，M.J.和Agre，P.(1994)Water channel proteins of plants andanimal cells.Trends in Biochem Sci.19421-425；Bohnert H，J.and Jensen，R.G.(1996))。
用于在植物中產(chǎn)生水分壓力耐受性的方法，參見TIBTECH.1489-97；Johansson，I.，Larsson，C.，Ek B.和Kjellbom，P.(1996)Themajor integral proteins of spinach leaf plasma membranes are putativeaquaporins and are phosphorylated in response to Ca and apoplastic waterpotential.The Plant Cell.81181-1191。LEA積累到高濃度也獲得干燥耐受性。LEA蛋白組-3中的一種預(yù)計(jì)在細(xì)胞脫水期間螯合濃縮的離子中扮演著重要的角色。LEA蛋白組-5中的另一種預(yù)計(jì)在細(xì)胞失水期間螯合離子。水分缺乏期間，通過調(diào)節(jié)滲透壓可以維持總水勢。研究認(rèn)為，兩種蛋白——滲透蛋白和非特異性脂肪轉(zhuǎn)移蛋白是由壓力誘導(dǎo)的，在控制病原體中發(fā)生作用。非特異性脂肪轉(zhuǎn)移酶下干旱條件下能被誘導(dǎo)(Plant A.L.，Cohen，A.，Moses，M.S和Bray，E.A.(1991)Nucleotide sequence and spatial expression pattern of a drought abscisicacid induced gene in tomato.Plant Physiol.97900-906；Toress-Schumann，S.，Godoy，J.A.and Pintor-Toro，J.A.(1992)A probable lipid transferprotein is induced by NaCl in stems of tomato plants.Plant Mol.Biol.18749-757)。
熱休克蛋白也可由水分缺乏誘導(dǎo)(Borkird，C.，Simoens，C.，Villarroel，R.和VanMontagu M.(1991)Gene associated with water-stressadaptation of rice cells and identification of two genes as hsp 70 andubiquitin.Physiol.Plant.82449-457；Almoguera，C.和Jordano，J.(1992)Developmental and environmental concurrent expression in sunflower dry-seed-stored low-molecular-weight heat shock protein and Lea mRNAs.Plant Mol.Biol.19781-792)，其干旱期間參與蛋白的再折疊，以恢復(fù)其功能或防止蛋白聚集(Vierling E.(1991)the roles of heat shockproteins in plants.Annual review of Plant Physiol.and Plant Mol.Biol.42579-620)。
小HSP是另一種與植物干燥耐受性相關(guān)的蛋白。在種子脫水期間和再水化的前幾天小HSP可能作為一種分子伴侶(Hoekstra，F(xiàn)，A.，Golovina，E，A.和Buitink，J.(2001)Mechanisms of plant desiccationtolerance.Trends in Plant Science.6(9)43-439)。除了熱休克蛋白外，在水稻秧苗的芽中，針對鹽、干旱和低溫也出現(xiàn)了OsHSP110聚集。研究顯示，兩種hsp，玉蜀黍中的hsp70和大豆中的hsp27都可以被水分壓力誘導(dǎo)(Sachs，M.M.和David Ho，T.H.(1986).Alterations ofgene expression during environmental stress in plants.Ann.Rev.PlantPhysiol.37363-376)。大部分基因表達(dá)分變化都發(fā)生在脫水期間，因此已經(jīng)分離出了許多脫水特異性基因產(chǎn)物，但是對再水化特異性基因產(chǎn)物知道甚少(Bemacchia，G.，Schwall，G.，Lottspeich，F(xiàn).，Salamini，F(xiàn).，和Bartels，D.(1995)Molecular Characterization of the Rehydration processin the Resurrection Plant Craterostigma Plantagineum.EMBO J 14610-618)。
大部分還未知的復(fù)雜調(diào)節(jié)和信號過程控制著水分缺乏期間的基因表達(dá)。與兩類蛋白，即蛋白酶和泛素降解機(jī)制有關(guān)的基因被水分不足誘導(dǎo)，該基因產(chǎn)物可能參與細(xì)胞水分損失過程中變性的蛋白的降解。同時(shí)，硫醇蛋白酶(一種參與在壓力下變性蛋白降解的酶)也被水分缺乏誘導(dǎo)(Guerrero，F(xiàn).D.，Jones，J.T和Mullet，J.E.(1990)Turgor-responsive gene transcription and RNA levels increases rapidlywhen pea shoots are wiltedsequence and expression of three induciblegenes.Plant Mol.Biol.1511-26)。
Neale，A.D.，Blomstedt，C.K.，Bronson，P.，Le，T.-N.，Guthridge，K.，Evans，J.，Gaff，D.F.和Hamill，J.D.從復(fù)蘇的Sporobolus stapfianus中分離出干旱壓力誘導(dǎo)型基因(2000.The isolation of genes from theresurrection grass Sporobulus stapfianus which are induced during severedrought stress.Plant，Cell and Environment.23265-277)。探測到基因編碼一個(gè)eIF1翻譯起始因子，兩個(gè)干旱壓力誘導(dǎo)型富含甘氨酸的蛋白質(zhì)，一個(gè)液泡膜嵌入蛋白(tonoplast-intrinsic protein，TIP)和一個(gè)早期光誘導(dǎo)蛋白(early light-inducible protein，ELIP)。以前，沒有發(fā)現(xiàn)這些基因產(chǎn)物和干旱壓力有關(guān)。這是第一次報(bào)道提示，編碼eIF1翻譯起始因子的基因可能在植物干旱壓力反應(yīng)中起作用。
幾種不同的壓力可以啟動相同或類似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。不同壓力引起的水分損失自然現(xiàn)象可以也導(dǎo)致植物激素ABA聚集，已知內(nèi)源性ABA含量增加能誘導(dǎo)某些水分缺乏誘導(dǎo)基因。因而ABA聚集是水分缺乏期間誘導(dǎo)基因的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的步驟之一。已有報(bào)道植物中的幾個(gè)蛋白激酶在各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的磷酸化過程(包括水分壓力和ABA反應(yīng))中發(fā)生作用。
已經(jīng)分離出了ABA誘導(dǎo)的蛋白激酶的cDNA，即pKABA1(Anderberg，R.J.和Walker-Simmons，M.K.(1992)Isolation of wheatcDNA clone for an abscisic acid-inducible transcript with homology toprotein kinases.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910183-10187)。一種新的激素盒包含基因Athb-12和Athb-7由水分缺乏和外源性ABA處理誘導(dǎo)，但是時(shí)程試驗(yàn)顯示，上述兩個(gè)基因由不同的方式調(diào)節(jié)(Lee，Y.H.和Chun.J.Y.(1998)A new homeodomain-leucine zipper gene fromArabidopsis thaliana induced by water stress and abscisic acid treatment.Plant Mol.Biol.37377-384)。
已有證據(jù)表面，壓力誘導(dǎo)反應(yīng)可能是由ABA介導(dǎo)也可能不依賴ABA(Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)Gene expressionand signal transduction in water-stress response.Plant Physiol.115327-334)。ABA介導(dǎo)基因反應(yīng)可能要求，也可能不要求發(fā)生蛋白合成。ABA誘導(dǎo)rd22(與Vicia faba的一種未知種子蛋白同源的蛋白)基因的mRNA需要發(fā)生蛋白合成，因?yàn)榉啪€酮抑制基因誘導(dǎo)(Yamaguchi-Shinozaki K.和Shinozaki，K.(1993)The plant hormone abscisic acidmediates the drought-induced expression but not the seed-specificexpression of rd22，a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsisthaliana.Mol.Gen.Genet.23817-25)。
基因結(jié)構(gòu)分析揭示，調(diào)節(jié)序列(順式作用基元)asl(TGACG)和spl(GGGCGG)分別位于-463和-443位(Briggs，M.R.，Kadonaga，J.T.，Bell，S.P.和Tijan，R.(1986).Pu rification and Biochemicalcharacterization of the promoter-specific transcription factor，Sp1.Science23447-52；Lam，E.，Benfey，P.M.，F(xiàn)ang，R.X.和Chua N-H.(1989).Sitespecific mutations alter in vitro factor binding and change promoterexpression pattern in transgenic plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.877891-7894)。同時(shí)顯示，這些序列分別和myb(含有Trp群基元的轉(zhuǎn)錄因子家族)識別元件TGGTTAG的-144和-666位點(diǎn)和2bHLH(基本螺旋-環(huán)-螺旋，basic helix-loop-helix，MYC)識別基元(CACATG)的-200和-191位點(diǎn)相似。已分離出編碼MYC相關(guān)DNA結(jié)合蛋白的cDNA(rd22BP1)，其編碼一68kD的蛋白，該蛋白是MYC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基本區(qū)域螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈基元的典型DNA結(jié)合區(qū)域。
該蛋白確實(shí)與MYC識別位點(diǎn)結(jié)合(Abe，H.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，Urao，T.，Iwasaki，T.，Hosokawa，D.和Shinozaki，K.(1997)Role ofArabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and AbscisicAcid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.91859-1868)。已經(jīng)克隆了干旱和ABA誘導(dǎo)型基因，該基因編碼MYB相關(guān)蛋白ATMYB2。rd22BP1(MYC)和ATMYB2(MYB)蛋白是rd22基因脫水和ABA誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄活化劑(Abe，H.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，Urao，T.，Iwasaki，T.，Hosokawa，D和Shinozaki，K.(1997).Role of Arabidopsis MYC andMYB Homologs in Drought-and Abscisic Acid-Regulated GeneExpression.The Plant Cell.91859-1868)。
與擬南芥(Arabidopsis)中的rd22相反，HVA22很少被干旱和ABA誘導(dǎo)，但可被放線酮誘導(dǎo)。HVA22的啟動子區(qū)包含ABA反應(yīng)復(fù)合體ABRE3，CE1和另一種ABA反應(yīng)復(fù)合體，后一種復(fù)合體依賴于G盒與另一種未知偶聯(lián)元件的相互作用(Shen，Q.和Ho，T-H D.(1995)Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene RevealsTwo Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing a G-Boxand a novel cis-Acting Element.The Plant Cell.7295-307)。
Yamaguchi-Shinozaki K和Shinozaki，K.克隆了一個(gè)脫水反應(yīng)基因rd29A，該基因不依賴于ABA反應(yīng)途徑(1993.Characterization of theexpression of dessication-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana andanalysis of its promoter in transgenic plants.Mol.Gen.Genet.236331-340)。發(fā)現(xiàn)TACCGACAT序列調(diào)節(jié)干旱誘導(dǎo)型基因，位于其他脫水誘導(dǎo)型基因的啟動子區(qū)。
一旦A.Thaliana中rd29a啟動子控制的DREBLA(脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)過量表達(dá)，那么很多壓力耐受型基因就都得到表達(dá)，從而提高干旱和其他幾種壓力的耐受型(Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1999)Improving plantdrought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology.17287-291)。
對DRE結(jié)合蛋白DREB2的另一基因的分析顯示，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中其啟動子在水分壓力下可被誘導(dǎo)(Nakasiniha，K.，Shinwari，Z.K.，Sakuma，Y.，Seki，M.，Miura，S.，Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000)Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genesencoding DRE-binding proteins involved in dehydration and high salinityresponsive gene expression.Plant.Mol.Biol.42657-665)。這些基因的表達(dá)不需要ABA，但對外源性ABA有反應(yīng)。
也有對ABA處理沒有反應(yīng)的干旱誘導(dǎo)型基因，如rd21，erd1和rd19，他們分別編碼硫醇蛋白酶，CIp蛋白酶和硫醇蛋白酶(Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)Gene expression and signaltransduction in water-stress response.Plant Physiol.115327-334)。事實(shí)上，有關(guān)這些基因的資料非常少。
一直需要尋找新的干旱相關(guān)基因，因此需要研究更好的改進(jìn)，除了表1列出的基因和基因序列外，新的基因序列羅列如下ABRE.，ABA-反應(yīng)元件(PyACGTGGC)(Shen Q和Ho.(1995)Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene RevealsTwo Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing a G-Boxand a novel cis-Acting Element.The Plant Cell.7295-307)。
G-盒，普遍存在的調(diào)節(jié)元件(CACGTG).(Menkens，A.E.，Schindler，U.和Cashmore A.R.(1995)The G-boxubiquitous regulatoryDNA element in plants bound by GBF family of bZIP proteins.Trends inBiochem Sci.20506-510)。
DRE，脫水反應(yīng)元件(TACCGACAT)(Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1996)Molecular responses to drought and coldstress.Current opinion in biotechnology.7161-167)。
MYBRS，MYB識別序列(PyAACPyPu)(Urao T，Yamaguchi-Shinozaki K，Urao S，Shinozaki K(1993)An Arabidopsis mybhomolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to theconserved MYB recognition sequence.The Plant Cell51529-1539)。
MYCRS，MYC識別序列(CANNTG)(Abe，H.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，Urao，T.，Iwasaki，T.，Hosokawa，D and Shinozaki，K.(1997)Role of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and AbscisicAcid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.91859-1868)。
當(dāng)使用與干旱或其他壓力有關(guān)的基因和基因片段(本發(fā)明上下文中的基因片段是指完整基因的部分核酸序列)時(shí)，有下列可能(a)通過表1所述的幾條路線克隆基因。
表1

<p>表1-12

Holmstrom，K.O.，Welin，B.和Mandal，A.將埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)(微生物)的三甲基甘氨醛脫氫酶轉(zhuǎn)移到煙草(高等植物)中，該煙草就具有干旱耐受力(1994，Production of theEscherichia coli betaine-aidehyde sakydrogonase an enzyme required forthe synthesis of the osmoprotectant glycine betaine，in transgenic plants.Plant J.6749-758)。
(c)還可以通過其他環(huán)境變化來表達(dá)干旱壓力表達(dá)基因Iuchi，S.，Kobayashi，Yamaguchi-Shimuzaki，K和Shinozaki，Kazuo報(bào)道，在水分和鹽壓力反應(yīng)下VcNCED1基因表達(dá)(2000 Astress-inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase involved inabscisic acid biosynthesis under water stress in drought tolerant compound.Plantphysical 123553-662)。
Pelloux J.，Jolivet，Y.，Hontaine，V.，Banvoy，J.，和Dizengromel，P.(2001 Changen in Rubieco and Rubisco activase gene expression andpolypeptide expression.)以及Richard.S.Mordancy.M.Drevet.C.Jouanin，L.和Seguin，S.(2000.Isolation and characterization of adehydrin gene from white spruce induced upon wounding，drought andcold stress.Plant Mol.Biol.43-1-10)報(bào)道，PgDhnl基因被干旱、寒冷壓力和受傷誘導(dǎo)。
Nakashima.K.Shinwari，Z.K..Sakuma，Y..Seki.M..Miura，S，Shinozaki.K.和Yamaguchi-bninozaki.K報(bào)道，在脫水和高鹽壓力下有干旱反應(yīng)元件DREB2基因表達(dá)(2000.Organization and expression oftwo Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involvedin dehydration and high salinity responsive gene expression.Plant.Mol，Biol 42；657-665)。
Hirayama.T..Ohto.C.Mizoguchi.T.和Shinozaki，K報(bào)道在干旱、鹽和低溫壓力下有磷酸肌醇特異性磷脂酶C表達(dá)(1995.A geneencoding a phosphoinositol-specific phospholipase C in induced bydehydration and salt stress in Arabidopsis thaliano，Proc.Natl.Acad.Sci 923903-3907)。
Weretilnyk.E.A，.和Hanson.A.D.報(bào)道，干旱和鹽壓力下，有三甲基甘氨醛脫氫酶基因表達(dá)(1990.Molecular cloning of a plantbetaine-aldehyde dehydrogenase，an enzyme implicated in adaptation tosalinity and drought.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，872745-2749)。
(d)可以用經(jīng)鑒定的基因來研究調(diào)節(jié)元件。在本發(fā)明中，調(diào)節(jié)元件是指諸如啟動子、轉(zhuǎn)錄因子和其他控制基因表達(dá)序列的區(qū)域。
Straub，P.P..Shen Q.和Ho，Tuan-hua.D使用壓力調(diào)節(jié)基因HVA1分析基因啟動子(1994.Structure and promoter analysis of an ABA-andstress-regulated barley gene，HVA1.Plant.Mol.Biol.26617-630)。Michel，D.，Salamini F.，Bartels，D.Dale，P.，Baga，M..和szalay，A選擇干旱反應(yīng)基因CdeT27-46分析其啟動子區(qū)域(1993.Analysis of adesiccation and ABA-responsive promoter Isolated from the resurrectionplant Craterostigma plantagineum.Plant Journal 429-40)。
Urao T.Yamaguchi-Shinozaki K.Urao S.Shinozaki K確定了編碼脫水反應(yīng)基因Atmyb2的轉(zhuǎn)錄因子的序列(1993.An Arabidopsis mybhomolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to theconserved MYB recognition sequence.Plant Cell 51529-1539)。同時(shí)Yamaguchi-Shinozaki.K和Shinozaki，K.分析了干旱誘導(dǎo)基因rc的啟動子區(qū)域(1997，Characterization of the expression of adesiccation-responsive rd29 gene of arabidopsis thaliana and analysis of itspromoter in transgenic plants.Mol Gen Genet 236331-340)。
Abe.H.，Yamaguchi-Shinozaki.K..Urao，T..Iwasaki，T..Hosokawa.D和Shinozaki.K.分析了干旱誘導(dǎo)基因rd22的調(diào)節(jié)因子(1997.Role ofArabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and AbscisicAcid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.91859-1868)。
Shen Q和Ho T.D分析了HVA22基因的調(diào)節(jié)元件，并且報(bào)道了新的偶聯(lián)元件(1995.Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene Reveals Two Independent ABA-ResponsiveComplexes Each Containing a G-Box and a novel c/s-Acting Element.ThePlant Cell.7295-307)。
(e)將從一系統(tǒng)中分離的基因或基因片段作為研究其他植物系統(tǒng)中相似基因的探針Roberts，J K和Key.J.L使用從果蠅(Drosophila)中克隆的hsp70基因來克隆大豆的相似基因(1991.Isolation and characterization of asoybean hsp70 gene.Plant molecular biology，16671-683)。
Singia.S.L..Pareek A和Grover的研究顯示，酵母hsp KM和大米hsp 110非常相似(1997 Yeast HSP104 homologue rice HSP 110 isdevelopmental-and stress regulated.Plant science，125211-219)。這些基因在干燥、鹽、低溫和高溫下表達(dá)。
Shen，Q.Chen，C.N.Brands，A..Pan.S.M.和Ho，T.D報(bào)道干旱誘導(dǎo)基因HVA22在幾種有機(jī)體種存在，如谷類，擬南芥，線蟲(Caenorhabitis elegans)，人類，鼠類和酵母(2001 The stress-andabscisic acid-induced barley gene HVA 22developmental regulation andhomologues in diverse organisms.Plant Molecular Biology.45327-340)。
(f)可以將在一個(gè)組織中表達(dá)的基因在另一組織中表達(dá)，如表2所示表2


(g)使用標(biāo)準(zhǔn)方案來克隆全長cDNAs或基因組DNA是可能的，技術(shù)詳述參見Ausubel.F.M.Brend R..Kingston.R.E.，Moore.D.D..Seidman.J.G..Smith，J.A.，Struhl.K于1987編的Current protocols inmolecular biology以及紐約的出版商John Wiley和Sons及Sambrook.J.Fritsch，E.F和Maniatis.T于1989年出版的Molecular cloning；alaboratory manual，Second edition.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.。
各種干旱基因相關(guān)基因的簡要說明見表3表3各種干旱相關(guān)基因、其來源和預(yù)期功能






<p>表1實(shí)施例11a產(chǎn)物的X-射線粉末衍射圖樣如下，以d間距表示。

實(shí)施例11b2-(R)-(4-氟-2-甲基-苯基)-4-(S)-((8aS)-6-氧代-六氫-吡咯并[1，2-a]-吡嗪-2-基)-哌啶-1-羧酸[1-(R)-(3，5-雙-三氟甲基-苯基)-乙基]-甲基酰胺鹽酸鹽為二水合物結(jié)晶形式向265mg實(shí)施例11a加入3ml水。將懸液在25℃下攪拌過夜，然后在10000rpm下離心5分鐘。利用離心過濾裝置(Millipore Ultrafree-MC 0.45μm)過濾固體，得到標(biāo)題化合物(250mg)。
X-射線粉末衍射數(shù)據(jù)報(bào)告在表2中。
參考文獻(xiàn)見(1)Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1994)The PlantCell.6251-264；該文獻(xiàn)描述了擬南芥模式植物中參與干旱、低溫和高鹽反應(yīng)的新順式作用元件的鑒別。
(2)Li，L.g.，Li，S.f.，Tao，Y.，和Kitagawa，Y.(2000)PlantScience 15443-51，該文獻(xiàn)從大米中克隆了新的水通道蛋白，該蛋白顯示其與爪蟾卵母細(xì)胞的寒冷耐受性有關(guān)。
(3)Tabaeizadeh、Zohrer、Yu、Long-Xi、Chen、Ri-Dong于1997年8月12日提交的美國專利No.5,656,474，該文獻(xiàn)從干旱壓力Lycopersicon chilense植物的樹葉中分離和鑒別了兩個(gè)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因家族的滲透壓力和ABA反應(yīng)成員。
(4)Kim、Soo Young于2001年6月21日提交的美國專利No.6,245,905，該文獻(xiàn)從從植物中分離了編碼脫落酸反應(yīng)元件結(jié)合因子2(ABF2)的核酸分子。
(5)Kim、Soo Young于2001年4月17日提交的美國專利No.6,218,527，該文獻(xiàn)從植物中分離了編碼脫落酸反應(yīng)元件結(jié)合因子3(ABF3)的核酸分子。
(6)Thomshow、Michael F.、Stockinger、Eric，J.于1999年4月6日提交的美國專利No.5,892,009，該文獻(xiàn)克隆了CBF1基因，該基因編碼CBF1蛋白，與調(diào)節(jié)植物中低溫和脫水耐受性促進(jìn)基因表達(dá)的區(qū)域連接。
(7)Chun、Jong-Yoon、Lee、Yong-Hun于1999年11月9日提交的美國專利No.5,981,729，該文獻(xiàn)克隆了水分缺乏和脫落酸誘導(dǎo)型的新基因。
現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)在于a.早期克隆干旱壓力基因的工作集中于植物系統(tǒng)模型，大部分是一年生植物。終年常綠的植物，如茶，在生命周期中可以經(jīng)歷幾個(gè)循環(huán)的干旱壓力。因此，該植物預(yù)期存在新的參與植物干旱耐受的基因。
b.堅(jiān)持不懈地尋找新基因，并利用其來生產(chǎn)更多的干旱耐受植物。植物模型，例如阿拉伯芥和其他表1所述家養(yǎng)植物已被用來克隆干旱相關(guān)基因。期望從其他至今未研究的植物中產(chǎn)生新的基因。
c.已報(bào)道的克隆干旱相關(guān)基因的方法依賴于cDNA文庫差異性篩選方法，差異性cDNA文庫分析和扣除雜交(參見表1、2和3)。這些方法在同一時(shí)間分析兩個(gè)樣本有其固有的局限性。因此，在鑒別和克隆差異性表達(dá)基因后，通常通過該基因在恢復(fù)期或在對其他變化，例如鹽壓力/ABA處理的反應(yīng)過程中來檢測其表達(dá)。因此，需要應(yīng)用合適的方法在一開始就關(guān)注該期望基因。
上述缺陷可以首次以本發(fā)明所述的一種簡單和可靠的方式而克服，該方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是非顯而易見的。
本發(fā)明的發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是克隆經(jīng)歷干旱壓力后在茶樹葉中表達(dá)的新基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是克隆經(jīng)歷干旱壓力但仍存在于整個(gè)植物的在茶樹葉中表達(dá)的新基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是鑒別經(jīng)歷干旱壓力后在茶樹葉中表達(dá)的新基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是克隆經(jīng)歷干旱壓力后在茶樹葉中被抑制的新基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生經(jīng)歷干旱壓力后(相對于灌溉好)在茶樹葉中表達(dá)和抑制的基因譜，以鑒別差異性表達(dá)基因，并克隆該基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是生產(chǎn)經(jīng)歷干旱壓力和ABA處理后在恢復(fù)和良好灌溉條件下(良好灌溉條件是指應(yīng)用大量的水分讓植物維持其水勢)茶樹第4葉表達(dá)和抑制的基因譜，以鑒別差異性表達(dá)基因，并克隆該基因。
本發(fā)明的進(jìn)一步發(fā)明目的是以水勢量化壓力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是研究干旱壓力下生理學(xué)活性的改變。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是確定干旱耐受性茶樹的基因組可變區(qū)的位置。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是確認(rèn)差異性表達(dá)基因的經(jīng)鑒定的3’端以證實(shí)經(jīng)歷干旱壓力的茶樹葉相對于良好灌溉的茶樹發(fā)生差異性表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在脫落酸條件下和恢復(fù)期間對經(jīng)鑒定基因進(jìn)行表達(dá)研究。本發(fā)明中恢復(fù)是指當(dāng)干旱壓力植物被灌溉，其水勢等于良好灌溉對照植物的水勢。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是克隆差異性表達(dá)基因的經(jīng)鑒定的3’端。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是對克隆基因的經(jīng)鑒定的3’端進(jìn)行測序。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在資料庫中比較克隆基因的序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過所述新基因向生物系統(tǒng)中引入水分壓力耐受性的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過所述新基因向茶樹中引入水分壓力耐受性的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及三個(gè)新基因，SEQ ID No 1-3，其有利于生物系統(tǒng)的水分壓力耐受性，所述基因在干旱條件下在茶樹中差異性表達(dá)，及其引入所述基因到生物系統(tǒng)中幫助其形成水分壓力耐受性的方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及三個(gè)新基因，SEQ ID No 1-3，其有利于生物系統(tǒng)的水分壓力耐受性，所述基因在干旱條件下在茶樹中差異性表達(dá)，及其引入所述基因到生物系統(tǒng)中幫助其形成水分壓力耐受性的方法。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，顯示差異性表達(dá)的三個(gè)新基因如下DS31(T11G，AP65)——SEQ ID NO.1DS61(T11A，AP1)——SEQ ID NO.2DS103(T11A，AP65)——SEQ ID NO.3括號中的是用于克隆基因的各種引物組合物。這些引物的詳細(xì)說明在實(shí)施例4中作詳細(xì)說明。
DS31(T11G，AP65)基本上是基因3`端的區(qū)域，northern印跡中能和1.5kb大小的轉(zhuǎn)錄物雜交，如附圖7所示。
DS61(T11A，AP1)基本上是基因3`端的區(qū)域，northern印跡中能和750bp大小的轉(zhuǎn)錄物雜交，如附圖7所示。
DS103(T11A，AP65)基本上是基因3`端的區(qū)域，northern印跡中能和1.9kb大小的轉(zhuǎn)錄物雜交，如附圖7所示。
每個(gè)克隆都用M/s的T7測序版本2測序試劑盒手工測序，使用Amersham Pharmacia Biotech，USA的測序引物[Lgh(5′-CGACAACACCGATAATC-3′)或Rgh(5′-GACGCGAACGAAGCAAC-3′)]。
本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因的序列為SEQ ID NO1資料(i)序列特征
(A)長度318bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO1基因數(shù)和詳細(xì)資料DS31(T11G，AP65)，括號中的術(shù)語是引物組合物，引物組合物的詳細(xì)說明見實(shí)施例4。
下劃線所示為引物aagc ttcaagaccaatcaatatt gttgcactca tgggcctggg atcatgtggg cctggatcat gtgggcctacacctttgtcc aagttcttca aggataggtg cccagatgct tatagctatc ctcaggatga tccaaccagt ttgttcacttgtcctcctgc tggtaccaat tattgcctat accttctgcc cttgaggcct ctttttcact cccttccctc tctttataattataggacag tgttatagta caataagacc tcactagttt caatatttgt gagattcaga cactgtgttt aattaaatttgtgacattta gtgttgtccaaaaaaaaaaa gcttSEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度251bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO2
基因數(shù)和詳細(xì)資料DS61(T11A，AP1)，括號中的術(shù)語是引物組合物，引物組合物的詳細(xì)說明見實(shí)施例4。
下劃線所示為引物aagc ttgattgccaataagaagg ggtcttgact agcccctgtt atatgagacg tgaggagcga tggcgatgacgatgatgacg atgatgatgt tggtgtggca gccagccgca taactttttt cagttttgat tgtctaaggt tttgatatgttaatggtcag ctaagcaaat acatgagctc atatatteag tacttggcat ataaataacc tgtcttgcta ttcatattaatgttctagat atgataatca ccttctctctctaaaaaaaa aaagcttSEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度361bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO3基因數(shù)和詳細(xì)資料DS103(T11A，AP65)，括號中的術(shù)語是引物組合物，引物組合物的詳細(xì)說明見實(shí)施例4。
下劃線所示為引物aagc ttcaagaccatcggcaaca gatgttgaaa ctcaccttac actaatgtgt ccagatcttc tcaacaggaattctagcaac cgaggacacc actatgatgt gtccagctct tctcaacagg aattgtagca atttagacaa ccgaggacaccactatacat acatacaagc atggttttaa ataaagcgtt cacatagctg atatcagata ctattgacgt gcagatattgttgaatatcg gtatcaatat tttaaaacca tgcatatgag agttcaacac aagttagaag ctctcttttg ttttcattttacaagtttgt gtaatttgat gtaagagcaa aagcttagta tatgtaatga gaattttgaactaaaaaaaa aaagctt
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因?yàn)镾EQ ID No.1-3。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述SEQ ID No.1的基因的長度為318bp。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述SEQ ID No.2的基因的長度為251bp。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述SEQ ID No.3的基因的長度為361bp。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因是環(huán)形的。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因在水分缺乏壓力下在茶樹(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)中差異性表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及鑒別水分缺乏壓力下在茶樹中差異性表達(dá)的基因SEQ ID No.1-3的方法。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及從在正常和干旱條件下生長的植物中分離總mRNA。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及逆轉(zhuǎn)錄所述mRNA獲得相應(yīng)的cDNA。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及對cDNA測序。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及用所述cDNA序列確定差異性表達(dá)基因。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行cDNA序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及使用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及所述基因在茶樹葉中差異性表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及顯示植物mRNA鏈的3`端差異性表達(dá)的方法。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述植物是茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述差異性表達(dá)通過Northern印跡確定。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及通過基因SEQ ID No.1-3向植物系統(tǒng)中引入缺水壓力耐受性的方法，該方法包括轉(zhuǎn)移所述基因到所述系統(tǒng)中的步驟。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因轉(zhuǎn)化技術(shù)選自包括農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)和基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，用所述方法調(diào)整所述壓力耐受性。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及用所述基因制備探針來鑒定對在水分缺乏壓力下生長具有耐受性的植物系統(tǒng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述基因用于在干旱條件下產(chǎn)生耐受性。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述基因用于產(chǎn)生抗干旱耐受性。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的SEQ ID No.1-3負(fù)責(zé)植物中的水分壓力耐受性。所述基因獨(dú)立或聯(lián)合向植物中引入干旱耐受性。所述基因從茶樹葉中分離得到。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因在植物中是穩(wěn)定的?；蛟趩幼雍驼{(diào)節(jié)元件的輔助下，能在所有植物系統(tǒng)中表達(dá)。該基因能給所有植物引入干旱耐受性，尤其是整合了該基因的茶樹。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，觀察到所述基因在植物系統(tǒng)的2/3代中一致表達(dá)。所述基因表達(dá)在2/3后代中一致。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)所述基因?qū)τ谵D(zhuǎn)化了該基因的植物的正常功能沒有副作用。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，克隆在經(jīng)歷干旱壓力的Camellia sinensis(L.)O.Kuntze(下文稱之為茶)葉中表達(dá)的新基因。具體地，本發(fā)明涉及比較水分壓力下和良好灌溉的2年生茶樹的第4葉的基因表達(dá)方式，以確認(rèn)和克隆該差異性表達(dá)基因。具體地，本發(fā)明還涉及新的基因末端的3引物(此后稱作3`)的確認(rèn)、克隆和分析(本發(fā)明中基因是指脫氧核糖核酸(下文稱作DNA)的部分，其能產(chǎn)生信使核糖核酸(下文稱為mRNA))，該基因在經(jīng)歷干旱壓力的茶樹的第4葉中表達(dá)。3`端是指mRNA的聚-A尾巴非?？拷囊欢?。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在干旱壓力調(diào)節(jié)下的茶樹中的三個(gè)新基因的克隆，該克隆方法包括●在經(jīng)歷干旱壓力的茶樹的第4葉中表達(dá)的新的基因序列●在經(jīng)歷干旱壓力的茶樹的第4葉中被抑制的新的基因序列
●第4葉中表達(dá)或抑制的基因的3’端圖譜，以鑒別差異性表達(dá)基因和克隆基因●確認(rèn)差異性表達(dá)基因的經(jīng)鑒定的3’端以證實(shí)茶植物中的差異性表達(dá)，和●克隆的差異性表達(dá)基因3’端的序列信息在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，選擇2年生茶樹克隆TV78，其生長在Himalayan Bioresource Technology，Palampur研究所的試驗(yàn)農(nóng)場中(32°06′32″N；76°33′43″E；高度1300m)。所有的植物都是從一個(gè)親本無性繁殖而來，以確保所有研究植物的遺傳同質(zhì)性。因此，觀察到的因?yàn)樘幚矶l(fā)生改變的基因表達(dá)能反應(yīng)處理的效果，而不是基因的異質(zhì)性。植物在塑料罐中培養(yǎng)(14.5cm高×15cm頂直徑×9cm低直徑)。一個(gè)罐中只有一個(gè)植物。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所有植物都在溫室中生長，以確保溫度和濕度的相對一致性。所有試驗(yàn)均采用從頂部數(shù)第4節(jié)點(diǎn)的張開的葉子(平均長度9.5±0.19cm；平均寬度3.65±0.1cm)。在試驗(yàn)期間，第一、二和三葉子的葉面積發(fā)生改變，而使基因表達(dá)產(chǎn)生生長相關(guān)改變，但第四葉的面積卻保持穩(wěn)定，平均長度9.5±0.19cm；平均寬度3.65±0.1cm。因此本發(fā)明選擇第四節(jié)點(diǎn)的葉子。第五節(jié)點(diǎn)的葉子相對于第四節(jié)點(diǎn)的要老一些。本發(fā)明的整個(gè)策略是選擇一些節(jié)點(diǎn)的葉子，這些節(jié)點(diǎn)的葉子相對年輕，其生長變化可以忽略或最小。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，對照植物正常地灌溉，而在處理點(diǎn)處抑制水分而產(chǎn)生干旱。每隔2天用棉簽將ABA(5mM)施到植物的近軸和離軸面上，和用于ABA處理的植物的根部(2ml)。正常灌溉的植物作為對照。干旱14天后正常給水以用于恢復(fù)試驗(yàn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，各種參數(shù)采集時(shí)間為處理后0、7、14和18天。用于差異顯示和northern印跡的樹葉樣本在第14天(對照組、干旱和ABA處理)和18天(恢復(fù)試驗(yàn))采集。樹葉用焦炭酸二乙酯(以下稱之為DEPC)處理液洗滌，[DEPC處理液的制備如下將DEPC加入到蒸餾水中，終濃度為0.1％，孵育，過夜，然后高壓滅菌(即加熱到121℃，壓力1.1kg/cm2)]，收集，然后立即浸入液氮中，凍結(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)以終止細(xì)胞活性。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及經(jīng)歷干旱的茶樹的第4葉中表達(dá)的基因的新3引物(以下稱之為3’)端的鑒別、克隆和分析。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及經(jīng)歷干旱的茶樹的第4葉中被抑制的基因的新3’端的鑒別、克隆和分析。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及從CO、DS、RC和AB葉中分離總mRNA，采用“差異顯示技術(shù)”來產(chǎn)生在CO、DS、RC和AB葉中表達(dá)和抑制的基因的3’端圖譜[Liang，P.，Zhu，W.，Zhang，X.，Guo，Z.，O′Connell，R.，Averboukh，L.，Wang，F(xiàn).and Pardee，A.B.(1994).Differential display using one-base anchored oligo-dT primers.NucleicAcids Res.22(25)5763-5764]。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及將DS茶樹芽中表達(dá)的基因的3’端連接到載體中，以產(chǎn)生重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到合適的大腸桿菌宿主中而產(chǎn)生克隆。本發(fā)明的載體是指能夠接受外源DNA的DNA序列，呈現(xiàn)環(huán)形質(zhì)粒DNA形式，對給定抗生素具有耐受性。
在本發(fā)明的一個(gè)有利的具體實(shí)施方案中涉及將DS茶樹芽中被抑制的基因的3’端連接到載體中，以產(chǎn)生重組質(zhì)粒，將該治質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到合適的大腸桿菌宿主中而產(chǎn)生克隆。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，檢測CO、DS、RC和AB葉中表達(dá)或抑制的基因，以確定他們與干旱壓力的相關(guān)性。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，用雙脫氧鏈終止方法對基因進(jìn)行測序以計(jì)算基因的單值性(Sanger，F(xiàn).S.，Nicklen，and A.R.，Coulson(1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的新的三個(gè)基因SEQ IDNo 1-3，該基因負(fù)責(zé)植物水分壓力耐受性。所述的基因獨(dú)立或聯(lián)合地向植物引入干旱耐受性。所述基因是從茶樹葉中分離的代。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因在植物系統(tǒng)中是穩(wěn)定的。發(fā)現(xiàn)在其啟動子和調(diào)節(jié)元件的幫助下，該基因在所有植物中都能表達(dá)。該基因能給所有植物引入干旱耐受性，尤其是整合了該基因的茶樹。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，觀察到所述基因在植物系統(tǒng)的2/3后代中一致表達(dá)。所述基因表達(dá)在2/3后代中是一致的。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)向植物導(dǎo)入該基因后，對植物正常功能沒有任何副作用。
附圖的簡要說明

圖1顯示了經(jīng)過ABA(AB)處理、控制水分產(chǎn)生干旱壓力(DS)和隨后在第14天給水(RC)的2年齡的茶樹第4葉的水勢(A)，光合作用率(B)和Fv/Fm比率(C)。四個(gè)不同測試數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
圖2顯示了茶樹第4葉中分離的總mRNA。附圖的縮寫分別表示CO，從良好灌溉的對照組中分離的RNA；DS，從干旱壓力植物中分離的RNA；RC，從恢復(fù)植物中分離RNA；AB，ABA處理的植物中分離的RNA；M，代表RNA標(biāo)記。
圖3顯示了CO、DS、RC和AB處理后在第4葉中表達(dá)和抑制的基因的3’端的圖譜，使用的啟動子組合如每條線底部所示，箭頭表示差異性表達(dá)。
圖4顯示了CO、DS、RC和AB處理后在第4葉中表達(dá)和抑制的基因的3’端的圖譜，使用的啟動子組合如每條線底部所示，箭頭表示差異性表達(dá)。
圖5顯示了從變性聚丙烯酰胺凝膠中洗脫的差異性表達(dá)的基因3’端的擴(kuò)增，M代表DNA大小標(biāo)記。
圖6顯示了如圖5所示的洗脫的差異性表達(dá)的基因3’末端的克隆的擴(kuò)增，M代表DNA大小標(biāo)記。
圖7顯示了通過northren雜交克隆基因的3’端來確認(rèn)差異性表達(dá)。
下述具體實(shí)施方案將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。但具體實(shí)施方案僅僅是為了說明，而不應(yīng)該認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的范圍以權(quán)利要求為準(zhǔn)。
實(shí)施例實(shí)施例1經(jīng)過ABA(AB)處理、控制水分產(chǎn)生的干旱壓力(DS)以及隨后在第14天再給水(RC)的2年齡的茶樹第4葉的水勢(A)，光合作用率(B)和Fv/Fm比率(C)。
水勢(以下以ψ表示)用干濕計(jì)測量(露點(diǎn)微伏特計(jì)，模式HR33T，Wescor USA)。葉盤(直徑0.5cm)用鋒利的紙張打孔機(jī)打孔，隨即放入樣本室(C-52；Wescor，USA)中。平衡30min后，獲得冷卻系數(shù)值(單位微伏)。將該值除以0.75(正比常數(shù)，將獲得的值轉(zhuǎn)換為“巴(bar)”，ψ的單位)獲得ψ值。干濕計(jì)的所有單位校準(zhǔn)為25℃，非25℃溫度下，以下公式進(jìn)行校正新溫度下的冷卻系數(shù)＝0.7(新溫度攝氏度值-25℃)+25℃下的冷卻系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)值(廠家提供)。
光合作用率用便攜式光合作用系統(tǒng)(Li-6400，Li-COR，Lincoln，Nebr.，USA)測定。使用廠家提供的藍(lán)-紅LED裝置維持光強(qiáng)度常數(shù)1000μEm-2s-1，并使用相同廠家提供的Peltier冷卻和加熱裝置以維持室溫度為25℃。
使用植物壓力計(jì)(PSM Mark II，Biomonitor，Sweden)測量葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)。在使用峰值為500nm光化性光激活葉綠素之前，使用黑暗適應(yīng)夾使葉子適應(yīng)黑暗。Fv/Fm率，表示光合系統(tǒng)II的光化學(xué)效率，按廠商說明記錄。
CO和RC植物的樹葉表型是扁平和張開的，而DS和AB植物的葉部分是卷曲的，這是植物的干旱反應(yīng)特征。對照組的參數(shù)，如ψ、A和Fv/Fm在試驗(yàn)期間都保持不變(附圖1)。而且，對照組的第4葉的葉面積在試驗(yàn)期間也保持不變。
在水控制點(diǎn)處，在7天里，ψ降低了23.4％，在14天里，該值降低了87.2％。A值分別降低了15.5％和62.9％；而Fv/Fm分別降低了0.56％和52.5％。在ABA處理的實(shí)施例中，ψ分別在7天里和14天里降低了16.5％和52.5％；A值分別降低了22.5％和57.7％；而Fv/Fm分別降低了1.8％和44.2％。上述降低值是相對于零值的那天而言(附圖1)。
在恢復(fù)試驗(yàn)中，ψ、A和Fv/Fm的值和對照組非常相似。
因此，該試驗(yàn)顯示，茶樹有很大的能力恢復(fù)其ψ、A和Fv/Fm所示的正常功能，盡管其經(jīng)歷了嚴(yán)重的干旱，ψ只有零值那天的12.8％。而且，在特定的ψ處，該數(shù)據(jù)能量化基因表達(dá)模式。
實(shí)施例2RNA的分離，用DNase 1消化RNA，RNA的定量和凝膠電泳為確保CO、DS、RC和AB茶樹葉的核糖核酸(以下稱之為RNA)的高質(zhì)量，使用RNeasy植物迷你試劑盒(購自M/s.Qiagen，Germany)。根據(jù)商家說明分離RNA。用260nm吸收率對RNA進(jìn)行定性，測定260nm和280nm的吸收比率對其純度進(jìn)行監(jiān)控。260nm/280nm的比值A(chǔ)＞1.8就達(dá)到本發(fā)明需要的目的。以下是計(jì)算RNA濃度和產(chǎn)出的公式RNA濃度(μg/ml)＝A260(260nm處的吸收率)×40×稀釋因子總量(μg)＝濃度×原料RNA樣本體積檢查RNA的完整性將5-6μgRNA溶于4.5μlDEPC處理的高壓滅菌水中，用15.5μl的M1溶液稀釋(2μl的5×MOPS緩沖液，3.5μl甲醛，10μl甲酰胺[5×MOPS緩沖液300mM乙酸鈉，10mM MOPS(3-{N-嗎啉}丙磺酸)，0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)])，65℃，孵育15min。加入2μl甲醛凝膠上樣緩沖液[50％甘油，1mM EDTA(pH，8.0)，0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯苯胺FF]，將RNA上樣到1.5％的甲醛瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓72v，1×MOPS緩沖液(60mM乙酸鈉，2mM MOPS，0.1mM EDTA)，操作如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.and Maniatis，T.1989(Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)所述。
微粒去除殘留DNA，將RNA(10-15μg)用10單位的DNase I在1×反應(yīng)緩沖液[10×反應(yīng)緩沖液100mM Tris-Cl(pH，8.4)，500mMKCl，15mM MgCl2，0.01％凝膠]中消化，37℃孵育30min(MessageClean試劑盒，購自M/s.GenHunter Corporation，USA)。加入PCI(苯酚、氯仿和異戊醇比例為25∶24∶1)沉淀DNase I，在0.3M乙酸鈉存在的情況下加入3倍體積的乙醇沉淀水相中的RNA。-70℃孵育3小時(shí)，將RNA沉淀用冷的70％乙醇清洗，最后溶解在10μl無RNA酶的水中。將獲得的無DNA的RNA進(jìn)行量化，如上方法測定其完整性，RNA性質(zhì)如附圖2所示。
需要大量的RNA時(shí)，我們使用改良的鹽酸胍方法(Lal，L.，Sahoo，R.，Gupta，R.K.，Sharma，P.和Kumar，S.Plant Molecular BiologyReporter 19181a-181f)。
除了上述方法，也可以使用其他方法分離茶樹第4葉的RNA。
實(shí)施例3逆轉(zhuǎn)錄(以下稱之為RT)將mRNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNAs(以下稱之為cDNAs)將來自CO、DS、RC和AB樣本的無DNA的RNA 0.2μg使用公知的逆轉(zhuǎn)錄酶各自反應(yīng)產(chǎn)生cDNAs。反應(yīng)如下0.2μM T11M引物(T11M中的M可以是T11A，T11C或T11G)，20μM dNTPs，RNA和RT緩沖液[25mM Tris-Cl(pH，8.3)，37.6mM KCl，1.5mM MgCl2和5mMDTT]。在本發(fā)明中，dNTP是指脫氧三磷酸核苷，包括脫氧三磷酸腺苷(以下稱之為dATP)、脫氧三磷酸鳥苷(以下稱之為dGTP)、脫氧三磷酸胞苷(以下稱之為dCTP)和脫氧三磷酸胸苷(以下稱之為dTTP)。根據(jù)每個(gè)RNA樣本的相應(yīng)T11M設(shè)定三個(gè)RT反應(yīng)。該反應(yīng)在溫度循環(huán)儀(型號480，購自M/s Perkin-Elmer，USA)中進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄的參數(shù)是65℃，5min，→37℃，60min，→75℃，5min，→4℃(直到去除樣本)。37℃孵育10min后加入100單位逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)50min。4個(gè)不同的RNA樣本和3個(gè)T11M產(chǎn)生12個(gè)反應(yīng)體系，得到12個(gè)不同的cDNA組。根據(jù)錨定堿基的M的不同(A，C或G)將總的RNA分為三個(gè)亞組(逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是RNAimage試劑盒的一種成分，該試劑盒購自M/s.GenHunter Corporation，USA)。
實(shí)施例4通過mRNA差異顯示產(chǎn)生差異性表達(dá)基因圖譜以鑒別差異性表達(dá)基因?qū)?shí)施例2得到的CO、DS、RC和AB的RT產(chǎn)物的不同cDNA亞組進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(以下稱之為PCR，該方法由Hofftnan-LaRoche Inc的專利揭露)擴(kuò)增，以放射性標(biāo)記dATP標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。放射性PCR操作如下20μl反應(yīng)混合物包括(1)反應(yīng)緩沖液[10mMTris-Cl(pH，8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％凝膠]，(2)2μMdNTPs，(3)0.2μM T11M和(4)0.2μM隨機(jī)引物(化合物1-4從M/s.GenHunter Corporation，Nashville，USA購得，作為RNAimage試劑盒的一部分)，0.2μlα[33P]dATP(～2000Ci/mmole，購自JONAKI Center，CCMB campus Hyderabad，India)，和1.0單位Thermus aqueticus(以下稱之為Taq)DNA聚合酶(購自M/S.Qiagen，Germany)。30μl無菌礦物油覆蓋在各反應(yīng)頂部以防止蒸發(fā)而導(dǎo)致體積改變。每個(gè)反應(yīng)的T11M引物與合成cDNA中所用的相同。參數(shù)選擇如下40循環(huán)，94℃，30s，→40℃，2min，→72℃，30s；一個(gè)循環(huán)72℃，5min；最后4℃孵育。
將擴(kuò)增產(chǎn)品加到6％變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分級。為此，將3.5μl每種擴(kuò)增產(chǎn)品與2μl上樣染料[95％甲酰胺，10mM EDTA(pH，8.0)，0.09％二甲苯靛FF和0.09％溴酚藍(lán)]混合，80℃孵育2min，上樣到6％的變性聚丙烯酰胺凝膠[變性聚丙烯酰胺凝膠15ml丙稀酰胺(40％的丙稀酰胺和雙丙稀酰胺原料比例20∶1)，10ml of 10×TBE，40ml蒸餾水和50g尿素]中電泳，1×TBE緩沖液[10×TBE108g Tris堿，55g硼酸和40ml 0.5M EDTA(pH，8.0)]作為跑膠緩沖液，60w，直到二甲苯靛(移動更慢的燃料)到達(dá)玻璃板的下端。測序膠的大板子的尺寸是13×16英尺。電泳后，去除一塊玻璃板，將凝膠轉(zhuǎn)移到3MM Whattman濾紙上，凝膠真空干燥，80℃過夜。用柯達(dá)X膠片曝光2-3天。曝光前，在干燥凝膠的四角用放射性墨水標(biāo)記，以利進(jìn)一步排列。圖3-4顯示CO、DS、RC和AB茶樹第4葉的差異性表達(dá)基因圖譜，顯影后，將膠片用于分析CO、DS、RC和AB信號條帶。
用于差異顯示的引物序列如下(購自M/s.GenHunter Corporation，USA，作為RNAimage試劑盒的一部分)T11M(錨定)引物 引物序列T11A5′-AAGCTTTTTTTTTTTTTA-3′T11C5′-AAGCTTTTTTTTTTTTTC-3′T11G5′-AAGCTTTTTTTTTTTTTG-3′隨機(jī)引物引物序列AP1 5′-AAGCTTGATTGCC-3′AP365′-AAGCTTCGACGCT-3′AP375′-AAGCTTGGGCCTA-3′AP655′-AAGCTTCAAGACC-3′
AP665′-AAGCTTGCCTTTA-3′AP675′-AAGCTTTATTTAT-3′AP685′-AAGCTTCTTTGGT-3′實(shí)施例5cDNA探針的再擴(kuò)增同樣，差異性表達(dá)帶克隆需要從變性聚丙烯酰胺凝膠中洗脫并進(jìn)一步擴(kuò)增以產(chǎn)生大量的DNA用于克隆。放射自顯影相片(曝光的X射線膠片)用干膠與放射性墨水定位。用無菌鋒利剃刀切割確認(rèn)的差異性表達(dá)條帶(與凝膠和濾紙一起)。在離心管中，100μl無菌水孵育10min以洗滌凝膠和濾紙的DNA，隨后煮沸10min。10,000rpm離心2min，使濾紙和凝膠碎片沉淀，把包含DNA的上清夜轉(zhuǎn)移到一新管中。用10μl 3M乙酸鈉，pH，5.5，，5pl肝糖原(原料濃度10mg/ml)和450μl乙醇沉淀DNA。-70℃孵育過夜，然后4℃離心，10,000rpm，10min，沉淀DNA以85％乙醇洗滌。DNA沉淀溶于10μl無菌蒸餾水。
洗脫的DNA用與實(shí)施例4相同的T11M和隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增。而且，除了dNTP的濃度以20μM代替2μM且不加入同位素外，其他PCR條件相同。反應(yīng)上調(diào)到40μl，PCR完成后，30μl PCR樣品在1.5％瓊脂糖凝膠上在包括溴乙啶的TEA緩沖液中(TAE緩沖液0.04MTris-乙酸，0.002M EDTA，pH8.5)(終濃度0.5μg/ml)(參見附圖5)跑膠。得到的擴(kuò)增產(chǎn)品在-20℃保存，以便克隆。
實(shí)施例6再擴(kuò)增PCR產(chǎn)品的克隆用200單位T4DNA-連接酶在1×連接緩沖液中(10×連接酶緩沖液500mM Tris-Cl，pH7.8，100mM MgCl2，100mM DTT，10mM ATP，500[mu]g/ml BSA)將實(shí)施例4獲得的再擴(kuò)增PCR產(chǎn)品連接到300ng稱之為PCR-TRAP載體的插入預(yù)備載體中。載體和其他需要的化合物購自M/s.GenHunter Corporation，Nashville，USA，用于PCR-TRAP克隆系統(tǒng)。連接操作在16℃在熱循環(huán)480(購自M/s.Perkin Elmer，USA)中進(jìn)行16小時(shí)，PCR產(chǎn)物連接到載體，如上述載體中產(chǎn)生環(huán)化質(zhì)粒。將外源DNA，例如本發(fā)明的PCR產(chǎn)物連接到合適的載體，例如PCR-TRAP載體的方法即為公知的克隆?？梢允褂闷渌虡I(yè)上可得的適于PCR產(chǎn)物克隆的載體。如前所定義的那樣，質(zhì)粒是一封閉的環(huán)形DNA分子，該載體存在于合適的宿主中，例如大腸桿菌埃希氏大腸桿菌(以下稱之為大腸桿菌)中的獨(dú)立染色體DNA，并可以賦予宿主抗生素耐受性。PCR-TRAP載體生成的質(zhì)粒賦予抗四環(huán)素耐受性。
連接的產(chǎn)品或質(zhì)粒需要置于合適的大腸桿菌宿主中以便增殖和繁殖，通過轉(zhuǎn)化方法。上述連接產(chǎn)品10μl用于轉(zhuǎn)化100μl感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(購自M/s.GenHunter Corporation USA，作為PCR-TRAP(R)克隆系統(tǒng)的一部分)。所謂感受態(tài)是指該大腸桿菌細(xì)胞能夠接受質(zhì)粒DNA。為此，將要連接的產(chǎn)品于感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴45min；劇烈加熱2min；在0.4ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)(LB培養(yǎng)基1L蒸餾水/去離子水中含有10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉)。將200μl轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在LB-四環(huán)素(1L中含10g氯化鈉和四環(huán)素，終濃度20μg/ml)平板上，37℃生長過夜。形成克隆，將單個(gè)分離克隆重劃線到LB-四環(huán)素平板上培養(yǎng)以獲得相同類型的克隆。顯然，四環(huán)素耐受性轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞明顯地表面PCR產(chǎn)物，即確認(rèn)的基因被克隆。
在上述整個(gè)過程中，T11M引物的選擇使mRNA的聚A尾巴區(qū)得到擴(kuò)增。聚A尾巴總是附于基因的3`端，因此T11M引物和隨機(jī)引物總是產(chǎn)生基因的3`區(qū)。
實(shí)施例7檢測PCR產(chǎn)物大小一旦基因被克隆和大腸桿菌被轉(zhuǎn)化，就必須檢測質(zhì)粒是否插入了正確大小的PCR產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^克隆PCR來完成，其中該克隆被裂解，然后將含有模板的裂解液用合適引物進(jìn)行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。
從實(shí)施例6的再劃線平板中挑選克隆，置于50μl克隆裂解緩沖液[克隆裂解緩沖液TE(Tris-Cl 10mM，1mM EDTA，pH8.0)和0.1％tween 20]，煮沸10min。沉淀細(xì)胞碎片，將上清液或含有模板DNA的克隆裂解產(chǎn)物用于PCR。PCR成分大部分和實(shí)施例4相同，除了用Lgh(5′-CGACAACACCGATAATC-3′)和Rgh(5′-GACGCGAACGAAGCAAC-3′)(特異性克隆位點(diǎn)側(cè)翼載體序列)引物代替T11M和隨機(jī)引物，2μl克隆裂解產(chǎn)物代替洗脫的DNA。而且反應(yīng)體積減少到20μl?？寺CR的條件是94℃，30s→52℃，40s→72℃，1min，30個(gè)循環(huán)，然后72℃，延伸5min，1個(gè)循環(huán)，最后保持在4℃。擴(kuò)增產(chǎn)物和分子量標(biāo)記在1.5％瓊脂糖凝膠上跑膠冰分析插入基因的正確大小。由于使用Lgh和Rgh側(cè)翼引物，克隆PCR產(chǎn)物的大小大于120bp，因?yàn)閭?cè)翼載體序列也被擴(kuò)增了(參見附圖6)。
實(shí)施例8用Northern印跡確認(rèn)差異性表達(dá)上述克隆的PCR產(chǎn)物位于差異性表達(dá)基因的3`端。本發(fā)明的范圍內(nèi)，將這些克隆的DNA片段稱為基因。由于差異性顯示總是有假陽性，即顯著差異性表達(dá)的基因(Wan，J.S.和Erlander，M.G.1997.Cloning differentially expressed genes by using differential display andsubtractive hybridization.In Methods in Molecular Biology.Vol.85Differential display methods and protocols.Eds.Liang，P.and Pardee，A.B.Humana press Inc.，Totowa，N.J.，pp.45-68)，Northern印跡能確認(rèn)CO、DS、RC和AB茶樹第4葉間的差異性表達(dá)。Northern印跡要求制備放射標(biāo)記探針，隨后將其和變性RNA雜交，印跡至膜上。
將實(shí)施例7的擴(kuò)增產(chǎn)品作為Northern印跡探針。擴(kuò)增產(chǎn)品在1.5％瓊脂糖凝膠中顯影后，從膠中切除，根據(jù)說明用QIAEX II凝膠抽提試劑盒(購自M/s.Qiagen，Germany)洗脫膠中的DNA。
根據(jù)說明，將純化片段用HotPrime試劑盒(購自M/s.GenHunterCorporation，Nashville，USA)進(jìn)行α[32P]dATP(4000Ci/mmole)標(biāo)記。用Q1Aquick核苷除去試劑盒(QIAGEN，Germany)純化放射標(biāo)記探針以除去非插入放射核酸。
為了進(jìn)行印跡，將20μgRNA在1.0％甲醛瓊脂糖凝膠中跑膠，基本如實(shí)施例2所述。跑膠一旦完成，在振蕩情況下將凝膠用DEPC高壓滅菌水沖洗2次，每次20min。然后將凝膠在振蕩情況下用10×SSPE(10×SSPE1.5M氯化鈉，115mM NaH2PO4，10mM EDTA)沖洗2次，每次20min。同時(shí)，將尼龍膜(Boehringer mannheim cat.no.#1209272)用DEPC水濕化，然后浸入到10×SSPE，5min，輕微振蕩。然后將凝膠中的RNA真空印跡(壓力40mb)到尼龍膜上，使用DEPC處理的10×SSPE作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)。轉(zhuǎn)化進(jìn)行4小時(shí)。壓力在凝膠移出真空印跡器前提高到70mb，維持15min。轉(zhuǎn)化后，移除凝膠，UV光源下在尼龍膜表面標(biāo)記RNA標(biāo)記。干燥尼龍膜，80℃烘烤45min。5×SSPE(20×SSPE3M氯化鈉，230mM磷酸鈉，20mM EDTA)簡單沖洗后，將該膜浸入預(yù)雜交液(50％甲酰胺，0.75M NaCl，50mM磷酸鈉，pH7.4，5mM EDTA，0.1％Ficoll-400，0.1％BSA，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％SDS溶液和150ug/ml新鮮煮沸鮭精DNA)中處理5小時(shí)。
將已合成的放射標(biāo)記探針煮沸10min使其變性，然后加入預(yù)雜交液浸濕印跡膜。雜交進(jìn)行16小時(shí)。去除溶液，在室溫下將用含有0.1％的SDS的1×SSC沖洗膜2次(20×SSC；3M氯化鈉和0.3M枸櫞酸鈉二水合物，pH，7.0)，每次15min。最后，在50℃用預(yù)溫的含有0.1％的SDS的0.25×SSC沖洗15min。移出膜，卷入到莎倫包裝膜(saranwrap)中，根據(jù)信號強(qiáng)度將X-射線膠片曝光12-240小時(shí)。
當(dāng)進(jìn)行Northern雜交時(shí)，將來自CO、DS、RC和AB第4葉的RNA印跡到膜上，并進(jìn)行測試來選擇探針。附圖7顯示了3個(gè)這種探針的結(jié)果，確認(rèn)了CO、DS、RC和AB第4葉之間的差異性表達(dá)，三個(gè)基因確認(rèn)發(fā)生差異性表達(dá)，其設(shè)計(jì)為DS31(T11G，AP65)DS61(T11A，AP1)DS103(T11A，AP65)括號中是克隆基因所用的各種引物組合。引物的詳細(xì)描述見實(shí)施例4。
DS31(T11G，AP65)，基本上是基因3`端的區(qū)域，northern印跡中能和1.5kb大小的轉(zhuǎn)錄物雜交，如附圖7所示。
DS61(T11A，AP1)基本上是基因3`端的區(qū)域，northern印跡中能和750bp大小的轉(zhuǎn)錄物雜交，如附圖7所示。
DS103(T11A，AP65)基本上是基因3`端的區(qū)域，northern印跡中能和1.9kb大小的轉(zhuǎn)錄物雜交，如附圖7所示。
上述轉(zhuǎn)錄物的大小是在RNA標(biāo)記的幫助下得到測量(Cat#R7020，購自M/S.Sigma chemical company，USA)。
實(shí)施例9使用BLAST(BLAST表示Basic Local Alignment Search Tool)在URLwww.ncbi.nlm.nih.gov的基因庫中搜索所有序列來確定序列的唯一性。序列ID1的結(jié)果令人欣慰，318個(gè)堿基的最大比特值是107，最大同一性也是107堿基(33.6％)。與已知序列如此低的同一性賦予了該克隆基因新穎性。進(jìn)一步分析揭示(附件1)，dr3l顯示了與下列基因的3`端有非常顯著的差異得分(8e-22到3e-9之間)，(1)葡萄(Vitis vinifera)，大豆和煙草(Nicotiana tabacum)的奇甜蛋白樣蛋白(thaumatin like proteins，TLP)；(2)發(fā)病機(jī)理相關(guān)的(pathogenesis-related，PR)含有煙草紅花煙種(N.tabacum)mRNA的蛋白R主要形式(E值，1e-17)；和(3)山毛櫸(Fagus sylvatica)的滲透素樣蛋白(osmotin-like protein，OLP)的部分olp2基因(E值，8e-19)。在BLAST程序中，E值或期待值表示在隨機(jī)檢索的數(shù)據(jù)庫中，期望發(fā)生的得分等于和好于S的不同配對數(shù)目，E值越低，得分越顯著。TLP，R主要形式PR蛋白以及OLP，這三個(gè)蛋白都屬于PR蛋白的PR-5家族，已知其受真菌感染和滲透壓壓力期間的誘導(dǎo)(SinghN.K.，Bracker C.A.，Hasegawa P.M.，Handa A.K.，Buckel S.，HermodonM.A.，Pfankoch E.，Regnier F.E.，Bressan R.A.1987.Charaterization ofosmotin.A thaumatin-like protein associated with osmotic adaptation toplant cells.Plant Physiology 85，529-536；Yun D.J.，Bressan R.A.，Hasegawa P.M.1997.Plant antifungal proteins.Plant Breeding Reviews1439-88)。因此PR-5家族和其基因可能與防御真菌感染和干旱有關(guān)，所以，茶樹防御干旱毒副作用的保護(hù)機(jī)制之一是通過過量產(chǎn)生RP-5樣基因產(chǎn)品。
序列ID2的結(jié)果也令人欣慰，251個(gè)堿基，最大比特得分是52，最大同一性是26個(gè)堿基(10.4％)。和已知序列如此低的同一性賦予了該克隆基因新穎性。序列同源性檢索顯示，ID2與雞的集鈣蛋白(calsequestrin)mRNA 3`端的顯著性得分是3e-4。集鈣蛋白是鈣結(jié)合蛋白，該蛋白在動物系統(tǒng)中有很少報(bào)導(dǎo)，存在于心臟和骨骼肌中(Cala，S E，Jones，L R.1983.Rapid purification of calsequestrin fromcardiac and skeletal muscle sacroplasmic reticulum vesicles byCa-dependent elution from phenyl-sepharose.Journal of BiologicalChemistry 258，11932-11936)。該蛋白除了作為鈣離子的存儲蛋白，還參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在紅甜菜和黃瓜中免疫研究顯示一55kDa多肽和兔骨骼肌的集鈣蛋白的單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。
這些集鈣蛋白樣蛋白參與細(xì)胞Ca2+調(diào)節(jié)。
需要說明的是，干旱/滲透壓力介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高，已知其能啟動干旱誘導(dǎo)基因產(chǎn)生離子保護(hù)性(Knight H，Brandt-S，Knight M R.1998.A history of stress alters drought calcium signaling pathways inArabidopsis.The Plant Journal 16，681-687；Knight H，Trewavas A J，Knight M R.1997.Calcium signaling in Arabidopsis thaliana respondingto drought and salinity.The Plant Journal 125，1067-1078)。抑制集鈣蛋白將導(dǎo)致內(nèi)Ca2+水平的升高，從而啟動一系列干旱誘導(dǎo)的基因。因此，數(shù)據(jù)顯示集鈣蛋白可能參與茶樹干旱條件下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
序列ID3的結(jié)果也令人欣慰，361個(gè)堿基，最大比特得分是40，最大同一性是23(11.1％)。與已知序列如此低的同一性賦予了該克隆基因新穎性，然而E值得分更高(陽性)，因此，在對該完整基因進(jìn)行克隆和測序前，很難斷定該序列的任何功能。
本發(fā)明的基因認(rèn)為具有新穎性，因?yàn)榕c2002年3月公開的資料庫序列相比較，同源性＜35％。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于●三個(gè)新基因，能促進(jìn)植物中的水分壓力耐受性。
●新基因能促進(jìn)干旱耐受性，尤其是茶樹中。
●克隆干旱壓力相關(guān)新基因的方法。
●CO、DS、RC和AB茶樹葉中表達(dá)和抑制基因的3`端圖譜，用于鑒別出現(xiàn)的差異性表達(dá)基因。
●確認(rèn)差異性表達(dá)基因的經(jīng)鑒定的3`端以證明經(jīng)歷干旱壓力的茶樹葉中存在差異性表達(dá)。
●測序克隆的差異性表達(dá)基因的3`端顯示還沒有記載在數(shù)據(jù)庫的新基因的唯一性●向植物系統(tǒng)中引入干旱耐受性的方法。
●向茶樹中引入干旱耐受性的方法。
權(quán)利要求
1.SEQ ID No 1-3的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的基因，其中SEQ ID No.1的基因的長度是318bp。
3.如權(quán)利要求1所述的基因，其中SEQ ID No.2的基因的長度是251bp。
4.如權(quán)利要求1所述的基因，其中SEQ ID No.3的基因的長度是361bp。
5.如權(quán)利要求1所述的基因，其中所述基因是環(huán)形的。
6.如權(quán)利要求1所述的基因，其中所述基因在缺水壓力條件下，在茶樹(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)中差異性表達(dá)。
7.一種鑒定在缺水壓力條件下，茶樹中SEQ ID No 1-3的基因差異性表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟(i)分離正常條件和干旱條件下生長的所述植物的總mRNA；(ii)逆轉(zhuǎn)錄所述mRNA獲得cDNA；(iii)測序所述cDNA；(iv)用所述cDNA鑒定差異性表達(dá)的基因。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中通過雙脫氧鏈終止法對所述cDNA進(jìn)行測序。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中用酶逆轉(zhuǎn)錄酶將所述mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述基因在茶樹葉中差異性表達(dá)。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述方法在所述植物mRNA鏈的3`端顯示差異性表達(dá)。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其中的茶樹是Camellia sinensis(L.)O.Kuntze。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的差異性表達(dá)通過Northern印跡來確認(rèn)。
14.一種利用SEQ ID No 1-3的基因在植物系統(tǒng)中引入缺水壓力耐受性的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)化所述基因到所述植物中的步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的方法用于利用SEQ IDNo 1-3的基因向茶樹中引入缺水壓力耐受性。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的基因用選自如下的技術(shù)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述方法用于調(diào)節(jié)所述壓力的耐受性。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述基因用于制備探針以鑒定對在所述缺水壓力條件下生長具有耐受性的植物。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述基因用于在干旱條件下形成耐受性。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述基因用于形成抗干旱的耐受性。
全文摘要
本發(fā)明涉及對生物系統(tǒng)的水分耐受性有用的三個(gè)新基因SEQ IDNo.1－3，所述基因在干旱條件下，在茶樹中差異性表達(dá)；以及將所述基因引入到生物系統(tǒng)中以幫助形成缺水耐受性的方法。
文檔編號C12N15/82GK1628127SQ02829011
公開日2005年6月15日 申請日期2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月27日
發(fā)明者普里特·夏爾馬, 桑賈伊·庫馬爾, 帕拉姆維爾·辛格·阿胡賈 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會