專利名稱：新的根結(jié)線蟲(Meloidogyne)抗性基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的根結(jié)線蟲抗性基因。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的不受高溫影響、并適用于多種根結(jié)線蟲物種和品系且對(duì)其具有數(shù)量抗性的根結(jié)線蟲抗性基因。本發(fā)明進(jìn)一步涉及應(yīng)用該基因的方法。
背景技術(shù)：
線蟲屬于動(dòng)物，組成一個(gè)龐大的門，是一種寄生于植物或動(dòng)物的有害的生物體。一般寄生于植物的根結(jié)線蟲長(zhǎng)度為1mm或更短。然而它們從植物的細(xì)胞胞質(zhì)中吸取營(yíng)養(yǎng)成分，由此造成的危害在世界范圍內(nèi)約為每年10億美元。迄今為止，已經(jīng)鑒定出了約70種屬于根結(jié)線蟲屬(Meloidogyne)的根結(jié)線蟲。因?yàn)樗鼈兗纳谒蟹N類的農(nóng)作物和多種雜草，所以據(jù)報(bào)道，它們所危害的植物超過(guò)2000種，包括甘薯、番茄和馬鈴薯。
當(dāng)一種植物感染了根結(jié)線蟲，在初期其地上部分觀察不到明顯的癥狀可以有效地用來(lái)判斷是否寄生了線蟲；但蟲癭或結(jié)已經(jīng)在其地下部分形成。物種及其變體不同，蟲癭或結(jié)的大小也是不同的，通常情況下約為1-2mm。因此，蟲癭或結(jié)有時(shí)是難以肉眼觀察到的，盡管位于蟲癭或結(jié)表面或根上的卵塊是可以肉眼觀察到的。最明顯的癥狀是在根或塊莖上出現(xiàn)一條垂直的裂縫，并且線蟲在各個(gè)發(fā)育階段均寄生于被感染的根或塊莖上。根結(jié)線蟲感染不僅降低農(nóng)作物的產(chǎn)量，而且大大降低或削減被感染的根或塊莖的市場(chǎng)價(jià)值。而且產(chǎn)生的根或塊莖上的裂縫使其它的病原生物很容易地侵害植物，從而提高了混合感染的可能性(Hooker，W.J.，Compendium of Potato Diseases，97-98頁(yè)，1981，The American Phytopathological Society，St.PaulMinnesota，U.S.A.；Jansson和Raman，Sweet Potato Pest Management，1-12頁(yè)，1991，Westview Press，Boulder，Colorado，U.S.A.；Jones等，Compendium of Tomato Diseases，49-50頁(yè)，1991，APS PRESS，St.Paul，Minnesota，U.S.A.)。
寄生于馬鈴薯的根結(jié)線蟲屬線蟲有如下四種花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne(M.)arenaria Chitwood)；南方根結(jié)線蟲(M.incognita Chitwood)；北方根結(jié)線蟲(M.hapla Chitwood)；和爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica Chitwood)。其中南方根結(jié)線蟲在世界范圍的馬鈴薯中發(fā)病率最高(Hooker，W.J.，Compendium of PotatoDiseases，97-98頁(yè)，1981，The American Phytopathological Society，St.Paul Minnesota，U.S.A.)。在日本Kyushu馬鈴薯種植區(qū)發(fā)現(xiàn)了線蟲感染，當(dāng)?shù)氐臍夂驕睾汀Ｒ虼耸谟柁r(nóng)作物抗性或發(fā)展害蟲綜合控制技術(shù)是所希望的。
對(duì)于馬鈴薯，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)是通過(guò)農(nóng)作物輪作來(lái)控制根結(jié)線蟲的。這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于降低線蟲的種群密度是有效的；然而，對(duì)于雜食性根結(jié)線蟲來(lái)說(shuō)，僅僅通過(guò)農(nóng)作物輪作來(lái)控制根結(jié)線蟲是困難的，因?yàn)檗r(nóng)作物輪作周期是有限的。另外，根結(jié)線蟲的種群密度也可以通過(guò)施用有機(jī)肥料在氨態(tài)氮的作用下得以控制。這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在在非洲、亞洲和中南美洲仍然使用，盡管這不是一項(xiàng)根本的控制根結(jié)線蟲的方法。用二氯丙稀、甲基溴等進(jìn)行土壤熏蒸是最快速作用的一項(xiàng)技術(shù)。然而，這項(xiàng)技術(shù)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)民存在不利的影響。
目前，增強(qiáng)寄主馬鈴薯線蟲抗性的技術(shù)已經(jīng)處于試驗(yàn)階段，并生成了許多抗性品系(Watanabe等，Amer.Potato J.71599-604，1994；Watanabe等，Breeding Science 45341-347，1995；Watanabe等，Breeding Science 46329-336，1996；Watanabe等，Beeding Science4953-61，1999；Watanabe和Watanabe，Plant Biotechnology171-16，2000)。對(duì)線蟲特別是南方根結(jié)線蟲具有高度抗性的四倍體馬鈴薯栽培種，迄今為止還沒有生成。
已經(jīng)嘗試使用近緣的具有根結(jié)線蟲抗性的野生二倍體來(lái)賦予栽培品種的抗性。基于表現(xiàn)型的遺傳分析或育種經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)近緣野生二倍體含有根結(jié)線蟲抗性基因(Rmi)，并且發(fā)現(xiàn)這些基因具有數(shù)量抗性和加性效應(yīng)(Iwanaga等，J.Amer.J.Hort Sci.，114(6)1008-1113，1989；Watanabe等，Breeding Sci.，46323-369，1996；Watanabe等，Breeding Sci.，4953-61，1999)。在前面所述的文獻(xiàn)中，報(bào)道了由Rmi基因引起的抗性不受溫度的影響，并且在高溫下仍然具有活性。但是還未分離出Rmi，其序列也是未知的。因?yàn)樵耘喾N馬鈴薯是同源四倍體，因此其遺傳方式是復(fù)雜的。因此，培育有用的抗性品種現(xiàn)在還不能實(shí)現(xiàn)。
現(xiàn)在，對(duì)于番茄和馬鈴薯，僅鑒定出一組根結(jié)線蟲抗性基因組在幾個(gè)基因圖譜中的位置。例如，對(duì)于番茄，報(bào)道了抗南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的秘魯番茄(Lycopersicon.peruvianum)衍生的Mi基因位于第6號(hào)染色體上(Messeguer等，Theor.Appl.Genet.，82529-536，1991；Ho等，PlantJ.，2971-982，1002)。據(jù)報(bào)道抗南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲的秘魯番茄衍生的Mi3基因位于12號(hào)染色體(Yaghoobi等，Theor.Appl.Genet.，91457-464，1995)。Williamson等的研究組分離了Mi基因，并說(shuō)明了其組成(Rossi等，Proc Natl Acad.Sci，959750-9754，1998；Milligan等，Plant Cell，101307-1319，1998)。因?yàn)镸i基因受高溫的影響，在感染的起始階段即感染后24-48小時(shí)期間，由于高溫其抗性不利地失活。
對(duì)于馬鈴薯，報(bào)道了抗根結(jié)線蟲(Meloidogyne chitwoodi)品系1的Rmc 1位于S.bulbocastanum的11號(hào)染色體(Brown等，TheorAppl.Genet.，92572-576，1996)。關(guān)于南方根結(jié)線蟲的抗性傳遞，據(jù)報(bào)道有兩種可能1)兩個(gè)或更多的基因參與抗性(Gomez等，Amer.Potato J.，60353-360，1983)；和2)細(xì)胞質(zhì)參與抗性發(fā)展(Gomez等，Amer.Potato J.，60353-360，1983；Iwanaga等，J.Amer.Hort.Sci.，1141108-1013，1989)。再有，發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲抗性是由5或6個(gè)抗性基因控制的加性和數(shù)量抗性(Watanabe等，Breed.Sci.，953-61，1999；Watanabe等，已提交)。
通常，植物對(duì)病原體的強(qiáng)抗性一般是高度特異性的。Folr提出的“基因?qū)颉奔僬f(shuō)提出高度特異性抗性基于植物抗性基因和病原體的無(wú)毒基因的相互作用(Flor，Ann.Rev.Phytopathol.，9275-296，1971)。一般假說(shuō)認(rèn)為配體-受體模式是基因?qū)蚍肿幼R(shí)別的一種機(jī)制(Gabriel和Rolfe，Ann.Rev.Phytopathol.28365-391，1990)。
迄今為止，分離的抗性基因基于基因產(chǎn)物的功能或結(jié)構(gòu)的相似性被分為5類(Baker等，Science，276726，1997；Bergelson等，Science2922281-2285，2001；Dangl和Jones，Nature 411826-833，2001)。I類抗性基因具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)和富亮氨酸重復(fù)(LRR)，而且據(jù)推論這些區(qū)域與抗性發(fā)展的信號(hào)傳遞有關(guān)。分離的I類基因的例子包括抗煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus)的煙草N基因(Whitham等，Cell，781101-1105，1994)；抗亞麻柵銹菌(Melampsoralini)的亞麻L(zhǎng)6(Lawrence等，Plant Cell，71195-1206，1995)和M(Anderson等，Plant Cell，9641-651，1997)基因；抗寄生霜霉(Peronospora parasitica)的擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)RPP5基因(Bent，Plant Cell，81757-1771，1996)，及其抗丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的RPS2(Bent等，Science2651856-1860，1993；Mindrinos等，Cell，781089-1099，1994)和RPM1(Grant等，Science，269；843-846，1995)基因；抗丁香假單胞菌的番茄PRF基因(Salmeron等，Cell 86123-133，1996)及其抗尖鐮孢(Fusarium oxysporum)的12C-1基因(Ori等，Plant Cell9521-531，1997)。再有，前面所述的抗根結(jié)線蟲的秘魯番茄衍生Mi基因同樣具有NBS和LRR(Milligan等，Plant Cell 101307-1319，1998)。
屬于第I類的蛋白在C末端側(cè)有不完整的LRR，在它的N末端側(cè)有不完整的NBS。在ATP酶、GTP酶等中發(fā)現(xiàn)了NBS，由3個(gè)基元組成并包含一個(gè)P環(huán)(Traut，Eur J.Biochem.，2299-19，1994)。通常，第一個(gè)激酶1a結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)磷酸結(jié)合環(huán)，激酶2結(jié)構(gòu)域在其下游。據(jù)推測(cè)固定在激酶2結(jié)構(gòu)域的天冬氨酸調(diào)整對(duì)磷酸移動(dòng)必需的金屬結(jié)合位點(diǎn)。激酶3a結(jié)構(gòu)域位于其下下游，具有通常與ATP的嘌呤相互作用的酪氨酸和精氨酸(Traut，Eur J.Biochem.，2299-19，1994)。該NBS的存在表明激酶活性或G蛋白在激活抗性中扮演著重要的角色(Hammond-Kosack和Jones，1997，Annu.Rev.Plant Phusiol.PlanyMol.Bioi.，48575-607，1997)。
在多種蛋白中發(fā)現(xiàn)了LRR區(qū)，并且認(rèn)為其通常在酵母、果蠅、人、或其它物種中與蛋白-蛋白之間的相互作用有關(guān)(Kobe和Deisenhofer，Nature，366751-756，1993)。然而，關(guān)于植物對(duì)害蟲的抗性，推測(cè)LRR區(qū)起著配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能，該配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域由無(wú)毒(Avr)基因形成，或者促進(jìn)抗性(R)基因產(chǎn)物和其它涉及防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白之間的相互作用(Bent，Plant Cell，81757-1771，1996)。
馬鈴薯是世界范圍內(nèi)的主要的農(nóng)作物，從發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)和日本的高投入農(nóng)業(yè)到發(fā)展中國(guó)家如非洲、亞洲和拉丁美洲的低投入農(nóng)業(yè)，馬鈴薯總是和生產(chǎn)體系的寬范圍相一致的優(yōu)良農(nóng)作物。馬鈴薯被在世界范圍內(nèi)廣泛種植，被用作飼料、工業(yè)淀粉、和發(fā)酵原料，也用作食品如主食、蔬菜、或零食(Harris，P.M.The Potato Crop，Chapman andHall，London，1978；International Potato Center http://www.cgiar.org.cip/2004)。從產(chǎn)品產(chǎn)量和卡路里供給量的觀點(diǎn)來(lái)看，馬鈴薯都是最重要的農(nóng)作物之一，尤其對(duì)于發(fā)展中國(guó)家。在這些國(guó)家中，人口在快速地增長(zhǎng)，對(duì)于這種有價(jià)值的食物來(lái)源，在未來(lái)幾年急切希望提高馬鈴薯產(chǎn)品的量和馬鈴薯的產(chǎn)量。
由于害蟲而失去大量的馬鈴薯，并且在許多地區(qū)包括熱帶、亞熱帶、和溫帶地區(qū)，由根結(jié)線蟲所造成的損失尤其嚴(yán)重(Hooker，W.J.，Compendium of Potato Diseases，97-98頁(yè)，1981，The AmericanPhytopathological Society，St.Paul Minnesota，U.S.A)。
遺憾的是，對(duì)由根結(jié)線蟲所造成的損失還沒有根本的解決辦法，因而闡明抗性基因的結(jié)構(gòu)和功能是人們所期待的。
發(fā)明公開內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種解決由根結(jié)線蟲所造成的嚴(yán)重?fù)p失的方法，這通過(guò)發(fā)現(xiàn)一種優(yōu)良的根結(jié)線蟲抗性基因?qū)崿F(xiàn)，該基因可廣泛適用于多種根結(jié)線蟲物種。
本發(fā)明者已經(jīng)基于如NBS或LRR核酸序列篩選出了二倍體馬鈴薯品系，NBS或LRR通常包含于一組植物抗性基因中。結(jié)果，成功地分離了一種新的具有優(yōu)良根結(jié)線蟲抗性的基因。同時(shí)還利用上述基因成功地生產(chǎn)出了具有優(yōu)良根結(jié)線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物，從而完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明涉及如下(1)-(8)的內(nèi)容。
(1)由下列(a)或(b)的DNA組成的基因(a)由SEQ ID NO1表示的核苷酸序列組成的DNA；或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列組成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列組成的DNA雜交，并且賦予宿主根結(jié)線蟲抗性的DNA。
(2)根據(jù)(1)的基因，其中根結(jié)線蟲抗性是數(shù)量抗性，抗性水平依賴于基因拷貝數(shù)目。
(3)一種重組載體，含有根據(jù)(1)的基因。
(4)把根據(jù)(1)的基因引入到宿主中而得到的一種轉(zhuǎn)化體。
(5)根據(jù)(4)的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是一種植物。
(6)根據(jù)(5)的轉(zhuǎn)化體，其中植物屬于茄科(Solanaceae)。
(7)一種生產(chǎn)根結(jié)線蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物的方法，這通過(guò)把根據(jù)(1)的基因引入到植物實(shí)現(xiàn)。
(8)用于控制根結(jié)線蟲的制劑，其含有根據(jù)(1)的基因。
1.新的根結(jié)線蟲抗性基因(1)根據(jù)本發(fā)明的基因的特征根據(jù)本發(fā)明的基因是一種新的從二倍體馬鈴薯品系中分離的根結(jié)線蟲抗性基因。該基因與普通的根結(jié)線蟲抗性基因在下述方面存在區(qū)別(i)不同于單顯性的根結(jié)線蟲抗性基因如番茄抗性基因(Mi基因)，本發(fā)明的基因是“數(shù)量抗性”，抗性水平根據(jù)基因拷貝數(shù)目而加強(qiáng)。
(ii)不同于番茄的抗性基因，其抗性不會(huì)因?yàn)楦邷孛舾卸鴨适В徊⑶?iii)本發(fā)明的基因可廣泛適用于多個(gè)根結(jié)線蟲物種和品系。
(2)本發(fā)明基因的分離本發(fā)明的基因可從二倍體馬鈴薯基因型85.37.38的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選得到，根據(jù)序列信息如通常存在于植物抗性基因的NBS或LRR，得知二倍體馬鈴薯基因型85.37.38具有根結(jié)線蟲抗性基因(Watanabe等，Amer.Potato J.71599-604，1994)。例如根據(jù)Hammond-Kosack和Jones等的一般理論，可從已知植物抗害蟲基因的保守序列如NBS或LRR序列設(shè)計(jì)引物(Ann.Rev.Plant Physiol.PlanMol.Biol.48575-607，1997)。這些引物可以用于擴(kuò)增從上述二倍體馬鈴薯品系的cDNA文庫(kù)中分離的感興趣的基因。
(3)核苷酸序列可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)來(lái)確定所獲得的基因的核苷酸的序列。可以應(yīng)用常規(guī)技術(shù)來(lái)進(jìn)行核苷酸測(cè)序，如Maxam和Gilbert的化學(xué)修飾法、利用M13噬菌體進(jìn)行的雙脫氧核苷酸鏈終止法、或利用核苷酸序列自動(dòng)分析儀(如ABI PRISM 377 DNA測(cè)序系統(tǒng)，Perkin-Elmer)。
SEQ ID NO1表示通過(guò)上述方法確定的本發(fā)明根結(jié)線蟲抗性基因的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的根結(jié)線蟲抗性基因并不局限于上述序列。還包括在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO1核酸序列組成的基因雜交的基因，只要本發(fā)明(1)所敘述的基因的特征，即根結(jié)線蟲抗性可賦予宿主。例如，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，鈉的濃度在10mM-300mM之間，溫度在25℃-70℃之間。優(yōu)選鈉濃度在50mM-100mM和溫度在42℃-55℃。
本發(fā)明基因的核苷酸序列一旦被確定，本發(fā)明的基因可以通過(guò)化學(xué)合成、以該基因的cDNA或基因組DNA為模板的PCR、或用一段以每個(gè)核苷酸序列作為探針的DNA片段雜交而得到。
2.載體本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明基因的重組載體。把根據(jù)本發(fā)明的基因引入到合適的載體，如質(zhì)粒，保持不變，并用合適的限制性內(nèi)切酶消化，或連接到合適的接頭(Linker)以制備上述重組載體。這樣的載體的例子包括pUC載體如pUC18、pUC19、pUC118、和pUC119，和二元載體如pBI110、pBI121，和pGA482。尤其當(dāng)使用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)二元載體時(shí)，外源基因插入二元載體邊緣序列的中間，并且該重組載體可以在大腸桿菌(E.coli)中擴(kuò)增。隨后，該擴(kuò)增了的重組載體通過(guò)凍融、電穿孔、或其它方法被引入到如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，EHA101，EHA105或C58C1RifR。所得物被用作轉(zhuǎn)化載體。
為了使外源基因在宿主中表達(dá)，需要在該基因的上游和下游分別連接上一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子?？梢允褂萌我粏?dòng)子和終止子，沒有特別的限制，只要它們能在宿主中發(fā)揮功能。如果宿主是植物，啟動(dòng)子序列的例子包括花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)衍生的35S轉(zhuǎn)錄物(The EMBO J.63901-3907，1987)，玉米泛素(Plant Mol.Biol.18675-689，1992)，胭脂堿合酶(NOS)基因，和章魚堿(OCT)合酶基因啟動(dòng)子。終止子序列的例子包括花椰菜花葉病毒衍生的和胭脂堿合酶基因衍生的終止子。
為了更有效地篩選出感興趣的轉(zhuǎn)化體，優(yōu)選導(dǎo)入一個(gè)有效的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因的例子包括賦予卡那霉素抗性的基因、賦予植物抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(htp)、和賦予植物bialaphos抗性的膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(bar)基因。這些選擇標(biāo)記基因和本發(fā)明的基因可以組合到同一個(gè)載體中?？蛇x擇地，可以使用分別包含在不同載體中的2類重組DNAs。
3.轉(zhuǎn)化體本發(fā)明也提供了引入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)化體。通過(guò)使用本發(fā)明上述載體轉(zhuǎn)化宿主而生成該轉(zhuǎn)化體。對(duì)于宿主沒有特別的限制，只要本發(fā)明的基因可以在其中發(fā)揮功能。宿主優(yōu)選為植物，例子包括茄科(Solanaceae)植物、旋花科(Convolvulaceae)植物如甘薯、和十字花科(Brassicaceae)植物包括根作物如蘿卜。本發(fā)明的基因被認(rèn)為可在超過(guò)2000種的植物中發(fā)揮有效功能。茄科植物如馬鈴薯、煙草和番茄是特別優(yōu)選的。本發(fā)明所使用的“植物”一詞是指培養(yǎng)的植物細(xì)胞、栽培植株、植物器官(如葉、花瓣、莖、根、根狀莖、或種子)、或植物組織(如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質(zhì)部或維管束)。例如，當(dāng)培養(yǎng)的植物細(xì)胞、整株植物、植物器官、或植物組織作為宿主時(shí)，本發(fā)明的基因被引入一塊上述植物中，這通過(guò)農(nóng)桿菌(Agrobacterium)二元載體方法，粒子槍方法，聚乙二醇方法，或其它方法實(shí)現(xiàn)。從而可以得到所需要的轉(zhuǎn)化體?？蛇x擇地，可以通過(guò)電穿孔的方法將基因引入原生質(zhì)體來(lái)制備轉(zhuǎn)化體。
轉(zhuǎn)導(dǎo)了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)化體可以通過(guò)選擇標(biāo)記篩選或本發(fā)明基因的功能分析，即根結(jié)線蟲抗性，來(lái)進(jìn)行選擇。生成的轉(zhuǎn)化體，特別是一種轉(zhuǎn)基因植物，可以在裝有土壤或蛭石的盆中培養(yǎng)和扦插繁殖。這樣繁殖的轉(zhuǎn)基因植物及其所有后代均包括在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體范圍之內(nèi)，只要它們包含了本發(fā)明的基因。
4.根結(jié)線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物引入了本發(fā)明根結(jié)線蟲抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)多種根結(jié)線蟲物種表現(xiàn)出強(qiáng)有力的抗性。另外，本發(fā)明基因所賦予的抗性是“數(shù)量抗性”，抗性水平根據(jù)引入的基因數(shù)目而加強(qiáng)。應(yīng)該注意到，通常的根結(jié)線蟲抗性基因不具備數(shù)量抗性。相應(yīng)地，本發(fā)明的基因可以通過(guò)增加所引入基因的數(shù)目來(lái)生成具有更強(qiáng)根結(jié)線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
迄今已鑒定出的根結(jié)線蟲抗性基因受溫度的影響，當(dāng)暴露于高于某一特定溫度水平時(shí)會(huì)喪失它們的抗性(Mi基因通常在28℃失活)。然而，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物即使在33℃-35℃高溫栽培時(shí)，仍然能夠保持對(duì)根結(jié)線蟲的抗性。相應(yīng)地，引入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物可以在溫帶或熱帶地區(qū)保持其根結(jié)線蟲抗性，在這些地區(qū)溫度相對(duì)較高。
因而，本發(fā)明可提供新的根結(jié)線蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物及其生產(chǎn)方法。
5.其它根據(jù)本發(fā)明的基因賦予了宿主優(yōu)良的根結(jié)線蟲抗性，尤其是茄科植物，如馬鈴薯、煙草和番茄。相應(yīng)地，該基因和含有該基因的組合物可以用作控制根結(jié)線蟲的制劑。在根結(jié)線蟲造成嚴(yán)重?fù)p失的地區(qū)，本發(fā)明的基因、引入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物和含有本發(fā)明基因用于控制根結(jié)線蟲的制劑均具有控制損失和提高農(nóng)作物生產(chǎn)力的重要效果。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示通過(guò)Southern雜交證實(shí)的基因引入結(jié)果。
圖2顯示通過(guò)RT-PCR證實(shí)的基因引入結(jié)果，其中2A代表引物RKN，2B代表引物Start2×2和PotaLRR。
圖3的照片顯示根部在感染根結(jié)線蟲42天后的情況，其中3A代表轉(zhuǎn)基因植物，3B代表對(duì)照，3C代表TA209。
圖4顯示根部在感染根結(jié)線蟲42天后的顯微照片(X40)，其中4A代表轉(zhuǎn)基因植物，4B代表對(duì)照。
本說(shuō)明書包括作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)文件的日本專利申請(qǐng)?zhí)?002-089622說(shuō)明書的部分或全部公開內(nèi)容。
實(shí)施本發(fā)明的最好方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出更加詳細(xì)的描述，盡管本發(fā)明的技術(shù)范圍不受實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1 基因功能域的分離根據(jù)已知具有抗性基因的二倍體馬鈴薯基因型85.37.38的基因組DNA設(shè)計(jì)如下引物(Watanabe等，Amer.Potato J.71599-604，1994)，并通過(guò)PCR分離基因。根據(jù)已知的害蟲抗性植物基因的保守功能域，如NBS或LRR序列，設(shè)計(jì)所述引物。
正向引物5’-GATCCATTCTATAATGTCTCACT-3’(SEQ IN NO2)反向引物5’-CTATCTATAAGATCTTTAATCA-3’(SEQ IN NO3)分離的Rmi候選基因命名為“片段#93”，并且檢查了其全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO1)及其與已知基因的同源性(表1)。
表1基因 同源性短莖茄(Solanum acaule)NBS-LRR蛋白 69％馬鈴薯(Solanum tuberosum)RGC 70％馬鈴薯NBS-LRR蛋白 69％馬鈴薯抗病性蛋白Gpa 69％馬鈴薯Rx蛋白 69％卡茄椒(Caps icum chacoense)抗病性蛋白BS2 54％番茄(Lycopersicon esculentum)Prf蛋白 54％番茄PRF蛋白 52％醋粟番茄(Lycopersicon pimpinellifolium)Prf蛋白53％番茄tospovirus抗性蛋白D蛋白 54％擬南芥菜推定蛋白 96％擬南芥菜RPP13蛋白 48％擬南芥菜rpp8蛋白 47％稻(Oryza sativa)推定抗病性蛋白47％擬南芥菜病毒抗性蛋白 48％擬南芥菜抗病性蛋白R(shí)PM1同源基因48％羽裂芥菜NBS/LRR抗病性蛋白R(shí)PM1蛋白 51％歐洲油菜(Brassica napus)抗病性同源基因9N蛋白 49％稻RPP1h蛋白 47％稻RPR1蛋白46％歐洲油菜抗病性蛋白48％普通小麥(Triticum aestivum)條銹病抗性蛋白Yr10蛋白 53％普通小麥條銹病抗性蛋白Yr10蛋白52％稻Pi-b蛋白86％稻Pib蛋白 56％
尖鐮孢(Fusarium oxysporum)蛋白 50％外源基因插入到二元載體的邊緣序列之間，生成的重組載體在大腸桿菌中擴(kuò)增。隨后，擴(kuò)增了的重組載體通過(guò)凍融、電穿孔或其他方法引入如根癌農(nóng)桿菌LBA4404，EHA101，EHA105或C58C1RifR。所得產(chǎn)物用于生成轉(zhuǎn)基因植物。
實(shí)施例2 載體構(gòu)建(1)插入二元載體分離的候選Rmi基因(片段#93)用BamHI切開，連接到pTarget載體一次，再用BamHI切開，然后連接到二元載體pBE2113Not。生成的重組載體引入大腸桿菌DH5α中并在其中擴(kuò)增得到用于農(nóng)桿菌引入載體(馬鈴薯RKNpBE2113NotI)。
(2)電穿孔通過(guò)電穿孔，二元載體(馬鈴薯RKNpBE2113NotI)引入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株(Gibco BRL)。具體地，儲(chǔ)存在-80℃下的根癌農(nóng)桿菌LBA4404在冰中融化，在潔凈工作臺(tái)條件下，將約20μl加入于1.5ml Eppendorf管中。加入DNA(100ng/μl，1μl)，保持混合物于冰中，產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到試管中用于電穿孔。
(3)基因引入確定隨后，加入50μl YM培養(yǎng)基，進(jìn)行抽吸，并轉(zhuǎn)移至15-mlFalcon管中。加入YM培養(yǎng)基到總量1ml，于225rpm和30℃震動(dòng)培養(yǎng)3小時(shí)。3小時(shí)后，取200μl培養(yǎng)物涂布于含卡那霉素的YM瓊脂培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48-56小時(shí)，生成的菌落用PCR和DNA測(cè)序來(lái)確定基因引入。
(4)菌落PCR取下已經(jīng)鑒定為引入了基因的根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株的菌落，使用具有如表2所述的組合物的反應(yīng)溶液進(jìn)行菌落PCR。取下生成的PCR產(chǎn)物(1μl)與少量藍(lán)色汁液混合。混合物進(jìn)行電泳，凝膠包含2％溶解在0.5％TAE中的瓊脂糖。使用λHind III標(biāo)記(標(biāo)記II，Boehringer Mannheim)。然后，含有表2所述組合物的溶液分裝于8連管(8-strip tubes)，并安裝于PCR儀(GeneAmp9600，Perkin-Elmer)。
表2

加入上述反應(yīng)溶液于1.5-ml Locking管中，加入80μl 75％的異丙醇，隨后混合。室溫放置15分鐘，并離心20分鐘(室溫最大速)。去掉上清液，再加入250μl 75％的異丙醇，隨后混合。然后，混合物離心5分鐘(室溫最大速)，去掉上清液，離心產(chǎn)物在通風(fēng)房間內(nèi)晾干。隨后，每管加入25μl模板抑制劑(TSR)并混合，將混合物離心沉淀，并在95℃ Heat Block熱激3分鐘。產(chǎn)物放置在冰上并轉(zhuǎn)移到DNA測(cè)序310專用管。然后進(jìn)行DNA測(cè)序。
取已經(jīng)鑒定為引入了基因的根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株的菌落，在含有100mg/l卡那霉素的YEB培養(yǎng)基中震動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，溫度為30℃，每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)為225。將培養(yǎng)的細(xì)胞溶液(每管850μl)注入冰上的冷凍管中，加入150μl甘油，然后用石蠟封口膜包裹密封試管，并且用渦旋混合儀混合管中的溶液。然后再用塑料包裹，并浸入預(yù)冷至-20℃的99.5％乙醇中，在冷凍室中-20℃冷凍約10分鐘。然后，儲(chǔ)存在預(yù)冷至-80℃的儲(chǔ)存容器中。
實(shí)施例3 轉(zhuǎn)基因植物的制備制備了應(yīng)用實(shí)施例2制備的載體來(lái)引入根結(jié)線蟲抗性基因結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物。使用再分化和早期種植并對(duì)線蟲敏感的二倍體Nicotiana benthamiana(科的一種植物)作為宿主植物。平行地，該基因被引入到線蟲敏感型四倍體馬鈴薯種，即Desiree。
(1)用根癌農(nóng)桿菌侵染植物在冰中凍融實(shí)施例2制備的根癌農(nóng)桿菌LB4404菌株。在潔凈的工作臺(tái)條件下，將YEB培養(yǎng)基(40ml)加入于Falcon管中，在其上加入抗生素，隨后反向混合?；旌衔锓盅b，每管10ml。加入根癌農(nóng)桿菌LB4404菌株(10μl)，并在震動(dòng)培養(yǎng)儀中培養(yǎng)，過(guò)夜(28℃，225rpm)，并用分光光度計(jì)分析培養(yǎng)物在600nm下的吸光度。一旦吸光度約為2，則用YEB培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)溶液，使吸光度在0.6-0.8之間。
傳代培養(yǎng)2-3周的植物用外科手術(shù)刀在無(wú)菌濾紙上作上標(biāo)記，劃分為根、莖、和葉，然后浸入無(wú)菌水防止變干。標(biāo)記的植物片段浸入吸光度調(diào)整在0.6-0.8之間的根癌農(nóng)桿菌溶液中7分鐘，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙，充分除去水分，并培養(yǎng)于共培養(yǎng)培養(yǎng)基3天。此處所用的共培養(yǎng)培養(yǎng)基包含1mg/l的芐基腺嘌呤(BA)、35mg/l的反式玉米素核苷和0.1mg/l的吲哚乙酸。
(2)在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)如上所述，制備共培養(yǎng)培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入20ml，其上放置無(wú)菌圓濾紙，移入感染的植物，培養(yǎng)3天。
表3改良的MS培養(yǎng)基的組成加入30g蔗糖于如下的組合物中，使總量為1升，PH值用KOH或HCl調(diào)整至5.9，然后加入2.5gGellan膠。

(1)在愈傷組織形成性培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)加入1mg/l的芐基腺嘌呤、0.1mg.l的NAA、150mg/l的卡那霉素和200mg/l的羧芐青霉素于表3所示的改良MS培養(yǎng)基中來(lái)制備愈傷組織形成性培養(yǎng)基。制備好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿20ml。在共生培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天的植物片段在上述愈傷組織形成性培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
(4)生苗培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)加入150mg/l的卡那霉素和200mg/l的羧芐青霉素于表3所示的改良MS培養(yǎng)基中來(lái)制備生苗培養(yǎng)基，制備好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿20ml。在愈傷組織形成性培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周并生成了愈傷組織的植物片段，在上述生苗培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。然后在室內(nèi)進(jìn)行整天光照(熒光)培養(yǎng)。
(3)在含MS培養(yǎng)基的試管中傳代培養(yǎng)將表3所示的改良MS培養(yǎng)基倒入試管中，每管5ml，并在高壓滅菌器中滅菌。在生苗培養(yǎng)基中再分化的植株中，將完全獨(dú)立的植株作為單個(gè)品系于無(wú)菌試管中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
(4)生根培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)加入卡那霉素(75mg/l)和100mg/l的羧芐青霉素于表3所示的改良MS培養(yǎng)基中，產(chǎn)物倒入培養(yǎng)瓶中，每瓶40ml制成生根培養(yǎng)基。在含MS培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)了1-2周，長(zhǎng)到2-3cm的植株繼續(xù)在上述生根培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每瓶約3株。
(5)條件在花盆中裝滿商業(yè)購(gòu)買的蔬菜用土，將在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)約3周，已經(jīng)長(zhǎng)根的植株轉(zhuǎn)移到花盆中生長(zhǎng)。
實(shí)施例4 通過(guò)Southern雜交證實(shí)基因引入再生植株生長(zhǎng)在選擇培養(yǎng)基上，即含有卡那霉素的培養(yǎng)基，根據(jù)根部生長(zhǎng)狀況選擇生長(zhǎng)良好的品系作為轉(zhuǎn)基因植株的臨時(shí)候選植株。轉(zhuǎn)基因候選植株應(yīng)用Southern雜交來(lái)證實(shí)基因引入。
(1)試驗(yàn)方法提取上述候選轉(zhuǎn)基因植株的臨時(shí)候選株系的DNA，用實(shí)施例1中的引物(SEQ ID Nos2和3)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增根結(jié)線蟲抗性基因結(jié)構(gòu)域。
通過(guò)PCR證實(shí)的引入了基因結(jié)構(gòu)域的株系進(jìn)行Southern雜交，使用實(shí)施例1中確定的Rmi(SEQ ID NO1)序列作為探針，并且估計(jì)引入的基因數(shù)目。雜交條件如表4所示。
表4

(2)結(jié)果根據(jù)圖1所示的結(jié)果，在對(duì)照中也發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)。認(rèn)為發(fā)生這些陽(yáng)性反應(yīng)是因?yàn)閷?duì)照基因含有可與非轉(zhuǎn)基因植物雜交的同源結(jié)構(gòu)域。因此，在與對(duì)照不同的條件下仍然具有條帶和與對(duì)照相比具有更多條帶數(shù)量的植株鑒定為引入了基因的植株。
實(shí)施例5 通過(guò)RT-PCR證實(shí)基因引入(1)試驗(yàn)方法1)cDNA的合成在研缽中用液氮將植株研成粉末，使用常規(guī)技術(shù)提取mRNA。用表5所示的反應(yīng)組合物并使用加入dT到隨機(jī)9聚體制備的引物和屬于Takara RNA PCR試劑盒(Takara)的M13引物M4進(jìn)行mRNA的反轉(zhuǎn)錄，以合成cDNA。所使用的引物和反應(yīng)條件如下所示
表5反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組合物

<使用隨機(jī)9聚引物的反應(yīng)>
隨機(jī)9聚體dp(5’-N N N N N N N N N-3’)反應(yīng)條件30℃預(yù)溫育10分鐘；一個(gè)循環(huán)，42℃ 30分鐘，99℃ 5分鐘，和55℃ 5分鐘。
<使用寡聚DT-銜接頭引物的反應(yīng)>
加入寡聚dT到寡聚DT-銜接頭而制備的引物使用M13引物M45’-gttttcccagtcacgac-3’(SEQ ID NO4)反應(yīng)條件一個(gè)循環(huán)，42℃ 30分鐘，99℃ 5分鐘，和55℃ 5分鐘。
2)PCR隨后，使用所得到的cDNA進(jìn)行PCR。使用GeneAmp 9600(AppliedBiosystems)進(jìn)行PCR，引物(RKN，Start2×2，和PotaLRR)和反應(yīng)條件如下所示。
<PCR使用引物RKN>
引物RKN-F1GTTGGTCATGAAAATGAA(SEQ ID NO5)引物RKN-R1ATATTGCTCTTCCAATCA(SEQ ID NO6)
表6使用引物RKN進(jìn)行PCR的反應(yīng)組合物

反應(yīng)條件共30個(gè)循環(huán)，95℃ 10分鐘，95℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘和72℃ 3分鐘最后在72℃延伸10分鐘<使用引物Start2×2和PotaLRR的反應(yīng)>
引物Start2×2ATGGCTTATGCTGCTATTACTTGT(SEQ ID NO7)引物PotaLRRCTAACTGATACAGACCTCAACAGA(SEQ ID NO8)
表7使用引物Start2×2和PotaLRR進(jìn)行PCR的反應(yīng)組合物

反應(yīng)條件共30個(gè)循環(huán)，95℃ 10分鐘，95℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘和72℃ 3分鐘最后在72℃ 延伸10分鐘3)電穿孔上述得到的PCR產(chǎn)物由于電穿孔，比較條帶的區(qū)別，來(lái)估計(jì)基因引入的發(fā)生率。
(2)結(jié)果RT-PCR的結(jié)果顯示在圖2中。當(dāng)使用PKN、Start2×2引物和PotaLRR時(shí)，對(duì)照中沒有發(fā)現(xiàn)條帶，而在候選轉(zhuǎn)基因植株(植株8和9)中發(fā)現(xiàn)了條帶。從而證實(shí)了基因引入并在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因植株的抗性評(píng)估(1)試驗(yàn)方法證明引入了基因的轉(zhuǎn)基因Nicotiana benthamiana(如1、8、14和18號(hào))，非轉(zhuǎn)基因Nicotiana benthamiana和線蟲敏感型番茄品種TA209用南方根結(jié)線蟲進(jìn)行感染?？梢匀庋塾^察和顯微檢查植物地上部分和根部的情況。
證明引入了基因的轉(zhuǎn)基因Nicotiana benthamiana(如1、8、14和18號(hào))、非轉(zhuǎn)基因Nicotiana benthamiana和線蟲敏感型番茄品種TA209種植在感染南方根結(jié)線蟲的土壤中培養(yǎng)來(lái)評(píng)估其抗性。根據(jù)常規(guī)技術(shù)來(lái)進(jìn)行評(píng)估(Williamson等，Plant Cell，1998)，使用罌紅(Sigma-Aldrich)對(duì)根結(jié)線蟲卵進(jìn)行染色，并以存在或不存在卵和卵的數(shù)量來(lái)評(píng)估抗性。同時(shí)檢查了根部是否存在蟲癭。從而檢測(cè)了引入基因的數(shù)量和線蟲抗性之間的相互關(guān)系。
(2)結(jié)果關(guān)于轉(zhuǎn)基因植株的地上部分的情況，與非轉(zhuǎn)基因植株和TA209不同的是其黃化的程度沒有進(jìn)一步發(fā)展。根結(jié)的數(shù)量也較少。在顯微鏡下進(jìn)一步觀測(cè)根部，在轉(zhuǎn)基因植株的根部沒有觀察到類似根結(jié)的變形根結(jié)。然而，在非轉(zhuǎn)基因植株和TA209的根部，觀察到類似根結(jié)的變形根結(jié)，且在該處觀察到了類似線蟲卵的陰影。因此證明引入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植株具有高度根結(jié)線蟲抗性(圖3和4)。
再有，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株可以維持其根結(jié)線蟲抗性，即使培養(yǎng)和種植在33℃-35℃的高溫環(huán)境下。從而證實(shí)本發(fā)明的基因不同于Mi基因(在28℃時(shí)失活)，其不受高溫的影響。
實(shí)施例7 野生型煙草根結(jié)線蟲抗性評(píng)價(jià)(1)試驗(yàn)方法根據(jù)實(shí)施例3所描述的方法使用實(shí)施例2制備的載體，將根結(jié)線蟲抗性基因引入到野生型煙草。引入了基因的品系進(jìn)行Southern雜交和RT-PCR以鑒定基因引入。進(jìn)一步，種植轉(zhuǎn)基因植株于感染了根結(jié)線蟲的土壤中，并在溫室中生長(zhǎng)6周，白天(16小時(shí))溫度為30℃-35℃，夜晚(8小時(shí))溫度為25℃-30℃。然后評(píng)價(jià)其根結(jié)線蟲抗性。通過(guò)下述方式進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，首先觀察根部是否有根結(jié)，然后顯微觀察沒有根結(jié)的植株。結(jié)果如表8所示。
(2)結(jié)果從表8可以明顯看出，本發(fā)明的根結(jié)線蟲抗性基因具有數(shù)量抗性，與普通的根結(jié)線蟲抗性基因如番茄的mi基因是不同的。
表8

1)數(shù)值引入的基因的數(shù)目I與對(duì)照相同2)N陰性；P陽(yáng)性；--未評(píng)估3)HR既沒有發(fā)現(xiàn)根結(jié)也沒有發(fā)現(xiàn)卵。
R在根部沒有發(fā)現(xiàn)根結(jié)，但發(fā)現(xiàn)了一些卵。
MR在根部發(fā)現(xiàn)一些根結(jié)和卵。
MS在根部發(fā)現(xiàn)許多根結(jié)。
S在整個(gè)根部均發(fā)現(xiàn)了許多根結(jié)。
實(shí)施例8 栽培種馬鈴薯根結(jié)線蟲抗性評(píng)估(1)試驗(yàn)方法使用實(shí)施例2制備的載體，根據(jù)實(shí)施例3所描述的方法將線蟲抗性基因引入到栽培種馬鈴薯(Desiree)。引入了該基因的物種進(jìn)行Southern雜交、PCR和RT-PCR以鑒定基因引入。然后，將轉(zhuǎn)基因植株種植在感染了根結(jié)線蟲的土壤中，并在溫室中生長(zhǎng)6周，白天(16小時(shí))溫度為30℃-35℃，夜晚(8小時(shí))溫度為25℃-30℃。以實(shí)施例7中同樣的方式評(píng)價(jià)其線蟲抗性。作為對(duì)照的未處理的Desiree、根結(jié)線蟲敏感型Atzimba(馬鈴薯)、TA209和N.benthamiana，在同樣的條件下生長(zhǎng)并隨后進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表9所示。
(2)結(jié)果從表9中可明顯看出，本發(fā)明的根結(jié)線蟲抗性基因在栽培種馬鈴薯中表現(xiàn)出數(shù)量抗性。
表9

1)數(shù)值引入基因的數(shù)目；I與對(duì)照和未處理品系表現(xiàn)相同的品系。
2)N陰性；P陽(yáng)性3)HR既沒有發(fā)現(xiàn)根結(jié)也沒有發(fā)現(xiàn)卵。
R在根部沒有發(fā)現(xiàn)根結(jié)，但發(fā)現(xiàn)了一些卵。
MR在根部發(fā)現(xiàn)一些根結(jié)和卵。
MS在根部發(fā)現(xiàn)許多根結(jié)。
S在整個(gè)根部均發(fā)現(xiàn)了許多根結(jié)。
4)N陰性；P陽(yáng)性在本文中的所有公開物、專利和專利申請(qǐng)共同以全文引作本文參考。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種新的根結(jié)線蟲抗性基因，該基因不受高溫的影響，可廣泛適用于多種根結(jié)線蟲物種和品系且對(duì)其具有數(shù)量抗性。該基因能夠賦予主要農(nóng)作物高度根結(jié)線蟲抗性，如馬鈴薯、番茄和煙草。
序列表的無(wú)格式文本SEQ ID NO2人工序列描述引物SEQ ID NO3人工序列描述引物SEQ ID NO4人工序列描述引物SEQ ID NO5人工序列描述引物SEQ ID NO6人工序列描述引物SEQ ID NO7人工序列描述引物SEQ ID NO8人工序列描述引物序列表<110>Japan as Represented by President of The University of Tsukuba<120>新的根結(jié)線蟲抗性基因及其用途<130>PH-1611-PCT<140>PCT/JP02/12392<141>2002-11-27<150>JP 2002-89622<151>2002-03-27<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2613<212>DNA<213>馬鈴薯
<400>1atggcttatg ctgctattac ttgtcttatg agaaccatac aacaatctat tcaacttact 60ggatgtaatt tgcaatcatt ctatgaaaag tttgaatctt tgagagcttn tttggagaaa 120cacacgggca atcttgatgc attgaaaagc ttggaagctg aaatcataga acttgtatgc 180actacagaag atattttgga cttggaatca agaaatgtta aaaatccaat ttcaagaata 240atagcttttt ggaaacttca ttctctcttg aaacaagcag taggacgcat tgattccacg 300ctgaacaagt ggatggaaat gcagaacatg tacaccaaaa ggaaagatga agaagcacat 360aacttggatc ttgctagtac tgcatcaatg tctcaacatg ttgtggagcc tcaggatatg 420atggttggac atgaaaatga actcgagatg atcatgcagg atcagcttgc tagaggagca 480agtgaacttg aagttgtctc cattgtaggt atggggggca tcggtaagac aactttggct 540gacaaaattt ataatgatcc attcataatg tcacactttg acattcgtgc aaaagctact 600gtttcacaag agtattgcgc gaaaaatgta tgcctaagtc ttctttcttc tataagtgga 660aagagcaatg agcatcaaga tgatgggcaa ctagctgatc gactgcaaaa aagtctaaaa 720gggaggaggt atttagtagt cattgatgac atatggaccg aacgagcttg ggatgatatg 780aaactatgtt tcccagattg taactgtgga agcagaatac tgctgacaac tcggaatatg 840gaagtagcta agtatgctag ctcaggtaag cctcctaaga atcaaatgcg actcttgaat 900attgatgaaa gttggaagtt actacccagt agagtctttg taaaaaactg tttctcccct 960gaatttgaac aacttgggaa acaaattgct cttaaatgcg ggggattacc tttagctatt 1020atcgttattg ctggagttct gtctaatatt ggtgagtcat ttgatgaatg gacaagtgtt 1080gcagagaatg taagttcagt ggtaagtaca gatcacaatg tacaatgcat gagagtgttg 1140gcgttgagtt atcatcactt accacatcac ttgagagcgt gttttctata ttttgcaata 1200
ttcccggagg atacagtgat ttttgtgaat aaacttgtga aattatggac agcagagggt 1260tttttgaaga cagaaatgat gaaaagtata gaagaagttg cagaaaaatg tgttaaagat 1320cttatagata gaaatttagt ttttgtccaa agggtgagta gttttgatgg aaaaataaaa 1380gcttgtggaa tgcatgatgt gatccgtgaa ctctgcttga gagaagctcg aaacncaaat 1440tttgtgaatg ttataatgga taatcaaaat ccatgtgaac aatccatgaa ttattccaca 1500aagggagttc ggataagtat ccaatccaaa cttgctgcca atcagttgtc tatggtttgt 1560aataacgatt cctattctgt tctcgttttt actgaagatc cctcaagctc aagaatggtg 1620cagggcttga agcatttcaa ggtactaaga gtacttatct tgcttcggtg gcattgcatg 1680tttcccaatt gcatagttga actatttcac ttgagatatc taggtttgag tgtttactcg 1740tccactaatg attgggatat ttgttttcca tcctcaatag ctagccttga gtatttgcaa 1800actttaatac ttaagtttcc aacatctctc ggatggaagt tcactagact tttcagatta 1860ccatcgagta ttttcaagat gtcgcaattg aggcatctat ctttggactg gaattacttg 1920aatggacatg aatctagcga gagatcaagt tgggttttga gaaatcttga gtgtctgtct 1980ggatggaatc ctttatcttg tacttcttcg gtttttagac tacttccgaa tgtaaagaag 2040ttgcaaatat gtggtatcca agaagactac ataagaaagg acaaggtctt tgatgatctt 2100tgctgcttaa atcagcttac agaattgaaa tttaagatta gaaagatgat tggaagagca 2160atatatgata catcttttgt tcttcctcct ctaggtgctt ttccgaagaa ccttaagaag 2220ttagctttta caggtactcg tttgcattgg aaggatttgg agattcttgg taagttgcct 2280aaactcgagg ccctcaaact aggatatgat gcctgcattg gtactgattg ggaagtaggt 2340gaggaagggt ttccacactt gaagttcttg cgattgaagc atttgtactt gcataactgg 2400agagctagta gtgatcattt tccacgactt gaacgactag tcattaaccg tcgttggagc 2460atgtattcga tcccacagga ttttgtagac ataaccacac ttcagctgat tcatataann 2520
gactctgcaa aatctgttgg gaactccgcc aagaagattc agcaggaaat tgaagacagc 2580tatggaagtt ctgttgaggt ctgtatcagt tag 2613<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>2gatccattct ataatgtctc act 23<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>3ctatctataa gatctttaat ca 22<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4gttttcccag tcacgac 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物<400>5gttggtcatg aaaatgaa18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6atattgctct tccaatca18<210>7<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>7atggcttatg ctgctattact tgt 24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8ctaactgata cagacctcaa caga 24權(quán)利要求
1.由下列(a)或(b)的DNA組成的基因(a)由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列組成的DNA；或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列組成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列組成的DNA雜交，并且賦予宿主根結(jié)線蟲抗性的DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因，其中根結(jié)線蟲抗性是數(shù)量抗性，其抗性水平的提高依賴于基因拷貝數(shù)目。
3.一種重組載體，其含有根據(jù)權(quán)利要求1的基因。
4.將根據(jù)權(quán)利要求1的基因?qū)氲剿拗鞫玫降霓D(zhuǎn)化體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化體，其中植物屬于茄科。
7.一種生產(chǎn)根結(jié)線蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法通過(guò)把根據(jù)權(quán)利要求1的基因?qū)氲街参飳?shí)現(xiàn)。
8.用于控制根結(jié)線蟲的制劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求1的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種優(yōu)良的根結(jié)線蟲抗性基因及應(yīng)用該基因的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的不受高溫影響、適用于多種根結(jié)線蟲物種和品系且對(duì)其具有數(shù)量抗性的根結(jié)線蟲抗性基因，并涉及引入了該基因的具有根結(jié)線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1628172SQ02829029
公開日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2002年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月27日
發(fā)明者渡邊和男, 渡邊純子 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人筑波大學(xué)