專(zhuān)利名稱(chēng)：耐受性誘導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在個(gè)體中誘導(dǎo)耐受抗原物質(zhì)的方法，該方法通過(guò)給藥增加個(gè)體細(xì)胞(特別是免疫反應(yīng)細(xì)胞)中COX-2(環(huán)氧合酶2)活性的化合物和一種材料或其抗原物質(zhì)，所述化合物還任選地增加IFN-γ含量，其中個(gè)體對(duì)所述材料或其抗原物質(zhì)產(chǎn)生負(fù)性免疫反應(yīng)。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及含有這些化合物和抗原材料或其部分的食品或藥物組合物。在供選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及新的體外方法，用于確定個(gè)體對(duì)具體物質(zhì)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的傾向。
在現(xiàn)代疾病中，變態(tài)反應(yīng)是工業(yè)社會(huì)不同環(huán)境因素帶來(lái)的疾病。變態(tài)反應(yīng)是一種過(guò)敏狀態(tài)，其由對(duì)外來(lái)物質(zhì)的夸大免疫反應(yīng)引起，這種疾病影響成千上萬(wàn)生物的生命，其常常規(guī)定什么可以吃、被觸摸、用嗅覺(jué)聞或者甚至可以居住。身體對(duì)外來(lái)物質(zhì)的反應(yīng)可以從較小的炎癥和不適直至在嚴(yán)重情況下死亡。
變態(tài)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的臨床癥狀是兩種不同反應(yīng)的結(jié)果，分別為早期特異性免疫反應(yīng)和晚期炎癥反應(yīng)。吸入的抗原，例如花粉或微塵，通過(guò)刺激高親和力免疫球蛋白(IgE)受體(例如肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞)介導(dǎo)早期反應(yīng)，從而釋放組胺和細(xì)胞因子。這種早期反應(yīng)持續(xù)約30分鐘。然后，在早期反應(yīng)期間從肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)晚期反應(yīng)，介導(dǎo)的方式為把炎癥細(xì)胞引入到鼻和上呼吸道。嗜酸性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和血小板啟動(dòng)炎癥循環(huán)。這種后期反應(yīng)通常持續(xù)高達(dá)約2天的時(shí)間，其擴(kuò)大起始的免疫反應(yīng)，從而引起更多炎癥細(xì)胞的釋放。
目前治療變態(tài)反應(yīng)的方法通常有兩種途徑。一種方式僅僅治療變態(tài)反應(yīng)癥狀，其中藥用藥物例如抗組胺藥。這種方法的缺點(diǎn)在于所給予的藥物需要重復(fù)給藥，從而可能引起不良副作用。另外，其僅僅治療癥狀，而不是治療參與過(guò)敏狀況的內(nèi)在疾病。另一種治療變態(tài)反應(yīng)的途徑就是所謂的“脫敏治療”，其包括把特異性抗原注射于個(gè)體內(nèi)。然而，在能夠啟動(dòng)治療之前，首先必須識(shí)別患者特異性抗原，然后用低劑量抗原重復(fù)注射至患者。這種方法使人不適，可能需要走訪(fǎng)臨床工作者高達(dá)50次以上。而且，過(guò)敏患者的抗原并不總是能夠被識(shí)別，從而使脫敏治療不可能進(jìn)行。
除了上述缺點(diǎn)外，上述途徑均不能確保過(guò)敏狀態(tài)的消除。同樣，兩種途徑均不能防止過(guò)敏狀態(tài)的進(jìn)一步發(fā)展。
越來(lái)越多的人對(duì)環(huán)境中遇到的物質(zhì)(例如花粉和纖維等)發(fā)展成變態(tài)反應(yīng)，并且患有食物變態(tài)反應(yīng)的患者數(shù)目也穩(wěn)步增加。具體地說(shuō)，對(duì)谷類(lèi)、堅(jiān)果或奶類(lèi)食品產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重問(wèn)題，因?yàn)樵谠S多國(guó)家這些產(chǎn)品是主要食物，其含有高數(shù)量的潛在蛋白質(zhì)抗原。
為了治療食物過(guò)敏反應(yīng)，目前已經(jīng)采取許多不同的措施。其中一種措施就是從日常飲食中除去過(guò)敏食品材料，然而這在實(shí)施起來(lái)非常困難，因?yàn)樾枰獓?yán)格的飲食改變，通常涉及限制措施，并最終影響生活質(zhì)量和/或抑制年輕人或新生兒的預(yù)期生長(zhǎng)發(fā)育。
另一種措施就是修飾變態(tài)材料本身的來(lái)源，這樣降低變態(tài)反應(yīng)能力。通常通過(guò)排除過(guò)敏性成分的食品材料達(dá)到上述目的，這常常出現(xiàn)問(wèn)題就是食品材料中的抗原性物質(zhì)常常是未知的，因此許多情況下并不清楚應(yīng)該選擇性地除去哪些材料。另一種改變食品材料抗原性的途徑就是以特異性方式處理食品材料，例如用熱或蛋白水解酶處理食品材料。
在此方面，US-P-4,293,571公開(kāi)了低過(guò)敏性組合物的制劑，其中蛋白質(zhì)材料經(jīng)過(guò)水解處理，剩余的非水解蛋白通過(guò)熱處理凝聚，然后經(jīng)超濾步驟除去可能構(gòu)成過(guò)敏原的凝聚材料和大分子肽類(lèi)。
食品過(guò)敏問(wèn)題在新生兒中出現(xiàn)的問(wèn)題更突出，因?yàn)樗麄儾荒苊鞔_地把他們的不適傳達(dá)給照顧者，因此過(guò)敏性疾病常常在出現(xiàn)顯著過(guò)敏癥狀后才被察覺(jué)，例如特應(yīng)性皮炎、呼吸和/或胃腸道障礙。
過(guò)敏材料的預(yù)防可能包括對(duì)這些嬰兒居家和具體生活的若干約束。然而，其飲食的關(guān)鍵預(yù)防措施是避免天然蛋白的致敏作用。例如，通過(guò)大量降低天然牛乳蛋白的攝取可以顯著降低牛乳變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。
無(wú)論飲食如何選擇，如果不用牛乳蛋白攻擊免疫系統(tǒng)，那么對(duì)牛乳蛋白的免疫耐受性不可能完成。迄今為止，當(dāng)嬰兒在局部(Prick測(cè)試)或全身攻擊(DBPCFC)后沒(méi)有顯示特異性變態(tài)反應(yīng)時(shí)，僅僅能夠通過(guò)外推法檢測(cè)耐受狀態(tài)。
因此，本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提供一種治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)癥狀的新方式。
通過(guò)在個(gè)體中提供一種對(duì)給定抗原誘導(dǎo)耐受性的方法解決了上述問(wèn)題，該方法包括對(duì)個(gè)體給藥一種抗原材料和提高個(gè)體細(xì)胞COX-2活性和/或增加IFN-γ含量的物質(zhì)，其中所述細(xì)胞特別是涉及免疫反應(yīng)的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞。


圖1顯示在耐受化期間用藥物和營(yíng)養(yǎng)治療引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)；圖2顯示在耐受化期間由藥物和營(yíng)養(yǎng)治療引起的對(duì)BLG的體液免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)；圖3顯示評(píng)估口服耐受性的PGE2和IFN-γ的測(cè)定。
COX-2是一種主要催化從花生四烯酸合成前列腺素的酶。
其它已知的COX-2底物包括二高-γ-亞麻酸(20∶3n∶6)和二十碳五烯酸(EPA，20∶5n-3)，它們分別生成PGE1和PGE3。
已經(jīng)克隆出人COX-2基因，并且現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)記載了其基因組模式及其對(duì)不同因子的基因表達(dá)，例如cAMP、NF-κB和TGF-β、IL-1或TNF-α。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“增加COX-2活性”應(yīng)該理解為增加其本身的酶活性，例如增加輔因子的量或增強(qiáng)與所述輔因子的合作，或者增加細(xì)胞中蛋白的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，或者僅僅增加底物的含量。
類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“負(fù)性免疫反應(yīng)”應(yīng)該理解為包括對(duì)個(gè)體有害的任何免疫反應(yīng)，例如變態(tài)反應(yīng)、自免疫反應(yīng)和器官排斥。
另外，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體細(xì)胞”應(yīng)該包括表達(dá)COX-2并且涉及產(chǎn)生耐受活性的所有細(xì)胞。這些細(xì)胞特別包括涉及免疫反應(yīng)的細(xì)胞，例如產(chǎn)生抗原的細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，特別是T-淋巴細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等。
給至個(gè)體的抗原材料可以是通常的食品材料本身、自體材料或非食品非自體材料。這樣的食品材料的例子為乳類(lèi)、蛋類(lèi)、豆類(lèi)、花生、甲殼類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、肉類(lèi)、芝麻、乳清、漿果或蘋(píng)果。
作為自體材料，可以提到的任意個(gè)體內(nèi)源性材料包括例如膠原、胰島素、髓磷脂結(jié)合蛋白、髓磷脂、乙酰膽堿受體、視網(wǎng)膜樣結(jié)合蛋白或體內(nèi)合成肽。
非食品非自體材料可以是任意的能夠誘導(dǎo)負(fù)性免疫反應(yīng)的個(gè)體外源性材料。這樣材料的例子是變應(yīng)原材料，例如花粉、微塵、碘、鎳、銅、毒液或膠乳、各種類(lèi)型的洗滌劑、化妝品、香水、石膏和藥物(例如抗生素)，還有異體抗原例如移植抗原。至于異體抗原，可以對(duì)接受這些異體抗原(例如移植物，例如器官)的患者在進(jìn)行移植之前給予異體抗原和增強(qiáng)COX-2活性的物質(zhì)，從而降低或基本上減少患者免疫系統(tǒng)對(duì)移植器官的排斥。這種目的可以這樣達(dá)到對(duì)患者給予部分移植器官例如含有移植器官相應(yīng)的HLA抗原的細(xì)胞材料，并給予患者目標(biāo)物質(zhì)從而引導(dǎo)患者免疫系統(tǒng)耐受即將到來(lái)的移植物。
在個(gè)體細(xì)胞中，特別是在涉及免疫反應(yīng)的細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞)中，增加COX-2活性的物質(zhì)可以是能夠產(chǎn)生所述作用的任何物質(zhì)。這些物質(zhì)可以容易地識(shí)別通過(guò)其對(duì)T-淋巴細(xì)胞中從花生四烯酸合成例如PGE2(前列腺素E2)的作用，其可以通過(guò)常規(guī)酶免疫分析測(cè)定。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，具有增加個(gè)體COX-2活性并且可選地增加IFN-γ含量的物質(zhì)包括丁酸鹽(酯)、n-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)例如花生四烯酸或神經(jīng)酰胺類(lèi)物質(zhì)。
所述目的物質(zhì)可以以單一產(chǎn)品形式單獨(dú)或共同給至個(gè)體。
為此目的，目的物質(zhì)和抗原材料可以包含在任何已知的藥物組合物中，例如片劑、小藥囊、溶液或膠囊等，其含有相應(yīng)給藥方式所需要的載體和賦形劑。這樣的給藥途徑包括局部給藥、鼻給藥、口腔給藥、靜脈給藥或腹腔給藥。
抗原材料可以按照需要進(jìn)行預(yù)處理。例如，藥物組合物中并不是包括引起負(fù)免疫反應(yīng)的整個(gè)材料，可以從這些材料中分離出各個(gè)抗原化合物或其部分例如具體的抗原肽，所述藥物組合物可以含有這些化合物。
目的物質(zhì)還可以包含在食品材料中。此時(shí)可以考慮三種方式。
第一種方式，把抗原非食品自體或非自體材料與目的物質(zhì)一起包含在通常食品材料中。因此，該方案是把已知抗原(例如上述提到的抗原)加入到食品材料中，再添加目的化合物。作為這樣的食品材料，可以提出任意液體例如水或乳類(lèi)、果凍和糖果等。
第二種方式，食品材料可以代表抗原材料，即，食品材料本身含有可能的抗原材料。此時(shí)，為了獲得本發(fā)明的組合物，可以簡(jiǎn)單地把目的物質(zhì)加入到食品材料中。作為這樣的食品材料，個(gè)體可以對(duì)其產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的任何食品均可，包括任意種類(lèi)的漿果、蘋(píng)果和桃類(lèi)等。具體地說(shuō)，來(lái)自谷類(lèi)植物或牛奶的食品材料是優(yōu)選的食品，因?yàn)橐阎@些食品含有高變應(yīng)原性化合物。這樣食品的例子為酸奶酪、凝乳、干酪、發(fā)酵乳、基于發(fā)酵產(chǎn)品的乳類(lèi)、冰淇淋或谷類(lèi)產(chǎn)品，例如基于發(fā)酵谷類(lèi)的產(chǎn)品、奶粉、飲料、水基漿、嬰兒食品或甚至寵物食品。
因此，本發(fā)明提供一種用于誘導(dǎo)個(gè)體中對(duì)給定抗原口服耐受性的有趣的新構(gòu)思，其方式是僅僅把能夠增加個(gè)體細(xì)胞COX-2活性的物質(zhì)添加到食品材料中，所述細(xì)胞特別是指免疫反應(yīng)細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞，優(yōu)選T-細(xì)胞，所述物質(zhì)可可選地能夠增加IFN-γ的含量。
因此，本發(fā)明教導(dǎo)了一種誘導(dǎo)個(gè)體口服耐受食品材料的方法。該方法特別適用于那些可能需要對(duì)食品材料產(chǎn)生耐受或變態(tài)反應(yīng)的新生兒。應(yīng)用本發(fā)明的教導(dǎo)，可以把嬰兒食品提供給不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的新生兒。而且，新生兒的免疫系統(tǒng)將被教導(dǎo)耐受所述牛乳蛋白，從而當(dāng)用相應(yīng)的食品材料喂養(yǎng)新生兒時(shí)不會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。
或者，可以把抗原組分加入到任意其它需要的食品材料中。例如，可以把花生或其相關(guān)過(guò)敏組分加入到發(fā)酵的乳類(lèi)產(chǎn)品中，例如加入到酸奶中以便提供花生味的酸奶，并加入目的物質(zhì)。這種方法也適用于把草莓和蘋(píng)果等物質(zhì)加入到這樣的發(fā)酵乳類(lèi)制品種。
下面將會(huì)理解本發(fā)明的組合物能夠完美地適合于防止變態(tài)反應(yīng)在出現(xiàn)于個(gè)體之前的發(fā)展。不愿被理論所束縛，據(jù)信免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的接觸同時(shí)誘導(dǎo)涉及抑制對(duì)所述材料的過(guò)度免疫學(xué)反應(yīng)通常對(duì)產(chǎn)生的特異性抗原不引起有害反應(yīng)。因此，本發(fā)明的構(gòu)思主要在于調(diào)控涉及口服耐受誘導(dǎo)性個(gè)體細(xì)胞的生物學(xué)/代謝機(jī)理，其中所述個(gè)體細(xì)胞優(yōu)選涉及免疫反應(yīng)的細(xì)胞。本發(fā)明的構(gòu)思可以進(jìn)一步用于自身免疫性疾病(自體材料或自身抗原)，并且可以進(jìn)一步用于特異性非食品、非自身抗原的耐受發(fā)展。
因此，本發(fā)明不但能夠防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，而且能夠治療已經(jīng)存在的變態(tài)反應(yīng)疾病，其方式是通過(guò)“教導(dǎo)”免疫系統(tǒng)不對(duì)材料起作用，所述材料同時(shí)具有能夠增加個(gè)體細(xì)胞COX-2活性的物質(zhì)，所述細(xì)胞優(yōu)選涉及免疫反應(yīng)的細(xì)胞，并且任選地增加IFN-γ含量。
下面將會(huì)理解藥物組合物或食品組合物中的目的物質(zhì)的量將足以達(dá)到所需效果，即足以增加COX-2在個(gè)體的各自細(xì)胞(優(yōu)選淋巴細(xì)胞、更優(yōu)選T-淋巴細(xì)胞)中的活性，并且任選地提高周?chē)M織中TFN-γ的含量，這樣一旦識(shí)別為誘導(dǎo)過(guò)度免疫反應(yīng)的外來(lái)抗原后，個(gè)體的免疫系統(tǒng)將被教導(dǎo)耐受抗原物質(zhì)。
本發(fā)明另一方面提供一種確定個(gè)體對(duì)抗原材料發(fā)展變態(tài)反應(yīng)傾向的方法，包括從個(gè)體中采取血樣品，可以任選地對(duì)其進(jìn)行處理以收集含有淋巴細(xì)胞的樣品細(xì)胞材料。這可以容易地通過(guò)下列方式達(dá)到例如，用小管收集細(xì)胞，或者把血樣轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基質(zhì)中，因此制備初級(jí)培養(yǎng)物，培養(yǎng)血液中存在的細(xì)胞。在隨后的步驟中，用抗原材料接觸樣品或血細(xì)胞，優(yōu)選淋巴細(xì)胞，更優(yōu)選T-淋巴細(xì)胞，然后分別測(cè)定樣品中COX-2的活性；和任選地測(cè)定樣品中TFN-γ的含量，將所述含量與對(duì)照組進(jìn)行比較，其中對(duì)照組可以是通用校正曲線(xiàn)，但優(yōu)選沒(méi)有接觸抗原材料的同一樣品。
與對(duì)照組相比，COX-2活性的增加和IFN-γ含量的增加表明采取樣品的個(gè)體對(duì)所述抗原材料不會(huì)產(chǎn)生大量的即過(guò)度或負(fù)性免疫反應(yīng)，所述個(gè)體會(huì)耐受這些抗原材料。另一方面，COX-2活性的顯著降低和IFN-γ含量的顯著降低表明所述個(gè)體將對(duì)此材料產(chǎn)生不利的反應(yīng)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述方法具有的許多基本優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭梢员苊饪贵w材料直接攻擊個(gè)體。因此，為了評(píng)估其相應(yīng)的趨向，要測(cè)試的患者或個(gè)體不需要發(fā)展成變態(tài)反應(yīng)癥狀，同時(shí)降低了與此類(lèi)測(cè)試有關(guān)的危險(xiǎn)性。而且，由于本發(fā)明方法借助于細(xì)胞和分子水平的測(cè)定，這種測(cè)試比評(píng)估個(gè)體是否會(huì)發(fā)展成變態(tài)反應(yīng)癥狀的測(cè)試要敏感得多。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)年輕的兒童甚至新生兒，不會(huì)使其遇到危險(xiǎn)。
下列實(shí)施例將更詳細(xì)地舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是限定本發(fā)明。
應(yīng)用的材料和方法如下動(dòng)物所有實(shí)驗(yàn)采用三周齡的雌性Balb/c小鼠，來(lái)自IFFA-Crédo(L′Abresle，法國(guó))。用不含牛奶的飲食喂養(yǎng)所有小鼠。在所有實(shí)驗(yàn)中，在喂養(yǎng)時(shí)每天稱(chēng)重小鼠，根據(jù)其體重確定需要的食物消耗量。
抗原BLG(牛乳球蛋白；結(jié)晶3次)和OVA(卵清蛋白；V級(jí))來(lái)自Sigma Chemical Co.。乳清蛋白濃縮物(Lacprodan 80)購(gòu)自DanmarkProtein AS(MD-Foods)，其由超濾酸性乳清(acid whey)產(chǎn)生，蛋白含量為80％。
統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用ANOVA單因素測(cè)試比較Seric IgE反應(yīng)。P＜0.05即達(dá)到顯著性差異。
實(shí)施例1小鼠的處理在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，每天以強(qiáng)制喂養(yǎng)和/或腹腔注射方法讓小鼠服用丁酸鹽(酯)(增加COX-2活性)、異丁苯丙酸(抑制COX活性)或生理鹽水(對(duì)照)，持續(xù)3-4天。在第0天，用灌胃法飼養(yǎng)小鼠乳清蛋白(3mg/g體重)或同樣體積的生理鹽水。把管飼法產(chǎn)品溶解于0.3ml生理鹽水中。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)的第4天，把置于0.04ml無(wú)菌生理鹽水和0.16ml 2％Al(OH)3(Superfos Biosecotr A/S，Denmark)中的0.08mgBLG和0.08mg OVA經(jīng)腹腔注射至所有小鼠。
在第4天或第26天，在3％異氟烷麻醉(Abbott SA)下經(jīng)心臟主動(dòng)脈穿刺采取血樣。經(jīng)頸脫位(cervical dislocation)處死后，立即取出脾臟，放置到20ml補(bǔ)充5％FCS的冷卻RPMI的處理組中。用細(xì)胞篩(Falcon)均化脾細(xì)胞溶液，用Histopaque密度離心(Sigma)在390×g下離心20分鐘從紅細(xì)胞中純化。讓細(xì)胞在96孔平板微滴培養(yǎng)皿(Costar)中共同培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)濃度為5×106細(xì)胞/毫升，培養(yǎng)液為補(bǔ)充2mM L-谷氨酰胺(Seromed)、100U青霉素/100mg鏈霉素(Seromed)、10％FCS(Bioconcept)的RPMI 1640(Bioconcept)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)環(huán)境含5％的CO2，同時(shí)培養(yǎng)液中還含有5、2.5、0.5或0.1mg/mL的BLG(Sigma)或含有250、50、10或2μg/mL的植物血球凝集素A(Seromed)。在最終培養(yǎng)的6小時(shí)加入(3H)Tdr(Amersham，Zurich)，收集培養(yǎng)皿，用閃爍計(jì)數(shù)法(TopCount，Canberra Packard，Zurich)分析。(3H)Tdr摻合結(jié)果以cpm表示，結(jié)果為三份培養(yǎng)物的平均值，把減去空白的平均值對(duì)BLG濃度作圖。把刺激指數(shù)計(jì)算為減去空白測(cè)試和對(duì)照值的比例，其為2.5mg BLG/mL和50μg PHA/mL下的值。
對(duì)各組進(jìn)行特異增生分析。在-20℃下快速冷凍分離后的血漿，直至用于BLG特異性IgE的分析。
實(shí)施例2用ELISA方法測(cè)定IgE特異性抗體用ELISA方法測(cè)定一式兩份血清樣品的抗-BLG IgE性能。簡(jiǎn)單地說(shuō)，應(yīng)用微滴培養(yǎng)皿(NUNC Immunoplate Maxisorp F96，丹麥)，以100μl/孔的濃度涂敷BLG，濃度為0.5mg/mL，在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中稀釋?zhuān)琾H為9.6，在4℃下過(guò)夜。用PBS-Tw(磷酸鹽-緩沖鹽-吐溫0.05％)洗滌四次，然后進(jìn)行各個(gè)連續(xù)的試劑添加步驟。培養(yǎng)皿中未占據(jù)的位點(diǎn)用200μL/孔的0.5％在PBS-Tw中的魚(yú)明膠(Sigma)占據(jù)，室溫下放置1小時(shí)。以一式兩份方式測(cè)定各個(gè)小鼠樣品的系列稀釋液(血清的3倍稀釋液)。首先在PBS-Tw中稀釋血清20倍，然后進(jìn)行測(cè)試。加入樣品稀釋液，室溫下孵化1小時(shí)，然后加入大鼠抗小鼠IgE過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體(Harlan Sera-Lab，美國(guó))，2小時(shí)后加入OPD底物(Sigma)。在492nm處測(cè)定光密度，室溫孵化15分鐘后，應(yīng)用Dynatech MR500 ELISA讀數(shù)計(jì)(Dynatech，Embrach Embraport，瑞士)。在各個(gè)培養(yǎng)皿中應(yīng)用從二十只非免疫雌性小鼠中獲得的混合樣品作為陰性對(duì)照物。通過(guò)計(jì)算陰性對(duì)照吸收度兩倍的樣品稀釋液確定截止(cut-off)稀釋液。把滴定度表達(dá)為截止稀釋液倒數(shù)的對(duì)數(shù)。
實(shí)施例3細(xì)胞因子ELISA在96孔微滴培養(yǎng)皿(Costar)誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌物，其中以2.5mg/mL/孔的BLG刺激5×105的脾細(xì)胞。經(jīng)48小時(shí)刺激后收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。應(yīng)用細(xì)胞特異性ELISA試劑盒Endogen測(cè)定IFN-γ的含量，其中按照制備商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。所有細(xì)胞因子樣品按照一式兩份進(jìn)行測(cè)試。
實(shí)施例4前列腺素E2和γ-干擾素測(cè)定應(yīng)用酶免疫分析(EIA)試劑盒(Cayman Chemical)測(cè)定淋巴細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)或12小時(shí)的培養(yǎng)物中的PGE2含量。各個(gè)測(cè)試在兩個(gè)稀釋液中測(cè)試一式三份的樣品。
在乳清蛋白喂飼的小鼠中，與非耐受化的對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)5天耐受化后，培養(yǎng)物中BLG-刺激的淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)耐受性導(dǎo)致PGE2和INF-γ生成的含量增加。
當(dāng)用COX抑制劑異丁苯丙酸處理小鼠時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到PGE2和INF-γ含量的增加。另一方面，與用乳清蛋白喂飼的小鼠陽(yáng)性對(duì)照組相比，用丁酸酯(鹽)處理小鼠顯示PGE2和INF-γ的進(jìn)一步增加。
實(shí)施例5增生經(jīng)4天耐受反應(yīng)后(圖3)，用乳清蛋白喂飼小鼠誘導(dǎo)的耐受性導(dǎo)致增生反應(yīng)指數(shù)的降低。刺激指數(shù)低于0.5表明小鼠已經(jīng)耐受。當(dāng)用COX抑制劑異丁苯丙酸處理小鼠時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到增生反應(yīng)指數(shù)的降低。另一方面，與用乳清喂飼的陽(yáng)性對(duì)照小鼠組相比，用丁酸鹽(酯)處理小鼠顯示增生反應(yīng)指數(shù)的進(jìn)一步降低。
用耐受原喂飼4天后用BLG攻擊小鼠，在第26天耐受反應(yīng)后觀(guān)察到類(lèi)似的較強(qiáng)結(jié)果。
實(shí)施例6IgE耐受反應(yīng)26天后，用乳清蛋白喂飼小鼠方式的誘導(dǎo)耐受性導(dǎo)致體液抗BLG IgE滴度的降低。與非耐受的小鼠相比，這種降低顯示顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。當(dāng)用COX抑制劑異丁苯丙酸處理小鼠沒(méi)有觀(guān)察到體液抗-BLG IgE的降低(參見(jiàn)圖2)。
另一方面，與用乳清蛋白喂飼的陽(yáng)性對(duì)照組小鼠相比，用丁酸酯(鹽)處理的小鼠顯示體液抗BLG IgE滴度的進(jìn)一步降低。與耐受化的小鼠(陽(yáng)性對(duì)照組)相比，這種體液抗-BLG IgE滴度的進(jìn)一步降低具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)對(duì)抗原材料耐受性的方法，其通過(guò)給予個(gè)體抗原材料或其抗原部分，并給予至少一種增加個(gè)體細(xì)胞COX-2活性和/或增加IFN-γ含量的物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中抗原為食品材料、自體材料或非食品非自體材料。
3.權(quán)利要求2的方法，其中食品材料來(lái)自乳類(lèi)、蛋類(lèi)、豆類(lèi)、堅(jiān)果類(lèi)、甲殼綱類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、肉類(lèi)、芝麻、乳清、漿果或蘋(píng)果。
4.權(quán)利要求2的方法，其中自體材料選自膠原、胰島素、髓磷脂結(jié)合蛋白、髓磷脂、乙酰膽堿受體、視網(wǎng)膜結(jié)合蛋白或多肽。
5.權(quán)利要求2的方法，其中非食品非自體材料選自花粉、微塵、碘、鎳、銅、毒素、膠乳、洗滌劑、化妝品、香水、石膏、抗生素或異體抗原。
6.上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中能夠增加個(gè)體細(xì)胞COX-2活性和任選增加IFN-γ含量的至少一種物質(zhì)選自丁酸鹽(酯)、n-6PUFA、神經(jīng)酰胺、植物提取物或細(xì)菌材料。
7.食品或藥物組合物，含有抗原材料或其抗原部分，和至少一種能夠增加個(gè)體細(xì)胞COX-2活性的物質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的食品組合物，其選自乳類(lèi)、酸奶、凝乳、奶酪、發(fā)酵乳類(lèi)、乳基發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵谷類(lèi)的產(chǎn)品、乳基粉末、飲料、水基果凍、嬰兒食品或?qū)櫸锸称贰?br> 9.權(quán)利要求5的組合物，其中至少一種能夠增加個(gè)體細(xì)胞COX-2含量和任選增加IFN-γ含量的物質(zhì)選自丁酸鹽(酯)、n-6 PUFA、神經(jīng)酰胺、植物提取物或細(xì)菌材料。
10.權(quán)利要求7-9任意一項(xiàng)的組合物用于防止個(gè)體對(duì)所述組合物中含有的抗原材料產(chǎn)生免疫反應(yīng)的趨向的用途。
11.測(cè)定個(gè)體對(duì)給定材料產(chǎn)生負(fù)性免疫反應(yīng)趨勢(shì)的方法，包括(a)從個(gè)體中采取血樣，(b)任選地從含有淋巴細(xì)胞的樣品中收集細(xì)胞材料，(c)讓樣品接觸抗原材料，和(d)測(cè)定COX-2的活性和/或測(cè)定IFN-γ的含量，和(e)將測(cè)定的含量與對(duì)照組比較，其中增加的COX-2活性和增加的IFN-γ含量是對(duì)所述材料耐受性的指示。
12.權(quán)利要求11的方法，其中測(cè)試致耐受性的材料是食品材料。
13.權(quán)利要求11的方法，其中食品材料選自乳類(lèi)、酸奶、凝乳、奶酪、發(fā)酵乳類(lèi)、乳基發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵谷類(lèi)的產(chǎn)品、乳基粉末、飲料、水基果凍、嬰兒食品或?qū)櫸锸称贰?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)個(gè)體對(duì)抗原物質(zhì)產(chǎn)生耐受性的方法，其通過(guò)對(duì)發(fā)生負(fù)性免疫反應(yīng)的個(gè)體給予增加個(gè)體細(xì)胞COX－2(環(huán)氧合酶2)活性并任選增加IFN－γ含量的化合物，其中所述細(xì)胞優(yōu)選免疫反應(yīng)細(xì)胞，還給予一種材料或其抗原部分。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及含有所述化合物和抗原材料或其抗原部分的食品或藥物組合物。在可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及新的體外方法，用于確定個(gè)體對(duì)具體材料產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的趨勢(shì)。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1529618SQ01821250
公開(kāi)日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2001年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月22日
發(fā)明者M·圖里尼, B·格爾曼, S·佩奎特, , M 圖里尼 申請(qǐng)人:雀巢制品公司