專利名稱：逆境耐受性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定和獲得能夠在植物中改變逆境耐受性，特別是耐寒性的方法。本發(fā)明也涉及這樣獲得的分離的核酸。本發(fā)明此外涉及獲得具有改變的逆境耐受性的植物以及通過本發(fā)明的方法獲得的植物。本發(fā)明還涉及具有改變的對寒冷逆境的耐受性的酵母菌株。
背景環(huán)境逆境狀況，例如太陽能、水或養(yǎng)分的短缺或過量、高鹽度和污染(例如重金屬污染)，可以對植物生長具有重要影響，并可以顯著地降低植物產(chǎn)量。滲透逆境-一種類型的環(huán)境逆境-可通過過量的鹽度、干旱、過熱、寒冷或凍結(jié)的狀況而誘導(dǎo)。
寒冷逆境可通過低于允許特定植物物種最適宜生長的范圍的溫度誘導(dǎo)。各植物物種或品種具有生長速率最大的最適生長溫度。越遠(yuǎn)離此最適生長溫度，對植物的逆境越大。許多植物物種，特別是來自熱帶或亞熱帶的植物物種，對寒冷很敏感。例如，已經(jīng)估計(jì)如果全世界的平均溫度下降僅僅在0.5到1.0℃之間，全世界的水稻產(chǎn)量將減少40％(Salisbury和Ross，Plant Physiology.4thed.WadsworthPublishing Company，Belmont，CA，1992)。然而來自溫帶的植物在經(jīng)歷適應(yīng)低的但不凍結(jié)的溫度的過程后，具有使它們的新陳代謝適應(yīng)并于凍結(jié)溫度存活的能力，該過程稱為寒冷順應(yīng)。例如非順應(yīng)黑麥一般無法存活于低于-5℃的溫度，但在寒冷順應(yīng)之后，它可以經(jīng)受低到-30℃的溫度。寒冷順應(yīng)的過程涉及許多基因表達(dá)的改變。植物的經(jīng)受寒冷的能力可能不同，這可導(dǎo)致周期性的但是并非顯著的植物生產(chǎn)力的損失。因此，通過評估低于任意給定植物的通常生長溫度的溫度的風(fēng)險(xiǎn)而確定農(nóng)作物或園藝植物可以種植的區(qū)域。
在寒冷順應(yīng)期間最顯著的變化包括生長的縮減或停止、組織水含量的減少(Levitt；Responses of Plants to Environmental Stresses，Vol.1.2nd edn.Academic Press.New York，NY 980)，短暫的脫落酸(ABA)水平的增加(Chen等，Plant Physiology 71，362-365，1983)，膜脂組成的改變(Lynch和Steponkus，Plant Physiology 83，761-767，1987；Uemur a和Steponkus，Plant Physiology 104，479-496，1994)，諸如脯氨酸、甜菜堿、多元醇和可溶性糖等相容滲透物的聚積以及抗氧化劑水平的增高(Koster和Lynch，PlantPhysiology 98，108-113，1992；Kishitani等，Plant，Cell andEnvironment 17，89-95，1994；Murelli等，PhysiologiaPlantarum 94，87-931995；Nomura等，Euphytica 83，247-250，1995；Drffling等，Plant Molecular Biology 23，221-225，1997；Tao等，Cryobiology 37，38-45，1998)。
已知鑒定和分離在寒冷逆境期間差異表達(dá)的基因或蛋白的多種方法。例如，作圖技術(shù)可以確定涉及寒冷耐受性的基因的染色體位點(diǎn)(Pan等，Theoretical and Applied Genetics 89，900-910，1994；Galiba等，Theoretical and Applied Genetics 90，1174-1179，1995)。另一種方法涉及突變分析，其中分離并表征具有改變的耐寒性反應(yīng)的突變體。例如，eskimol，賦予順應(yīng)的野生型植物提高的2℃冷凍耐受性，是從篩查了組成型冷凍耐受突變體的800000個乙基甲基磺酸酯(EMS)誘變的鼠耳芥屬株系的集合中分離出來的(Xin和Browse，PNAS 95，7799-7804，1998)。相反，篩查了植物株系中在寒冷順應(yīng)方面有缺陷的突變體(Warren等人，Plant Physiology 111，1011-1019，1996；Knight等，Plant Cell 8，489-503，1996)。采用誘變和報(bào)告基因活化的組合分離了cos-、los-和hos-突變體(分別為組成性、低和高表達(dá)滲透反應(yīng)性基因)(Ishitani等，Plant Cell 9，1935-1949，1997；Ishitani等，Plant Cell 10，1151-1161，1998；Lee等，Plant Journal 17，301-308，1999)。作圖和突變分析策略的一個缺點(diǎn)是它們并非直接導(dǎo)致編碼寒冷誘導(dǎo)基因的核酸的分離。另一種策略采用cDNA文庫的差異篩選和相關(guān)技術(shù)，在過去已經(jīng)從不同的植物物種產(chǎn)生了若干寒冷誘導(dǎo)基因(綜述，Xin和Browse，Plant，Cell and environment 23，893-902，2000)。許多這些基因具有已知的功能并可以分組為涉及干旱逆境、信號傳導(dǎo)通路、或與熱休克蛋白、分子伴侶、“抗冷凍蛋白”或調(diào)控蛋白相關(guān)。一些基因在寒冷逆境期間高度表達(dá)，通常稱為COR(COld調(diào)控)基因(Tomashow，AnnualReview of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50，571-599，1999)。
用于設(shè)計(jì)改造耐寒植物的策略包括諸如甘露醇(US6,416,985)、脯氨酸(US6,239,332)、海藻糖(US6,323,001)或甘氨酸-甜菜堿(Hayashi等，Plant Journal 12，133-142，1997；US6,281,411)等滲透保護(hù)物質(zhì)的聚積。其它的方法涉及對控制逆境反應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路的操作(WO 01/77355)，包括轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用(WO 01/77311，US6,417,428，WO 02/44389，US5,891,859)。另外已經(jīng)采用多種基因提高耐寒性。例子為COR組的成員(COR15aUS5,296,462，US5,356,816)、細(xì)胞周期相關(guān)基因(WO 01/77354)、蛋白激酶相關(guān)蛋白(WO 01/77356)、LEA樣蛋白CAP85(US5,837,545)以及磷脂結(jié)合蛋白(WO 02/00697)的應(yīng)用。然而植物中導(dǎo)致寒冷順應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路以及賦予對寒冷逆境抗性的基因的身份仍然在很大程度上不為人知。
酵母已經(jīng)被用來篩選賦予對鹽逆境抗性的植物基因。例如，鹽敏感的酵母菌株(JM26)先前已經(jīng)用來自鹽逆境的甜菜的cDNA文庫轉(zhuǎn)化，并用于篩選具有提高的耐鹽性的克隆(WO 02/52012)。該轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞豐富培養(yǎng)基(YPD)上或在加入甲硫氨酸和亮氨酸的合成培養(yǎng)基(SD)上生長，補(bǔ)充了0.15M NaCl或20mM LiCl。與非轉(zhuǎn)化酵母菌株相比，在選擇培養(yǎng)基上顯示出更好生長的推定的陽性克隆被分離并作進(jìn)一步表征。
然而，以前沒有用過利用酵母來鑒定涉及寒冷逆境的植物基因。Jesus Ferreira等最近在單倍體酵母中的研究(2001)采用轉(zhuǎn)座子誘變鑒定了10個不同的對耐寒性有反應(yīng)的酵母基因，其突變導(dǎo)致生長在15℃停止。所鑒定的基因包括編碼谷氨酸合酶(YDL171C)、GTP結(jié)合蛋白(YML121W)、GSK-3Ser/Thr蛋白激酶(YNL307C)以及TFIID組分(YLR399C)的基因。先前描述了其中3個基因?qū)溆蟹磻?yīng)(YLR399C，YML121W，YNL307C)，且其中4個分離的基因還涉及對鹽逆境的抗性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種在植物中篩選涉及逆境反應(yīng)的核酸的新方法，該方法涉及在二倍體酵母中篩選涉及改變對溫度逆境的耐受性/抗性的植物基因。本發(fā)明也提供了通過該篩選鑒定的新的植物基因和這些基因編碼的多肽。也提供了生產(chǎn)具有改變的對環(huán)境逆境狀況的耐受性或抗性的植物的方法，包括將上述的基因引入植物。也提供了對環(huán)境逆境狀況具有改變的耐受性或抗性的植物，該植物用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的第一個具體實(shí)施方式
，提供了一種鑒定能夠在植物或酵母中改變對寒冷逆境狀態(tài)的耐受性或抗性的核酸的篩選方法，該方法包括下列步驟(i)提供來自生物體的編碼序列的cDNA文庫；(ii)將這些編碼序列以可表達(dá)的形式引入野生型酵母細(xì)胞中；(iii)使(ii)的酵母細(xì)胞在寒冷逆境的條件下生長；(iv)識別轉(zhuǎn)基因的酵母細(xì)胞和野生型酵母細(xì)胞之間的差異，優(yōu)選識別生長速率的差異；(v)從與野生型酵母細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)基因的酵母細(xì)胞分離核酸。
野生型酵母細(xì)胞優(yōu)選為野生型二倍體釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)酵母細(xì)胞，更優(yōu)選野生型釀酒酵母W303酵母細(xì)胞。此外優(yōu)選生物體是植物，該植物優(yōu)選是鹽處理的植物，更優(yōu)選鹽處理的鹽生植物或其一部分，最優(yōu)選鹽處理的甜菜(Beta vulgaris)或其一部分。
利用酵母細(xì)胞鑒定涉及鹽或滲透逆境的基因在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。酵母是一種檢測賦予對滲透壓或鹽逆境的耐受性的基因的良好模型生物體，因?yàn)橐阎试S互補(bǔ)的合適的突變體。WO 02/052012教導(dǎo)了一種篩選方法，其中用分離自鹽逆境甜菜的cDNA轉(zhuǎn)化突變的對鹽敏感的酵母菌株。該方法導(dǎo)致鑒定了可以有助于提高植物對鹽、干旱或滲透逆境的耐受性的基因。這里，第一次把酵母用于涉及寒冷逆境應(yīng)用的植物cDNA文庫篩選。與WO 02/052012中導(dǎo)致鹽敏感的突變由引入的植物cDNA互補(bǔ)相反，本發(fā)明中采用野生型酵母代替突變體；野生型酵母是二倍體，以避免會最終導(dǎo)致酵母宿主的耐寒性的隱性染色體突變的任何效應(yīng)。本發(fā)明表明，由于沒有適宜的冷敏感突變體存在，用來自鹽逆境的植物的cDNA轉(zhuǎn)化的野生型酵母細(xì)胞可用于分離能夠賦予植物對寒冷逆境的耐受性的基因。
術(shù)語″耐受性″和″抗性″這里可以互換使用。
篩選方法的第一步涉及提供來自任何生物體的編碼序列的cDNA文庫，例如植物動物或真菌。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，該cDNA文庫由植物制成，優(yōu)選是鹽處理的植物，更優(yōu)選鹽處理的鹽生植物或其一部分，更優(yōu)選鹽處理的甜菜植物或其一部分，最優(yōu)選鹽處理的甜菜植物的葉子。甜菜(sugar beet，Beta vulgaris)，一種相對鹽生的農(nóng)作物，提供了耐寒性基因的潛在良好來源。盡管本發(fā)明通過利用甜菜cDNA文庫進(jìn)行舉例說明，應(yīng)當(dāng)理解其它的鹽生植物可以同樣地為該目的服務(wù)。cDNA文庫的制備是現(xiàn)有技術(shù)中已知的常規(guī)技術(shù)，cDNA文庫優(yōu)選包括該植物細(xì)胞的基本上全部mRNA的拷貝。有利的是，單單編碼序列就足夠。
篩選方法的第二步涉及將編碼序列引入酵母細(xì)胞。酵母轉(zhuǎn)化方法，例如電穿孔或用醋酸鋰處理，以及在酵母中包括pYES等酵母載體中表達(dá)基因的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(例如參見Current Protocols inMolecular Biology，Unit 13(Ausubel等，1994)以及Guide to YeastGenetics and Molecular Biology(Guthrie和Fink，1991))。為了檢測對逆境條件的耐受性或抗性的目的，可以方便地采用一些已知方法的任意一種將編碼序列引入酵母細(xì)胞并在其中表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選特征，采用了一種基于λ噬菌體的載體，更優(yōu)選用λPG15在酵母中引入和表達(dá)編碼序列。噬菌體λPG15包括可切除的表達(dá)質(zhì)粒pYPGE15，其可以直接用于大腸桿菌和酵母互補(bǔ)(Brunelli和Pall，Yeast 9，1309-1318，1993)。質(zhì)粒cDNA文庫可以采用cre-lox重組酶系統(tǒng)從λPG15中回收(Brunelli和Pall，Yeast 9，1309-1318，1993)。酵母細(xì)胞優(yōu)選為釀酒酵母，更優(yōu)選為二倍體野生型株系W303，以及它的甘油磷酸脫氫酶缺陷的二倍體突變株(gpd1)。酵母株系W303具有MATa/MATα、ADE2/ade2、CAN1/can1-100、CYH2/cyh2、his3-11，15/his3-11，15、LEU1/leu1-c、LEU2/leu2-3，112、trp1-1URA3trp1-3′D/trp1-1、ura3-1/ura3-1基因型，并源自親本株系W303-1A和W303-1B(Primig等，Nat.Genet.26，415-423，2000)。W303gpd1突變株出乎意料地比W303野生型株系更加耐寒(參見圖1)。為了這一原因，在篩選中采用野生型株系，而gpd1突變株作為對比的標(biāo)準(zhǔn)。因此預(yù)期賦予耐寒性的核酸將提高野生型酵母細(xì)胞的生長至與gpd1突變株相當(dāng)或更好的水平。
有利的是，gpd1基因能夠用于提高酵母的耐寒性，例如面包酵母。已知酵母對寒冷逆境敏感。冷凍逆境特別對酵母作為酵素的質(zhì)量具有負(fù)面影響。已經(jīng)突變或改造使甘油磷酸脫氫酶(gpd1)基因滅活(使用本領(lǐng)域已知的技術(shù))的酵母細(xì)胞驚人地比野生型酵母對寒冷和/或冷凍逆境更為耐受。這個特性可對例如烘焙或釀造工業(yè)有益。因而本發(fā)明也提供了一種提高酵母細(xì)胞的耐寒性的方法，包括在酵母中下調(diào)編碼甘油磷酸脫氫酶的核酸的表達(dá)和/或抑制甘油磷酸脫氫酶的活性。而且本發(fā)明通過下調(diào)其表達(dá)而提供了gpd1基因在改變酵母的逆境耐受性中的應(yīng)用。這樣獲得的逆境耐受酵母細(xì)胞可以以純化形式(例如酵素)或以組合物(例如生面團(tuán))應(yīng)用。
該篩選的第三步涉及使酵母細(xì)胞在逆境條件下生長。將用鹽逆境甜菜的cDNA轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞鋪于適宜的培養(yǎng)基上并在寒冷逆境下生長。選擇10℃的溫度，因?yàn)檫@個溫度仍然允許酵母菌株的最低限度生長，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇低于最適生長溫度的任何其它溫度。在特定一段時間后，選擇能在這些寒冷條件下生長的菌落，通過將該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再次在寒冷逆境條件下生長而重復(fù)測試它們的耐寒性。有利的是，來自鹽處理植物的cDNA也可以是尋找能賦予針對其它逆境的耐受性的基因的適宜基礎(chǔ)。這可以簡單地通過將在上述步驟(iii)中的酵母細(xì)胞在由尋找的基因類型確定的逆境條件下生長而實(shí)現(xiàn)。例如，為了鑒定賦予對熱逆境的耐受性的基因，使該酵母細(xì)胞在熱條件下生長。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，逆境優(yōu)選是寒冷逆境。然后確定是否逆境耐受性來源于該轉(zhuǎn)基因，而不是源自宿主基因組的突變。為此，從轉(zhuǎn)基因的耐寒酵母克隆去除包括該轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒，并驗(yàn)證耐寒性是否也隨之消失；第二，從轉(zhuǎn)基因耐寒酵母克隆中分離包括該轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒，并再引入非轉(zhuǎn)基因的酵母菌株，然后將新轉(zhuǎn)化的酵母菌株的耐寒性與非轉(zhuǎn)化的酵母菌株對比。
該篩選方法的第四步是識別生長快的酵母細(xì)胞。基于它們在逆境狀態(tài)下比未用這樣的核酸轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞生長更快的能力識別用賦予逆境抗性的植物核酸轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，但是也可以用其它的選擇標(biāo)準(zhǔn)，這取決于施加的逆境的類型。
最后，在篩選方法的最后步驟中，從酵母宿主中分離賦予逆境耐受性的核酸并進(jìn)行表征。從酵母中分離核酸和對這些核酸測序的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
本發(fā)明也包括上述的篩選方法用于鑒定編碼能夠賦予植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞寒冷逆境耐受性的蛋白質(zhì)的核酸的應(yīng)用。
如上所述的篩選方法獲得了若干編碼提高酵母菌株的寒冷逆境耐受性的蛋白質(zhì)的核酸，這里命名為CRYO基因和CRYO蛋白。這些核酸編碼的蛋白質(zhì)全部與液泡或質(zhì)膜的小泡運(yùn)輸有關(guān)。對逆境的反應(yīng)需要新陳代謝的適應(yīng)，包括蛋白及其他組分在不同的細(xì)胞器之間，特別在高爾基氏體和液泡之間，但也在質(zhì)膜和液泡之間的運(yùn)輸。植物液泡執(zhí)行不同的功能，取決于它們所在的細(xì)胞類型。它們在細(xì)胞生長或功能中扮演重要角色，作為蛋白質(zhì)、離子、次級代謝產(chǎn)物和新陳代謝的廢物的存儲細(xì)胞器。在這最后一方面，液泡也類似于溶酶體。它們含有降解損壞的或多余的細(xì)胞材料的水解酶。對環(huán)境條件變化或?qū)δ婢车倪m應(yīng)不僅涉及新的細(xì)胞組分的合成而且涉及細(xì)胞材料的降解。這些降解過程需要經(jīng)由內(nèi)體等膜結(jié)合小泡廣泛運(yùn)輸材料，同樣水解酶也經(jīng)由內(nèi)體傳遞給液泡。
CRYO4(SEQ ID NO 8)是與At1g72160具同源性的蛋白，后者是鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)中的胞質(zhì)因子；且其另外與酵母SEC14(＝Y(jié)MR079W)具有顯著的同源性。該酵母蛋白是一種胞質(zhì)磷脂酰肌醇/磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對于從高爾基復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)分泌蛋白和蛋白分泌是需要的(Bankaitis等，(1990) Nature 347，561-562)。在酵母中，它作為外周膜蛋白與高爾基復(fù)合體相關(guān)，在磷脂代謝和小泡運(yùn)輸之間形成聯(lián)系(Li等，(2000)Mol.Biol.Cell 11，1989-2005)。在體外它催化磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿在膜之間轉(zhuǎn)運(yùn)，對生存和分泌是必需的(Tschopp等，(1984)J.Bacteriol 160，966-970)。
CRYO5(SEQ ID NO 10)是一種有RING結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。RING-結(jié)構(gòu)域蛋白已知涉及諸如轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的生物過程和靶向的蛋白水解。RING結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，是一種40到60個氨基酸長度的C3HC4型鋅指結(jié)構(gòu)域。多種有RING指結(jié)構(gòu)域的蛋白顯示與E2遍在蛋白-綴合酶結(jié)合(Ubc′s)結(jié)合(Freemont(2000)Curr Biol.10，R84-87)。上述結(jié)構(gòu)域Zf-RING指與在酵母CLASS E液泡分選蛋白質(zhì)VPS27中發(fā)現(xiàn)的不同。然而，可能有一些保守功能，因?yàn)閂PS27也與遍在蛋白化過程和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)聯(lián)，存在于CRIO5中的Zf-RING指結(jié)構(gòu)域通常發(fā)現(xiàn)于也涉及遍在蛋白化和蛋白酶體蛋白質(zhì)降解的蛋白中。
本發(fā)明的其它蛋白屬于E類液泡運(yùn)輸突變體組。酵母中的某些突變體已知為“E類”突變體(Jones等，InYeast III，Cold SpringHarbor Laboratory Press，p363-470，1997)，不能將蛋白正確分選到液泡。顯微分析揭示這些突變株含有大的異常內(nèi)體結(jié)構(gòu)(Raymond等，Molecular Biology of the Cell 3，1389，1992)，其中充滿了正常轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡的蛋白。
CRYO1、CRYO2和CRYO3都具有SNF7結(jié)構(gòu)域(Pfam PF03357/IPR005024；Pfam數(shù)據(jù)庫，Bateman等，(2004)Nucleic AcidsResearch Database Issue 32，D138-D141)。這3種蛋白在結(jié)構(gòu)上屬于CHMP蛋白家族(Howard等，(2001)J.Cell Sci.114，2395-2404)。CRYO1(SEQ ID NO 2)和CRYO2(SEQ ID NO 4)彼此是同種型。CRYO1和它的植物同源物尚未進(jìn)行功能表征，但它們與酵母SNF7(＝DID1＝VPS32＝Y(jié)LR025W)相關(guān)。SNF7突變體屬于E類液泡運(yùn)輸突變體組(Jones等，InYeast III，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p363-470，1997)。SNF7突變體聚積了與液泡截然不同的顯著細(xì)胞器，含有大量通常存在于液泡中的酶，例如水解酶CpY，PrA & PrB。該蛋白涉及對葡萄糖限制反應(yīng)的SUC2的去阻抑。SNF7突變體表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化酶去阻抑的降低，蜜三糖的生長缺陷，對葡萄糖的溫度敏感生長，以及純合子二倍體的孢子形成缺陷。SNF7糖相關(guān)表型可以是由于改變的葡萄糖傳感器的轉(zhuǎn)換。這些和其它數(shù)據(jù)表明從高爾基復(fù)合體和從質(zhì)膜向液泡的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)受到了干擾。SNF7與vps20和mos10形成了卷曲螺旋形成蛋白家族。所述蛋白涉及同一運(yùn)輸步驟，內(nèi)體到液泡的運(yùn)輸，但可能參與不同的運(yùn)輸物特異性事件(Kranz等，2001)。
SEQ ID NO 6(CRYO3)是酵母DID2(＝FT11＝Y(jié)KR035W-A)的植物同源物，另一E類液泡運(yùn)輸?shù)鞍椎某蓡T。DID2與SNF7相關(guān)；它具有類似的結(jié)構(gòu)特征，它可以具有相當(dāng)?shù)墓δ?，可能屬于酵母中同樣的蛋白?fù)合物(Amerik等，Molecular Biology of the Cell，11，3365-3380，2000)。有報(bào)道說人的直向同源物CHMP1涉及膜運(yùn)輸并定位于早期內(nèi)體(Howard等，2001)。CHMP1也定位于核基質(zhì)，因此影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期進(jìn)程，并進(jìn)一步與PcG蛋白Polycomblike(Pcl)相互作用(Stauffer等，2001 J Cell Sci.114，2383-93)。
除了改變對寒冷逆境的耐受性，這些蛋白還可涉及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和分選(CRYO1[SEQ ID NO 1/2]、CRYO2[SEQ ID NO 3/4]、CRYO3[SEQ IDNO 5/6]和CRYO4[SEQ ID NO 7/8])、液泡形成、發(fā)育或機(jī)能(CRYO1，CRYO2，CRYO3)、涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯(CRYO3，CRYO5)、涉及膜流動性(CRYO4)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(CRYO5)。
由本發(fā)明的篩選方法鑒定的核酸編碼的蛋白迄今為止是未知的，因此，本發(fā)明也提供了分離的CRYO蛋白，(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有具有至少下列序列同一性的序列i.與SEQ ID NO 2給出的全長序列具有76％，或80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；ii.與SEQ ID NO4給出的全長序列具有55％或60％、70％、80％，優(yōu)選90％更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；iii.與SEQ ID NO 6給出的全長序列具有90.5％或90.6％、90.7％、90.8％、90.9％，優(yōu)選91％、92％、93％、94％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；iv.與SEQ ID NO 8給出的全長序列具有50％，或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；v.與SEQ ID NO 10給出的全長序列具有50％或60％、70％、80％優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；本發(fā)明的CRYO基因是編碼上面定義的CRYO蛋白的任意核酸。
蛋白的“同源物”包括相對于未修飾的目的蛋白具有氨基酸置換、缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，且具有與它們衍生自的未修飾蛋白類似的生物學(xué)和功能活性。為生產(chǎn)這種同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以被其他具有類似性質(zhì)(例如類似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊結(jié)構(gòu)的傾向性)的氨基酸替換?，F(xiàn)有技術(shù)中熟知保守置換表(例如參見Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman and Company)。對于CRYO4或CRYO5，可用于本發(fā)明的方法的同源物與未修飾蛋白具有至少50％序列同一性或相似性(功能同一性)，或與未修飾蛋白具有至少60％序列同一性或相似性，或與未修飾蛋白具有至少70％序列同一性或相似性。通常CRYO4或CRYO5的同源物與未修飾蛋白具有至少80％序列同一性或相似性，優(yōu)選至少85％序列同一性或相似性，進(jìn)一步優(yōu)選至少90％序列同一性或相似性，最優(yōu)選與未修飾蛋白具有至少95％序列同一性或相似性。對CRYO2，可用于本發(fā)明的方法的同源物與未修飾蛋白具有至少55％序列同一性或相似性(功能同一性)，或與未修飾蛋白具有至少60％序列同一性或相似性，或與未修飾蛋白具有至少70％序列同一性或相似性。通常CRYO2的同源物與未修飾蛋白具有至少80％序列同一性或相似性，優(yōu)選至少85％序列同一性或相似性，進(jìn)一步優(yōu)選至少90％序列同一性或相似性，最優(yōu)選與未修飾蛋白具有至少95％序列同一性或相似性。對CRYO1，可用于本發(fā)明的方法的同源物與未修飾蛋白具有至少76％序列同一性或相似性(功能同一性)，通常CRYO1的同源物與未修飾蛋白具有至少80％序列同一性或相似性，優(yōu)選至少85％序列同一性或相似性，進(jìn)一步優(yōu)選至少90％序列同一性或相似性，最優(yōu)選與未修飾蛋白具有至少95％序列同一性或相似性。對CRYO3，可用于本發(fā)明的方法的同源物與未修飾蛋白具有至少90.5％序列同一性或相似性(功能同一性)，通常CRYO3的同源物與未修飾蛋白具有至少91％序列同一性或相似性，優(yōu)選至少92％序列同一性或相似性，進(jìn)一步優(yōu)選至少93％序列同一性或相似性，最優(yōu)選與未修飾蛋白具有至少95％序列同一性或相似性。而且本發(fā)明的CRYO蛋白的同源物能夠在上述的測定中增加酵母的寒冷逆境耐受性。
兩種特殊形式的同源-直向同源(orthologous)和共生同源(paralogous)是用來描述基因的祖先遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語“共生同源”涉及物種的基因組內(nèi)的基因重復(fù)復(fù)制，導(dǎo)致共生同源基因。術(shù)語“直向同源”涉及由祖先遺傳關(guān)系所致在不同生物體中的同源基因。這里采用的術(shù)語“同源物”也包括了可用于本發(fā)明方法的蛋白的共生同源物和直向同源物。
其它植物物種中的直向同源物可以通過進(jìn)行所謂的交互blast搜索而找到。這可以通過涉及用感興趣的序列(SEQ ID NO 1到10的任意一個)對任意的序列數(shù)據(jù)庫的第一輪blast進(jìn)行，例如公眾可獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫，可以在http//www.nebi.nlm.nih.gov找到。如果搜尋在水稻中的直向同源物，將目標(biāo)序列對例如在NCBI中可獲得的Oryza sativa Nipponbare 28,469全長cDNA克隆進(jìn)行blast。當(dāng)從核苷酸開始時可以采用BLASTn，當(dāng)從蛋白開始時，可以采用TBLASTX，采用標(biāo)準(zhǔn)的缺省值。blast結(jié)果可以進(jìn)行過濾。過濾結(jié)果或未過濾結(jié)果的全長序列再與目標(biāo)序列進(jìn)行反向blast(第二次blast)。然后對比第一次和第二次blast的結(jié)果。真正的直向同源物為那些與查詢序列再次匹配的序列。在大家族的情形下，采用ClustalW和鄰近結(jié)合方法構(gòu)建種系發(fā)生樹狀結(jié)構(gòu)，以有助于顯示分類。
同源蛋白可以被分組為“蛋白家族”，一個蛋白家族可通過功能和序列相似性分析而定義，例如Clustal W。Clustal W程序可以產(chǎn)生感興趣蛋白的同源性蛋白的鄰近關(guān)系樹并給出了它們的結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系的良好的概括。
CRYO1、CRYO2或CRY3蛋白含有SNF7結(jié)構(gòu)域且可以認(rèn)為是與人CHMP1和酵母SNF7同樣的蛋白家族的成員。SNF7結(jié)構(gòu)域(Pfam PF03357)發(fā)生于真核細(xì)胞中涉及蛋白分選和從內(nèi)體到液泡/溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)的一組蛋白質(zhì)。在Interpro數(shù)據(jù)庫中，SNF7家族描述為真核蛋白的一個家族，其被不同地描述為假設(shè)蛋白、發(fā)育蛋白或與酵母SNF7相關(guān)。該家族含有人CHMP1。CHMP1(染色質(zhì)修飾蛋白(CHromatin ModifyingProtein)；帶電荷多泡體蛋白(CHarged Multivesicular bodyProtein))由PRSM1基因的可變(alternative)可讀框編碼，在復(fù)雜和簡單真核生物中都是保守的。CHMP1含有預(yù)測的雙向核定位信號，以獨(dú)特的形式分布于所有檢測的細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核基質(zhì)中。人CHMP1強(qiáng)烈參與多泡體形成。多泡體是充滿小泡的內(nèi)體，將蛋白靶向到溶酶體內(nèi)。免疫細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)分級分離將CHMP1定位至早期內(nèi)體，且CHMP1與SKD1/VPS4發(fā)生物理相互作用，后者是一種高度保守的直接與在酵母中多泡體分選關(guān)聯(lián)的蛋白。與突變SKD1蛋白的作用類似，人CHMP1融合衍生物的過表達(dá)擴(kuò)張了內(nèi)體區(qū)室，并破壞了一些內(nèi)體標(biāo)記的正常分布。在釀酒酵母中的遺傳研究進(jìn)一步支持CHMP1在小泡運(yùn)輸中的保守作用。刪除CHMP1的出芽酵母同源物CHM1，導(dǎo)致羧肽酶S和Y分選缺陷，且產(chǎn)生異常的、多層片的小泡前區(qū)室。該表型將CHM1分類為E類小泡蛋白分選基因的成員。在該CHMP家族中，可以發(fā)現(xiàn)其它的CHMP蛋白，例如酵母蛋白Chm1p、Chm2p、Vps24p、Chm5p和Chm6p，或人蛋白AF281064、AF042384、AF151842、AF19226、AF161483、AF132968和AW965590(Howard等，2001)。所有這些蛋白組成了具有類似的大小和電荷分布(堿性N末端和酸性C末端)和遍及完整蛋白序列的序列保守的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白家族(Howard等，2001)。該結(jié)構(gòu)保守也表明了功能保守CHM基因產(chǎn)物涉及羧肽酶Y的正確分選，且可在如Howard等人(2001)所描述的脈沖追蹤試驗(yàn)中測定。
CRYO4屬于與酵母SEC14同樣的家族。CRYO4含有一個SMART數(shù)據(jù)庫定義的SEC14結(jié)構(gòu)域(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等(2004)Nucleic Acids Res 32，D142-D144)SEC14結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白(Sec14p)的同源物和RhoGAPs、RhoGEFs和RasGAP、神經(jīng)纖維瘤蛋白(NF1)中。也有報(bào)道說它是一種脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Db1的SEC14結(jié)構(gòu)域已知與G蛋白β/Y亞單位結(jié)合。在Interpro數(shù)據(jù)庫中也描述了該結(jié)構(gòu)域(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)(IPR001251)，其中含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白被分組為多種視黃醛/視網(wǎng)膜結(jié)合蛋白的家族，可以是動物中視覺周期的功能組分。細(xì)胞視黃醛-結(jié)合蛋白(CRALBP)攜帶11-順式視黃醇或11-順式-視黃醛作為內(nèi)源性配體，并可以作為底物攜帶蛋白調(diào)節(jié)這些類維生素A與視覺循環(huán)酶的相互作用。多結(jié)構(gòu)域蛋白Trio與LAR跨膜酪氨酸磷酸酶結(jié)合，含有一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，且具有單獨(dú)分開的rac-特異性和rho-特異性鳥嘌呤核苷交換因子結(jié)構(gòu)域。Trio是一種多功能蛋白，整合和擴(kuò)增涉及協(xié)同肌動蛋白重塑的信號，對細(xì)胞遷移和生長是必需的。該家族的其它成員為轉(zhuǎn)移蛋白，包括可以作為RAC1效應(yīng)器而發(fā)揮功能的鳥嘌呤核苷酸交換因子，從高爾基復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)分泌蛋白所需的磷脂酰肌醇/磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白以及提高分離的膜之間的配體轉(zhuǎn)移的α維生素E轉(zhuǎn)移蛋白。可用于本發(fā)明的同源物包括SEC14結(jié)構(gòu)域，且表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性(Jouannic等，Eur.J.Biochem.258，402-410(1998)描述了一種合適的測定分析)，包括例如鼠耳芥蛋白At1g72160、At4g09160、At1g22530、At1g72150、At3g51670、At1g30690、水稻蛋白BAB86220和AY107978編碼的玉米蛋白。
CRYO5在蛋白的羧基末端部分包括RING型鋅指結(jié)構(gòu)域，另外還有一個跨越SEQ ID NO 10的氨基酸(從)15到305的保守序列，對應(yīng)于Pfam-B-23829結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域推測與C3HC4型Zn-指結(jié)構(gòu)域相結(jié)合)，以及從AA425到473的序列，對應(yīng)于Pfam-B-2377。與該P(yáng)fam-B-2377結(jié)構(gòu)域相應(yīng)的CRYO5序列含有在其它同源植物蛋白中也發(fā)現(xiàn)的保守氨基酸序列，且包括序列HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG，其中各種不同的同源物之間可以發(fā)生少于7處錯配。CRYO5的植物同源物組成了一類新的蛋白(CRYO5樣蛋白)，其特征在于在蛋白的N末端一半存在富含絲氨酸的區(qū)域，包括上述的保守序列特征(signature)的酸性區(qū)域以及RING指結(jié)構(gòu)域。例示性同源物包括序列NP_196626、NP_974832、NP_568462.2和AK066069編碼的蛋白。
屬于這些家族和/或含有一個或多個這些結(jié)構(gòu)域的同源蛋白可以有利地用于本發(fā)明的方法中，以賦予植物細(xì)胞或酵母非生物逆境耐受性，特別是耐寒性。
當(dāng)最佳地對比時，如果兩個序列中的氨基酸殘基或核苷酸的序列分別是一樣的，兩個多肽或核酸被稱為是“同一的”。在兩個(或多個)多肽或核酸之間的序列對比通常通過在“對比窗口”中進(jìn)行2個序列的對比來識別和對比局部區(qū)域的序列相似性。這里所采用的“對比窗口”指至少約20個連續(xù)位點(diǎn)的片段，通常為大約50到大約200，更通常為大約100到大約150，在將兩個序列最佳排列后，可以將序列與同樣數(shù)目的連續(xù)位點(diǎn)的參考序列進(jìn)行對比。用于對比的序列的最佳排列可以通過Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2，482，1981)，Needleman和Wunsch的同源性對比算法(J.Mol.Biol.48 443，1970)，Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Nat.Acad.Sci.85，2444，1988)，這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施方案(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)或通過觀察來進(jìn)行。當(dāng)采用Needleman-Wunsch算法時，采用10或11的缺口開放罰分，0.5或1的缺口延伸罰分，如果可能，將全長序列相互對比。
術(shù)語“衍生物”指與SFQ ID NO 2、4、6、8或10所示的天然存在形式的蛋白的氨基酸相比，可以含有天然或非天然存在的氨基酸殘基的置換、缺失或添加的肽，寡肽，多肽，蛋白和酶。蛋白的“衍生物”包括其中氨基酸殘基被相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸置換的蛋白。蛋白的“衍生物”包括與天然存在形式多肽的氨基酸相比，可以含有天然存在的改變的(諸如糖基化、?；?、肉豆蔻酰化或磷酸化的)或非天然存在的氨基酸殘基(例如生物素化氨基酸，或CNBr處理后改變的氨基酸)的肽、寡肽，多肽，蛋白和酶。蛋白的“衍生物”也包括攜帶翻譯后修飾的蛋白。與其來源的氨基酸相比，衍生物也可以包括一個或多個非氨基酸取代基，例如，與氨基酸共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的報(bào)道分子或其它配體，例如結(jié)合的促進(jìn)其檢測的報(bào)道分子，以及相對于天然存在蛋白的氨基酸而言非天然存在的氨基酸殘基。蛋白質(zhì)的“置換變異體”指那些氨基酸序列中至少一個殘基被去除且一個不同的殘基插入其位置的變異體。氨基酸置換通常為單個殘基，但可以根據(jù)位于多肽的功能限制而成簇；插入通常以大約1-10個氨基酸殘基的數(shù)量級，而缺失在大約1-20個殘基的范圍。氨基酸置換優(yōu)選包括保守氨基酸置換。蛋白質(zhì)的“插入變異體”為那些所述蛋白質(zhì)的預(yù)先確定的位置引入了一個或多個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。插入可以包括氨基末端和/或羧基末端的融合以及序列內(nèi)單個或多個氨基酸的插入。通常在氨基酸序列內(nèi)的插入比氨基-或羧基-末端融合小，為大約1到10個殘基的數(shù)量級。氨基-或羧基-末端融合蛋白或肽的例子包括在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的轉(zhuǎn)錄活化劑的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或活化結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白，(組氨酸)6-標(biāo)簽，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，蛋白A，麥芽糖結(jié)合蛋白，雙氫葉酸還原酶，標(biāo)簽●100表位，c-myc表位，F(xiàn)LAG-表位，lacZ，CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)，HA表位，蛋白C表位和VSV表位。蛋白的“功能片段”或“缺失變異體”的特征在于從蛋白質(zhì)中除去一個或多個氨基酸，而剩余的片段仍然保留了未修飾蛋白的生物活性，例如在實(shí)施例2和3中詳述的分析中賦予酵母對寒冷逆境的能力。這種蛋白的“功能片段”包括蛋白的至少15個連續(xù)的氨基酸殘基，對于功能片段最小的大小為提供該序列與被截短的原始序列至少可比的功能和/或活性的足夠長度的序列，而最大的大小不是關(guān)鍵。通常截短的氨基酸在大約5到大約60個氨基酸的長度?！懊庖邔W(xué)活性”指分子或其特異性片段，如特異性表位或半抗原，其由抗體識別(即，結(jié)合)?？梢圆捎肎eysen等人描述的肽掃描技術(shù)(Chem Biol.3，679-688，1996)確定特異性表位。功能片段也可以包括含有對本發(fā)明的蛋白特異性的表位的那些片段。
CRYO蛋白的衍生物、功能片段、置換、缺失或插入變異體優(yōu)選具有與未修飾蛋白至少同樣或更好的功能活性，如增加酵母的耐寒性的能力?？梢杂美缟鲜龅暮Y選方法或?qū)ο嚓P(guān)蛋白描述的方法來檢測功能活性。
蛋白的氨基酸變異體可以容易地用現(xiàn)有技術(shù)中已知的肽合成技術(shù)制成，例如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作?，F(xiàn)有技術(shù)中熟知操作DNA序列來產(chǎn)生蛋白的置換、插入或缺失變異體的方法。例如，在DNA中預(yù)先確定的位點(diǎn)產(chǎn)生置換突變的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，包括M13誘變，T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)，QuickChange定點(diǎn)誘變(Stratagene，San Diego，CA)，PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其它定點(diǎn)誘變方案。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了可通過本發(fā)明的篩選方法獲得的核酸，該核酸可以用于改變植物和/或酵母中的逆境耐受性或抗性。根據(jù)本發(fā)明的篩選方法鑒定了迄今未知的幾種核酸。因此本發(fā)明也提供了編碼上述蛋白的分離的核酸，其互補(bǔ)序列或一部分。
術(shù)語“核酸”、“核苷酸序列”、“基因”、“多核苷酸”和“核酸分子”這里可互換使用，指以任意長度的多聚形式的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或兩者的組合。該術(shù)語也包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。也包括已知的核苷酸修飾例如甲基化、環(huán)化和“加帽”以及用諸如肌苷的類似物置換一個或多個天然存在的核苷酸。該術(shù)語也包括肽核酸(PNA)。
本發(fā)明的核酸可以有利地用重組或合成方法制成，如PCR克隆機(jī)制。通常這里定義的這類技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，如Sambrook等人所描述的(Molecular Cloninga Laboratory Manual，2001)。也可以通過技術(shù)文獻(xiàn)中描述的已知技術(shù)合成多核苷酸，例如參見Caruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47，411-418(1982)，以及Adams等，J.Am.Chem.Soc.105，661(1983)。然后可以通過合成互補(bǔ)鏈和在合適的條件下將鏈一起退火，或通過用合適的引物序列采用DNA聚合酶加入互補(bǔ)鏈，而獲得雙鏈DNA片段。
編碼蛋白的核苷酸序列(基因、編碼序列、可讀框或ORF)是以可表達(dá)形式存在時(即當(dāng)編碼序列或ORF位于合適的控制序列或調(diào)控序列的控制下時)可以轉(zhuǎn)錄為mRNA和/或翻譯為多肽的核苷酸序列。編碼序列或ORF由5′翻譯起始密碼子和3′翻譯終止密碼子為界。編碼序列或ORF可以包括但是并不限于RNA、mRNA、cDNA、重組核苷酸序列，合成制造的核苷酸序列或基因組DNA。編碼序列或ORF可以被間插核酸中斷。
“可表達(dá)形式”表示分離的核酸分子為適于轉(zhuǎn)錄為mRNA和/或翻譯而產(chǎn)生蛋白的形式，無論組成性地或在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外信號誘導(dǎo)之后，例如環(huán)境刺激或逆境(有絲分裂原、缺氧、低氧、溫度、鹽、光、脫水等)或化合物，如IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，或例如抗生素(四環(huán)素、氨芐西林、利福平、卡那霉素)、激素(例如赤霉素、植物激素、細(xì)胞分裂素、糖皮質(zhì)激素、油菜素類固醇、乙烯、脫落酸等)，激素類似物(吲哚乙酸(IAA)，2，4-D等)、金屬(鋅、銅、鐵等)，或地塞米松等。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，功能蛋白的表達(dá)還可能需要一種或多種翻譯后修飾，例如糖基化、磷酸化、去磷酸化，或一種或多種蛋白-蛋白相互作用，等等。所有這些過程都包括在術(shù)語“可表達(dá)形式”的范圍內(nèi)。
基本上編碼同一蛋白但分離自不同來源的基因和編碼序列可以由實(shí)質(zhì)上不同的核酸組成。相反地，實(shí)質(zhì)上不同的核酸可以設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)基本上相同蛋白的表達(dá)。這些核酸是例如給定基因的不同等位基因的存在或遺傳密碼子的簡并性或密碼子使用的差異的結(jié)果。優(yōu)選密碼子使用的不同在http//www.kazusa.or.jp/codon中給予說明。等位基因變異體進(jìn)一步定義為包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及小插入/缺失多態(tài)性(INDEL，具有通常小于100bp的大小)。在多數(shù)有機(jī)體的自然發(fā)生的多態(tài)種系中，SNP和INDEL組成了最大一組的序列變異體。另外或可選地，在特定常規(guī)育種程序中，例如在標(biāo)志物輔助育種中，有時要求通過對植物進(jìn)行誘變處理向植物中引入等位基因變異。一種合適的誘導(dǎo)突變的方法為EMS誘變。接著通過例如PCR的方法來鑒定等位基因變異體，之后為選擇步驟，來選擇討論序列的優(yōu)異等位基因變異體，該變異體可以產(chǎn)生生長特性的改變。選擇通常通過監(jiān)測含有目的序列的不同等位基因變異體(例如SFQ ID NO 1，3，5，7或9)的植物的生長性能來進(jìn)行。監(jiān)測生長表現(xiàn)可以在溫室或田野中進(jìn)行。另外任選的步驟包括將其中識別了優(yōu)異等位基因變異體的植物與另一植物雜交，這可以被用于例如將感興趣表型特征組合起來。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在育種程序中可以利用能夠調(diào)節(jié)編碼CRYO蛋白(例如SEQ IDNO 2，4，6，8或10)的核酸的表達(dá)的核苷酸序列。例如，在該程序中，識別一種DNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物可以與能調(diào)節(jié)植物中感興趣蛋白(例如SEQ ID NO 2，4，6，8或10)的活性的基因(該基因可以為編碼感興趣蛋白的基因或其它能夠影響感興趣蛋白的活性的基因)遺傳連鎖。接著，該DNA標(biāo)志物可用于育種程序來選擇具有改變的生長特性的植物?，F(xiàn)在可利用許多技術(shù)識別SNP和/或INDEL。
作為SEQ ID NO 1，3，5，7或9的任一個編碼的CRYO蛋白的核酸的可變剪接變異體的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這里應(yīng)用的術(shù)語“可變剪接變異體”包括編碼CRYO蛋白的核酸的變異體，其中任選地對特定信號起反應(yīng)，選擇的內(nèi)含子和/或外顯子被切除、替代或加入?，F(xiàn)有技術(shù)中已知確定基因的基因組序列中的內(nèi)含子和外顯子位置的方法。剪接變異體均源自一個同樣的前體-mRNA，剪接發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄后但在mRNA翻譯前，且通常以組織特異性或瞬時的方式調(diào)節(jié)(例如，使得mRNA具有組織特異性表達(dá)，例如參見Burge等，(1999).Splicing ofprecursors to mRNAs by the spliceosomes.The RNA World II，Gesteland，Cech和Atkins，eds.(Cold Spring Harbor，NY，ColdSpring Harbor Laboratory Press)，pp.525-560)。優(yōu)選的變異體為其中蛋白的生物活性保持不受影響的變異體，可以通過選擇性地保留蛋白的功能片段而實(shí)現(xiàn)。制造這種剪接變異體的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，例如通過RNAi(Celotto和Graveley(2002)RNA 8，718-724)，用核酶，通過在基因中引入突變，通過改變剪接體或改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)可變剪接。
本發(fā)明也包括能夠與編碼SEQ ID NO 2，4，6，8或10所示蛋白的核酸雜交的核酸。這里采用的術(shù)語“雜交”是實(shí)質(zhì)上同源的互補(bǔ)核苷酸序列彼此相互退火的過程。雜交過程可以完全在溶液中進(jìn)行，即，互補(bǔ)核酸都在溶液中。依賴于這一過程的分子生物學(xué)工具包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；以及所有以此為基礎(chǔ)的方法)、差減雜交、隨機(jī)引物延伸、核酸酶S1作圖、引物延伸、反轉(zhuǎn)錄、cDNA合成、RNA差異顯示、以及DNA序列確定。雜交過程的發(fā)生也可以其中一個互補(bǔ)核酸固定于基質(zhì)例如磁珠、瓊脂糖凝膠珠或任何其它樹脂。依賴于這一過程的分子生物學(xué)工具包括分離多聚(A+)mRNA。此外，雜交過程的發(fā)生可以其中一個互補(bǔ)核酸固定于固體支持物，例如硝酸纖維素或尼龍膜，或者通過如光能無機(jī)照相固定于例如硅玻璃支持物(后者已知為核酸陣列或微陣列或核酸芯片)。依賴于這一過程的分子生物學(xué)工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交、噬菌斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了允許雜交的發(fā)生，核酸分子通常被加熱或用化學(xué)方法變性從而由雙鏈熔解為兩條單鏈和/或從單鏈核酸中去除發(fā)卡結(jié)構(gòu)或其它二級結(jié)構(gòu)。例如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成的條件影響著雜交的嚴(yán)格性。雜交的高度嚴(yán)格性條件包括高溫和/或低鹽濃度(包括NaCl和檸檬酸三鈉的鹽)和/或雜交緩沖液中甲酰胺的存在和/或降低雜交緩沖液中例如SDS(去污劑)的化合物的濃度和/或從雜交緩沖液中排除諸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇等化合物(提高分子擁擠度)。如Sambrook等人(2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(3rd Edition Cold SpringHarbor Laboratory Press，CSH，New York)中描述了常規(guī)的雜交條件，但是熟練技術(shù)人員理解可以根據(jù)已知的或預(yù)期的核酸同源性和/或長度來設(shè)計(jì)多種不同的雜交條件?！皣?yán)格雜交”的典型條件為例如在60℃雜交，然后在2XSSC，0.1XSDS以及1XSSC，0.1XSDS中洗滌。
本發(fā)明的方法也可以有利地采用DNA或核酸的部分來實(shí)施，所述部分編碼保留了CRYO活性的多肽，即與編碼SEQ ID NO2、4、6、8或10所示的蛋白的核酸相似的生物學(xué)功能。DNA序列的部分指從原始(較大的)DNA分子來源或制備的DNA片段，當(dāng)在植物中表達(dá)時，該DNA部分產(chǎn)生具有改變的生長特性的植物。該部分可以包括許多基因，含有或不含另外的調(diào)控元件，或可以只包括間隔序列等。
術(shù)語“序列的一部分”表示所指的原始序列的截短序列。截短的核酸序列在長度上可以非常不同；最小的大小為提供與所指的原始序列至少相當(dāng)?shù)墓δ芎?或活性的足夠大小的序列，而最大的大小并不關(guān)鍵。在一些應(yīng)用中，最大的大小通常不比提供原始序列的期望活性和/或功能所需的大很多。通常，截短的核苷酸序列在大約15到大約180個核苷酸的長度范圍內(nèi)。然而更有代表性的是，該序列的長度大約150個核苷酸為最大，優(yōu)選最大為大約180個核苷酸。通常期望選擇至少大約30，36或45個核苷酸的序列，直至最大為大約60或75個核苷酸。
本發(fā)明定義的DNA序列也可以被間插序列中斷，“間插序列”表示破壞打斷感興趣DNA序列中的編碼序列或破壞打斷含有感興趣DNA序列的DNA序列的表達(dá)形式的任意核酸。去除間插序列可恢復(fù)編碼序列或所述的表達(dá)形式。間插序列的例子包括內(nèi)含子和可動DNA序列，例如轉(zhuǎn)座子?！翱蓜覦NA序列”表示可以作為重組事件的結(jié)果而移動的任意DNA序列。
本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明的核酸的重組遺傳構(gòu)建體。遺傳構(gòu)建體有助于將上述的核苷酸序列在植物細(xì)胞、組織或器官中引入和/或表達(dá)和/或維持。該遺傳構(gòu)建體優(yōu)選包括(i)分離的編碼植物蛋白的核酸，所述植物蛋白(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50％或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任意一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；(ii)與(i)的核酸可操作性地連接的調(diào)控元件，該調(diào)控元件為植物和/或酵母可表達(dá)啟動子；以及任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
該核酸構(gòu)建體可以為表達(dá)載體，其中核酸可操作性地與一個或多個允許在原核和/或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控序列連接。該載體可以購買得到，適合于轉(zhuǎn)化入植物并適合感興趣基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)。
有利的是，任何可通過本發(fā)明的篩選方法獲得的核酸均可以用于該構(gòu)建體；優(yōu)選采用以上(a)到(d)的任一項(xiàng)定義的核酸。
這里采用的術(shù)語“可操作性地連接”指在調(diào)控元件和感興趣基因之間的功能性連接，從而使調(diào)控元件能夠起始感興趣基因的轉(zhuǎn)錄。
這里采用的術(shù)語“植物可表達(dá)啟動子”指能夠在植物細(xì)胞中驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的啟動子。這不僅包括植物來源的任意啟動子，例如轉(zhuǎn)錄的DNA序列的天然啟動子，也包括能夠在植物中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的非植物來源的任意啟動子。該啟動子也可以是人工或合成啟動子。術(shù)語“植物可表達(dá)啟動子”包括但不僅限于組成型、誘導(dǎo)型、器官-、組織-或細(xì)胞-特異性和/或發(fā)育調(diào)控的啟動子。術(shù)語“調(diào)控元件”、“調(diào)控序列”、“控制序列”和“啟動子”這里可互換使用，在廣義上下文的情形下，指能夠?qū)崿F(xiàn)它們所連接的序列的表達(dá)的調(diào)控核酸。
方便地，可以采用任意類型的啟動子驅(qū)動植物中編碼CRYO蛋白的核酸的表達(dá)。更具體地說，組成型啟動子可以是但并不僅限于以下之一35S啟動子(Odell等，Nature 313，482-493，1985)，35S’3啟動子(Hull和Howell，Virology 86，482-493，1987)，Ti質(zhì)粒的胭脂氨酸合酶基因的啟動子(“PNOS”)(Herrera-Estrella，Nature303，209-213，1983)或章魚氨酸合酶基因的啟動子(“POCS”，DeGreve等，J.Mol.Appl.Genet.1，499-511，1982)。很清楚可以采用其它的組成型啟動子獲得類似的效果。可以采用分生組織特異性啟動子，例如rnr(核糖核苷酸還原酶)、cdc2a啟動子和cyc07啟動子實(shí)現(xiàn)在植物所有生長部分中的表達(dá)，由此增加細(xì)胞增殖，從而提高產(chǎn)量或生物量。如果需要的結(jié)果為影響種子的特性，例如儲藏能力、種子大小、種子數(shù)目、生物量等，那么可以選擇種子特異性啟動子，例如p2S2、pPROLAMIN、pOLEOSIN。為了增加萌芽時的生長可以選擇糊粉特異性啟動子，從而增加糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胚芽。如果預(yù)期的結(jié)果是改變開花器官的數(shù)目，可以采用花序特異性啟動子，例如pLEAFY。為生產(chǎn)雄性不結(jié)果植物，需要花粉囊特異性啟動子。為了影響例如花瓣大小等花的結(jié)構(gòu)，可以選擇花瓣特異性啟動子。如果需要的結(jié)果是改變特定器官的生長和/或發(fā)育特征，則對啟動子的選擇取決于要改變的器官。例如，采用根特異性啟動子將導(dǎo)致根部增加的生長和/或增加的生物量或產(chǎn)量和/或根部的表型改變。當(dāng)根本身是需要的最終產(chǎn)品時(這類作物包括甜菜、蘿卜、胡蘿卜和馬鈴薯)，這會特別重要?？梢圆捎霉麑?shí)特異性啟動子改變例如果實(shí)的外皮強(qiáng)度或增加果實(shí)的大小?？梢圆捎镁G色組織特異性啟動子增加葉子大小?？梢圆捎眉?xì)胞壁特異性啟動子增加細(xì)胞壁的硬度，從而提高對病原微生物的抗性?？梢圆捎没ǚ勰姨禺愋缘膯幼由a(chǎn)雄性不結(jié)果植物?？梢圆捎妹}管特異性啟動子增加從葉子到種子的轉(zhuǎn)運(yùn)。可以采用結(jié)節(jié)特異性啟動子增加植物的固氮能力，從而增加植物的營養(yǎng)水平?？梢圆捎媚婢痴T導(dǎo)型啟動子在逆境條件期間驅(qū)動核酸表達(dá)以增加膜完整性。逆境誘導(dǎo)型啟動子，例如水逆境誘導(dǎo)的啟動子WSI18，干旱逆境誘導(dǎo)的Trg-31啟動子，ABA相關(guān)啟動子rab21或在特定逆境條件下如溫度逆境(寒冷、冰凍、熱)或滲透逆境或干旱逆境或氧化逆境或生物逆境下誘導(dǎo)的任意其它啟動子均可以用于驅(qū)動CRYO基因的表達(dá)。
如果需要的結(jié)果是影響植物在不利條件下的耐寒性，那么可以選擇寒冷誘導(dǎo)型啟動子，例如prd29、pws18或pcor15。
類似地，術(shù)語“酵母可表達(dá)啟動子”指能夠在酵母細(xì)胞中驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的啟動子，包括天然酵母啟動子以及其它能在酵母細(xì)胞中驅(qū)動表達(dá)的啟動子序列。在酵母中表達(dá)的合適的啟動子為現(xiàn)有技術(shù)中已知例如參見Current Protocols in Molecular Biology，13單元(Ausubel等，1994)以及Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Guthrie和Fink，1991)。
本發(fā)明的重組基因構(gòu)建體可以包括來自其它基因的另外調(diào)控序列或其它序列。其中包括來自經(jīng)典真核基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需要的TATA框，具有或不具有CCAAT框序列)以及另外的調(diào)控元件(即，上游活化序列，增強(qiáng)子和靜默子)，其對發(fā)育和/或外部刺激起反應(yīng)或以組織特異性的方式改變基因的表達(dá)。一種經(jīng)典的原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列也包括在內(nèi)，在該情形下它可以包括一個-35框序列和/或-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。調(diào)控元件也包含賦予、活化或增強(qiáng)細(xì)胞、組織或器官中核酸分子表達(dá)的合成融合分子或衍生物。
在引入植物的構(gòu)建體中可以任選地采用一個或多個終止子序列。術(shù)語“終止子”包括一個在轉(zhuǎn)錄單位末端的控制序列，其為DNA序列，它發(fā)出初級轉(zhuǎn)錄本的3’端加工處理和聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的信號。其它調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適合用于本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子序列。
另外，可以構(gòu)建和采用重組核酸，以將本發(fā)明的核酸的基因產(chǎn)物靶向到植物細(xì)胞內(nèi)特定的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室，或?qū)⒌鞍锥ㄏ虻郊?xì)胞外環(huán)境。這通?？梢酝ㄟ^將編碼轉(zhuǎn)運(yùn)或信號肽的DNA序列與重組核酸可操作性連接起來而得到。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括復(fù)制起點(diǎn)序列，它是在特定細(xì)胞類型中保持和/或復(fù)制所需的，例如細(xì)菌細(xì)胞，當(dāng)遺傳構(gòu)建體需要在細(xì)胞中作為游離型遺傳元件(如，質(zhì)粒或粘粒分子)保持的時候。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但并不限于f1-ori和colE1復(fù)制起點(diǎn)。
該遺傳構(gòu)建體可以任選地包括選擇標(biāo)志基因，這里采用的術(shù)語“選擇標(biāo)志基因”包括賦予細(xì)胞一種表型的任意基因，它在該細(xì)胞中表達(dá)以協(xié)助識別和/或選擇用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或其衍生物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。合適的標(biāo)志物可以選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)志物，含有重組DNA的細(xì)胞因此能夠在可殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗生素或除草劑濃度存在下存活。選擇標(biāo)志基因的例子包括bar基因，其提供對除草劑Basta的抗性；氨芐西林抗性基因(Ampr)，四環(huán)素抗性基因(Tcr)，細(xì)菌卡那霉素抗性基因(Kanr)，膦絲菌素抗性基因，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptII)，潮霉素抗性基因，以及氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因。視覺標(biāo)志物，如綠色熒光蛋白(GFP，Haseloff等，Nature 334，585-591，1997)，β-葡糖醛酸酶(GUS)以及熒光素酶也可以用作選擇標(biāo)記。
根據(jù)另一具體實(shí)施方式
，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的蛋白的核酸或這種蛋白作為選擇標(biāo)志基因在植物或其它生物體中的應(yīng)用。本發(fā)明更優(yōu)選涉及編碼上述的CRYO蛋白的基因作為選擇標(biāo)志基因的應(yīng)用，通過用諸如亞適生長溫度等逆境條件處理進(jìn)行選擇。
可通過這里描述的篩選方法獲得的核酸編碼相對于野生型酵母在逆境條件下支持酵母更快生長的蛋白，由于這些核酸來源于植物，因此很可能在引入植物中后這些核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)也可以支持植物在逆境條件下相較于野生型植物更快的生長。因此本發(fā)明提供了一種增加植物的非生物逆境耐受性的方法，包括在這些植物中引入遺傳修飾以及在這些植物中選擇編碼下列蛋白的核酸序列的經(jīng)調(diào)節(jié)的表達(dá)的步驟(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50％或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項(xiàng)的功能片段。
該蛋白優(yōu)選增加酵母的寒冷逆境耐受性。同樣，本發(fā)明提供了一種增加酵母的逆境耐受性優(yōu)選對寒冷逆境的耐受性的方法，包括調(diào)節(jié)植物中編碼CRYO蛋白的核酸序列的表達(dá)和/或調(diào)節(jié)CRYO蛋白的活性。
CRYO蛋白的同源蛋白也可以方便地用于本發(fā)明的方法，因此本發(fā)明提供了一種增加植物的非生物逆境耐受性的方法，包括在這些植物中引入遺傳修飾以及在這些植物中選擇編碼選自以下組的蛋白的核酸序列的經(jīng)調(diào)節(jié)的表達(dá)的步驟(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白(ii)含有SEC14結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白(iii)含有RING指結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結(jié)構(gòu)域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發(fā)生不多于6處置換。
這里采用的“增加的逆境耐受性”包括對于任何給定的逆境，植物或酵母對該特定逆境的耐受性增加，無論這些植物或酵母是否對該特定的逆境已經(jīng)具有一定程度的耐受性，或無論該植物或酵母是否對該逆境新賦予了耐受性。
該增加的耐受性優(yōu)選是對溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，更優(yōu)選寒冷逆境。
這里采用的術(shù)語“耐受性”和“抗性”包括對抗逆境的保護(hù)作用，從由環(huán)境逆境條件導(dǎo)致的細(xì)胞代謝改變、降低的細(xì)胞生長和/或細(xì)胞死亡的延遲到實(shí)質(zhì)上完全抑制。有利的是，通過本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物或酵母對環(huán)境逆境條件具有耐受性或抗性。
這里采用的術(shù)語“環(huán)境逆境”包括諸如干旱逆境(水、脫水)、滲透逆境、鹽逆境、溫度逆境(由于例如熱或霜凍等)的逆境因素。包括“寒冷逆境”、“急劇冷卻逆境”、“冷凍逆境”或“熱逆境”的“溫度逆境”是由低于或高于特定生物體的最適生長溫度而誘發(fā)的逆境。最適生長溫度范圍可以容易地確定或?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知?！皾B透逆境”為細(xì)胞、組織、器官或整株植物的失水、縮減的細(xì)胞膨脹或縮減的水含量相關(guān)或誘導(dǎo)的任意逆境?！案珊的婢场敝讣?xì)胞、組織、器官或生物體的剝奪水份或縮減水份供應(yīng)誘導(dǎo)或相關(guān)的任意逆境。術(shù)語“鹽逆境”指通常與鹽或離子濃度升高相關(guān)或尤其誘導(dǎo)的任意逆境，導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外環(huán)境的滲透勢的紊亂。“氧化逆境”發(fā)生在寒冷逆境與強(qiáng)光結(jié)合的情況，臭氧逆境的情況，病原體感染或受傷后壞死的情況，衰老和由于應(yīng)用某些除草劑(如莠去津或百草枯)的情況。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選特征，逆境為寒冷逆境。方便地，檢測酵母細(xì)胞中對環(huán)境條件的耐受性或抗性的結(jié)果給與了對插入的編碼序列或基因誘導(dǎo)植物對環(huán)境逆境的耐受性或抗性的能力的可靠的衡量指標(biāo)。分離的核酸賦予植物對環(huán)境逆境的耐受性或抗性的能力可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法檢測，例如，參見Physical Stresses in PlantsGenes and Their Products for Tolerance，S.Grillo(編者)，A.Leone(編者)(1996年6月)，Springer Verlag；ISBN3540613471；Handbook of Plant and Crop Stress，Mohammad Peassarakli(Editor)，Marcel Dekker，ISBN0824789873；The Physiology of Plants UnderStress；Abiotic Factors，Erik T.Nilsen，David M.Orcutt(Contributor)，Eric T.Nilsen.2nd版(1996年10月)，John Wiley& Sons，ISBN047131526；Drought，Salt，Cold and Heat StressMolecular Responses in Higher Plants(BiotechnologyIntelligence Unit))，Kazuo Shinozaki(編者)，Kazuko Yamaguchi-Shinozaki(編者)(1999)。RG Landes Co，ISBN1570595631；PlantsUnder StressBiochemistry，Physiology and Ecology and TheirApplication to Plant Improvement(Society for ExperimentalBiology Seminar Serie)，Hamlyn G.Jones，T.J.Flowers，M.B.Jones(編者).(1989年9月).Cambridge Univ.Pr.(Short)，ISBN0521344239；Plant Adaptation to Environmental Stress，LeslieFowden，Terry Mansfield，John Stoddart(編者)(1993年10月)Chapman & Hall；ISBN0412490005；或附加的例子。對酵母也存在類似的方法，例如，參見The molecular and cellular biology ofthe yeast Saccharomyces cerevisiaw，Pringle，Jones，Broach andStrathern，Cols Spring Harbor laboratory press，1992(NewYork)；Guide to yeast Genetics and Mollecular and Cell Biology(Methods in enzymology的350和351卷)(Guthrie和Finf編)，Academic Press(2002)San Diego；Yeast Gene Analysis(Brown和Tuite)(微生物學(xué)方法26卷)Academic press(San Diego)；YeastStress Responses(編者Hohmann和Mager)Springer Verlag，Heidelberg 1997。
本發(fā)明的方法包括植物或植物細(xì)胞的遺傳修飾。術(shù)語“遺傳修飾”指與野生型細(xì)胞相比通過人工干預(yù)在細(xì)胞的遺傳內(nèi)容方面的改變，包括遺傳工程、育種或誘變等技術(shù)。遺傳內(nèi)容的改變包括基因組的修飾，并包括植物細(xì)胞染色體以及游離體中遺傳材料的添加、缺失和置換。該術(shù)語也包括向植物細(xì)胞中加入染色體外信息。遺傳修飾優(yōu)選導(dǎo)致核酸的經(jīng)調(diào)節(jié)的表達(dá)。本發(fā)明的方法也包括后繼的選擇步驟，這期間選擇具有需要的特性的植物。選擇步驟可以基于檢測改變的生長特性的存在或缺乏，或基于檢測與引入的感興趣核酸相關(guān)聯(lián)的選擇或篩選標(biāo)志基因的存在或缺乏。
調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或降低)編碼CRYO蛋白的核酸的表達(dá)或調(diào)節(jié)CRYO蛋白本身包括特定的細(xì)胞或組織中基因表達(dá)改變或基因產(chǎn)物即多肽水平改變，所述基因或基因產(chǎn)物影響CRYO基因表達(dá)或蛋白活性。
通過本發(fā)明的篩選方法獲得的核酸具有改變植物或酵母對寒冷逆境的耐受性的能力。也可以通過直接向植物或酵母施用上述核酸編碼的蛋白而獲得該效果。
調(diào)節(jié)編碼CRYO蛋白的核酸的表達(dá)和/或調(diào)節(jié)CRYO蛋白本身的水平和/或活性優(yōu)選通過重組方法實(shí)現(xiàn)。這種重組方法可以包括直接或間接途徑來調(diào)節(jié)核酸的表達(dá)和/或調(diào)節(jié)蛋白的活性。
例如，間接的方法可以包括向植物中引入能夠調(diào)節(jié)目的蛋白(CRYO蛋白)的活性和/或目的基因(編碼CRYO的基因)表達(dá)的核酸。CRYO基因或CRYO蛋白可以是野生型，即天然的或內(nèi)源性的核酸或多肽。或者，它可以是來自相同或其它物種的核酸，該基因作為轉(zhuǎn)基因引入，例如通過轉(zhuǎn)化。通過精密的人工操作，該轉(zhuǎn)基因在組成和/或基因組環(huán)境方面可以從其天然形式被充分地改變。調(diào)節(jié)CRYO蛋白的活性和/或CRYO基因表達(dá)的間接方法還包括抑制或刺激驅(qū)動天然基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控序列，可以將這類調(diào)控序列引入植物。
一個直接和更優(yōu)選的方法包括向植物或酵母中引入編碼上述的蛋白或其功能片段的核酸。該核酸可以通過例如轉(zhuǎn)化引入。該核酸可以來自(無論直接或間接(如果隨后改變))任何來源，只要該序列在植物或酵母中表達(dá)時導(dǎo)致CRYO核酸/基因表達(dá)的調(diào)節(jié)或CRYO蛋白活性的調(diào)節(jié)。
核酸優(yōu)選分離自鹽生植物，更優(yōu)選來自甜菜。最優(yōu)選能夠調(diào)節(jié)植物中CRYO基因的表達(dá)或CRYO蛋白的活性的核酸為SEQ ID NO 1，3，5，7，9所示的核酸或其同源物、衍生物或功能片段，或?yàn)榫幋aSEQ IDNO 2，4，6，8或10所示的蛋白或其同源物、衍生物或功能片段的核酸。
然而，應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明的應(yīng)用并非僅限于SEQ ID NO 1，3，5，7，9所示的核酸的應(yīng)用，也不僅限于編碼SEQ ID NO 2，4，6，8或10的蛋白的核酸，而其它編碼SED ID NO 1到10的同源物、衍生物或功能片段的核酸均可應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。本發(fā)明的方法可以方便地用于賦予植物或其部分或酵母對環(huán)境逆境條件的耐受性或抗性。
調(diào)節(jié)核酸/基因的活性可以通過抑制或刺激驅(qū)動天然基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的控制序列來達(dá)到，例如，可以將調(diào)控序列引入植物或酵母?！昂怂帷被颉暗鞍住笨梢允且吧?，即天然的或內(nèi)源性的核酸或多肽。或者，它可以是來自相同或其它物種的異源核酸，該基因作為轉(zhuǎn)基因引入，例如通過轉(zhuǎn)化。通過精密的人工操作，該轉(zhuǎn)基因的組成和/或基因組環(huán)境可以由其天然形式被充分地改變。調(diào)節(jié)基因表達(dá)也包括基因的轉(zhuǎn)錄物水平的改變，其能夠足夠誘導(dǎo)一定的表型效應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選特征，設(shè)想核酸的表達(dá)增強(qiáng)或提高?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有許多文件記載了獲得提高或增加的基因表達(dá)或基因產(chǎn)物的方法，包括例如強(qiáng)啟動子驅(qū)動的過表達(dá)，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的應(yīng)用。
然而，下調(diào)核酸的表達(dá)也可以在植物或酵母中產(chǎn)生改變的逆境耐受性。方便地，具有改變的逆境耐受性的植物可以通過以有義或反義方向表達(dá)編碼CRYO蛋白的核酸而獲得。下調(diào)技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，在酵母中下調(diào)表達(dá)的類似或其它方法在現(xiàn)有技術(shù)中也是已知的(例如，用彌補(bǔ)宿主菌株的代謝缺陷的基因或用來自細(xì)菌的賦予對抗生素卡那霉素或遺傳霉素的抗性的基因來中斷ORF)。
本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
提供了含有編碼CRYO蛋白的核酸分子的宿主細(xì)胞，優(yōu)選的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞或酵母。除了植物細(xì)胞，本發(fā)明的多肽也可以在原核或真核生物工程細(xì)胞中通過重組表達(dá)來生產(chǎn)，例如細(xì)菌、真菌或動物細(xì)胞。合適的表達(dá)體系為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
本發(fā)明延伸至對非生物逆境優(yōu)選寒冷逆境有耐受性的植物或酵母，該植物或酵母具有與相應(yīng)的野生型植物或酵母相比升高水平的上述蛋白。因此本發(fā)明還包括可通過本發(fā)明的方法獲得的植物。本發(fā)明因此提供可通過本發(fā)明的方法獲得的植物，該植物具有增加的逆境耐受性，且該植物具有改變的CRYO蛋白活性和/或改變的編碼CRYO蛋白的核酸的表達(dá)。特別是本發(fā)明提供了對非生物逆境優(yōu)選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，該植物具有編碼選自下組的蛋白或其功能片段的核酸的增加表達(dá)(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白；(iii)含有RING指結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結(jié)構(gòu)域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發(fā)生不多于6處置換；該增加的耐受性為相對于相應(yīng)的野生型植物而言。
另外本發(fā)明提供了對非生物逆境優(yōu)選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物相比時，該植物具有核酸的增加表達(dá)，所述核酸編碼以下蛋白(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50％或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項(xiàng)的功能片段。
本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物組織的方法，包括向植物、植物細(xì)胞或植物組織中引入可表達(dá)形式的本發(fā)明的核酸分子或以上定義的遺傳構(gòu)建體。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
，提供了一種生產(chǎn)相對于相應(yīng)的野生型植物具有改變的逆境耐受性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)向植物細(xì)胞中引入編碼CRYO蛋白或CRYO蛋白家族成員或其功能片段的核酸；以及(ii)從所述的植物細(xì)胞再生和/或培植成熟植物。
優(yōu)選逆境為寒冷逆境、鹽逆境、滲透逆境、干旱逆境或氧化逆境的至少一種，逆境更優(yōu)選為寒冷逆境。
本發(fā)明延伸至通過這里描述的任意方法所獲得的任意植物細(xì)胞、植物或植物部分或者酵母細(xì)胞，和所有的植物部分，包括植物的可收獲部分、種子和繁殖體。本發(fā)明也包括含有用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物或其一部分。本發(fā)明進(jìn)一步延伸至包括由任意的前述方法產(chǎn)生的初級轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或整株植物的后代，唯一的要求為后代表現(xiàn)出與通過本發(fā)明的方法在親本中所產(chǎn)生的同樣的基因型和/或表型特征。
這里采用的術(shù)語“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代、植物部分、植物細(xì)胞、組織和器官。術(shù)語“植物”因此也包括懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉子、花、果實(shí)、種子、根莖、鱗莖、根(包括塊莖)、莖干枝條(包括莖培養(yǎng))、配偶體、孢子體、花粉以及小孢子。本發(fā)明的方法中特別有用的植物包括所有屬于Viridiplantae超家族的植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括，飼料或草料豆類、裝飾植物、食品農(nóng)作物、樹木、或灌木，從包括下列植物的列表中選擇爵床科(Acanthaceae)、槭樹科(Aceraceae)、菖蒲科(Acoraceae)、鐵線蕨科(Adiantaceae)、龍舌蘭科(Agavaceae)、番杏科(Aizoaceae)、澤瀉科(Alismataceae)、蔥科(Alliaceae)、蘆薈科(Aloeaceae)、六出花科(Alstroemeriaceae)、莧科(Amaranthaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、漆樹科(Anacardiaceae)、密穗蕨科(Anemiaceae)、觀音座蓮科(Angiopteridaceae)、番荔枝科(Annonaceae)、夾竹桃科(Apocynaceae)、水蕹科(Aponogetonaceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、天南星科(Araceae)、五加科(Araliaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、檳榔科(Arecaceae)、馬兜鈴科(Aristolochiaceae)、天門冬科(Asparagaceae)、鐵角蕨科(Aspleniaceae)、芳香草科(Asteliaceae)、菊科(Asteraceae)、鳳仙花科(Balsaminaceae)、落葵科(Basellaceae)、Bataceae、秋海棠科(Begoniaceae)、小檗科(Berberidaceae)、樺木科(Betulaceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、紅木科(Bixaceae)、烏毛蕨科(Blechnaceae)、木棉科(Bombacaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)蔥芥(Alliariapetiolata)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、Arabispetiolaris、Arabispumila、南芥屬(Arabis sp.)、團(tuán)扇薺(Berteroa incana)、Biscutella laevigata、Brassicajunceae、甘藍(lán)類型(Brassicanapus)、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus var.Napus)、黑芥(Brassicanigra)、甘藍(lán)(Brassica oleracea)、Brassica oleracea var.gongylo、薺菜(Capsella bursa-pastoris)、草甸碎米薺(Cardaminepratensis)、巖薺(Cochlearia officinalis)、Dentaria laciniata、Descurainia pinnata、Draba asprella、Draba verna、葶藶(Draba)、Erysimum asperum、Erysimum asperum、Erysimum capitatum、Lepidiumflayum、北美獨(dú)行菜(Lepidium virginicum)、Lesquerellaargyraea、Lesquerella densiflora、Lesquerella rubicundula、Lesquerella sp.、香雪球(Lobularia maritima)、緞花(Lunariaannua)、Lunaria rediviva、Neobeckia aquatica、Nerisyreniacamporum、Physaria chambersii、蘿卜(Raphanus sativus)、白芥子(Sinapis alba)、Stanleya pinnata、Streptanthus cordatus、菥冥(Thlaspi arvense)、圓葉遏藍(lán)菜(Thlaspi rotundifolium)、鳳梨科(Bromeliaceae)、醉魚草科(Buddlejaceae)、橄欖科(Burseraceae)、黃楊科(Buxaceae)、莼菜科(Cabombaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、蘇木科(Caesalpiniaceae)、水馬齒科(Callitrichaceae)、裂果草科(Calochortaceae)、頭花草科(Calyceraceae)、桔?？?Campanulaceae)、大麻科(Cannabaceae)、美人蕉科(Cannaceae)、山柑科(Capparaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、木麻黃科(Casuarinaceae)、衛(wèi)矛科(Celastraceae)、藜科(Chenopodiaceae)、半日花科(Cistaceae)、藤黃科(Clusiaceae)、葉柄花科(Cneoraceae)、彎子木科(Cochlospermaceae)、使君子科(Combretaceae)、鴨跖草科(Commelinaceae)、鈴蘭科(Convallariaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、山茱萸科(Comaceae)、榛科(Corylaceae)、景天科(Crassulaceae)、燧體木科(Crossosomataceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、火把樹科(Cunoniaceae)、柏科(Cupressaceae)、兔絲子科(Cuscutaceae)、桫欏科(Cyatheaceae)、蘇鐵科(Cycadaceae)、莎草科(Cyperaceae)、翅萼樹科(Cyrillaceae)、碗蕨科(Dennstaedtiaceae)、蚌殼蕨科(Dicksoniaceae)、刺戟科(Didiereaceae)、五椏果科(Dilleniaceae)、薯蕷科(Dioscoreaceae)、川續(xù)斷科(Dipsacaceae)、龍腦香科(Dipterocarpaceae)、茅膏菜科(Droseraceae)、鱗毛蕨科(Dryopteridaceae)、柿樹科(Ebenaceae)、厚殼樹科(Ehretiaceae)、胡頹子科(Elaeagnaceae)、杜英科(Elaeocarpaceae)、溝繁縷科(Elatinaceae)、巖高蘭科(Empetraceae)、尖苞樹科(Epacridaceae)、麻黃科(Ephedraceae)、木賊科(Equisetaceae)、杜鵑花科(Ericaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、赤苞藤科(Erythroxylaceae)、鼠刺科(Escalloniaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、澳番荔枝科(Eupomatiaceae)、豆科(Fabaceae)、殼斗科(Fagaceae)、大風(fēng)子科(Flacourtiaceae)、刺樹科(Fouquieriaceae)、瓣鱗花科(Frankeniaceae)、紫堇科(Fumariaceae)、龍膽科(Gentianaceae)、牻牛兒苗科(Geraniaceae)、苦苣苔科(Gesneriaceae)、銀杏科(Ginkgoaceae)、球花科(Globulariaceae)、草海桐科(Goodeniaceae)、茶薼子科(Grossulariaceae)、洋二仙草科(Gunneraceae)、血皮草科(Haemodoraceae)、喜鹽草科(Haloragaceae)、金縷梅科(Hamamelidaceae)、蝎尾蕉科(Heliconiaceae)、七葉樹科(Hippocastanaceae)、風(fēng)信子科(Hyacinthaceae)、繡球花科(Hydrangeaceae)、田基麻科(Hydrophyllaceae)、金絲桃科(Hypericaceae)、鳶尾科(Iridaceae)、水韭科(Isoetaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、燈心草科(Juncaceae)、旱白花菜科(Koeberliniaceae)、刺球果科(Krameriaceae)、唇形科(Lamiaceae)、樟科(Lauraceae)、玉蕊科(Lecythidaceae)、浮萍科(Lemnaceae)、貍藻科(Lentibulariaceae)、百合科(Liliaceae)、沼花科(Limnanthaceae)、沼鱉科(Limnocharitaceae)、亞麻科(Linaceae)、刺蓮花科刺蓮花科(Loasaceae)、山梗菜科(Lobeliaceae)、馬錢科(Loganiaceae)、Lomandraceae、藤蕨科(Lomariopsidaceae)、桑寄生科(Loranthaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、千屈菜科(Lythraceae)、木蘭科(Magnoliaceae)、金虎尾科(Malpighiaceae)、錦葵科(Malvaceae)、竹芋科(Marantaceae)、蜜囊花科(Marcgraviaceae)、蘋科(Marsileaceae)、角胡麻科(Martyniaceae)、花水蘚科(Mayacaceae)、黑藥花科(Melanthiaceae)、野牡丹科(Melastomataceae)、楝科(Meliaceae)、蜜花科(Melianthaceae)、防己科(Menispermaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、含羞草科(Mimosaceae)、檬立木科(Monimiaceae)、水晶蘭科(Monotropaceae)、桑科(Moraceae)、芭蕉科(Musaceae)、苦檻藍(lán)科(Myoporaceae)、楊梅科(Myricaceae)、肉豆蔻科(Myristicaceae)、紫金?？?Myrsinaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、蓮科(Nelumbonaceae)、紫茉莉科(Nyctaginaceae)、睡蓮科(Nymphaeaceae)、藍(lán)果樹科(Nyssaceae)、金蓮木科(Ochnaceae)、柳葉菜科(Oenotheraceae)、木犀科(Oleaceae)、方枝樹科(Oliniaceae)、柳葉菜科(Onagraceae)、瓶爾小草科(Ophioglossaceae)、蘭科(Orchidaceae)、列當(dāng)科(Orobanchaceae)、紫萁科(Osmundaceae)、酢漿草科(Oxalidaceae)、芍藥科(Paeoniaceae)、露兜樹科(Pandanaceae)、罌粟科(Papaveraceae)、西番蓮科(Passifloraceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、田蔥科(Philydraceae)、新西蘭麻科(Phormiaceae)、商陸科(Phytolaccaceae)、松科(Pinaceae)、胡椒科(Piperaceae)、海桐花科(Pittosporaceae)、車前科(plantaginaceae)、懸鈴木科(Platanaceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、禾本科(Poaceae)、羅漢松科(Podocarpaceae)、桃兒七科(Podophyllaceae)、花蔥科(Polemoniaceae)、遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)、蓼科(Polygonaceae)、水龍骨科(Polypodiaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、馬齒莧科(PoRTulacaceae)、報(bào)春花科(Primulaceae)、山龍眼科(Proteaceae)、鳳尾蕨科(PteRIdaceae)、安石榴科(Punicaceae)、鹿蹄草科(Pyrolaceae)、大花草科(Rafflesiaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、木樨草科(Resedaceae)、帚燈草科(Restionaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、薔薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、假葉樹科(Ruscaceae)、蕓香科(Rutaceae)、楊柳科(Salicaceae)、刺茉莉科(Salviniaceae)、檀香科(Santalaceae)、無患子科(Sapindaceae)、山欖科(Sapotaceae)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、三白草科(Saururaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、卷柏科(Selaginellaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、菝葜科(Smilacaceae)、茄科(Solanaceae)、黑三棱科(Sparganiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、旅人蕉科(Strelitziaceae)、安息香科(Styracaceae)、箭根薯科(Taccaceae)、檉柳科(Tamaricaceae)、紅豆杉科(Taxaceae)、杉科(Taxodiaceae)、山茶科(Theaceae)、金星蕨科(Thelypteridaceae)、瑞香科(Thymelaeaceae)、椴樹科(Tiliaceae)、菱科(Trapaceae)、孔藥花科(Tremandraceae)、延齡草科(Trilliaceae)、昆欄樹科(Trochodendraceae)、旱金蓮科(Tropaeolaceae)、有葉花科(Tumeraceae)、香蒲科(Typhaceae)、榆科(Ulmaceae)、蕁麻科(Urticaceae)、敗醬科(Valerianaceae)、馬鞭草科(Verbenaceae)、綠菊科(Veronicaceae)、堇菜科(Violaceae)、槲寄生科(Viscaceae)、葡萄科(Vitaceae)、百歲葉科(Welwitschiaceae)、林仙科(Winteraceae)、刺葉樹科(Xanthorrhoeaceae)、Xerophyllaceae、黃眼草科(Xyridaceae)、澤米科(Zamiaceae)、姜科(Zingiberacea)和蒺藜科(Zygophyllaceae)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選特征，植物為單子葉或雙子葉植物，例如選自水稻、玉米、小麥、大麥、大豆、向日葵、油菜、苜蓿、粟、油菜籽和棉花的農(nóng)作物。也不排除另外的物種，例如莧屬(amaranth)，朝鮮薊、蘆筍、椰菜、芽甘藍(lán)、甘藍(lán)、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)、綠葉菜、亞麻、散葉甘藍(lán)、小扁豆、含油種子油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、甜菜、甘蔗、番茄、南瓜和茶、樹木和藻類等。更有利的是，通過本發(fā)明的方法獲得的植物使農(nóng)作物在逆境條件下，優(yōu)選在寒冷逆境條件下以提高的產(chǎn)量、生長、發(fā)育和繁殖力生長。本發(fā)明也使作物能夠在原本不可能生長的地區(qū)生長。
感興趣基因優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化引入植物。這里涉及的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括將外源性多核苷酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，而不考慮用來轉(zhuǎn)移的方法。多核苷酸可以被瞬時或穩(wěn)定引入宿主細(xì)胞并可以保持非整合，例如，作為質(zhì)粒，或可選地，它可以整合入宿主基因組。獲得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可以用于以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生轉(zhuǎn)化植物。目前植物物種的轉(zhuǎn)化是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)，可以方便地采用幾種轉(zhuǎn)化方法中的任意一種來將感興趣基因引入合適的祖先細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法包括運(yùn)用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學(xué)物質(zhì)、直接向植物中注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉(zhuǎn)化和顯微注射。方法可以選自鈣/聚乙二醇方法用于原生質(zhì)體(Krens等，Nature 296，72-74，1982；Negrutiu I.等，Plant Mol.Biol.8，363-373，1987)；原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito等，Bio/Technol.3，1099-1102，1985)；向植物材料微注射(Crossway等，Mol.Gen.Genet.202，179-185，1986)；DNA或RNA-包被粒子轟擊(Klein等，Nature 327，70 1987)用(非整合)病毒等感染等等，農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Cheng等，1997-WO 97/48814；Hansen1998-WO 98/54961；Hiei等，1994-WO 94/00977；Hiei等，1998-WO 98/17813；Rikiishi等，1999-WO 99/04618；Saito等，1995-WO 95/06722)，包括“flower dip”轉(zhuǎn)化法(Bechtold和Pelletier，Methods Mol.Biol.82，259-266，1998；Trieu等，Plant J.22，531-541，2000)。
通常轉(zhuǎn)化后，選擇植物細(xì)胞或細(xì)胞組中一個或多個標(biāo)志物的存在，該標(biāo)志物由與感興趣基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，接著轉(zhuǎn)化材料再生為完整的植株。采用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法，整個生物體可以從單個轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞再生?？梢圆捎帽景l(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化能夠后繼克隆繁殖(通過器官發(fā)生或胚胎形成)的植物組織，且由其再生整株植物。選擇的特定組織取決于對于要轉(zhuǎn)化的特定物種可利用且最適的克隆繁殖體系而不同。例示性的組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、胚軸、雌配子體、愈傷組織、現(xiàn)有分生組織(例如，頂點(diǎn)分生組織、葉腋芽和根部分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和胚軸分生組織)。
DNA轉(zhuǎn)移和再生后，可以運(yùn)用例如Southern分析等評估推定轉(zhuǎn)化植物中感興趣基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組結(jié)構(gòu)構(gòu)成，可選地或附加地，新引入的DNA的表達(dá)水平可以用Northern和/或Western分析采取，兩種技術(shù)都為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，如通過無性繁殖或傳統(tǒng)育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以自花受精產(chǎn)生純合子的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，T2植物進(jìn)一步通過經(jīng)典培育技術(shù)繁殖。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以采取多種形式，例如它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如，所有細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如，在植物中，將轉(zhuǎn)化的根莖嫁接到未轉(zhuǎn)化的幼芽上)。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)與相應(yīng)的野生型酵母細(xì)胞相比具有對非生物逆境改變的耐受性的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞的方法，該方法包括向酵母細(xì)胞中引入上述的編碼CRYO蛋白的核酸。本發(fā)明特別提供了一種生產(chǎn)相對于相應(yīng)的野生型酵母對非生物逆境優(yōu)選寒冷逆境具有增加的耐受性的轉(zhuǎn)基因酵母的方法，該方法包括向酵母細(xì)胞中引入編碼選自下組的蛋白或其功能片段的核酸(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白；(iii)含有RING指結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結(jié)構(gòu)域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發(fā)生不多于6處置換。
另外，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)與相應(yīng)的野生型酵母相比具有對非生物逆境優(yōu)選對寒冷逆境增加的耐受性的轉(zhuǎn)基因酵母的方法，該方法包括向酵母細(xì)胞中引入編碼以下蛋白或其功能片段的核酸(a)含有SEQ ID NO 2，4，6，8或10給出的序列；(b)含有與SEQ ID NO 2，4，6，8或10給出的全長序列具有至少50％或60％，70％，80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項(xiàng)的功能片段。
另外本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞。優(yōu)選地，具有編碼上述蛋白或其功能片段的核酸的增加表達(dá)的該轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞，當(dāng)與相應(yīng)的野生型酵母細(xì)胞相比時，對非生物逆境優(yōu)選寒冷逆境具有耐受性。
本發(fā)明也涉及編碼上述CRYO蛋白的核酸或CRYO蛋白本身在改變植物或其部分或植物細(xì)胞的逆境耐受性中的應(yīng)用。本發(fā)明揭示了SEQID NO 1到SEQ ID NO 10所示序列涉及導(dǎo)致逆境耐受性的重要過程，如具有改變的逆境耐受性的植物所例證的，該植物已經(jīng)用編碼上述的CRYO蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化。類似地，本發(fā)明也涉及編碼CRYO蛋白的核酸或CRYO蛋白本身在改變酵母的逆境耐受性中的應(yīng)用。該逆境優(yōu)選為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種。
本發(fā)明也包括了CRYO蛋白的同源物的應(yīng)用，因此本發(fā)明涉及一種蛋白或其活性片段，或編碼該蛋白或其活性片段的核酸在改變植物或其部分或植物細(xì)胞的逆境耐受性中的應(yīng)用，該蛋白選自(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白；(iii)含有RING指結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結(jié)構(gòu)域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發(fā)生不多于6處置換。
該逆境優(yōu)選為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種。
本發(fā)明也包括了CRYO蛋白的同源物的應(yīng)用，因此本發(fā)明涉及一種蛋白或編碼該蛋白的核酸的應(yīng)用，該蛋白(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50％或60％、70％、80％優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項(xiàng)的功能片段。
而且，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對寒冷逆境條件的耐受性的特征可以與賦予植物寒冷逆境耐受性的其它方法結(jié)合，例如，甘露醇、脯氨酸、甘氨酸-甜菜堿、水-通道蛋白等滲透保護(hù)劑的應(yīng)用。因此，本發(fā)明的賦予植物對環(huán)境逆境條件的耐受性的方法可以與已知的包括引入多種逆境耐受性基因的方法結(jié)合。這些方法的結(jié)合在增強(qiáng)對環(huán)境逆境的耐受性或抗性方面可以具有加合和/或協(xié)同效應(yīng)。
本發(fā)明的生產(chǎn)對逆境具有增強(qiáng)的耐受性的植物的方法也可以與其它感興趣特性相結(jié)合，例如(i)除草劑耐性(DE-A 3701623；Stalker，Science 242(1988)，419)，(ii)昆蟲抗性(Vaek，Plant Cell 5(1987)，159-169)，(iii)病毒抗性(Powell，Science 232(1986)，738-743；Pappu，World Journal of Microbiology & Biotechnology 11(1995)，426-437；Lawson，Phytopathology 86(1996)56 suppl.)，(iv)臭氧抗性(Van Camp，Biotechnol.12(1994)，165-168)，(v)改善水果的保藏性能(Oeller，Science 254(1991)，437-439)，(vi)改進(jìn)淀粉組成和/或產(chǎn)量(Stark，Science 242(1992)，419；Visser，Mol.Gen.Genet.225(1991)，289-296)，(vii)改變脂質(zhì)組成(Voelker，Science 257(1992)，72-74)，(viii)(生物)聚合物的生產(chǎn)(Poirer，Science 256(1992)，520-523)，(ix)花顏色的改變，例如，通過操縱花青素和類黃酮的生物合成途徑(Meyer，Nature 330(1987)，667-678，WO90/12084)，(x)對細(xì)菌、昆蟲和真菌的抗性(Duering，Molecular Breeding2(1996)，297-305；Strittmatter，Bio/Technology 13(1995)，1085-1089；Estruch，Nature Biotechnology 15(1997)，137-141)，(xi)生物堿和/或強(qiáng)心苷組成的改變，(xii)誘導(dǎo)維持雄性和/或雌性生育力(EP-A1 0 412 006；EP-A10 223 399；WO93/25695)；(xiii)花序/花的更長的壽命，以及(xiv)除溫度逆境以外的非生物逆境抗性。


本發(fā)明將參考下列附圖進(jìn)行例示說明圖1野生型(wt)酵母菌株與gpd1突變體對比的寒冷敏感性。酵母細(xì)胞在YPD(上行)或在SD培養(yǎng)基(下行)上于30℃(對照，左欄)、10℃(中欄)或15℃(右上)生長。與gpd1株系相比，WT株系表現(xiàn)出降低的生長。
圖2用CRYO1、CRYO2、CRYO3、CRYO4或CRYO5基因轉(zhuǎn)化的野生型酵母菌株與用空載體(pYPGE@)轉(zhuǎn)化的wt酵母菌株相比的耐寒性。(a)用CRYO1、CRYO2或CRYO3基因轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在10℃生長10天或用CRYO4基因轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞生長14天后增加的生長。(b)用CRYO5基因轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞與用空載體(pYPGE)轉(zhuǎn)化的野生型酵母相比增加的生長。左側(cè)兩圖為在YPD培養(yǎng)基或SD培養(yǎng)基上在30℃生長的對照。右側(cè)兩圖表示在YPD培養(yǎng)基或SD培養(yǎng)基上于10℃生長的同樣的酵母菌株的生長。
圖3來自甜菜的CRYO1和CRYO2序列以及它們在鼠耳芥和酵母中的同源物之間的序列比對。At＝鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，Bv＝甜菜(Beta vulgaris)以及Sc＝釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
圖4CRYO3序列以及來自多種生物體的同源蛋白之間的序列比對，表現(xiàn)出不同物種之間的高度保守。At＝鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)；Bv＝甜菜(Beta vulgaris)；Mm＝小鼠(Mus musculus)；Hs＝智人(Homo sapiens)；Sp＝粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)。
圖5用CRYO1和CRYO2探針對甜菜基因組DNA進(jìn)行Southern印跡。采用的酶為BamHI，HindIII和EcoRI。
圖6a)用CRYO2探針的Northern印跡。顯示了用250mM NaCl處理甜菜植物后的不同時間點(diǎn)(以小時計(jì))。采用α3-微管蛋白作為對照。b)用CRYO2探針的Northern印跡。顯示了用100μM ABA處理甜菜植物后的不同時間點(diǎn)(以小時計(jì))。采用α3-微管蛋白作為對照。
圖7野生型酵母(上行)和用CRYO5基因轉(zhuǎn)化的酵母(下行)在YPD(左圖)和補(bǔ)充了1mM叔丁基過氧化氫的YPD(右圖)上的生長。
實(shí)施例除非在實(shí)施例中另外說明，所有的重組DNA技術(shù)根據(jù)Sambrook等人在(2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，NY或第1和2卷的Ausubel等人(1994)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols，USA中所描述的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在Plant MolecularBiology Labfase(1993)中描述，作者R.D.D.Croy，BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK聯(lián)合出版。
實(shí)施例1鹽逆境誘導(dǎo)的甜菜cDNA文庫的構(gòu)建將甜菜種子(Beta vulgaris cv.Dita)播種在含有沙子和蛭石(1∶1w/w)的混合物的罐中。將植物在溫室條件下生長(8h 20℃，16h25℃，采用輔助光照以保證最小12h的光周期)。將植物周期性地用營養(yǎng)液(2.4g/l Ca(NO3)2·4H2O，1g/l KNO3，1g/l MgSO4·7H2O，0.3g/lKH2PO4，5.6mg/l Fequelate(Kelantren，Bayer)，1.1mg/l ZnSO4·7H2O，3.3mg/l MnO4·H2O，0.3mg/l CuSO4·5H2O，3.8mg/l H3BO3，0.18mg/l(NH4)6Mo7·4H2O)灌溉。為構(gòu)建cDNA文庫，在收獲前將3周大小的植物用200mM NaCl灌溉24h。
以從鹽處理的甜菜植物的葉子制備的poly(A)+RNA合成定向cDNA(cDNA合成試劑盒，Stratagene)。將cDNA連接到噬菌體λPG15載體中，并用Gigapack III gold packaging extract(Stratagene)包裝。采用cre-lox重組酶系統(tǒng)從λPG15中回收質(zhì)粒cDNA文庫(Brunelli和Pall，1993)。
實(shí)施例2篩選測定的建立本工作中采用的酵母菌株為野生型二倍體菌株W303/W303(can1-100，his 3-11，15，leu2-3，112，trp1-1，ura3-1，GAL+)(WT)以及甘油磷酸脫氫酶缺陷的突變體(gpd1)。構(gòu)建了來自2個gpd1突變菌株(YRA111(W303-1A mat a gpd1∷TRP1)以及YRA114(W303-1Agpd1∷TRP1 matα))的二倍體菌株。采用了二倍體菌株，因?yàn)檫@些菌株防止可能導(dǎo)致對寒冷逆境的耐受性的隱性染色體突變的分離。菌株生長在YPD培養(yǎng)基(2％葡萄糖、2％蛋白胨以及1％的酵母提取物)上或在SD培養(yǎng)基(2％葡萄糖、不含氨基酸的0.7％酵母氮基(Difco)，50mMMES[2-(N-嗎啉代)-乙磺酸]，用Tris調(diào)至pH5.5，以及需要的氨基酸、嘌呤和嘧啶)上。
在第一步中，將WT二倍體菌株對寒冷的敏感性與gpd1突變菌株相比較。假定甘油的產(chǎn)生可能是對寒冷逆境的反應(yīng)。在寒冷逆境條件下監(jiān)測生長。使酵母菌株生長直至穩(wěn)定期，將20μl的1/10，1/100和1/1000稀釋的培養(yǎng)物點(diǎn)在YPD和SD培養(yǎng)基上，在15或10℃的溫度下保持10到14天，在30℃下2天作為對照。10℃為測定的允許WT菌株生長的最低溫度。令人驚訝的是，gpd1株系表現(xiàn)出耐寒，而野生型對寒冷敏感(圖1)。這使得可以采用WT株系篩選可以賦予耐寒性的基因，而gpd1株系可以作為對比研究的標(biāo)準(zhǔn)耐寒酵母株系。
在第二步中，確定了轉(zhuǎn)化的最佳條件。最后最佳的方案為用30μl飽和的WT細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)物接種300ml YPD培養(yǎng)基。使培養(yǎng)物過夜生長，直到OD660≅0.8,]]>并以2000rpm離心。隨后將細(xì)胞用水和AcLiTE溶液(0.1M醋酸鋰，10mM Tris-HCl pH7.6以及1mM EDTA(乙二胺四乙酸，二鈉鹽))洗滌。然后，將細(xì)胞沉淀重懸在2ml的AcLiTE溶液中，邊搖動邊在30℃孵育15分鐘，之后加入200μl的ssDNA(10mg/ml)。將細(xì)胞懸浮液在Eppendorf管中分為110μl等份，并加入200ng的cDNA文庫。采用Gietz等的熱休克轉(zhuǎn)化(Nucleic Acids Res.20，1425，1992)簡要地說，向每一等份試樣加入500μl的PEG-AcLiTE溶液(含有40％w/w的PEG(聚乙二醇)4000的AcLiTE溶液)?；旌虾?，將等份試樣在30℃下孵育30分鐘，之后在42℃孵育20分鐘，然后收獲細(xì)胞并在200μl的1M山梨醇中重懸。將兩個等份試樣鋪在含SD瓊脂和除色氨酸(gpd1突變的標(biāo)記物)和尿嘧啶(質(zhì)粒的標(biāo)記物)外所有必需的添加劑的14cm Petri培養(yǎng)皿中。為了定量轉(zhuǎn)化的效率，4個55μl等份試樣與原始的細(xì)胞沉淀分開，并用0，10，50和100ng cDNA文庫接種。然后采用同樣的轉(zhuǎn)化方案，最后細(xì)胞在100μl山梨醇中重懸，并鋪于含有同樣的SD培養(yǎng)基的7cm Petri培養(yǎng)皿中。平均產(chǎn)率為每ng cDNA大約60個菌落。另外觀察到用經(jīng)冷凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化或以一次大規(guī)模反應(yīng)而不是多次小規(guī)模反應(yīng)轉(zhuǎn)化顯著降低了轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率。
實(shí)施例3分離CRYO基因采用在pYPGE15中構(gòu)建的cDNA文庫用LiCl法轉(zhuǎn)化酵母WT株系W303(Nucleic Acids Res.20，1425，1992)。通過尿嘧啶原養(yǎng)型在含亮氨酸和腺嘌呤的SD平板上選擇轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化后3天Petri培養(yǎng)皿中出現(xiàn)了菌落。在無菌水中收獲菌落并通過鋪板不同的稀釋度而定量細(xì)胞的數(shù)目。平均而言將比從轉(zhuǎn)化平板回收的細(xì)胞濃度高10倍的細(xì)胞鋪于YPD和SD培養(yǎng)基。接著將平板置于10℃的培養(yǎng)箱中，選擇8天后能夠生長的菌落。然后再次檢查在第一輪中分離的菌落的耐受性，棄除那些不呈現(xiàn)顯著耐受性的菌落。從剩余的菌落，通過在極限培養(yǎng)基中選擇而除去質(zhì)粒，以分析該耐受性是否取決于該質(zhì)粒。作為最后的確認(rèn)，從能通過先前的控制的菌落中回收質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化入野生型株系，再次進(jìn)行具有耐受性的克隆的選擇。獲得的結(jié)果列于表1表1在YPD或SD培養(yǎng)基上耐寒酵母轉(zhuǎn)化體選擇的篩選操作概述。

將再次確認(rèn)的陽性克隆測序，顯示它們編碼不同的基因，其中有命名為CRYO1，CRYO2，CRYO3，CRYO4和CRYO5(對于冷-耐受)的基因，表2中給出了概括表2

當(dāng)轉(zhuǎn)移到酵母中時，編碼CRYO1到CRYO5蛋白的基因賦予寒冷逆境耐受性(圖2)。
發(fā)現(xiàn)CRYO1與酵母DID1蛋白具有同源性，且經(jīng)對同源性數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析，顯示其與鼠耳芥推定蛋白gi/15233464和gi/15224854具有顯著的同源性(＜90％)(如圖3所示)。根據(jù)本發(fā)明，這些推定的鼠耳芥蛋白被分別命名為AtCRYO1和AtCRYO2。
CRYO3在鼠耳芥中也是保守的，具有3種推定的蛋白，在數(shù)據(jù)庫中標(biāo)注為At1g73030，At1g17730和At4g17680，享有大于90％的同源性。根據(jù)本發(fā)明，這些推定的鼠耳芥蛋白被分別命名為AtCRYO3，AtCRYO3.2和AtCRYO3.3。CRYO3在人和小鼠中也是保守的，如在圖4堆積中所示。
實(shí)施例4Southern印跡揭示了甜菜中多于一種同種型為了確定甜菜基因組中CRYO1和CRYO2的存在并估計(jì)該植物物種中編碼血紅蛋白的基因的數(shù)目，進(jìn)行了Southern印跡分析。從3周大小的甜菜葉子中制備基因組DNA(Rogers SO和Bendich AJ，Extraction of total cellular DNA from plants，algae and fungi(Eds)Plant molecular biology manual，Kluwer AcademicPublishers，Dordrecht，Netherlands，1994)。用BamHI，HindIII或EcoRI消化5mg的DNA，在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，并印跡到尼龍膜濾器上(Hybond N+，Amersham Life Science)。將膜濾器與對CRYO1和CRYO2的32P標(biāo)記探針雜交。在高度嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交和洗滌(65℃)(Church GM和Gilbert W.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA81，1991-1995，1984)。在所有泳道中一些雜交片段的存在，與用于消化基因組DNA的限制性內(nèi)切酶無關(guān)，表明基因組中有一些同種型，特別是對于CRYO2(圖5)。
實(shí)施例5在甜菜中CRYO2未被NaCl和ABA誘導(dǎo)為了研究CRYO2是否也參與甜菜植物對鹽逆境的反應(yīng)，采用northern印跡分析分析了對暴露于NaCl不同時間起反應(yīng)的CRYO2mRNA的聚積。按照Davis等的描述(Basic methods in MolecularBiology.Elsevier.Amsterdam pp.143-1461986)，從對照、250mMNa+或100mM ABA處理的甜菜葉子中分離總RNA，在含有2.2％甲醛的1％瓊脂糖凝膠中分離30mg的總RNA，并印跡到尼龍膜濾器上(Hybond N，Amersham Life Science)。采用上述的探針進(jìn)行雜交。CRYO2特異性探針顯示了相應(yīng)于CRYO2 cDNA大小的僅一個條帶。在65℃，將濾器用4XSSC緩沖液(0.6M NaCl，0.06M檸檬酸三鈉，用HCl調(diào)至pH7)，0.1％SDS洗滌兩次，5分鐘，用0.4XSSC，0.1％SDS洗滌2次，5分鐘。將同樣的濾器與含有鼠耳芥α3微管蛋白基因(Ludwig等，PNAS84，5833-5837，1987)的1.9kb EcoRI片段再次雜交。如圖6a所示，經(jīng)NaCl處理CRYO2mRNA并沒有隨時間而聚積，同樣，也沒有觀察到在ABA處理3小時后CRYO2的誘導(dǎo)(圖6b)。
實(shí)施例6CRYO5也給與對氧化逆境的耐受性將W303pYPGECRYO5和wt酵母(對照)的稀釋系列鋪于含有1mM叔丁基過氧化氫(t-BOOH)的YPD培養(yǎng)基上，并在2和4天后檢測對氧化逆境的耐受性。
具有CRYO5的酵母克隆有強(qiáng)t-BOOH耐受表型，且該表型具有很高的可重復(fù)性在1mM t-BOOH的濃度下，對照酵母細(xì)胞根本不生長，而過表達(dá)CRYO5的酵母細(xì)胞生長(圖7)。
強(qiáng)表型的定義基于drop測試實(shí)驗(yàn)。制備不同稀釋度的飽和培養(yǎng)物(1∶10，1∶100，1∶1000)，使其在選擇培養(yǎng)基(含1mM t-BOOH的YPD)上生長。“強(qiáng)表型”為那些以所有測定的稀釋度都生長良好的克隆?！盁o強(qiáng)表型”表示該克隆以所有稀釋度均不生長。表達(dá)空質(zhì)粒的對照細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中完全不生長。
實(shí)施例7耐寒植物的構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用在組成型或誘導(dǎo)型啟動子控制下的可表達(dá)形式的至少一種CRYO基因轉(zhuǎn)化植物。
實(shí)施例8檢測耐寒植物使植物經(jīng)受寒冷逆境足夠長的時間段來檢測轉(zhuǎn)化植物。當(dāng)與同樣的未轉(zhuǎn)化植物株系相比時，轉(zhuǎn)化株系表現(xiàn)出在逆境條件期間更好的生長和/或在逆境條件后更好的恢復(fù)和/或更高的產(chǎn)量(生物量和/或可收獲部分)。
權(quán)利要求
1.一種增加植物的非生物逆境耐受性的方法，包括在所述的植物中引入遺傳修飾以及選擇所述植物中編碼選自以下組的蛋白的核酸序列經(jīng)調(diào)節(jié)的表達(dá)的步驟(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白；(iii)含有RING指結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結(jié)構(gòu)域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發(fā)生不多于6處置換。
2.一種增加植物或酵母的非生物逆境耐受性的方法，包括在所述的植物或酵母中引入遺傳修飾以及選擇編碼蛋白的核酸在所述植物或酵母中經(jīng)調(diào)節(jié)的表達(dá)和/或蛋白在植物或酵母中經(jīng)調(diào)節(jié)的活性的步驟，該蛋白(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50％或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項(xiàng)的功能片段。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的遺傳修飾包括向植物或酵母中引入分離的編碼所述的蛋白或其功能片段的核酸。
4.權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的逆境優(yōu)選為寒冷逆境。
5.一種生產(chǎn)相對于野生型植物具有增加的非生物逆境耐受性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括下列步驟(i)向植物細(xì)胞中引入編碼權(quán)利要求1或2中所列的蛋白或其功能片段的核酸；以及(ii)從所述的植物細(xì)胞再生和/或培植成熟植物。
6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的方法所獲得的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
7.對非生物逆境，優(yōu)選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物相比時，該植物具有編碼選自以下組的蛋白或其功能片段的核酸的增加的表達(dá)(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白；(iii)含有RING指結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結(jié)構(gòu)域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發(fā)生不多于6處置換。
8.對非生物逆境，優(yōu)選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物相比時，該植物具有編碼權(quán)利要求2中所列的蛋白的核酸的增加的表達(dá)。
9.權(quán)利要求6到8任一項(xiàng)的植物的可收獲部分、器官、組織、繁殖材料、種子以及祖先或后代。
10.一種生產(chǎn)相對于相應(yīng)的野生型酵母細(xì)胞具有增加的非生物逆境耐受性的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞的方法，該方法包括向酵母細(xì)胞中引入編碼權(quán)利要求1或2中所列的蛋白或其功能片段的核酸。
11.權(quán)利要求10的方法所獲得的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞。
12.對非生物逆境，優(yōu)選寒冷逆境具有增加的耐受性的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞，當(dāng)與相應(yīng)的野生型酵母細(xì)胞相比時，該酵母細(xì)胞具有編碼權(quán)利要求1或2中所列的蛋白或其功能片段的核酸的增加的表達(dá)。
13.編碼權(quán)利要求2中所列蛋白的核酸在改變酵母、植物、植物部分或植物細(xì)胞的非生物逆境耐受性中的應(yīng)用，其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的非生物逆境優(yōu)選為溫度逆境，所述的非生物逆境更優(yōu)選為寒冷逆境。
14.編碼選自以下組的蛋白或其功能片段的核酸在改變酵母、植物、植物部分或植物細(xì)胞的非生物逆境耐受性中的應(yīng)用(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白；(iii)含有RING指結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結(jié)構(gòu)域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發(fā)生不多于6處置換；其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的非生物逆境優(yōu)選為溫度逆境，所述的非生物逆境更優(yōu)選為寒冷逆境。
15.權(quán)利要求2的蛋白在改變酵母、植物、植物部分或植物細(xì)胞的非生物逆境耐受性中的應(yīng)用，其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的非生物逆境優(yōu)選為溫度逆境，所述的非生物逆境更優(yōu)選為寒冷逆境。
16.選自以下組的蛋白或其功能片段在改變酵母、植物、植物部分或植物細(xì)胞的非生物逆境耐受性中的應(yīng)用(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白；(iii)含有RING指結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結(jié)構(gòu)域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發(fā)生不多于6處置換；其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的非生物逆境優(yōu)選為溫度逆境，所述的非生物逆境更優(yōu)選為寒冷逆境。
17.編碼權(quán)利要求1或2中所列的蛋白的核酸或權(quán)利要求1或2中所列的蛋白在植物或其它生物體中作為選擇標(biāo)記的應(yīng)用。
18.一種分離的蛋白(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有具有至少下列序列同一性的序列i.與SEQ ID NO 2給出的全長序列具有76％，或80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；ii.與SEQ ID NO 4給出的全長序列具有55％，或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；iii.與SEQ ID NO 6給出的全長序列具有90.5％，或90.6％、90.7％、90.8％、90.9％，優(yōu)選91％、92％、93％、94％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；iv.與SEQ ID NO 8給出的全長序列具有50％，或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；v.與SEQ ID NO 10給出的全長序列具有50％，或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；
19.分離的編碼權(quán)利要求19的蛋白的核酸，其互補(bǔ)序列或一部分。
20.一種遺傳構(gòu)建體，包括(i)分離的編碼植物蛋白的核酸，所述植物蛋白(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQ ID NO 2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50％，或60％、70％、80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(jù)(a)到(c)的任意一項(xiàng)，含有以相應(yīng)的天然或非天然改變的氨基酸進(jìn)行的置換；(ii)與(i)的核酸可操作性地連接的調(diào)控元件，該調(diào)控元件為植物和/或酵母可表達(dá)的啟動子；以及任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
21.含有編碼權(quán)利要求18的蛋白的分離的核酸的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞為細(xì)菌、酵母、真菌、植物或動物細(xì)胞。
22.一種鑒定能夠改變植物或酵母對寒冷逆境狀態(tài)的耐受性或抗性的核酸的篩選方法，所述的方法包括下列步驟(i)提供來自生物體的編碼序列的cDNA文庫；(ii)將這些編碼序列以可表達(dá)的形式引入野生型酵母細(xì)胞；(iii)使(ii)的酵母細(xì)胞在寒冷逆境的條件下生長；(iv)識別轉(zhuǎn)基因的酵母細(xì)胞和野生型酵母細(xì)胞之間的差異，優(yōu)選識別生長速率的差異；(v)從與野生型酵母細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)基因的酵母細(xì)胞中分離核酸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的野生型酵母細(xì)胞為野生型釀酒酵母酵母細(xì)胞，優(yōu)選野生型釀酒酵母W303酵母細(xì)胞。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述的生物體為植物，優(yōu)選為鹽處理的植物，更優(yōu)選為鹽處理的鹽生植物或其一部分，最優(yōu)選為鹽處理的甜菜或其一部分。
25.權(quán)利要求22到24任一項(xiàng)的篩選方法在鑒定編碼能夠賦予植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞對寒冷逆境耐受性的蛋白的核酸中的應(yīng)用。
26.增加酵母細(xì)胞耐寒性的方法，包括在酵母中下調(diào)編碼甘油磷酸脫氫酶的核酸的表達(dá)和/或抑制甘油磷酸脫氫酶的活性。
全文摘要
提供了一種選擇和分離能夠賦予植物或酵母對環(huán)境逆境的耐受性或抗性的核酸的方法，另外還公開了核酸、其編碼的蛋白以及它們在生產(chǎn)具有提高的環(huán)境逆境抗性的植物或酵母中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/415GK1771327SQ200480009698
公開日2006年5月10日 申請日期2004年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月11日
發(fā)明者J·M·米萊薩洛爾特, R·塞拉諾薩洛姆 申請人:作物培植股份有限公司