本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物之一，以小麥粉為主的原料可以制成許多食品，如面包、油條、煎餅、水餃、面條等等，它在人們的食物結(jié)構(gòu)和食品消費(fèi)方面占有重要的地位。小麥中的醇溶蛋白對胃具有保養(yǎng)功能，能夠在表面形成保護(hù)膜，有效防止被氧化，能夠提高胃粘膜蛋白純度，可一定程度防止胃酸侵蝕，而且醇溶蛋白具有消炎作用，是胃粘膜的抵抗能力增加。

然而，小麥應(yīng)用中存在一個嚴(yán)重的問題，即小麥過敏。小麥過敏是指特定的人群對面粉的一些蛋白質(zhì)產(chǎn)生的不良反應(yīng)。由于小麥及面粉作為原料和添加物，被廣泛的應(yīng)用到許多食品中，使得所有的食物過敏中，幾乎30%左右與小麥過敏相關(guān)（甄宇江，食物致敏原與食品安全[M]，北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011）。因此，小麥被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織認(rèn)定為八大類食物過敏原之一，小麥過敏是一個不可忽視的食品安全問題。小麥過敏原涉及的范圍很廣，如ω5-醇溶蛋白是引發(fā)小麥依賴運(yùn)動激發(fā)性過敏癥和蕁麻疹的主要過敏原（Morita E et al. Food-dependent exercise-induced anaphylaxis: a report of two cases and determination of wheat-gamma-gliadin as the presumptive allergen[J]，Br J Dermatol，2000，143(5):1059-1063)，γ-醇溶蛋白被推測是乳糜瀉和小麥依賴運(yùn)動的主要過敏原（小麥蛋白過敏原的研究進(jìn)展，食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，(7)：2783-2788），清蛋白和球蛋白是法國兒童小麥過敏性皮炎的主要致敏源(Battais F et al，F(xiàn)ood allergy to wheat: differences in immunobulin E-binding proteins as a function of age or symptoms[J]，J Nutr Sci Vitamin，2004，50(5): 367-370)。近年來，小麥過敏已經(jīng)威脅到特定的過敏人群的健康，主要引發(fā)的疾病有乳糜瀉、過敏性皮炎、蕁麻疹、職業(yè)哮喘、依賴運(yùn)動激發(fā)過敏癥等等。

小麥醇溶蛋白是乳糜瀉和依賴運(yùn)動激發(fā)過敏癥的主要致病抗原，它主要以多肽單鏈的形式存在，富含谷氨酰胺和脯氨酸，有α/β、γ、ω三種類型，它對粘膜損害大。其小麥過敏原的表位目前已經(jīng)被證實含有QQIPQQQ，QQFPQQQ，PQQSFPQQ，QQPPQQ等模體（Q：谷氨酰胺，I：異量氨酸，P：脯氨酸，F(xiàn)：苯丙氨酸，S：絲氨酸）（小麥過敏研究進(jìn)展，食品科學(xué)，2007，28(8)：559-562），隨著食品貿(mào)易國際化，食品過敏問題具有更大的潛在危險性。因此，建立可靠、定量的過敏原檢測方法對確保食品標(biāo)簽的一致性和消費(fèi)者的安全性十分必要。目前，小麥致敏原的主要檢測技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫印跡法、免疫層析法等（食物中過敏原檢測技術(shù)研究進(jìn)展，食品科學(xué)，2010，31(21)：417-421）。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于通過體外原核表達(dá)小麥醇溶蛋白TaWG05，并通過生物免疫方法制備多克隆抗體，從而為相關(guān)過敏原的檢測奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明的技術(shù)方案簡述如下。

一種小麥醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）提取小麥品種鄭麥004的基因組DNA；

（2）設(shè)計引物，以上述基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因TaWG05，引物序列設(shè)計如下：

上游引物：TCGACCCTCGCATCCATGACCAA，

下游引物：TCATTGTCCACCATTGTAGGCG；

（3）構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-TaWG05，具體為：

將步驟（2）中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-32a表達(dá)載體分別采用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選、鑒定，獲得構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pET-32a-TaWG05；

（4）TaWG05蛋白的原核表達(dá)和純化，具體為：

將步驟（3）中所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-TaWG05轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）細(xì)胞，篩選陽性克隆，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，加入終濃度為0.8mM的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h左右；

培養(yǎng)結(jié)束后，菌液離心，收集菌體，超聲裂解細(xì)胞，離心收集沉淀，用洗滌劑洗滌沉淀后，得粗TaWG05目的蛋白，進(jìn)一步經(jīng)超濾管離心超濾脫去脲素得純化的TaWG05目的蛋白；

所述洗滌劑配方為：50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，8mol/ L尿素，5mmol/L β-巰基乙醇，pH=8.0；

（5）制備多克隆抗體，具體為：

將步驟（4）所得TaWG05目的蛋白免疫新西蘭大耳兔，分離血清，最終得到TaWG05蛋白多克隆抗體；

免疫新西蘭大耳兔時，具體免疫程序為：

首次免疫：將步驟（4）所得TaWG05目的蛋白用PBS（pH=7.4）溶解，調(diào)整濃度為4mg/mL；再以1 ：1 的體積比與弗氏完全佐劑混合均勻，免疫新西蘭大耳兔1 次，單只兔子的免疫劑量為0.6mg；

第二至第四次免疫：將步驟（4）所得TaWG05目的蛋白用PBS（pH=7.4）溶解，調(diào)整濃度為4mg/mL；再以1 ：1 的體積比與弗氏不完全佐劑(FIA) 混合混合均勻，免疫大耳兔3次，每次單只兔子的免疫劑量為0.3mg。

利用上述小麥醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體的制備方法所制備的小麥醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體，ELISA檢測表明，所制備的小麥醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體的效價可達(dá)1:32000。

所述小麥醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體在小麥致敏原檢測中的應(yīng)用，用于檢測小麥醇溶蛋白TaWG05。

本申請中所述小麥醇溶蛋白TaWG05基因，其堿基序列如SEQ ID No.1所示，

所述小麥醇溶蛋白TaWG05基因所編碼的小麥醇溶蛋白TaWG05，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述小麥醇溶蛋白TaWG05，其33-40處氨基酸（即：PQQSFPQQ）為IgE抗體結(jié)合表位區(qū)段。

需要解釋的是，因語言習(xí)慣問題，本申請中未特殊說明時，小麥醇溶蛋白TaWG05、TaWG05蛋白等均指小麥γ-醇溶蛋白TaWG05，相關(guān)描述盡管不夠統(tǒng)一，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本申請的技術(shù)方案并不構(gòu)成必然的障礙。

小麥過敏是指特定的人群對面粉的一些蛋白質(zhì)產(chǎn)生的不良反應(yīng)，而醇溶蛋白主要是乳糜瀉和小麥依賴運(yùn)動激發(fā)過敏癥的重要過敏原。而現(xiàn)有過敏原檢測技術(shù)中，檢測食物成品中潛在過敏原的最直接的方法是檢測過敏原（蛋白質(zhì)）。通過信息生物學(xué)的方法，發(fā)明人對小麥γ-醇溶蛋白TaWG05的結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其氨基酸33-40位置存在IgE抗體結(jié)合表位區(qū)段（PQQSFPQQ），推測其可能與小麥依賴運(yùn)動激發(fā)過敏癥有關(guān)?；诖颂攸c(diǎn)，發(fā)明人通過小麥醇溶蛋白TaWG05的原核表達(dá)、多克隆抗體制備，制備了特定的小麥醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體。利用該抗體，可建立可靠、定量的過敏原檢測方法，從而為確保食品標(biāo)簽的一致性和消費(fèi)者的安全性提供保障。進(jìn)一步地，利用該多克隆抗體，對小麥醇溶蛋白TaWG05在其它小麥品種中的分布表達(dá)情況進(jìn)行了檢測鑒定，從而為小麥品質(zhì)的改良奠定了理論基礎(chǔ)。

總之，本申請針對特定小麥γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體的制備，其不僅針對單一的小麥γ-醇溶蛋白TaWG05，同時也為其他過敏原的快速檢測提供了參考和借鑒，更為小麥品種改良提供了較好的指導(dǎo)，因而對于面粉過敏人群的健康指導(dǎo)具有較為重要的應(yīng)用意義。

附圖說明

圖1為對小麥γ-醇溶蛋白 TaWG05編碼基因信號肽的序列預(yù)測；

圖2 為小麥γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因的PCR擴(kuò)增圖，擴(kuò)增片段為TaWG05編碼區(qū)22aa-324aa的氨基酸序列，圖中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖3為小麥γ-醇溶蛋白 TaWG05的誘導(dǎo)表達(dá)的檢測結(jié)果，其中A圖為小麥γ-醇溶蛋白 TaWG05的表達(dá)檢測，1：空載體誘導(dǎo)表達(dá)，2：pET-32a-TaWG05誘導(dǎo)表達(dá)；B圖為小麥γ-醇溶蛋白 TaWG05重組蛋白的SDS-PAGE分析，1：0.4mg/mL BSA，2：超聲波破碎后的蛋白上清，3：包涵體稀釋2倍，4：包涵體稀釋5倍，5：包涵體稀釋10倍；C圖為純化后的SDS-PAGE分析，1：pET-32a-TaWG05稀釋5倍，2：pET-32a-TaWG05稀釋10倍；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖4為小麥γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體的ELISA效價檢測圖，其中分別設(shè)置有：空白對照、陰性對照和抗體不同稀釋濃度（陽性組），酶標(biāo)儀分別測定各個孔在450nm的吸光度（A），計算時，計算陽性血清（P）與陰性血清（N）A值之比（P/N），P/N>2.1為陽性；結(jié)果顯示該抗體的效價為1：32K；

圖5為抗原蛋白印跡檢測，其中1：抗原上樣量為10ng，2：抗原上樣量為5ng，3：抗原上樣量為1ng，4：抗原上樣量為0.5ng；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；抗體稀釋比為1:1000；

圖6 為小麥γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體在小麥品種中的鑒定結(jié)果，其中1：新麥26，2：鄭麥366，3：鄭麥9023，4：矮抗58，5：鄭麥004，6：豫麥18，7：偃展4110；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；抗體稀釋比為1:1000。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請做進(jìn)一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中部分實驗背景情況簡要介紹如下。

生物材料：

新麥26，鄭麥366，鄭麥9023，矮抗58，鄭麥004，豫麥18，偃展4110等，均為商品化小麥品種；

質(zhì)粒pET-32a，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實驗室涂金星教授贈予；

E.coli DH5α、E.coli Rosetta (DE3)購買自全式金公司；

新西蘭大耳兔，月齡3個月，體重1.8kg左右；由ABclonal公司提供。

主要試劑：

蛋白胨、牛肉膏和酵母粉抽提物購買自O(shè)xoid 公司 ；

質(zhì)粒小提試劑盒、膠回試劑盒、RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；

IPTG、Amp霉素、高保真酶Phusion、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII 及其配套緩沖液購自TaKaRa公司；

HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG與PVDF 膜為Millipore 公司產(chǎn)品；

Protease Inhibitor蛋白酶抑制劑購自Roche公司；

弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma 公司。

主要實驗設(shè)備：

SDS-PAGE蛋白電泳儀、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc 2000TM，均為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；

臺式低溫離心機(jī)，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；

超聲波細(xì)胞破碎儀，美國BRANSON公司產(chǎn)品；

蛋白純化系統(tǒng)，Profinia公司產(chǎn)品；

酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司產(chǎn)品。

實施例1

本申請所提供的小麥γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體，通過如下步驟制備而成。

（1）提取小麥品種鄭麥004的基因組DNA；

利用天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒，參考其說明書，提取小麥品種鄭麥004基因組DNA。

（2）設(shè)計引物：引物序列設(shè)計時，基于生物信息學(xué)軟件SignalP 4.1 server的預(yù)測，小麥γ-醇溶蛋白TaWG05的N端22個氨基酸殘基為轉(zhuǎn)運(yùn)肽（預(yù)測結(jié)果如圖1所示），因此在擴(kuò)增小麥γ-醇溶蛋白TaWG05對應(yīng)的目的基因時，去除其轉(zhuǎn)運(yùn)肽的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計如下：

上游引物：TCGACCCTCGCATCCATGACCAA，

下游引物：TCATTGTCCACCATTGTAGGCG；

以步驟（1）中所提取基因組DNA為模板，利用上述引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因：小麥γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因；

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為：98℃預(yù)變性30S；98℃變性10S，56℃退火20S，72℃延伸30S，共32個循環(huán)；72℃延伸5min。

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳檢測，電泳結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，小麥γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因片段約900bp，符合897bp的理論大小。對此擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步送上海生工公司進(jìn)行測序驗證。結(jié)果表明，擴(kuò)增片段序列正確，與預(yù)期符合。

進(jìn)一步的，根據(jù)測序結(jié)果，利用BioEdit軟件對TaWG05基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在33-40位置存在IgE抗體結(jié)合表位區(qū)段（PQQSFPQQ），因而可推測其可能與小麥依賴運(yùn)動激發(fā)過敏癥有關(guān)。

（3）構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-TaWG05，具體為：

按照現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-TaWG05，簡要描述如下。

將步驟（2）中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并回收酶切產(chǎn)物；

同時將表達(dá)載體pET-32a采用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并回收酶切產(chǎn)物；

將所回收酶切產(chǎn)物在PCR儀中采用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，22℃連接2h后，4℃放入展示柜過夜。

酶切時的體系設(shè)計為：

10×Fast Digest buffer，6μL；

pET-32a載體（或TaWG05基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物），20μL；

BamHI，1U/L、2μL；

HindIII，1U/L、2μL；

ddH₂O，30 μL。

T4 DNA連接酶連接時的連接體系設(shè)計如下：

10×T4 DNA 連接緩沖液，1μL；

TaWG05基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，7μL；

pET-32a載體，1μL；

T4 DNA 連接酶，1μL。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α 細(xì)胞，具體操作過程如下：

（1）取連接產(chǎn)物5μL，加到100μL E.coli DH5α細(xì)胞懸液中，輕輕混勻，冰上放置30min；

（2）42℃水浴熱激90s，迅速取出置冰上冷卻5min；

（3）加入500μL 無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻后放入37℃搖床1h，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)；

（4）吸取步驟3中的菌液200μL均勻涂布于含有Amp霉素的LB 固體培養(yǎng)基平板上，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h。

最后將篩選、鑒定正確的陽性克隆送上海生工進(jìn)行測序驗證，測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-TaWG05。

（4）小麥γ-醇溶蛋白TaWG05的原核表達(dá)和純化，具體為：

將步驟（3）中所構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-TaWG05轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）細(xì)胞，篩選陽性克隆，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

對鑒定正確的陽性克隆菌株接種至LB 培養(yǎng)基（含50mg/mL氨芐霉素），37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期；然后加入終濃度為0.8mM的IPTG， 37℃、220rpm 搖床培養(yǎng)4h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

培養(yǎng)結(jié)束后，菌液離心（12000 rpm、15min），收集菌體，菌體經(jīng)pH=7.4 的PBS 重懸并重復(fù)洗滌三次。

超聲裂解細(xì)胞，離心收集沉淀，用洗滌劑洗滌沉淀，洗滌時每次轉(zhuǎn)速6000rpm，得粗TaWG05目的蛋白，

所述洗滌劑配方為：50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，8mol/ L尿素，5mmol/L β-巰基乙醇，pH=8.0。

將粗TaWG05 目的蛋白再經(jīng)超濾管離心超濾脫去脲素，得純化的γ-醇溶蛋白TaWG05，具體操作方法為：

將粗TaWG05目的蛋白溶液經(jīng)pH=7.4的PBS溶液10 倍稀釋后，與pH=7.4 的PBS溶液1:1 混合， 4℃下離心10min，得到的蛋白溶液繼續(xù)以1:1 比例與pH=7.4 的PBS溶液混合，經(jīng)相同條件超濾，重復(fù)此操作，直至最后剩余的蛋白溶液體積為1mL左右，即得純化的γ-醇溶蛋白TaWG05。

圖3A為蛋白提純前菌液的電泳圖，粗TaWG05 目的蛋白的SDS-PAGE 結(jié)果如圖3B所示，從圖中可以看出經(jīng)純化后的粗TaWG05目的蛋白已經(jīng)獲得較好的純化效果；純化后的γ-醇溶蛋白TaWG05的電泳結(jié)果如圖3C所示。從圖中可以看出，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，所獲得的γ-醇溶蛋白TaWG05純度較高，可以用于后續(xù)實驗。

（5）制備多克隆抗體

將步驟（4）所得的提純后的γ-醇溶蛋白TaWG05目免疫新西蘭大耳兔，分離血清，最終得到TaWG05蛋白多克隆抗體，具體為：

選擇月齡在3個月，體重1.8kg左右的健康大耳兔，共免疫四次，注射在雙腋下和腹股溝位置，具體免疫程序為：

第一次免疫：將步驟（4）所得TaWG05目的蛋白用PBS（pH=7.4）溶解，調(diào)整濃度為4mg/mL；再以1 ：1 的體積比與弗氏完全佐劑混合均勻，免疫新西蘭大耳兔1次，單只兔子的免疫劑量為0.6mg；

第二次免疫：間隔12天，把弗氏完全佐劑換用不完全弗氏不完全佐劑，單只兔子的疫劑量為0.3mg，其余同操作第一次免疫；

第三次免疫：間隔22天，其余操作同第二次免疫；

第四次免疫：間隔20天，其余操作同第二次免疫；

第四次免疫后，間隔12天采血（所采血液中加有抗凝血劑），所采集血液37℃靜置1小時后，1000rpm離心15分鐘后分離血清，血清中即含有所制備的γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體。

（6）ELISA檢測血清效價

進(jìn)一步地，對步驟（5）中所獲得的含有多克隆抗體血清進(jìn)行效價檢測，可判定其是否具有應(yīng)用前景，具體檢測過程為：

A、抗原包被：用步驟（5）中所制備純化后的γ-醇溶蛋白TaWG05作抗原，用磷酸緩沖液（PBS）稀釋至10μg/mL，以25ng/孔量加入聚苯乙烯反應(yīng)板中，4℃放置過夜；

B、洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次；

C、封閉：按l00μL/孔量加入封閉液，室溫放置1h；

D、洗滌：用洗滌液洗3次；

E、加待測血清樣品：將陰性血清（沒有被免疫的兔子血清）和待測血清（即步驟（5）中所制備含多克隆抗體的血清）按倍比法用稀釋液稀釋（1:1K，1:4K等），各取l00μL加入相應(yīng)的凹孔內(nèi)，加蓋37℃恒溫箱溫育2h；

F、洗滌：用洗滌液洗3次；

G、加酶標(biāo)抗抗體：按100μL／孔量加入酶標(biāo)抗體，加蓋，37℃恒溫箱溫育1h；

H、洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次；

I、顯色：按100μL/孔量，各孔加入新鮮配制的底物溶液，室溫暗處放置5～30min進(jìn)行顯色，此時顯示為藍(lán)色；

J、終止反應(yīng)、比色：按50μL/孔量，每孔加入終止液；此時顏色變黃；用酶標(biāo)儀測定450nm 處各孔的吸光值（A），陽性反應(yīng)的最大稀釋度為待測樣品的效價，計算陽性血清（P）與陰性血清（N）吸光值A(chǔ)值之比（P/N），P/N>2.1為陽性；P/N<2.1而大于1.5為可疑，P/N<1.5為陰性。結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，步驟（5）中所制備的含γ-醇溶蛋白TaWG05含多克隆抗體的血清其效價可達(dá)1:32000。

進(jìn)一步地，利用Western-blot技術(shù)，對所制備的含γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體的血清進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，目的條帶在50kD左右，而γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體在稀釋為1:1000時，仍可檢測到0.5ng抗原，表現(xiàn)出較好地靈敏度。

實施例2

利用實施例1所制備的γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體，可對其他小麥品種（或含小麥的蛋白制品）中是否含有γ-醇溶蛋白TaWG05進(jìn)行有效檢測，從而為對γ-醇溶蛋白TaWG05過敏人群提供有效的健康指導(dǎo)，也可為小麥品種的改進(jìn)提供指導(dǎo)方向。具體而言，本實施例以部分小麥品種（新麥26，鄭麥366，鄭麥9023，矮抗58，鄭麥004，豫麥18，偃展4110）為例，對其是否含有γ-醇溶蛋白TaWG05蛋白進(jìn)行了檢測，依據(jù)此檢測結(jié)果，即可為小麥改良或者抗敏原檢測奠定基礎(chǔ)。具體實驗過程如下。

（1）提取小麥種子蛋白，具體步驟如下：

（A）取200μL總蛋白抽提緩沖液加入到1.5ml離心管中，放在冰上待用；

所述總蛋白抽提緩沖液配方為：

；

（B）液氮研磨小麥種子，取大約0.1g粉末，加入到步驟（A）的200μL總蛋白抽提緩沖液中，充分混勻；

（C）4℃、12000rpm離心10分鐘；

（D）取上清，以3:1的體積比例加入4×Laemmli buffer，混勻后95℃以上變性10min，再冰上冷卻5min；

（E）室溫、12000rpm離心5min，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE檢測。

（2）利用實施例1中所制備的γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體，分別對步驟（1）中所提取的不同小麥品種的蛋白進(jìn)行檢測，具體檢測步驟簡述如下。

（A）對步驟（1）中的SDS-PAGE檢測的蛋白膠，切掉多余的濃縮膠，將分離膠小心的用清水洗2次，轉(zhuǎn)移至冰上的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min；

（B）按照陽極、硝酸纖維素膜、凝膠、陰極順序放好，200mA恒流100min；

（C）轉(zhuǎn)膜后將膜小心放入封閉液（含2%BSA或3%脫脂奶粉的PBST）中，搖床上輕微搖晃，室溫下封閉 1個小時；

（D）按照和封閉液一樣的配方配制3%（m/V）脫脂牛奶的TBST溶液，加入對應(yīng)比例的一抗（實施例1所制備的γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體）（一抗稀釋倍數(shù)：1：1000）混勻后，將封閉液中的膜迅速轉(zhuǎn)移至含一抗混合液中，搖床上輕微搖晃， 4℃ 雜交過夜；

（E）洗膜：將膜快速的從一抗混合液中取出，以TBST溶液洗膜， 5min/次、4次；

（F）加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，向TBST溶液加入對應(yīng)比例（1：10000）的二抗，混勻，立即將洗好的膜加入到二抗溶液中，搖床上輕微搖晃，室溫下雜交 1.5小時；

（G）洗膜：將膜快速的從二抗中取出，以TBST溶液洗膜，5min/次、5次；

（H）顯影：ECL顯色法。

結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，在強(qiáng)新麥26、鄭麥366、鄭麥9023中，γ-醇溶蛋白TaWG05幾乎無表達(dá)；而在矮抗58、鄭麥004、豫麥18、偃展4110品種中，γ-醇溶蛋白TaWG05表達(dá)量很高，依據(jù)此結(jié)果，顯然可為對γ-醇溶蛋白TaWG05過敏人群提供較好的健康指導(dǎo)，也為小麥品種的有針對性改進(jìn)提供了指導(dǎo)方向。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所

<120> 一種小麥醇溶蛋白TaWG05多克隆抗體的制備方法

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

atgaagatct tcttggtctt tgccctcctc gttgtatcaa tgatcatcac caccgcgacc 60

gcgcagctcg atcctagcat ccatgtacaa gaaaggccac aacaatcgtt tccgcagcag 120

caaccactta cccaacaaca accattcccg ccgcaagagc cacaacaacc actattccag 180

caacaacaac cgcatccaca tcagtcactt ccccaacaac aacttcccca gcaacattta 240

tttccacagc aaccgccgca acaacaattt ccacagcaga tgccacttcc tcatcaacaa 300

caaatattcc cgcaacaaca aatattcccg caacaacaac aacccccaca acaacaacca 360

ttttaccaat atcaacaacc attaacacaa caaccatacc cgcaagagca accattgcca 420

caacaacaac cttctgtgga ggaaaaccaa caattgaact tgtgcaagga gttcctgctg 480

cagcagtgca acccggagga gaaactatca ttactgcagt cagtgatccc gttcctccga 540

ccaaagacct cgcaacagaa caactgccag ttgaagcggc aacaatgttg tcgacaactt 600

gcacatatca gcgagccgtc ccgatgcccg gccatccaca acattgtgca cgccatcatc 660

atgcaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa 720

catgtggata gaggtttcgt ccagcctcaa ccacaacagt tgggccaggg aatgcccatg 780

cagcctcaac atcaattggg ccagggctta agcctacctc aacaactagc ccagttcaag 840

ttggttaggt tacttgtgat tcagaccttg cctatgttat gcaatgtgca tgtcccatct 900

gattgctaca ccattagtgc accatttggt ggcatcactg cctacaacgg tggacaatga 960

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 2

Met Lys Ile Phe Leu Val Phe Ala Leu Leu Val Val Ser Met Ile Ile

1 5 10 15

Thr Thr Ala Thr Ala Gln Leu Asp Pro Ser Ile His Val Gln Glu Arg

20 25 30

Pro Gln Gln Ser Phe Pro Gln Gln Gln Pro Leu Thr Gln Gln Gln Pro

35 40 45

Phe Pro Pro Gln Glu Pro Gln Gln Pro Leu Phe Gln Gln Gln Gln Pro

50 55 60

His Pro His Gln Ser Leu Pro Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln His Leu

65 70 75 80

Phe Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Met Pro Leu

85 90 95

Pro His Gln Gln Gln Ile Phe Pro Gln Gln Gln Ile Phe Pro Gln Gln

100 105 110

Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Pro Phe Tyr Gln Tyr Gln Gln Pro Leu

115 120 125

Thr Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Glu Gln Pro Leu Pro Gln Gln Gln Pro

130 135 140

Ser Val Glu Glu Asn Gln Gln Leu Asn Leu Cys Lys Glu Phe Leu Leu

145 150 155 160

Gln Gln Cys Asn Pro Glu Glu Lys Leu Ser Leu Leu Gln Ser Val Ile

165 170 175

Pro Phe Leu Arg Pro Lys Thr Ser Gln Gln Asn Asn Cys Gln Leu Lys

180 185 190

Arg Gln Gln Cys Cys Arg Gln Leu Ala His Ile Ser Glu Pro Ser Arg

195 200 205

Cys Pro Ala Ile His Asn Ile Val His Ala Ile Ile Met Gln Gln Gln

210 215 220

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

225 230 235 240

His Val Asp Arg Gly Phe Val Gln Pro Gln Pro Gln Gln Leu Gly Gln

245 250 255

Gly Met Pro Met Gln Pro Gln His Gln Leu Gly Gln Gly Leu Ser Leu

260 265 270

Pro Gln Gln Leu Ala Gln Phe Lys Leu Val Arg Leu Leu Val Ile Gln

275 280 285

Thr Leu Pro Met Leu Cys Asn Val His Val Pro Ser Asp Cys Tyr Thr

290 295 300

Ile Ser Ala Pro Phe Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Gly Gly Gln

305 310 315