本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及針對腫瘤標(biāo)志物建立的抗體組合及其ELISA方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤最重要的特點是局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且是致死的主要原因。它由一個細(xì)胞轉(zhuǎn)化不斷增生繁衍形成，可發(fā)展浸潤到局部組織，并轉(zhuǎn)移遠(yuǎn)處部位，這種擴散到其他部位的腫瘤已經(jīng)屬于高度惡性級，其治愈的可能性已經(jīng)是微乎其微了。目前，發(fā)達國家腫瘤的診斷與治療多在早期，相應(yīng)的一些腫瘤標(biāo)志物作為必檢項目，所以腫瘤特異標(biāo)記物是腫瘤早期診斷、個體化醫(yī)療和腫瘤預(yù)測及預(yù)防的關(guān)鍵。但是目前世界上很少有特異的標(biāo)記物，不能單純依據(jù)腫瘤標(biāo)志物確診腫瘤。因此，充分利用本地豐富的臨床資源進行生物標(biāo)記物（尤其是對廣東危害嚴(yán)重的惡性腫瘤）的研發(fā)和應(yīng)用，既順應(yīng)市場的實際需求，也符合國家的戰(zhàn)略需要。在癌癥的早期階段，只有很微量的特異腫瘤標(biāo)志物被分泌并釋放到血液中，直接檢測方法難以檢測到這些生物標(biāo)志物的變化。然而，即使是微量的這些生物標(biāo)志物作為自身抗原時，可以刺激免疫系統(tǒng)，產(chǎn)出大量的針對性抗體，利用這個信號放大的結(jié)果更有利于腫瘤的檢測。

抗體是迄今為止被人類研究的最深入的一組生物結(jié)合分子。它們被廣泛地應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，起到了非常重要的作用。但是，受體積、低穩(wěn)定性等影響，它們在診斷領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制?？贵w類似物的開發(fā)解決了這個難題，它體積小但具有抗原決定簇，能夠綁定在靶蛋白上，因此具備作為分子生物學(xué)工具的潛能。此外，通過與新的醫(yī)療保健產(chǎn)品結(jié)合，它們能夠被用作治療劑和用于探測病人樣本中的蛋白質(zhì)并使之成像的工具。他們還可以被用于鑒定細(xì)胞系和組織樣本上的新生物標(biāo)志物。

由于抗體芯片中的關(guān)鍵材料——檢測抗體受體積、低穩(wěn)定性、高生產(chǎn)成本及批次間的差異和自身分子量大而導(dǎo)致的空間位阻的影響，抗體在包括抗體芯片在內(nèi)的診斷領(lǐng)域的應(yīng)用往往有限。為了解決這些問題，科學(xué)家們開發(fā)了體積小且活性強的重組抗體類似物，以用于分子識別?？贵w類似物與抗體相比具有良好的溶解性、組織滲透性、熱穩(wěn)定性、酶穩(wěn)定性、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，因此，篩選出穩(wěn)定的抗體類似物，能夠廣泛取代抗體用于高通量技術(shù)（抗體芯片）篩分多種不同抗體類似物庫進行抗體類似物結(jié)合試劑的開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開腫瘤標(biāo)志物S100B的5個比較好的抗體類似物為S100B-A10、S100B-A12、S100B-B11、S100B-D10和S100B-D12；腫瘤標(biāo)志物GP73的抗體類似物為GP73-A5、GP73-B4、GP73-F6和GP73-G4；腫瘤標(biāo)志物CK8的抗體類似物為CK8-F5和CK8-12。但是這些抗體類似物的應(yīng)用還沒有進行研究。尤其是將這些抗體類似物經(jīng)過活性及抗體對檢測后，把最好的靶標(biāo)抗體對應(yīng)用于抗體芯片的制備，為開發(fā)性能穩(wěn)定、診斷靈敏度高和特異性強的新型腫瘤標(biāo)志物免疫檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。這將為腫瘤的早期腫瘤早期診斷、個體化醫(yī)療和腫瘤預(yù)測提供一種可靠的途徑。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實現(xiàn)的。

針對腫瘤標(biāo)志物建立的ELISA抗體組合，以腫瘤標(biāo)志物的抗體類似物與其常規(guī)抗體配對。

優(yōu)選地，所述腫瘤標(biāo)志物為S100B、GP73或CK8。

針對腫瘤標(biāo)志物S100B建立的ELISA抗體組合，S100B標(biāo)志物的抗體組合為以抗S100B的常規(guī)抗體為包被抗體，以S100B的抗體類似物S100B-A10、S100B-A12、S100B-B11、S100B-D10或S100B-D12為檢測抗體。

針對腫瘤標(biāo)志物GP73建立的ELISA抗體組合，GP73標(biāo)志物的抗體組合為以抗GP73的常規(guī)抗體為包被抗體，以GP73的抗體類似物GP73-A5、GP73-B4、GP73-F6或GP73-G4為檢測抗體。

針對腫瘤標(biāo)志物CK8建立的ELISA抗體組合，CK8標(biāo)志物的抗體由抗CK8的抗體類似物F5和抗CK8的常規(guī)抗體組成。

優(yōu)選地，S100B標(biāo)志物的抗體組合為以抗S100B的常規(guī)抗體為包被抗體，以S100B的抗體類似物S100B-D10為檢測抗體。

優(yōu)選地，GP73標(biāo)志物的抗體組合為以抗GP73的常規(guī)抗體為包被抗體，以GP73的抗體類似物GP73-G4為檢測抗體。

優(yōu)選地，CK8標(biāo)志物的抗體組合為以CK8抗體類似物F5作為捕獲抗體，相應(yīng)的常規(guī)抗體237或260做檢測抗體；

或以CK8抗體類似物F5作為檢測抗體，相應(yīng)的常規(guī)抗體260或251做捕獲抗體。

本發(fā)明已分別篩選出針對3種腫瘤標(biāo)志物的抗體類似物，包括S100B、GP73和CK8，用于鑒定人工結(jié)合蛋白。

本發(fā)明采用一種親和選擇和基因表達產(chǎn)物相結(jié)合的技術(shù)，以改造的噬菌體為載體，將編碼外源多肽或蛋白質(zhì)的外源DNA片段克隆入噬菌體外殼蛋白的結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，外源多肽或者蛋白質(zhì)與噬菌體外殼蛋白融合表達，隨著子代噬菌體的重新組裝，融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于該噬菌體內(nèi)，通過測序可以得知表達外源多肽或者蛋白的DNA片段。

本發(fā)明采用一個抗體序列庫，使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使得各種靶分子的多肽配體通過一種被稱為淘選的體外選擇程序得以快速鑒定。

噬菌體淘選與擴增利用抗原-抗體的特異性親和力，首先，將生物素標(biāo)記的靶蛋白包被到鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠酶標(biāo)板上，再加入噬菌體（庫容量3×10¹⁰），反應(yīng)1h后，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，如此 經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”，即可將有用的基因從多達百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。

此實驗經(jīng)過重復(fù)淘選3輪，應(yīng)用噬菌體ELISA進行陽性驗證。先將抗原包被在酶標(biāo)板上，封閉后加入含噬菌體抗體的培養(yǎng)上清，然后加入HRP標(biāo)記的抗噬菌體抗體；最后通過TMB顯色，如淘選出的噬菌體為目標(biāo)噬菌體，則陽性反應(yīng)顯藍色，而對照不顯色。

優(yōu)選地，將反應(yīng)為陽性的克隆進行測序后，導(dǎo)入載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行蛋白表達。

將陽性較強的噬菌體的基因進行PCR擴增提取后，用雙酶切法將其連接到pET11A載體，轉(zhuǎn)化到BL21進行誘導(dǎo)表達目標(biāo)蛋白，然后用過柱層析法對目標(biāo)蛋白進行提取和純化。獲得的相應(yīng)蛋白，即為抗體類似物。

優(yōu)選地，在獲得抗體類似物后，研究團隊對抗體類似物的活性及相應(yīng)的抗體對進行篩選測試，擬為抗體類似物芯片免疫試劑的進一步開發(fā)提供最佳的抗體對。

通常篩選抗體對的方法是夾心ELISA，本發(fā)明采用的夾心ELISA方案是：

（1）將抗體類似物包被于NUNC微孔板，孵育、封閉后，加入靶標(biāo)抗原孵育1h；隨后操作如噬菌體ELISA，加入噬菌體中分離的抗體類似物，然后加入HRP標(biāo)記的抗噬菌體抗體，最后通過TMB顯色，能配成對的抗體類似物反應(yīng)顯藍色，而未能配對的類似物和對照組不顯色。

（2）采用針對相應(yīng)靶標(biāo)的單抗作為包被抗體，包被于酶標(biāo)板，4℃溫育過夜；室溫用封閉液封閉2h后，加入梯度稀釋的對應(yīng)靶標(biāo)物（抗原），室溫溫育2h；洗滌完成后加入上述生物素標(biāo)記的抗體類似物，室溫溫育1.5～2h；洗滌完成后加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，室溫溫育45 min；最后加入顯色液顯色，顯色完全加入終止液終止到顯黃色并用酶標(biāo)儀進行OD₄₅₀的測定讀數(shù)；根據(jù)所得數(shù)據(jù)（OD值）觀測是否是與抗原濃度成正比關(guān)系，如果是表示：可以成抗體對，如果沒有，則沒有成抗體對，即不能測定其靶標(biāo)，梯度越明顯越有利于靶標(biāo)的測定。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

用于配對的抗體類似物，具有體積小且活性強的特性，與抗體相比具有良好的溶解性、組織滲透性、熱穩(wěn)定性、酶穩(wěn)定性、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為GP73的噬菌體-ELISA特異反應(yīng)結(jié)果。

圖2為S100B的噬菌體-ELISA特異反應(yīng)結(jié)果。

圖3為 CK8的噬菌體-ELISA特異反應(yīng)結(jié)果。

圖4為S100B抗體類似物活性測定結(jié)果。

圖5為GP73抗體類似物活性測定結(jié)果。

圖6為S100B抗體類似物抗體對篩選結(jié)果。

圖7為GP73抗體類似物抗體對篩選結(jié)果。

具體實施方式

下面通過說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明進一步具體描述，下述所使用的實驗方法若無特殊說明，均為本技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有常規(guī)的方法，所使用的配料或材料，如無特殊說明，均為通過商業(yè)途徑可得到的配料或材料。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進，這些改進也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

本發(fā)明公開腫瘤標(biāo)志物S100B的5個比較好的抗體類似物為S100B-A10、S100B-A12、S100B-B11、S100B-D10和S100B-D12；腫瘤標(biāo)志物GP73的抗體類似物為GP73-A5、GP73-B4、GP73-F6和GP73-G4；腫瘤標(biāo)志物CK8的抗體類似物為CK8-F5和CK8-12。

抗體類似物的制備，流程如下：

首先，將生物素標(biāo)記的靶蛋白包被到鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠酶標(biāo)板上，再加入噬菌體（庫容量3×10¹⁰）；

反應(yīng)1h后，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來；

洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫；

如此 經(jīng)過3～5輪的“吸附-洗脫-擴增”，即可將有用的基因從多達百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。

此實驗經(jīng)過重復(fù)淘選3輪，應(yīng)用噬菌體ELISA進行陽性驗證。

先將抗原包被在酶標(biāo)板上，封閉后加入含噬菌體抗體的培養(yǎng)上清；

然后加入HRP標(biāo)記的抗噬菌體抗體；

最后通過TMB顯色，如淘選出的噬菌體為目標(biāo)噬菌體，則陽性反應(yīng)顯藍色，而對照不顯色；對于靶標(biāo)CK8，則在特定波長下檢測實驗組和對照組的光密度值（OD值），對陽性克隆進行篩選，如圖3所示，其中實驗組OD值比對照組明顯增大（>100），只有個別的克隆與蛋白靶標(biāo)沒有特異性結(jié)合。

完成了抗體類似物的篩選，將反應(yīng)為陽性的克隆進行測序后，導(dǎo)入載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行蛋白表達。

首先，將陽性較強的噬菌體的基因進行PCR擴增提取后，用雙酶切法將其連接到pET11A載體，轉(zhuǎn)化到BL21進行誘導(dǎo)表達目標(biāo)蛋白；

然后用過柱層析法對目標(biāo)蛋白進行提取和純化；

獲得的相應(yīng)蛋白，即為抗體類似物。

實施例2

針對已報道的抗體類似物，本發(fā)明首先研究了其活性，以鑒定其是否針對相應(yīng)的抗原有較好的結(jié)合原性。

采用直接ELISA方法，而進行直接ELISA測定前，需要對抗體類似物進行生物素標(biāo)記。然后將對應(yīng)的抗原梯度包被于酶聯(lián)板，4℃溫育過夜后室溫進行封閉1.5 h；待封閉后加入生物素標(biāo)記好的抗體類似物，室溫溫育2h；之后加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶（streptavidin-HRP），室溫溫育45 min；最后加入TMB顯色，顯色完成后加入終止液終止到顯黃色，并用酶標(biāo)儀進行OD₄₅₀的測定讀數(shù)；根據(jù)所得數(shù)據(jù)觀測是否隨著抗原濃度的降低，呈現(xiàn)相應(yīng)的梯度降低，如果是，表示有結(jié)合原性，否則則沒有結(jié)合原性或者結(jié)合原性不好。

目前，針對相應(yīng)的靶標(biāo)物，本發(fā)明研究團隊已經(jīng)完成對S100B（含5個類似物）、GP73（含4個類似物）的結(jié)合原性的測定，結(jié)果如圖4（S100B）、圖5（GP73）所示。從兩個圖中可以看出，各個抗體類似物對其相應(yīng)的靶標(biāo)均表現(xiàn)出了結(jié)合原性，結(jié)合原性也較強。

實施例3

夾心ELISA方法篩選相應(yīng)靶標(biāo)的抗體對，篩選抗體對的方法是夾心ELISA：

方案1：將抗體類似物包被于NUNC微孔板，孵育、封閉后，加入靶標(biāo)抗原孵育1h；

隨后操作如噬菌體ELISA，加入噬菌體中分離的抗體類似物，然后加入HRP標(biāo)記的抗噬菌體抗體，最后通過TMB顯色，能配成對的抗體類似物反應(yīng)顯藍色，而未能配對的類似物和對照組不顯色。

方案2：采用自有的針對相應(yīng)靶標(biāo)的單抗作為包被抗體，包被于酶標(biāo)板，4℃溫育過夜；

室溫用封閉液封閉2h后，加入梯度稀釋的對應(yīng)靶標(biāo)物（抗原），室溫溫育2h；洗滌完成后加入上述生物素標(biāo)記的抗體類似物，室溫溫育1.5～2h；洗滌完成后加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，室溫溫育45 min；最后加入顯色液顯色，顯色完全加入終止液終止到顯黃色并用酶標(biāo)儀進行OD₄₅₀的測定讀數(shù)；

根據(jù)所得數(shù)據(jù)（OD值）觀測是否是與抗原濃度成正比關(guān)系，如果表示：可以成抗體對，如果沒有，則沒有成抗體對，即不能測定其靶標(biāo)，梯度越明顯越有利于靶標(biāo)的測定。

針對相應(yīng)的靶標(biāo)物，本發(fā)明已經(jīng)完成對S100B和GP73抗體類似物的抗體對的測定，采用夾心ELISA方案2進行，結(jié)果如圖6（S100B）和圖7（GP73）所示，并且成功的獲得了相應(yīng)抗體對。

S100B的抗體對中，最好的是常規(guī)抗體（抗S100B抗體）和抗體類似物（S100B-D10）的抗體對最好；圖7中可得出，其常規(guī)抗體（抗GP73抗體）做為包被抗體，相應(yīng)的抗體類似物（GP73-A5、GP73-B4、GP73-F6和GP73-G4）做檢測抗體時，均可以成為較好的抗體對，其中GP73-G4與之成的抗體對是最好的。

實施例4

按照實施例2中方案2的方法，對CK8抗體類似物的配對情況進行鑒定，如表1。

表1

由表1中可得出，以CK8抗體類似物F5做為捕獲抗體，相應(yīng)的常規(guī)抗體（237，260）做檢測抗體時，均可以成為較好的抗體對，而與另一CK8抗體類似物12配對時并沒有優(yōu)勢，相應(yīng)的常規(guī)抗體（251，259）配對結(jié)果差。

另外，以CK8抗體類似物F5做為檢測抗體，相應(yīng)的常規(guī)抗體（260，251）做檢測抗體時，均可以成為較好的抗體對，而與常規(guī)抗體（237，259）配對結(jié)果差（見表2）。

表2

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