用于牛支原體檢測(cè)的特異性引物對(duì)、檢測(cè)試劑盒及其使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于牛支原體檢測(cè)的特異性引物對(duì)及相 應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛支原體是牛呼吸系統(tǒng)疾病的主要病因之一，其可引起牛的肺炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié) 炎、乳房炎、生殖道炎癥以及流產(chǎn)和不孕等疾病（Assie等，2009)。1898年，法國人Nocard 和Roux等首次在患呼吸系統(tǒng)疾病的病牛肺臟中分離到該支原體（Hale等，1962)。1961年， 美國人Hale等首次從在患乳房炎奶牛的牛奶中分離出牛支原體。之后，牛支原體及其相關(guān) 疾病迅速擴(kuò)散至世界各個(gè)國家和地區(qū)的牛群，對(duì)世界養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展造成了極大的威脅 (Nicholas 等，2003)。
[0003] 1983年，我國學(xué)者黎濟(jì)申等首次從國內(nèi)乳房炎患病奶牛的乳汁中分離出牛支原體 (黎濟(jì)申，1983)。2008年以來，我國多地相繼發(fā)生并廣泛流行的以發(fā)熱、咳嗽和流鼻涕為主 要癥狀，以壞死性肺炎為主要病變的牛呼吸道傳染病亦被確定為牛支原體感染所致的牛支 原體肺炎(辛九慶等，2008 ;胡長(zhǎng)敏等，2009)。由于該病常規(guī)藥物療效不佳，且無有效疫苗進(jìn) 行預(yù)防，因此給我國的養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 由于牛支原體肺炎臨床癥狀無特殊性，臨床上極易與其他呼吸道疾病相混渚，因 此，目前牛支原體肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷 等。其中，病原學(xué)診斷最為確實(shí)，但卻需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間。而血清學(xué)診斷方法中常規(guī)的 常規(guī)的抗體檢測(cè)方法診斷牛支原體肺炎靈敏度低，非特異性高。應(yīng)用高親和力的單克隆抗 體建立的牛支原體檢測(cè)方法，雖然具有較高的靈敏度，但卻往往不能對(duì)牛支原體和無乳支 原體進(jìn)行有效鑒別。因此，快速、靈敏和特異的牛支原體檢測(cè)方法的建立對(duì)牛支原體肺炎的 及時(shí)、準(zhǔn)確診斷和有效控制具有重要意義。雖然PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牛支原體肺炎的實(shí) 驗(yàn)室診斷（Soehnlen 等，2011 ;Justice_Allen 等，2011 ; Aebi 等，2012)，但絕大大多數(shù)為 了對(duì)牛支原體與無乳支原體進(jìn)行鑒別而采用套式PCR檢測(cè)技術(shù)或多種PCR技術(shù)，從而相對(duì) 延長(zhǎng)了檢測(cè)所需時(shí)間或增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜程度。（李嬡等，2009 ;劉洋等，2010 ;辛慶九等， 2010)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了用于牛支原體檢測(cè)的特異性引物 對(duì)，以及相應(yīng)的PCR檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本申請(qǐng)人通過對(duì)已完成基因組序列測(cè)定的牛支原體基因序列的比較分析，篩選出 高度保守的膜表面蛋白基因序列，并與本實(shí)驗(yàn)室分離的不同菌株的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比 較，獲得牛支原體高度保守的表面蛋白基因序列。在此基礎(chǔ)上，在NCBI中進(jìn)行BLAST檢測(cè)， 比較該基因序列與其他病原微生物核酸序列的同源性，依此設(shè)計(jì)并合成PCR擴(kuò)增引物。
[0007] 本申請(qǐng)人通過對(duì)牛支原體基因組的比較分析發(fā)現(xiàn)，不同菌株的牛支原體脂蛋白 P48基因高度保守，國內(nèi)外來源的菌株其P48脂蛋白基因序列完全一致。而該基因序列與無 乳支原體的相關(guān)基因序列存在數(shù)個(gè)堿基的差異。因此，本申請(qǐng)人根據(jù)牛支原體P48脂蛋白 基因和無乳支原體基因之間的差異，設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)特異性PCR擴(kuò)增引物，建立了牛支 原體的PCR快速檢測(cè)方法，該方法可快速、靈敏并特異地對(duì)牛支原體進(jìn)行檢測(cè)，從而為牛支 原體肺炎的快速診斷提供了新的技術(shù)手段。
[0008] 本申請(qǐng)?zhí)峁┑挠糜谂Ｖгw檢測(cè)的特異性引物為： 上游引物 P48-F :CGAACCTAAAAAGGGTGAATTAGCATCTT ; 下游引物 P48-R :ATTACTGAGTTAATAGCAGCAACTGCAACG。
[0009] 本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊环N用于牛支原體檢測(cè)的PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要 求1所述的引物對(duì)。
[0010] 優(yōu)選地，所述PCR試劑盒由以下成分組成：2XPCR Mix 12. 5yL ;10μΜ上游引物 0· 5 μ L ;10 μ M下游引物0· 5 μ L ;待檢樣品4 μ L ;超純水補(bǔ)至總體積25 μ L。 toon] 本申請(qǐng)的第三個(gè)目的是提供上述試劑盒的使用方法，步驟如下： (1) 牛支原體基因組DNA的提??； (2) 牛支原體基因組DNA的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30 秒，55°C退火45秒，72°C延伸45~50秒，30~40個(gè)循環(huán)，72°C延伸5~10min。
[0012] 本申請(qǐng)的第四個(gè)目的是提供上述引物對(duì)在制備用于牛支原體檢測(cè)的PCR檢測(cè)試 劑盒中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選地，所述牛支原體檢測(cè)方法如下： (1) 待檢樣品牛支原體基因組DNA的提?。?(2) 牛支原體基因組DNA的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30 秒，55°C退火45秒，72°C延伸45~50秒，30~40個(gè)循環(huán)，72°C延伸5~10min ; (3) 電泳，對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析：有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶，即為待檢樣品中有牛 支原體；反之，則無。
[0014] 優(yōu)選地，步驟（1)中待檢樣品牛支原體基因組DNA的提取方法為：（1)采集牛肺臟 組織，不以有生命的動(dòng)物體及其離體樣品作為采集對(duì)象； (2) 將組織病料經(jīng)勻漿處理后與2倍體積的去離子水混勻； (3) 3000 rpm 離心 IOmin ; (4) 取上清并用0. 45 μ m的濾器過濾以除去大顆粒物質(zhì)； (5) 將濾液經(jīng)12000rpm離心10 min ; (6) 棄上清，沉淀懸浮于30 μ L去離子水，并沸水浴10 min后再冰浴5min ; (7) 12000 rpm離心5min，吸取上清即得。
[0015] 本申請(qǐng)的第五個(gè)目的是提供一種適用于牛支原體PCR檢測(cè)的臨床樣品處理方法， 步驟如下： (1) 采集牛肺臟組織，不以有生命的動(dòng)物體及其離體樣品作為采集對(duì)象； (2) 將組織病料經(jīng)勻漿處理后與2倍體積的去離子水混勻； (3) 3000 rpm 離心 IOmin ; (4) 取上清并用0. 45 μ m的濾器過濾以除去大顆粒物質(zhì)； (5) 將濾液經(jīng)12000rpm離心10 min ; (6) 棄上清，沉淀懸浮于30 μ L去離子水，并沸水浴10 min后再冰浴5min ; (7) 12000 rpm離心5min，吸取上清即得。
[0016] 與現(xiàn)有牛支原體檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于： (1)本方法操作簡(jiǎn)便：本方法僅用一對(duì)引物對(duì)牛支原體進(jìn)行PCR檢測(cè)，相較以前所用的 套式PCR等技術(shù)，操作更加簡(jiǎn)便，填補(bǔ)了國內(nèi)應(yīng)用單一引物對(duì)對(duì)牛支原體進(jìn)行有效鑒別診 斷的空白。且本方法對(duì)樣品的處理亦較簡(jiǎn)單，從而便于操作。
[0017] (2)本方法特異性高：本方法所應(yīng)用的引物對(duì)特異性高，能夠有效將牛支原體與無 乳支原體等其他病原微生物進(jìn)行鑒別，而傳統(tǒng)的分離和鑒定方法，常因非特異性細(xì)菌的增 殖而影響結(jié)果的判定。套式PCR法雖然具有高特異性，但需要兩次PCR，因此耗時(shí)較長(zhǎng)。
[0018] (3)本方法敏感性高：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的牛支原體培養(yǎng)物（IO9個(gè)支原體/mL)經(jīng) IO9倍稀釋后，應(yīng)用本方法仍能檢出陽性。
[0019] (4)本方法檢測(cè)所需時(shí)間短：本方法可在2小時(shí)內(nèi)判定結(jié)果，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法則 至少需要一周以上時(shí)間。
[0020] (5)本方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定：應(yīng)用本方法對(duì)同一樣品進(jìn)行不同批次的檢測(cè)，或不同的 操作人員，其結(jié)果一致性高，因而適合大批量樣品的檢測(cè)和分析。
[0021] (6)本發(fā)明還提供了一種適用于牛支原體PCR檢測(cè)的臨床樣品處理方法，該方法 通過對(duì)臨床采集的組織材料簡(jiǎn)單處理即可用于PCR擴(kuò)增，從而簡(jiǎn)化了操作程序，縮短了整 個(gè)檢測(cè)過程所需時(shí)間，從而為及時(shí)采取措施進(jìn)行疫情的防控創(chuàng)造了先機(jī)。
【附圖說明】
[0022] 附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為本申請(qǐng)的特異性引物對(duì)的特異性分析；其中，M為DNAMarker DL5000,泳道1~8 分別為1 :牛支原體基因組；2 :絲狀支原體絲狀亞種小菌落型基因組；3 :無乳支原體基因 組；4 :雞毒支原體BG44T基因組；5 :雞毒支原體Rlow株基因組；6 :滑液支原體WUV1853株 基因組；7 :巴氏桿菌基因組；8 :空白對(duì)照。
[0023] 圖2為PCR檢測(cè)方法的敏感性分析；其中M為DNAMarker DL5000,泳道1~13分 別為l〇7mL的牛支原體培養(yǎng)液的ΙΟ?ΚΓ13的稀釋液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，N為空白對(duì)照。
[0024] 圖3為組織病料進(jìn)行的PCR擴(kuò)增；其中M :DNA Marker DL2000 ;1~7 :不同來源的 牛支原體肺炎疑似組織病料；8 :空白對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0026] 本申請(qǐng)所用特異性引物的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)為牛支原體脂蛋白P48基因，在現(xiàn)有技術(shù)已 測(cè)定的牛支原體菌株中該基因序列完全一致，其與無乳支原體的不同菌株間同源性達(dá) 89%~94%，依據(jù)牛支原體與無乳支原體P48基因之間的差異設(shè)計(jì)引物對(duì)P48-F/P48-R，并進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果效果最佳。
[0027] 下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
[0028] 實(shí)施例1引物的合成及支原體基因組的PCR擴(kuò)增 1引物合成 P48-F ：CGAACCTAAAAAGGGTGAATTAGCATCTT P48-R :ATTACTGAGTTAATAGCAGCAACTGCAACG。
[0029] 2樣品的準(zhǔn)備 1) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的牛支原體液體培養(yǎng)物lmL，加入到I. 5mL的無菌離心管中， 12000rpm 離心 IOmin ; 2) 棄上清，用15 μ L無菌超純水懸浮沉淀； 3) 將懸浮的沉淀于沸水中煮IOmin后，再冰浴3min ; 4) 12000rpm離心10min，上清即為粗提的牛支原體基因組DNA，取上清10 μ L并移入 PCR管中，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增或置-20°C保存?zhèn)溆茫?5) 雞毒支原體、滑液支原體的基因組提取如上所述，絲狀支原體絲狀亞種小菌落型基 因組和無乳支原體PG2株基因組由哈爾濱獸醫(yī)研宄所惠贈(zèng)，巴氏桿菌基因組用細(xì)菌基因組 提