BRCA1基因g.41244291delT突變及其在乳腺癌輔助診斷中的應(yīng)用
【專利說明】BRCA1基因 g. 41244291 de IT突變及其在乳腺癌輔助診斷中 的應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及BRCAl基因 g. 41244291delT突變及其 在乳腺癌輔助診斷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是全球第二大常見惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中居首位。據(jù)世界衛(wèi)生組織 國際癌癥研宄中心統(tǒng)計，2012年全球女性乳腺癌新發(fā)病例達(dá)167萬，占全部女性惡性腫瘤 發(fā)病的25%。同時乳腺癌是全球第五位常見的惡性腫瘤死亡原因，居女性惡性腫瘤死亡原 因之首，全球共52萬人因乳腺癌死亡，占所有女性惡性腫瘤死亡的14. 7%。而2012年，中 國女性乳腺癌新發(fā)病例18. 7萬，發(fā)病人數(shù)僅次于肺癌，其中4. 8萬女性因乳腺癌死亡，居女 性惡性腫瘤死亡的第六位。
[0003] 乳腺癌是具有很強(qiáng)遺傳背景的惡性腫瘤，5-10%的乳腺癌是因?yàn)閿y帶高外顯率的 乳腺癌易感基因突變所致。BRCA1，BRCA2, TP53, PALB2, PTEN，CHEK2, ATM，RAD50等被認(rèn)定 為乳腺癌易感基因，攜帶這些基因胚系突變的乳腺癌被稱為遺傳性乳腺癌，其中至少10% 的遺傳性乳腺癌是由于BRCAl突變所致。
[0004] 突變位點(diǎn)的存在被認(rèn)為賦予了個體不同的表型性狀，以及對于環(huán)境暴露、藥物治 療等因素的不同反應(yīng)性，因此突變位點(diǎn)可能是導(dǎo)致個體對常見疾病發(fā)病易感性差異的重要 遺傳基礎(chǔ)。將疾病的突變位點(diǎn)譜用于疾病的輔助診斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來，利用 突變位點(diǎn)對疾病進(jìn)行輔助診斷已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研宄熱點(diǎn)，在腫瘤、先天性疾 病和心腦血管疾病等常見重大疾病上的應(yīng)用價值已初見端倪。
[0005] 攜帶BRCAl功能性突變的個體極有可能發(fā)展為乳腺癌患者，尤其是乳腺癌家族史 攜帶者。針對突變攜帶者采取一系列的預(yù)防措施，例如較早的進(jìn)入乳腺癌篩查，并提高篩 查頻率，以及預(yù)防性手術(shù)的實(shí)施將早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌而取得較好的干預(yù)和治療效果。中國的 BRCAl基因檢測起步較晚，盡管有幾項(xiàng)相關(guān)的研宄，但是尚未發(fā)現(xiàn)足夠量的突變"熱點(diǎn)"，尤 其是中國人群特異的乳腺癌相關(guān)突變。并且由于種族差異，歐美國家的突變譜也不完全適 用于中國人群，若能篩選出乳腺癌發(fā)病相關(guān)的突變位點(diǎn)作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診 斷試劑盒，對我國乳腺癌篩查和早期診斷必將是一次有力的推動。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種具有新的突變位點(diǎn)的BRCAl突變基因。
[0007] 本發(fā)明另一個目的是提供檢測上述突變位點(diǎn)的特異性引物。
[0008] 本發(fā)明第三個目的是提供上述BRCAl突變基因及特異性引物在制備乳腺癌輔助 診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明第四個目的是提供一種乳腺癌輔助診斷試劑盒。
[0010] 發(fā)明人通過分離和研宄乳腺癌患者及與其年齡匹配的健康對照外周血DNA中的 突變，尋找與乳腺癌相關(guān)的高特異性的突變位點(diǎn)，并研制出可臨床或人群應(yīng)用的乳腺癌輔 助診斷試劑盒，為乳腺癌的篩查和診斷提供支持。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 一種用于乳腺癌輔助診斷的BRCAl突變基因，該突變基因與BRCAl正?；蛐蛄?相比具有g(shù). 41244291delT位點(diǎn)移碼突變。
[0013] 用于檢測上述BRCAl基因的突變位點(diǎn)的特異性測序引物，其上游引物的序列如為 SEQ ID NO. 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 用于檢測上述BRCAl基因的檢測方法，該方法采用Sanger測序方法，使用PCR擴(kuò) 增引物，對BRCAl基因進(jìn)行突變檢測；其中PCR擴(kuò)增引物的上游引物的序列如為SEQ ID NO. 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0015] 上述的BRCAl突變基因在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0016] 上述的引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0017] -種乳腺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測BRCA1基因是否具有 g. 41244291delT位點(diǎn)移碼突變。
[0018] 所述的試劑盒，該試劑盒含有上述引物（上游引物的序列如為SEQ ID NO. 3所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示），該試劑盒還可以含有PCR技術(shù)所需的常用試劑。
[0019] 具體地說
[0020] 本發(fā)明采用Sanger測序技術(shù)在70例具有乳腺癌家族史的中國漢族女性乳腺癌患 者中，我們發(fā)現(xiàn)有1例患者存在BRCAl基因組第17號染色體的41244291位置發(fā)生T堿基 的缺失；隨后進(jìn)行無家族史乳腺癌樣本驗(yàn)證，在3000例無家族史中國漢族乳腺癌女性乳腺 癌患者中，存在8例患者攜帶該突變；在3000例無腫瘤家族史，年齡匹配的正常女性對照人 群中，未發(fā)現(xiàn)突變個體。因此，該突變對乳腺癌的陽性預(yù)測值為100%，人群家族性乳腺癌患 者中發(fā)生率為1. 43%，散發(fā)性乳腺癌中發(fā)生率為0. 27%。為進(jìn)一步提高該突變致乳腺癌的 可靠性，我們在2004年建立的中國漢族正常人群隊(duì)列（排除任何腫瘤患者，排除乳腺癌家 族史患者）中女性7120名（36歲-70歲）檢測該突變，發(fā)現(xiàn)突變陽性1例（基線時為52 歲），隨訪至2013年，共發(fā)生25例新發(fā)乳腺癌患者，其中包含該突變陽性者。該突變位點(diǎn)為 本研宄首次在中國漢族女性乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，且在正常人群中不存在該突變，通過納入 前瞻性隊(duì)列研宄，證明了攜帶該突變的患者最終發(fā)展成了乳腺癌，證明了該位點(diǎn)是乳腺癌 的致病因素。
[0021] 以上研宄所發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌輔助診斷相關(guān)的突變位點(diǎn)為g. 41244291delT，該突變 發(fā)生于第17號染色體的41244291位置，該基因在NCBI參考數(shù)據(jù)庫GRCh37. pl3中的編號 為NC_000017. 10(41196312-41277500)，這里列出在該數(shù)據(jù)庫中本突變位點(diǎn)前后IOObp的 堿基序列供參考，如SEQ ID NO: 1所示，BRCAl基因突變序列對應(yīng)的序列如SEQ IDNO:2所 示，其中突變位點(diǎn)為在SEQ ID NO: 1序列的第101位由堿基T缺失發(fā)生移碼突變。
[0022] SEQ ID NO: 1
[0023] GAAGTGGGCTCCAGTATTAATGAAATAGGTTCCAGTGATGAAAACATTCAAGCAGAACTAGGTAGAAAC AGAGGGCCAAAATTGAATGCTATGCTTAGAT1AGGGGTTTTGCAACCTGAGGTCTATAAACAAAGTCTTCCTGGAAG TAATTGTAAGCATCCTGAAATAAAAAAGCAAGAATATGAAGAAGTAGTTCAGACT
[0024] SEQ ID NO:2
[0025] GAAGTGGGCTCCAGTATTAATGAAATAGGTTCCAGTGATGAAAACATTCAAGCAGAACTAGGTAGAAAC AGAGGGCCAAAATTGAATGCTATGCTTAGAT[-]AGGGGTTTTGCAACCTGAGGTCTATAAACAAAGTCTTCCTGGA AGTAATTGTAAGCATCCTGAAATAAAAAAGCAAGAATATGAAGAAGTAGTTCAGACT
[0026] 本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：（I)篩選出人群中BRCAl與乳腺癌發(fā)生相關(guān)的 新突變，提供位點(diǎn)的突變后堿基序列（2)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫：以標(biāo)準(zhǔn)操作程 序（SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。（3)突變篩選 和驗(yàn)證其作用：采用Sanger測序技術(shù)在70例具有乳腺癌家族史的中國漢族女性乳腺癌患 者中，我們發(fā)現(xiàn)有1例患者存在BRCAl基因的基因組序列中41244291位置T堿基發(fā)生缺失 導(dǎo)致移碼突變；隨后進(jìn)行無家族史乳腺癌樣本驗(yàn)證，在3000例無家族史中國漢族女性乳腺 癌患者中，存在8例患者攜帶該突變；在3000例無腫瘤家族史，年齡匹配的中國漢族正常女 性對照人群中，未發(fā)現(xiàn)突變個體。我們在2004年建立的中國漢族正常人群隊(duì)列（排除任何 腫瘤患者，排除乳腺癌家族史患者）中女性7120名（36歲-70歲）檢測該突變，發(fā)現(xiàn)突變 陽性1例（基線時為52歲），隨訪至2013年，共發(fā)生25例新發(fā)乳腺癌患者，其中包含該突 變陽性者。（4)對篩選出的突變位點(diǎn)，需要滿足在正常人群中無頻率。（5)乳腺癌輔助診斷 試劑盒的研制：根據(jù)乳腺癌病例所獨(dú)有的突變位點(diǎn)開發(fā)突變位點(diǎn)輔助診斷試劑盒。
[0027] 本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口 學(xué)資料、臨床資料等，并采用了 Sanger測序?qū)RCAl基因的外顯子編碼區(qū)域進(jìn)行掃描。
[0028] 具體來說研宄的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個部分：
[0029] 1.研宄樣本的選擇（均為中國漢族）
[0030] (1)經(jīng)病理學(xué)明確診斷的具有乳腺癌家