族史的乳腺癌病例;
[0031] (2)經(jīng)病理學明確診斷的散發(fā)型乳腺癌病例;
[0032] (3)與病例年齡匹配的健康女性對照;
[0033] (4)社區(qū)來源的全人群隊列樣本;
[0034] 本研宄共采用13190例符合標準的樣本進行研宄。
[0035] 2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA,按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/ μ 1DNA,純度(紫外 2600D 與 2800D 比值)在 1. 6-2. 0。
[0036] 3. Sanger測序技術篩選突變位點
[0037] (1)取受試者全基因組DNA樣本;
[0038] (2)采用Primer 3軟件在線設計引物;
[0039] (3)采用Sanger測序?qū)RCAl基因的外顯子編碼區(qū)進行掃描;
[0040] (4)檢測并比較各基因型在乳腺癌病例與健康女性對照中的分別差異。
[0041] 4.單個突變位點采用Sanger測序平臺進行基因分型
[0042] (1)取受試者DNA樣本;
[0043] (2)采用Primer 3軟件在線設計引物;
[0044] (3)采用Sanger測序?qū)RCAl基因突變的外顯子編碼區(qū)進行掃描;
[0045] (4)檢測并比較乳腺癌病例與健康女性對照中不同基因型的分布差異。
[0046] 5.診斷試劑盒制備方法
[0047] 采用Sanger測序?qū)RCAl基因的外顯子編碼區(qū)進行掃描和單個突變位點檢測后 確定乳腺癌病例與健康對照中基因型分布差異的突變位點,作為乳腺癌診斷的指標。最后 篩選出的與乳腺癌發(fā)病有關的突變位點組成輔助診斷試劑盒(g. 41244291delT)。診斷試劑 可以包括該突變位點的特異性引物以及Taq酶、dNTP等試劑。
[0048] 6.統(tǒng)計分析方法
[0049] 運用卡方檢驗(用于分類變量)或者student t檢驗(用于連續(xù)性變量)比較人 口學特征等在研宄對象組間分布的差異。
[0050] 統(tǒng)計學分析均通過專門的統(tǒng)計學分析軟件完成(PLINK1. 07)。統(tǒng)計學顯著性水平 P值設為〇. 05,所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側(cè)檢驗。
[0051] 以下是本發(fā)明進一步的說明:
[0052] 在上述70例有家族史的乳腺癌病例中我們采用Sanger測序?qū)RCAl基因的外顯 子編碼區(qū)進行掃描得相關結(jié)果。
[0053] 根據(jù)Sanger測序檢測結(jié)果,本發(fā)明人檢測到在"乳腺癌病例"組中的1名患者存 在 g. 41244291delT 突變。
[0054] 根據(jù)上述檢測結(jié)果,我們將這個與乳腺癌發(fā)病相關的突變位點在中國漢族無家族 史乳腺癌樣本驗證,在3000例中國漢族無家族史乳腺癌患者中,存在8例患者攜帶該突變; 在3000例無腫瘤家族史,年齡匹配的中國漢族正常女性對照人群中,未發(fā)現(xiàn)突變個體。
[0055] 在3000例散發(fā)性中國漢族乳腺癌患者中,存在8例患者攜帶該突變;在3000例中 國漢族正常人群中,未發(fā)現(xiàn)突變個體。進一步在隊列人群中對該突變位點用于乳腺癌診斷 的效果進行評價,發(fā)現(xiàn)其能夠進行乳腺癌的早期診斷,且在正常人群中無突變個體。
[0056] 根據(jù)上述實驗結(jié)果,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一個能用于乳腺癌輔助診斷的突變位點。
[0057] 具體而言,該突變位點的堿基序列的改變有助于乳腺癌的輔助診斷,為臨床醫(yī)生 快速準確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴重程度,及時采取更具個性化的防治方案提供支 持。
[0058] 本發(fā)明有益效果:
[0059] 本發(fā)明提供的突變位點序列改變作為乳腺癌輔助判斷的標志物的優(yōu)越性在于:
[0060] (1)突變位點是一種新型基因生物標志物,區(qū)別于傳統(tǒng)生物標志物,穩(wěn)定、微創(chuàng)、易 于檢測,將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性,該類生物標志物的成功開發(fā)將為乳腺癌 的診斷和治療開創(chuàng)全新局面,為其他疾病生物標志物的研制提供借鑒。
[0061] (2)采用嚴密的驗證和評價體系,本發(fā)明人初期采用Sanger測序?qū)RCAl基因的 外顯子編碼區(qū)進行掃描以獲取疾病相關的突變位點譜,并應用Sanger測序方法在大樣本 散發(fā)型中國漢族乳腺癌患者中進行了驗證;以上方法和策略的應用加速和保證了突變位點 生物標志物和診斷試劑盒在臨床上的應用,也為其他疾病生物標志物的研制提供方法和策 略上的借鑒。該突變位點為本研宄首次在中國漢族女性乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn),且在正常人群 中不存在該突變,數(shù)據(jù)庫顯示歐美人群該區(qū)域的掃描也未發(fā)現(xiàn)該突變位點。通過納入前瞻 性隊列研宄,證明了攜帶該突變的患者最終發(fā)展成了乳腺癌,證明了該位點是乳腺癌的致 病因素。
[0062] 本發(fā)明通過控制年齡對疾病發(fā)展的影響因素,研宄突變位點在乳腺癌輔助診斷的 應用前景,闡述突變位點對于乳腺癌進展的影響,揭示其診斷價值。因此,本發(fā)明獲得了乳 腺癌發(fā)病相關突變位點譜和特異性標志物;通過突變位點序列的改變進行相關診斷試劑 盒的研制和應用,可使得乳腺癌的診斷更加方便易行,為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情, 為臨床治療效果評價奠定基礎,并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫 助。
【具體實施方式】
[0063] 實施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0064] 發(fā)明人于2004年開始至2013年從南京醫(yī)科大學腫瘤中心及社區(qū)正常人群中收集 了大量的中國漢族女性乳腺癌患者及正常人群的血標本,通過對樣品資料的整理,發(fā)明人 從中選擇了符合下列標準的樣本Sanger測序掃描分型的實驗樣品:
[0065] 1、病理學明確診斷的具有乳腺癌家族史的乳腺癌患者70例;
[0066] 2、病理學明確診斷的無家族史散發(fā)型乳腺癌患者3000例;
[0067] 3、無腫瘤家族史,與病例年齡匹配的健康女性對照3000例;
[0068] 4、社區(qū)來源的全人群隊列中的女性樣本7120例。
[0069] 并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。
[0070] 實施例2外周血DNA中突變位點的測序掃描
[0071] 在上述70例有家族史的乳腺癌患者和健康對照中,采用Sanger測序檢測獲得相 關結(jié)果,測序過程遵循Sanger測序的標準操作,人工設計Sanger測序引物,引物序列為F: 5'-GGCAACGAAACTGGACTCAT-3'(SEQIDNO:3)*R:5'-TGTGTATGGGTGAAAGGGCT-3'(SEQID N0:4),引物序列由南京金斯瑞公司合成(詳見表1)。
[0072] 具體步驟為:
[0073] 1、向儲存于2ml凍存管中的白細胞加入溶血試劑(即裂解液,40份量配置方法如 下:鹿糖219. 72g、氯化鎂2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合后,用TrisHcl溶 液定容至2000ml,下同),顛倒混勾后完全轉(zhuǎn)入。
[0074] 2、去除紅細胞:用溶血試劑將5ml離心管補至4ml,顛倒混勾,4000rpm離心10分 鐘,棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次,4000rpm離心10分鐘,棄 上清。
[0075] 3、抽提DNA :向沉淀中加 Iml抽提液(每300ml中含有122. 5ml 0. 2M氯化鈉, 14. 4ml 0.5M乙二胺四乙酸,15ml 10%十二烷基硫酸鈉,148. Iml雙蒸水,下同)和8μ1蛋 白酶Κ,震蕩器上充分震蕩混勻,37°C水浴過夜。
[0076] 4、去除蛋白質(zhì):加 Iml飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘, 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿:異戊 醇=24 :1,v/v,下同),充分混勾后(手搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘,取上清(分入 兩個I. 5ml的離心管)。
[0077] 5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1,再加入與上清液等體積的冰無 水乙醇,上下輕搖,可見白色絮狀沉淀物,再以12000rpm離心10min。
[0078] 6、DNA洗絳:在沉淀中加入冰無水乙醇lml, 12000rpm離心10min,棄上清后真空 抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0079] 7、測量濃度:通常能得到20-50ng/ μ I DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在 1. 6~2, 0〇
[0080] 8、PCR反應體系30微升,包括:模板50ng ;引物F : 1微升和引物R : 1微升;2 X MIX 15微升;H2O補足至30微升。
[0081] 9、PCR 反應程序:95 °C 5min ; (95 °C 30s ;56 °C 30s ;72 °C 30s) X40 個循環(huán); 72°C 6min ;4°C 保存。
[0082] 10、采用ABI3730平臺進行Sanger測序;
[0083] 11、使用〇11'〇11^82軟件進行