本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種特異性好、靈敏度高的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志的引物及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：中藥鑒定的主要內(nèi)容為中藥材及其基元的鑒定，也包括飲片、提取物和中成藥的中藥成分鑒定，中藥的準(zhǔn)確鑒定是中藥事業(yè)運(yùn)行和發(fā)展的基本環(huán)節(jié)。以往對(duì)于中藥的檢測(cè)是根據(jù)形態(tài)和顯微鏡下特征進(jìn)行分類與鑒定，鑒定周期長(zhǎng)、時(shí)效性差。隨著各種先進(jìn)儀器以及分子生物學(xué)的發(fā)展，新的鑒別方法亦紛紛推出，如光譜鑒別、色譜鑒別、實(shí)時(shí)熒光PCR及DNA分子標(biāo)記鑒別和蛋白質(zhì)檢測(cè)等等。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)是將傳統(tǒng)PCR檢測(cè)模式中的PCR擴(kuò)增和檢測(cè)相結(jié)合（即在同一個(gè)密閉容器中將PCR擴(kuò)增反應(yīng)與熒光染料檢測(cè)結(jié)合在一起），即在每一個(gè)PCR循環(huán)后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，可以得到每個(gè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變化曲線。通過分析這些反應(yīng)曲線，可以得出待測(cè)物的定性、定量檢測(cè)結(jié)果，不僅具有普通PCR的高靈敏性，還具有高特異性和高精確性。然而，對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)其PCR擴(kuò)增引物及具體檢測(cè)方法尤為重要，不同的引物及檢測(cè)方法所得到的檢測(cè)結(jié)果截然不同。迄今為止，還沒有關(guān)于特異性好、靈敏度高的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志的引物及檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種特異性好、靈敏度高的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志的引物及檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志的引物，其特征在于所述引物的DNA序列如下：上游引物：5’-AATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-CAAGAGATGAGGCGAAGGC-3’。一種上述實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志的引物的檢測(cè)方法，其特征在于：反應(yīng)體系為：2X濃度的SYBR?PremixExTaq12.5μL濃度為10μmol/L的上游引物0.25μL濃度為10μmol/L的下游引物0.25μL濃度<50ng的待檢樣品的DNA模板1μL雙蒸水11μL；反應(yīng)參數(shù)為：變性，95℃，30s；擴(kuò)增，95℃，5s、60℃，30s；循環(huán)次數(shù)30；30個(gè)循環(huán)以下產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線即為遠(yuǎn)志。本發(fā)明PCR引物設(shè)計(jì)合理，用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，可以檢測(cè)出來(lái)自遠(yuǎn)志的微量DNA，完全將遠(yuǎn)志與其它中藥材的ITS2基因進(jìn)行區(qū)分，檢測(cè)特異性好、靈敏度高，方法快速，易操作。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例的引物PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例實(shí)時(shí)熒光PCR的溶解曲線檢測(cè)結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志與其它中草藥的結(jié)果圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例靈敏度分析結(jié)果圖。具體實(shí)施方式一.實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志引物序列的設(shè)計(jì)1.遠(yuǎn)志相近物種ITS2序列分析登錄NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），以Polygalatenuifolia及ITS2為關(guān)鍵詞在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，將搜索結(jié)果的序列下載存盤后，進(jìn)行BlastN程序在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性序列的搜索，并將所有相似性序列下載存盤。2.遠(yuǎn)志物種特異性檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)將下載的序列進(jìn)行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差異處設(shè)計(jì)特異性引物：上游引物：5’-AATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-CAAGAGATGAGGCGAAGGC-3’；二.遠(yuǎn)志ITS2序列的克隆及測(cè)序驗(yàn)證1.遠(yuǎn)志物種特異性檢測(cè)引物合成在上海生工生物工程有限公司合成遠(yuǎn)志物種特異性檢測(cè)引物1對(duì)，其DNA序列為：上游引物：5’-AATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-CAAGAGATGAGGCGAAGGC-3’；2.遠(yuǎn)志DNA的提取采用DNA提取試劑盒（購(gòu)于寶生物公司）提取遠(yuǎn)志（安國(guó)市藥源中藥材有限公司商品，產(chǎn)地四川）模板DNA，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取遠(yuǎn)志模板DNA的濃度為100ng左右；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：以合成的特異性引物PCR擴(kuò)增遠(yuǎn)志模板DNA的后，以2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。圖1中：M.DL2000marker；1~5.引物擴(kuò)增結(jié)果；6.水對(duì)照。表明經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，分別產(chǎn)生143bp的特異性電泳條帶，電泳效果最好，PCR擴(kuò)增效率高。片段的切膠回收：采用寶生物公司的DNA片段回收試劑盒將目的條帶回收及純化，操作過程按試劑盒附帶的說(shuō)明書進(jìn)行。回收片段的連接、克隆及測(cè)序：回收片段與克隆載體pMD-19T連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌株送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果采用NCBI的BlastN程序通過序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果確定所克隆的目的片段的序列為遠(yuǎn)志ITS2序列。三.實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志的方法25μL反應(yīng)體系為：2X濃度的SYBR?PremixExTaq12.5μL濃度為10μmol/L的上游引物（SEQIDNO.1）0.25μL濃度為10μmol/L的下游引物（SEQIDNO.2）0.25μL濃度<50ng的待檢樣品的DNA模板1μL雙蒸水11μL反應(yīng)參數(shù)為：變性，95℃，30s；擴(kuò)增，95℃，5s、60℃，30s；循環(huán)次數(shù)30；30個(gè)循環(huán)以下產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線即為遠(yuǎn)志。本發(fā)明實(shí)施例與水對(duì)照、空白對(duì)照的特異性擴(kuò)增曲線檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。圖2中：1.遠(yuǎn)志、2.水對(duì)照、3.空白對(duì)照。將本發(fā)明實(shí)施例與水對(duì)照、空白對(duì)照的溶解曲線檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。圖3中：1.遠(yuǎn)志、2.水對(duì)照、3.空白對(duì)照。結(jié)果證明了本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增具有有效性及特異性。四.本發(fā)明實(shí)施例檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)：采用DNA提取試劑盒提取下表所示各待測(cè)樣品的模板DNA，用微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)所提取的模板DNA的濃度為50ng，除模板DNA外，其它按照本發(fā)明實(shí)施例所述實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志的方法實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)梔子等其它中藥材，結(jié)果如圖4所示。圖4中圖中：1、2、3分別代表ZY1、ZY2、ZY3，4代表ZY4-ZY30的擴(kuò)增曲線，5為及水對(duì)照，6為空白對(duì)照。樣品編號(hào)樣品名稱來(lái)源/產(chǎn)地ZY1遠(yuǎn)志安國(guó)市藥源中藥材有限公司·四川ZY2遠(yuǎn)志安國(guó)市藥源中藥材有限公司·甘肅ZY3甘草進(jìn)口ZY4梔子毫州市大西北藥業(yè)有限責(zé)任公司·安徽省毫州市ZY5龍膽草安國(guó)市藥源中藥材有限公司·吉林ZY6知母安國(guó)市藥源中藥材有限公司·河北ZY7黃芩安國(guó)市藥源中藥材有限公司·河北ZY8黃連安國(guó)市藥源中藥材有限公司·四川ZY9肉蓯蓉徐州醫(yī)藥股份有限公司中藥飲片廠ZY10肉蓯蓉石家莊市誠(chéng)信中藥材有限公司ZY11管花肉蓯蓉山東嘉泰中藥飲片有限公司ZY12肉蓯蓉毫州市永剛飲片廠有限公司ZY13仙茅安國(guó)市藥源中藥材有限公司·廣西ZY14鎖陽(yáng)安國(guó)市藥源中藥材有限公司·內(nèi)蒙古ZY15枸杞子寧夏中寧縣枸杞開發(fā)有限公司ZY16菟絲子安國(guó)市藥源中藥材有限公司·內(nèi)蒙古ZY17地黃安國(guó)市藥源中藥材有限公司·河南ZY18黃柏安國(guó)市ZY19黃柏吉林省北藥藥材加工有限公司ZY20關(guān)黃柏黑龍江ZY21纈草毫州市永剛飲片廠有限公司ZY22金銀花安國(guó)市藥源中藥材有限公司·廣西ZY23枇杷安國(guó)市藥源中藥材有限公司·內(nèi)蒙古ZY24桔梗寧夏中寧縣枸杞開發(fā)有限公司ZY25鐵皮石斛杭州然電子商務(wù)有限公司·云南ZY26石斛廣州ZY27草決明北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司·安徽Z(yǔ)Y28天花粉安國(guó)市藥源中藥材有限公司·河南ZY29麥冬安國(guó)市藥源中藥材有限公司·四川ZY30百合安國(guó)市藥源中藥材有限公司·甘肅結(jié)果表明：產(chǎn)生的30個(gè)循環(huán)以下的特異性擴(kuò)增曲線即為遠(yuǎn)志，其他樣品在30個(gè)循環(huán)以后出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或沒有擴(kuò)增曲線，說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確的對(duì)遠(yuǎn)志的成分進(jìn)行鑒定，具有很好的特異性。五.本發(fā)明實(shí)施例檢測(cè)方法的靈敏度檢測(cè)采用DNA提取試劑盒提取遠(yuǎn)志樣品（安國(guó)市藥源中藥材有限公司·四川）的模板DNA，用微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)所提取的模板DNA梯度稀釋，制備成25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL5個(gè)濃度梯度樣品，分別按照上述反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，以確定本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)靈敏度，結(jié)果如圖5所示。圖5中：1、25ng/μL擴(kuò)增結(jié)果；2、5ng/μL擴(kuò)增結(jié)果；3、1ng/μL擴(kuò)增結(jié)果；4、0.2ng/μL擴(kuò)增結(jié)果；5、0.04ng/μL擴(kuò)增結(jié)果；6、空白對(duì)照。結(jié)果表明：所產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線即為遠(yuǎn)志，當(dāng)DNA濃度≥0.04ng/μL時(shí)均可以特異擴(kuò)增，即該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)靈敏度為0.04ng/μL。說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確的對(duì)遠(yuǎn)志的成分進(jìn)行鑒定，具有很好的靈敏度。序列表<110>遼寧師范大學(xué)<120>實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)遠(yuǎn)志的引物及檢測(cè)方法<130>2016<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>上游引物<400>1aatgcgatacttggtgtgaattg23<210>2<211>19<212>DNA<213>下游引物<400>2caagagatgaggcgaaggc19當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3