本發(fā)明涉及一種細(xì)菌基因指紋圖譜的制備方法，具體的說涉及一種應(yīng)用LH-PCR技術(shù)制備細(xì)菌性陰道病的細(xì)菌基因指紋圖譜的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)是由細(xì)菌引起的陰道感染，是育齡期女性常見的下生殖道感染性疾病，其可引發(fā)多種不良妊娠結(jié)局，如自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、羊水感染、產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎和剖腹產(chǎn)切口感染及圍產(chǎn)兒并發(fā)癥等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌性陰道病的復(fù)發(fā)和持續(xù)感染還能增加滴蟲性陰道炎、白假絲酵母菌性陰道炎、宮頸癌和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的風(fēng)險(xiǎn)。

目前對細(xì)菌性陰道病的病因，特別是對細(xì)菌性陰道病患者的陰道菌群構(gòu)成的差異，缺乏深入研究。以往使用的培養(yǎng)法并不能全面地反映陰道菌群的構(gòu)成，導(dǎo)致對細(xì)菌性陰道病患者的病原菌研究受到局限，有時(shí)患者臨床評價(jià)雖已是治愈狀態(tài)，但其陰道菌群構(gòu)成卻還沒有恢復(fù)到正常狀態(tài)，致病菌仍存在，此時(shí)如僅通過臨床評價(jià)停止治療，則會導(dǎo)致細(xì)菌性陰道病復(fù)發(fā)，耽誤疾病治療，增加疾病的復(fù)發(fā)率。

隨著近20年來分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使用分子生物學(xué)方法研究細(xì)菌性陰道病復(fù)發(fā)的機(jī)理和細(xì)化診斷臨床不同細(xì)菌性陰道病亞型成為一種趨勢，人們對細(xì)菌性陰道病的菌群結(jié)構(gòu)研究也在不斷深入。長度多態(tài)片段PCR(length heterogeneity PCR，LH-PCR)是運(yùn)用熒光標(biāo)記的探針來決定來源于不同微生物擴(kuò)增序列的相對數(shù)量，帶標(biāo)記的片段通過毛細(xì)管電泳被分離出來，而后被一個(gè)帶有熒光性的自動基因序列分析儀所監(jiān)測到。LH-PCR是一種分析微生物結(jié)構(gòu)的方法，其原理是由于基因或基因操縱子的插入或剪切造成某些特定基因固有長度呈現(xiàn)多態(tài)性。因此，可以利用這種多態(tài)性來確定微生物的種群信息。LH-PCR測定的超變量區(qū)域主要存在于核糖體的小亞基(rrn)。

LH-PCR作為一種基于PCR的分子指紋圖譜技術(shù)，其與高通量測序技術(shù)相比具有技術(shù)操作靈敏，快速簡單，成分低廉等的優(yōu)點(diǎn)。但是，目前尚未有將該技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是將其作為一種疾病的診斷技術(shù)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用LH-PCR技術(shù)，制備細(xì)菌性陰道病的細(xì)菌基因指紋圖譜的方法，以及應(yīng)用該細(xì)菌基因指紋圖譜精確判斷樣品中是否存在細(xì)菌性陰道病致病菌群的用途。本發(fā)明所述的細(xì)菌基因指紋圖譜能用于細(xì)菌性陰道病的臨床快速診斷，避免傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)的診斷不準(zhǔn)確、操作繁瑣、耗時(shí)長、工作量大以及高通量測序價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確、快速有效地檢測陰道內(nèi)的菌群分布狀況。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種細(xì)菌性陰道病的LH-PCR細(xì)菌基因指紋圖譜的制備方法，其中所述細(xì)菌為陰道內(nèi)細(xì)菌，所述基因?yàn)?6S rRNA基因。

進(jìn)一步的，所述細(xì)菌性陰道病的LH-PCR細(xì)菌基因指紋圖譜的制備方法，是對擴(kuò)增片段長度為310-380bp的基因片斷進(jìn)行分析。

更進(jìn)一步的，所述細(xì)菌性陰道病的LH-PCR細(xì)菌基因指紋圖譜的制備方法，其中當(dāng)片段長度340-374bp中的任何一個(gè)片斷的相對峰面積大于10％時(shí)，確定為有細(xì)菌性陰道病致病菌群存在；當(dāng)片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積都小于10％，確定為正常菌群，沒有細(xì)菌性陰道病致病菌群存在。

優(yōu)選的，所述細(xì)菌性陰道病的LH-PCR細(xì)菌基因指紋圖譜的制備方法，其中LH-PCR的引物為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'的5'端用FAM熒光標(biāo)記。

進(jìn)一步的，所述細(xì)菌性陰道病的LH-PCR細(xì)菌基因指紋圖譜的制備方法，包括：

1.提取陰道分泌物的細(xì)菌基因組DNA；

2.對細(xì)菌基因組DNA中的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，和

5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'端用FAM熒光標(biāo)記；

PCR的反應(yīng)體系(50μL)：10×緩沖液5μL，dNTPs1μL，引物各1.5μL，DNA聚合酶1μL，BSA2.5μL，模板DNA1μL，ddH₂O補(bǔ)足50μL；同時(shí)設(shè)置不添加模板的陰性對照；

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后于4℃恒溫保存；

3.毛細(xì)管電泳LH-PCR產(chǎn)物：

將所述PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行富集，收集300-400bp的片斷；然后用Qiagen凝膠回收純化，并與Hi-Di甲酰胺及GS500 Liz內(nèi)部尺寸標(biāo)準(zhǔn)混合，混合物在PCR儀中在95℃下變性5min，再進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，注射時(shí)間為10s，注射和運(yùn)行電壓為15.0kV，運(yùn)行溫度為60℃，運(yùn)行時(shí)間為70min；

4.毛細(xì)管電泳圖譜的分析

將樣品的指紋電泳圖譜用GeneScan 3.7進(jìn)行收集，LH-PCR數(shù)據(jù)運(yùn)用BioNumerics 6.0軟件進(jìn)行處理，對擴(kuò)增片段長度為310-380bp的片斷進(jìn)行分析。

優(yōu)選的，所述細(xì)菌性陰道病的LH-PCR細(xì)菌基因指紋圖譜的制備方法，其中所述細(xì)菌的種類選自Mycobacterium、Ureaplasma、Mycoplasma、Sneathia、Corynebacterium、Atopobium、Gardnerella、Mobiluncus、Prevotella、Actinomyces、Staphylococcus、Anaerococcus、Peptoniphilus、Megasphaera、Lactobacillus。

優(yōu)選的，所述細(xì)菌性陰道病的LH-PCR細(xì)菌基因指紋圖譜的制備方法，其中所述細(xì)菌種類和對應(yīng)的擴(kuò)增片段長度為：

本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述制備方法制備的細(xì)菌基因指紋圖譜在診斷細(xì)菌性陰道病中的用途。

本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述制備方法制備的細(xì)菌基因指紋圖譜在判斷樣品中是否存在細(xì)菌性陰道病致病菌群中的用途。

本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述制備方法制備的細(xì)菌基因指紋圖譜在判斷樣品中是否存在Mycobacterium、Ureaplasma、Mycoplasma、Sneathia、Corynebacterium、Atopobium、Gardnerella、Mobiluncus、Prevotella、Actinomyces、Staphylococcus、Anaerococcus、Peptoniphilus、Megasphaera、Lactobacillus細(xì)菌中的應(yīng)用。

任何的指紋圖譜技術(shù)都是為了提供一個(gè)菌群的整體情況，而不是區(qū)分每個(gè)單獨(dú)的菌種。因此，其主要是反映出環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)的演變或差異，以分析出疾病狀態(tài)與菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。LH-PCR通過分析峰形變化，較容易跟蹤菌群結(jié)構(gòu)的變化，可以精確的分析出陰道分泌物的菌群結(jié)構(gòu)，可對主要致病菌進(jìn)行分類與鑒定。且該方法操作相對簡單，較少的操作步驟減少了誤差產(chǎn)生概率，因此重現(xiàn)性非常好。此外，LH-PCR與高通量測序及其他指紋圖譜技術(shù)如T-RFLP(末端限制性酶切多態(tài)性檢測，Terminal restriction fragment length polymorphism)相比，PCR產(chǎn)物不需要進(jìn)行限制性酶切，可以直接進(jìn)行基因分析，即可得到微生物種群的構(gòu)成信息，具有成本低，操作簡便快速的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)相對于Amsel標(biāo)準(zhǔn)和Nugent評分來說又可以精確的分析出陰道分泌物的菌群結(jié)構(gòu)，因此可作為分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于臨床分析陰道菌群變化，在臨床上可通過構(gòu)建不同的LH-PCR圖譜對疾病狀態(tài)進(jìn)行分類診斷。

附圖說明

圖1：D0組(0)、SG-D7組(1)、FG-D7組(2)、SG-D30組(3)、FG-D30組(4)5組樣品的LH-PCR特征峰的主成分分析結(jié)果(Principal Component Analysis，PCA)。

圖2：D0組(0)、SG-D7組(1)、FG-D7組(2)、SG-D30組(3)、FG-D30組(4)5組樣品的LH-PCR特征峰；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖3：實(shí)施例2患者1用藥前(D0)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖4：實(shí)施例2患者1用藥后7天(D7)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖5：實(shí)施例2患者1用藥后30天(D30)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖6：實(shí)施例2患者2用藥前(D0)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖7：實(shí)施例2患者2用藥后7天(D7)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖8：實(shí)施例2患者2用藥后30天(D30)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

具體實(shí)施方式

下面實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識到在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下所作的改動，均屬于本發(fā)明的范圍。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自：天根生化科技有限公司。

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS15.0(Chicago，IL，USA)進(jìn)行分析，如果P<0.05，說明數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

實(shí)施例1：應(yīng)用LH-PCR技術(shù)制備細(xì)菌性陰道病的細(xì)菌基因指紋圖譜

1.研究對象及標(biāo)準(zhǔn)：

1.1 研究對象：選取63例診斷為細(xì)菌性陰道病的育齡期女性，規(guī)范使用甲硝唑凝膠治療5天，并在用藥前(0天)、用藥后7天、用藥后30天取樣。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)：采用Amsel臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和Nugent實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷細(xì)菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)。所有的分泌物涂片均由微生態(tài)實(shí)驗(yàn)室2名有經(jīng)驗(yàn)的微生物專家判讀。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)：

①妊娠期、哺乳期和絕經(jīng)期女性

②因其他疾病長期服用激素類藥物者

③服用免疫抑制劑者

④有心、肝、腎、內(nèi)分泌等內(nèi)科疾病者(主要通過問診)

⑤患有滴蟲、外陰陰道白假絲酵母菌病等其它陰道感染者

⑥甲硝唑過敏者

⑦依從性差者

1.4 隨訪時(shí)間：對入組的BV患者進(jìn)行兩次隨訪，分別為用藥后7天、用藥后30天。記錄患者每次就診時(shí)的癥狀、體征、pH值及Nugent評分。

1.5 治療方法和治愈標(biāo)準(zhǔn)：入組的BV患者使用甲硝唑凝膠(37.5mg，qd，陰道上藥)，連續(xù)給藥5天。在用藥后第7天和第30天分別隨訪，評價(jià)治療效果。治愈標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)滿足微生態(tài)評價(jià)痊愈標(biāo)準(zhǔn)和臨床評價(jià)痊愈標(biāo)準(zhǔn)為治愈。微生態(tài)評價(jià)痊愈標(biāo)準(zhǔn)：Nugent評分0-3分。臨床痊愈標(biāo)準(zhǔn)：陰道分泌物性狀正常，Whiff試驗(yàn)陰性，線索細(xì)胞消失，陰道分泌物pH值<4.5。

2.樣品制備：

2.1.樣本采集：分別用兩個(gè)無菌棉拭子從研究對象陰道側(cè)壁上1/3處取得陰道分泌物，一個(gè)迅速放入含有1ml PBS(pH:7.4)無菌離心管中，放于-80℃超低溫冰箱以便基因組提取。另一個(gè)均勻涂在載玻片上，行革蘭染色，油鏡下觀察，進(jìn)行Nugent評分。

2.2.細(xì)菌基因組DNA的提取(應(yīng)用天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組提取劑盒及其內(nèi)試劑)：

1)取凍存陰道分泌物，10000rpm(約11500×g)離心1min，盡量吸凈上清。

2)加入180μl緩沖液(20mM Tris，pH 8.0；2mMNa2-EDTA；1.2％Triton)；終濃度為20mg/ml的溶菌酶(溶菌酶用溶菌酶干粉溶解在緩沖液中進(jìn)行配制)，37℃處理30min以上。

3)向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混勻。

4)加入220μl緩沖液GB，振蕩15sec，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

5)加220μl無水乙醇，充分振蕩混勻15sec，出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(約13400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm(約13400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm(約13400×g)離心30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。

9)重復(fù)操作步驟8。

10)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(約13400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液(這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn))。

11)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm(約13400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。

12)加入4μl RNase A(100mg/ml)溶液，振蕩15sec，室溫放置5min。

2.3. DNA濃度及純度檢測：

分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測總基因組DNA的濃度和純度，測得所有樣本DNA在OD260處均有顯著吸收峰，DNA濃度大于10ng/μl，總量大于0.1μg且OD260/OD280比值均在1.8-2.0之間，說明步驟2.1所提取的DNA濃度和純度符合PCR和毛細(xì)管電泳的實(shí)驗(yàn)要求。

3.應(yīng)用LH-PCR技術(shù)制備細(xì)菌基因指紋圖譜的步驟

3.1.細(xì)菌PCR擴(kuò)增

選用引物

fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和

5'FAM-PRUN518r(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')

擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因，其中5'FAM-PRUN518r的5'端用FAM熒光標(biāo)記。

PCR的反應(yīng)體系(50μL)：10×緩沖液5μL，dNTPs1μL，引物各1.5μL，DNA聚合酶1μL，BSA2.5μL，模板DNA1μL，ddH₂O補(bǔ)足50μL。

同時(shí)設(shè)置不添加模板的陰性對照。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后于4℃恒溫保存。

3.2.毛細(xì)管電泳LH-PCR產(chǎn)物

將步驟3.1的PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行富集，收集300-400bp的片斷。然后用Qiagen凝膠純化試劑盒切膠回收純化，并與Hi-Di甲酰胺及GS500Liz內(nèi)部尺寸標(biāo)準(zhǔn)混合，混合物先放入PCR儀(Peltier Thermal Cycler DNAEngine)，在95℃下變性5min，立刻放入冰盒中。再放入ABI PRISM 310遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)中進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，注射時(shí)間為10s，注射和運(yùn)行電壓為15.0kV，運(yùn)行溫度為60℃，運(yùn)行時(shí)間為70min。

3.3.毛細(xì)管電泳圖譜的分析

每個(gè)樣品的指紋電泳圖譜用GeneScan 3.7進(jìn)行收集。LH-PCR數(shù)據(jù)運(yùn)用BioNumerics 6.0軟件進(jìn)一步處理。電泳圖譜轉(zhuǎn)換為BioNumerics曲線格式，并且使用規(guī)范化的內(nèi)部尺寸標(biāo)準(zhǔn)，對擴(kuò)增片段長度為310-380bp的片斷進(jìn)行分析。

4.細(xì)菌基因指紋圖譜制備

4.1.樣品數(shù)據(jù)分組：

按步驟1.5對63例研究對象連續(xù)給藥5天，在用藥后第7天隨訪，臨床評價(jià)均為治愈；在用藥后第30天隨訪，42名治愈未復(fù)發(fā)，21名復(fù)發(fā)，治愈率為66.67％。

上述63例研究對象，每例分別在第0天、第7天、第30天取3次樣，共189個(gè)樣品。根據(jù)上述治療結(jié)果，樣品數(shù)據(jù)共分為5組：

0組：D0組(用藥前患者取樣的樣品，供63例)、

1組：SG-D7組(用藥后30天未復(fù)發(fā)的患者在7天時(shí)取樣的樣品，共42例)、

2組：FG-D7組(用藥后30天復(fù)發(fā)的患者在7天時(shí)取樣的樣品，共21例)、

3組：SG-D30組(用藥后30天未復(fù)發(fā)的患者在30天時(shí)取樣的樣品，共42例)、

4組：FG-D30組(用藥后30天復(fù)發(fā)的患者在30天時(shí)取樣的樣品，共21例)。

4.2. LH-PCR特征峰

通過對189個(gè)(63個(gè)患者，每個(gè)患者取樣3次)陰道分泌物樣本進(jìn)行LH-PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LH-PCR的掃描峰主要集中340-375bp，但是不同樣品數(shù)據(jù)組的LH-PCR特征峰各不相同。

圖1顯示的D0組、SG-D7組、FG-D7組、SG-D30組、FG-D30組這5組樣品的LH-PCR特征峰的主成分分析結(jié)果(Principal Component Analysis，PCA)，從圖1中可以看出：

針對D30的樣品，SG-D30組群(實(shí)心圓圈)和FG-D30組群(空心圓圈)的陰道微生物群落明顯的分成了兩個(gè)集群，說明治愈組(未復(fù)發(fā)組)和復(fù)發(fā)組的集落明顯不同；

FG-D30組群(空心圓圈)與D0組(空心方塊)的微生物群落分布相重疊，說明復(fù)發(fā)組和未治療組的集落具有相似性；

SG-D7組(實(shí)心三角)和FG-D7組(空心三角)的樣本分布存在部分重疊，卻又不完全相同，說明即便是第7天時(shí)臨床評價(jià)同為治愈，后續(xù)復(fù)發(fā)的和未復(fù)發(fā)的樣品集落在中間狀態(tài)中也存在差異。

因此，基于本發(fā)明形成的LH-PCR特征峰，可以通過對BV和健康女性陰道內(nèi)微生物菌群的主成分分析，明顯區(qū)分出不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)陰道菌群的差異，能將疾病與健康狀態(tài)下的陰道菌群明顯的區(qū)分開來。

進(jìn)一步對LH-PCR特征峰進(jìn)行Kruskal Wallis Test檢驗(yàn)，結(jié)果見圖2和表1。圖2顯示的是D0組、SG-D7組、FG-D7組、SG-D30組、FG-D30組這5組樣品的LH-PCR特征峰。在每一組峰譜中，縱軸為每一個(gè)片段的相對峰面積，橫軸為14個(gè)通過Kruskal Wallis Test檢驗(yàn)后有顯著性差異的片段長度，自左到右依次為340bp、341bp、343bp、344bp、345bp、347bp、349bp、353bp、354bp、356bp、361bp、363bp、368bp、375bp。表1顯示的是這14個(gè)片段長度的相對峰面積的四分位數(shù)間距。

表1 具有顯著性差異的片段長度的相對峰面積的四分位數(shù)間距

從圖2和表1的結(jié)果可以計(jì)算出，當(dāng)片段長度340-374bp中的任何一個(gè)片斷的相對峰面積(四分位數(shù)間距)大于10％時(shí)，確定為有細(xì)菌性陰道病致病菌群存在；當(dāng)片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積(四分位數(shù)間距)都小于10％，確定為正常菌群，沒有細(xì)菌性陰道病致病菌群存在。

為了確定產(chǎn)生顯著性差異的基因片段長度所對應(yīng)的細(xì)菌種類，申請人將LH-PCR的分析結(jié)果與高通量測序結(jié)果進(jìn)行了對比比較。

其中高通量測序是使用標(biāo)準(zhǔn)的454/Roche GS-FLX方案完成對16S rRNA基因V1-V3區(qū)的測序工作。高通量測序共產(chǎn)生了1,622,359條高質(zhì)量的reads，每個(gè)樣本平均有8071條序列(3424–18517)。所有樣本共檢測到8967個(gè)OTU(操作分類單元，operation taxonomy units)，并且每個(gè)樣本的OTUs數(shù)在54–706之間。在對原始序列進(jìn)行篩選后，通過比對RDP數(shù)據(jù)庫完成細(xì)菌種類的比較。最終確認(rèn)差異片段長度所對應(yīng)的細(xì)菌種類為表2所示：

表2 細(xì)菌種類和對應(yīng)的片段長度

實(shí)施例2：應(yīng)用本發(fā)明LH-PCR圖譜進(jìn)行細(xì)菌性陰道病診斷

患者1：

用藥前(0天)LH-PCR圖譜(圖3)顯示有343bp、353bp、366bp三處相對峰面積大于10％，因此診斷為患有細(xì)菌性陰道病。同時(shí)進(jìn)行微生態(tài)評價(jià)和臨床標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)進(jìn)行驗(yàn)證，其Nugent評分為9，陰道分泌物稀薄，有魚腥臭味，Whiff試驗(yàn)陽性，線索細(xì)胞陽性，陰道分泌物pH值為5.1，臨床診斷為患有細(xì)菌性陰道病，與通過本發(fā)明LH-PCR基因指紋圖譜診斷的結(jié)果一致。

對該患者規(guī)范使用甲硝唑凝膠治療5天，在用藥后7天再對其進(jìn)行分析，此時(shí)該患者的微生態(tài)評價(jià)和臨床標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)顯示其BV已治愈，通過LH-PCR圖譜(圖4)分析，顯示片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積<10％，根據(jù)實(shí)施例1的圖譜分析，說明此時(shí)患者已治愈，并且菌群恢復(fù)到正常狀態(tài)，沒有致病菌存在，預(yù)測其沒有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

在用藥后30天，第3次進(jìn)行LH-PCR分析，圖譜(圖5)顯示片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積<10％，診斷為其細(xì)菌性陰道病未復(fù)發(fā)，已治愈。同時(shí)對30天時(shí)的樣品也進(jìn)行微生態(tài)評價(jià)和臨床標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)進(jìn)行驗(yàn)證，其Nugent評分為1，陰道分泌物性狀正常，Whiff試驗(yàn)陰性，線索細(xì)胞陰性，陰道分泌物pH值為4.1，臨床診斷為也同樣為治愈未復(fù)發(fā)，與通過本發(fā)明LH-PCR基因指紋圖譜診斷的結(jié)果一致，且與用藥后7天的LH-PCR分析預(yù)測正確。

患者2：

用藥前(0天)LH-PCR圖譜(圖6)顯示有343bp、353bp兩處相對峰面積大于10％，診斷為患有細(xì)菌性陰道病。同時(shí)進(jìn)行微生態(tài)評價(jià)和臨床標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)進(jìn)行驗(yàn)證，其Nugent評分為9，陰道分泌物性狀稀薄，有魚腥臭味，Whiff試驗(yàn)陽性，線索細(xì)胞陽性，陰道分泌物pH值4.8，臨床診斷為患有細(xì)菌性陰道病，與通過本發(fā)明LH-PCR基因指紋圖譜診斷的結(jié)果一致。

對該患者規(guī)范使用甲硝唑凝膠治療5天，在用藥后7天再對其進(jìn)行分析，此時(shí)該患者的微生態(tài)評價(jià)和臨床標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)顯示其BV已治愈，但是通過LH-PCR圖譜(圖7)分析，顯示仍有364bp、368bp兩處相對峰面積大于10％，根據(jù)實(shí)施例1的圖譜分析，此時(shí)菌群并沒有恢復(fù)到正常，還屬于異常菌群狀態(tài)，致病菌仍存在，預(yù)測其可能后續(xù)有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

在用藥后30天，第3次進(jìn)行LH-PCR分析，圖譜(圖8)顯示有353bp、366bp兩處相對峰面積大于10％，診斷為其仍患有細(xì)菌性陰道病。同時(shí)對30天時(shí)的樣品也進(jìn)行微生態(tài)評價(jià)和臨床標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)進(jìn)行驗(yàn)證，其Nugent評分為8，陰道分泌物性狀稀薄，有魚腥臭味，Whiff試驗(yàn)陽性，線索細(xì)胞陽性，陰道分泌物pH值5.2，臨床診斷為也同樣為患有細(xì)菌性陰道病，與通過本發(fā)明LH-PCR基因指紋圖譜診斷的結(jié)果一致，且與用藥后7天的LH-PCR分析預(yù)測正確。