大熊貓抗細菌潛力檢測的ii類mhc基因的特異性引物及分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于擴增大熊貓II類主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibilitycomplex，MHC)基因二號外顯子的特異性引物和II類MHC基因的分 型方法，尤其涉及大熊貓抗細菌潛力檢測的II類MHC基因的特異性引物及分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大熊貓（Ailuropodamelanoleuca)是我國特有的珍稀物種，為國家一級保護動 物，也是世界自然基金會的形象大使和世界生物多樣性保護的旗艦物種。另外，如今的大熊 貓雖以竹子為主食但其牙齒和消化道卻保留食肉動物的特征，因此其演化和生存的過程也 備受關(guān)注。被譽為"國寶"的大熊貓在距今60萬年前曾廣泛分布于我國東南黃河、長江和 珠江流域，然而現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)的發(fā)展使其生境破碎片斷化，迫使它們彼此孤立在秦嶺、岷山、 邛崍山、涼山、大相嶺和小相嶺六個山系中。
[0003] 多項保護遺傳學(xué)研究采用分子技術(shù)利用中性標(biāo)記（如線粒體DNA控制區(qū)、指紋圖 譜和微衛(wèi)星標(biāo)記等）發(fā)現(xiàn)彼此隔離的山系減少甚至阻斷了大熊貓種群間的基因交流，使得 該物種遺傳多樣性降低且種群分化加劇。這些研究雖然為解決種群的歷史和結(jié)構(gòu)等問題提 供了幫助，但并未反映出大熊貓在種群演化過程中的適應(yīng)性能力。另外，如今大熊貓的生存 嚴(yán)重受到高疾病感染率和高死亡率的威脅。因此，為了進一步了解大熊貓的適應(yīng)性能力和 其高染病率的成因，就需要深入研究與大熊貓疾病抗性有關(guān)的基因，如編碼與免疫相關(guān)的 主要組織相容性復(fù)合體（MHC)的MHC基因家族，這是因為MHC分子具有結(jié)合及呈遞抗原從 而激發(fā)相應(yīng)免疫反應(yīng)的功能，所以其在面對多變的病原時展現(xiàn)的適應(yīng)性進化可以作為評估 一個物種適應(yīng)性能力的標(biāo)記。
[0004] II類MHC基因編碼豐富的細胞表面蛋白，這些蛋白只存在于吞噬性細胞表面。當(dāng) 吞噬性細胞吞食掉侵入組織的細菌后，細菌碎片將通過II類MHC提示給輔助T細胞，啟動 專一性免疫反應(yīng)。因為II類MHC分子具有細菌病原識別和呈遞功能，所以II類MHC基因 的基因型、表達多樣性及表達豐度影響著機體對疾病的易感性和自身免疫能力等多種生物 學(xué)特征。而經(jīng)典II類MHC結(jié)合細菌病原肽的部位由基因二號外顯子編碼，因此研究經(jīng)典II 類MHC基因二號外顯子的多態(tài)性和基因型有助于我們探究大熊貓II類MHC基因中與疾病 有關(guān)的特定等位基因和該物種抗細菌感染能力強弱。然而，由于MHC基因是多基因家族，基 因復(fù)制和協(xié)同進化使同一座位上的不同等位基因差異較大，而不同座位之間的等位基因又 高度相似，因此在用通用引物進行多位點擴增時，前者可能造成同一座位上等位基因擴增 失效和無效等位基因的產(chǎn)生，而后者則造成不同座位等位基因的交叉擴增。另外，假基因的 存在也會影響研究結(jié)果。因此，在分離和鑒定大熊貓所有表達的II類MHC基因的基礎(chǔ)上設(shè) 計座位特異引物并進行正確大熊貓II類MHC基因分型和基因多態(tài)性分析，是研究與細菌引 起的疾病有關(guān)的特定等位基因和評估大熊貓抗病能力的必要前提，對全面和科學(xué)地進行大 熊貓保育有重要借鑒意義，比如野外放歸時選擇適應(yīng)能力強的個體和選擇優(yōu)良個體進行人 工配種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供大熊貓II類MHC區(qū)域6個經(jīng)典座位（1 個DRA，1個DRB3, 2個DQA及2個DQB)二號外顯子擴增的特異性引物和基因分型方法，它 能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
[0006] 用于擴增大熊貓II類MHC區(qū)域DRA、DRB3、DQA1、DQA2、DQB1和DQB2基因二號外 顯子的特異性引物組包括十對引物，引物對的核苷酸序列如下所示：
[0027] 引物對一、引物對二擴增DRA，其中引物對一為巢式PCR外側(cè)引物，引物對二是巢 式PCR內(nèi)側(cè)引物；引物對三、引物對四擴增DRB3，其中引物對三為巢式PCR外側(cè)引物，引物 對四是巢式PCR內(nèi)側(cè)引物；引物對五擴增DQA1 ;引物對六擴增DQA2 ;引物對七、引物對八擴 增DQB1，其中引物對七為巢式PCR外側(cè)引物，引物對八是巢式PCR內(nèi)側(cè)引物；引物對九、弓丨 物對十?dāng)U增DQB2,其中引物對九為巢式PCR外側(cè)引物，引物對十為巢式PCR內(nèi)側(cè)引物。
[0028] 采用所述的引物對，以從大熊貓糞便中用酚氯仿法提取的DNA為模板，先每對引 物分別用l〇yLPCR體系在特定PCR擴增條件下進行目標(biāo)片斷擴增，然后將擴增產(chǎn)物利用 SSCP對每個位點分別進行基因分型。
[0029] 擴增大熊貓DQA1和DQA2基因二號外顯子的10yLPCR體系是：1yL含Mg2+的ΙΟχ Buffer，0.8yL2.5mM的dNTP，0.3yL10mM的上游引物，0.3yL10mM的下游引物，O.lyL 5U/μL的rTaq酶，1μL基因組DNA，6. 5μL滅菌超純水；擴增大熊貓DRA、DRB3、DQB1和 DQB2基因二號外顯子的第一輪PCR10yL體系是：5yL2xGCBuffer，0.8yLL2.5mM的 dNTP，0. 3yLlOmM的第一輪巢式PCR上游引物，0. 3yLLlOmM的第一輪巢式PCR下游引 物，0. 1μL5U/μL的rTaq酶，1μL基因組DNA，2. 5μL滅菌超純水；第二輪PCR10μL體 系是：1μL含Mg2+ 的 10xBuffer，0· 8μL2. 5mM的dNTP，0· 3μLlOmM的第二輪巢式PCR 上游引物，0. 3yLlOmM的第二輪巢式PCR下游引物，0.lyL5U/yL的rTaq酶，lyL第一 輪PCR產(chǎn)物，6. 5μL滅菌超純水。
[0030] 擴增大熊貓DQA1和DQA2基因二號外顯子的特定PCR擴增條件是：95°C預(yù)變性4 分鐘，95 °C變性30秒，59 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共34個循環(huán)，最后72 °C延伸8分鐘； 擴增大熊貓DRA、DRB3、DQB1和DQB2基因二號外顯子的特定PCR擴增條件是：第一輪PCR 95 °C預(yù)變性4分鐘，95 °C變性30秒，59 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共22個循環(huán)，最后72°C 延伸10分鐘；第二輪PCR95°C預(yù)變性3分鐘，95°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸30 秒，共33個循環(huán)，最后72°C延伸8分鐘。
[0031] 對大熊貓II類MHC區(qū)域上述基因二號外顯子進行SSCP分型的方法是：
[0032] 1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝 板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；
[0033] 2)制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板 間，確認無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；
[0034] 3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用 裝滿0. 5XTBE的注射器沖洗點樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預(yù)電泳20min;
[0035] 4)樣品電泳，吸取8uLPCR產(chǎn)物，加入4uL2Xloadingbuffer，快速離心混合， 95°C變性7min后迅速置于冰上，并用槍及時加入點樣孔內(nèi)，4°C，30W，電泳8-llh;
[0036] 5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0037] 6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速 洗膠4次；
[0038] 7)加入500mL預(yù)冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入 500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0039] 8)讀取條帶，確定基因型。
[0040] 本發(fā)明在分離和鑒定大熊貓所有表達的MHC基因的基礎(chǔ)上設(shè)計出大熊貓II類MHC 區(qū)域6個經(jīng)典座位二號外顯子的特異引物和基因分型方法。由于MHC基因是多基因家族， 基因復(fù)制和協(xié)同進化使同一座位上的不同等位基因差異較大，而不同座位之間的等位基因 又高度相似，因此本發(fā)明設(shè)計的特異擴增引物較過去通用引物有較大優(yōu)勢，具體表現(xiàn)為： 1.對大熊貓是無損傷的。由于本發(fā)明能通過巢式PCR有效擴增糞便樣品中提取的DNA，所 以優(yōu)于抽血提取DNA等可能會對大熊貓造成傷害的取樣方法；2.PCR特異性高，擴增效果更 好。采用本發(fā)明的引物運用巢式PCR可以在有效擴增同一座位上不同等位基因的同時避免 產(chǎn)生無效等位基因，而且不會交叉擴增不同座位的等位基因。利用本發(fā)明有利于正確進行 大熊貓II類MHC基因分型和基因多態(tài)性分析，能幫助我們進一步研究與細菌引起的疾病有 關(guān)的特定等位基因、評估大熊貓抗病能力以及更好地設(shè)計大熊貓保育計劃，比如選擇適應(yīng) 能力強的個體進行野外放歸和選擇優(yōu)良個體進行人工配種。
【附圖說明】
[0041] 圖1是本發(fā)明對大熊貓6個經(jīng)典MHCII類基因二號外顯子擴增結(jié)果；
[0042] 圖2是本發(fā)明對大熊貓DRA基因二號外顯子的基因分型結(jié)果。每個泳道對應(yīng)不同 的大熊貓個體；
[0043] 圖3是本發(fā)明對大熊貓DRB3基因二號外顯子的基因分型結(jié)果。每個泳道對應(yīng)不 同的大熊貓個體；
[0044] 圖4是本發(fā)明對大熊貓DQA1基因二號外顯子的基因分型結(jié)果。每個泳道對應(yīng)不 同的大熊貓個體；
[0045] 圖5是本發(fā)明對大熊貓DQA2基因二號外顯子的基因分型結(jié)果。每個泳道對應(yīng)不 同的大熊貓個體；
[0046] 圖6是本發(fā)明對大熊貓DQB1基因二號外顯子的基因分型結(jié)果。每個泳道對應(yīng)不 同的大熊貓個體；
[0047] 圖7是本發(fā)明對大熊貓DQB2基因二號外顯子的基因分型結(jié)果。每個泳道對應(yīng)不 同的大熊貓個體；
【具體實施方式】
[0048] 本發(fā)明的大熊貓II類MHC區(qū)域6個經(jīng)典座位二號外顯子特異引物篩選方法共兩 個步驟：1.以已經(jīng)測得的大熊貓II類MHC基因組序列為基礎(chǔ)，設(shè)計II類MHC區(qū)域6個經(jīng) 典座位二號外顯子特異引物；2.將合成的引物對II類MHC基因進行擴增，檢測其擴增準(zhǔn)確 性和效率。
[0049] 下面結(jié)合實例對發(fā)明作進一步說明：
[0050] 1.樣品準(zhǔn)備：大熊貓糞便樣品均來源于臥龍大熊貓研究中心。
[0051 ] 2.DNA提取：酚氯仿法提取從糞便中提取DNA。
[0052] 3.引物合成：根據(jù)已經(jīng)測得的大熊貓II類MHC基因組序列，發(fā)現(xiàn)大熊貓DRA、 DQA1、DQA2和DRB3座位的二號外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子序列之間差別很大，因此可以把引物設(shè) 在這些變異區(qū)段直接擴增完整的二號外顯子，不過為了提高擴增效率設(shè)計兩對引物對DRA 和DRB3進行巢式擴增。而大熊貓DQB1和DQB2座位的二號外顯子側(cè)翼序列高度相似，因 而設(shè)計了兩對引物進行巢式擴增。引物序列為：擴增DRA的DRAF、DRAdn、RAF和RAR(其中 DRAF和DRAdn為巢式PCR外側(cè)引物，RAF和RAR是巢式PCR內(nèi)側(cè)引物）；擴增DRB的DRB1F2、 RB13dn4、DRB1F3 和RB13dn3(其中DRB1F2 和RB13dn4 為巢式PCR外側(cè)引物，DRB1F3 和 RB13dn3是巢式PCR內(nèi)側(cè)引物）；擴增DQA1的DQAlup3和DQAldnl;擴增DQA2的DQA2upl和 DQA2dnl