基因修飾的細(xì)菌的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的引用
[0002] 本申請要求于2013年3月14日提交的美國臨時專利申請第61/782, 141號的優(yōu) 先權(quán)，并且通過引用將其全部結(jié)合于此，用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明總體涉及具有增加的生物量（biomass)生產(chǎn)能力的基因修飾的 (genetically modified)細(xì)菌，如甲基桿菌屬（Methylobacterium)。這種基因修飾的細(xì)菌 可以用于從單碳（C1)化合物，如甲醇（CH3OH)和甲烷（CH4)生產(chǎn)有用的化學(xué)化合物。
【背景技術(shù)】
[0004] 甲基營養(yǎng)是微生物，如細(xì)菌和某些真菌，在作為唯一的碳和能量源的簡單的 (reduced) (^化合物像CH 4和CH 30H上生長的能力。因為一些C1同化途徑是非常低效的，因 此使更少的原料轉(zhuǎn)向至二氧化碳（CO2)的代謝途徑對于有利的碳基化合物（carbon-based compound)的生產(chǎn)是有用的。因此，優(yōu)化基因修飾的微生物以減少CO2廢氣是合乎需要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本公開的實施方式指向當(dāng)在(^化合物如甲醇上生長時，修飾細(xì)菌內(nèi)的途徑以相對 于必不可少浪費成CO2增加中間代謝中的碳的總保持量（retention)。根據(jù)一個方面，本文 描述的基因修飾的細(xì)菌具有與不存在基因修飾的細(xì)菌（包括野生型細(xì)菌）相比的增加的基 質(zhì)產(chǎn)率（成為生物量的碳的克數(shù)相對于成為CO2的碳的克數(shù)）。在該方面，由于基因修飾的 細(xì)菌的增加的效率，每單位基質(zhì)的生物量產(chǎn)量增加。根據(jù)可替代的方面，與包括野生型細(xì)菌 的不存在基因修飾的細(xì)菌相比，本文描述的基因修飾的細(xì)菌產(chǎn)生了更少的二氧化碳以及更 多的碳基生物量。在這方面，每單位基質(zhì)的生物量產(chǎn)量增加。
[0006] 根據(jù)本公開的一些方面，提供了重組細(xì)菌，其已經(jīng)被基因修飾以中斷細(xì)菌的用于 異化以七合物像CH3OH的H4MPT(四氫甲烷碟呤）途徑。根據(jù)該方面，除去、改變、抑制劑結(jié) 合、或另外地防止表達(dá)用于C1異化的細(xì)菌的H4MPT (四氫甲烷碟呤）途徑之內(nèi)的一個或多個 基因。以這種方式，中斷、抑制、沉默用于C1異化的細(xì)菌的H 4MPT途徑或另外地使其對于C1異化無效。根據(jù)該方面，通過中斷H4MPT途徑，不需要完全阻止C1異化。相反，基因修飾可 以導(dǎo)致途徑的一些操作，然而，基因修飾旨在使H4MPT途徑相對于未修飾的H4MPT途徑失去 作用。
[0007] 根據(jù)本公開的一些方面，提供了重組細(xì)菌，其已經(jīng)被基因修飾以中斷用于低級碳 同化，如，C1同化的細(xì)菌的絲氨酸循環(huán)。根據(jù)該方面，除去、改變、抑制劑結(jié)合、或者另外地防 止表達(dá)用于(^同化的細(xì)菌絲氨酸循環(huán)內(nèi)的一個或多個基因。以這種方式，中斷、抑制、沉默 用于C1同化的細(xì)菌的絲氨酸循環(huán)或者另外地使其對于(^同化無效。根據(jù)該方面，通過中斷 絲氨酸循環(huán)，不需要完全阻止C1同化。相反，基因修飾可以導(dǎo)致絲氨酸循環(huán)的一些操作，然 而，基因修飾旨在使絲氨酸循環(huán)相對于未修飾的絲氨酸循環(huán)失去作用。
[0008] 根據(jù)本公開的一些方面，可以基因修飾細(xì)菌以中斷用于C1異化的細(xì)菌的H4MPT途 徑或中斷用于C1同化的細(xì)菌的絲氨酸循環(huán)。根據(jù)本公開的一些方面，可以基因修飾細(xì)菌以 中斷用于C1異化的細(xì)菌的H 4MPT途徑并且中斷用于C1同化的細(xì)菌的絲氨酸循環(huán)。
[0009] 根據(jù)一些方面，可以基因修飾細(xì)菌以包括來自用于C1同化和C i異化的RuMP(核 酮糖單磷酸）途徑的一個或多個基因。來自RuMP途徑的一個或多個基因編碼一些C1同化 酶，并且當(dāng)酶包含于細(xì)菌中時，表達(dá)這些酶以進(jìn)行C1同化。來自RuMP途徑的一個或多個基 因編碼一些C1異化酶，并且當(dāng)酶包含于細(xì)菌中時，表達(dá)這些酶以進(jìn)行C i異化。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，并不是所有屬于RuMP途徑的基因都需要包括在細(xì)菌的基因組中以使 得細(xì)菌表達(dá)對于C1同化或C i異化起作用的酶。
[0010] 根據(jù)一個方面，可以基因修飾細(xì)菌以中斷用于C1異化的細(xì)菌的H4MPT途徑并且包 括用于C1同化和C i異化的RuMP途徑的一個或多個基因。根據(jù)進(jìn)一步的方面，可以基因修 飾細(xì)菌以中斷用于C1同化的細(xì)菌的絲氨酸循環(huán)并且包括來自用于C1同化和C1異化的RuMP 途徑的一個或多個基因。根據(jù)又進(jìn)一步的方面，可以基因修飾細(xì)菌以中斷用于(^異化的細(xì) 菌的H4MPT途徑并且中斷用于C1同化的細(xì)菌的絲氨酸循環(huán)以及包括來自用于C i同化和C i 異化的RuMP途徑的一個或多個基因。
[0011] 根據(jù)一些方面，細(xì)菌可以是包括用于C1同化的絲氨酸循環(huán)或卡爾文循環(huán)，以及 H4MPT或硫醇基（thiol-based)(例如，谷胱甘肽、放線硫醇）(^異化途徑中的任何一種。根 據(jù)本公開，這類細(xì)菌可以通過使絲氨酸循環(huán)、卡爾文循環(huán)、H4MPT C1異化途徑或硫醇基（例 如，谷胱甘肽、放線硫醇）C1異化途徑失去作用（disabling)，并且用于C i同化、C 1異化或二 者的RuMP途徑起作用而改善。根據(jù)一些方面，細(xì)菌可以是甲基桿菌屬。根據(jù)一些方面，細(xì) 菌可以是扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens)。根據(jù)一些方面，細(xì)菌可以是扭脫 甲基桿菌AMl。根據(jù)一些方面，細(xì)菌可以是扭脫甲基桿菌PAl。
[0012] 根據(jù)一個方面，基因修飾扭脫甲基桿菌PAl細(xì)胞以中斷用于C1異化的細(xì)胞的 H4MPT(四氫甲烷碟呤）途徑并包括用于C1異化的重組RuMP途徑。
[0013] 根據(jù)可替換的方面，基因修飾扭脫甲基桿菌PAl細(xì)胞以中斷用于C1同化的細(xì)胞的 絲氨酸循環(huán)并且包括用于C1同化的重組RuMP途徑。
[0014] 根據(jù)可替換的方面，基因修飾扭脫甲基桿菌PAl細(xì)胞以中斷用于C1異化的細(xì)胞的 H4MPT (四氫甲烷碟呤）途徑，中斷用于C1同化的細(xì)胞的絲氨酸循環(huán)并且包括用于C1同化和 C1異化的重組RuMP途徑。
【附圖說明】
[0015] 從結(jié)合附圖的示例性實施方式的以下【具體實施方式】將更完全地理解本發(fā)明的前 述和其他特征和優(yōu)點，其中：
[0016] 圖1是存在于未改變的絲氨酸循環(huán)甲基營養(yǎng)生物中的代謝途徑。有助于(；同化與 異化的天然途徑以紫色示出；僅用于C1異化的途徑為紅色；用于C 1同化的途徑為綠松色； 中間代謝途徑為灰色。
[0017] 圖2是存在于絲氨酸循環(huán)甲基營養(yǎng)生物中的代謝途徑，其中，H4MPT-依賴的甲醛氧 化途徑已經(jīng)失去作用（鮮紅的X)，并且，如通過HPS和PHI (深藍(lán)的）的引入和表達(dá)已經(jīng)引 入RuMP循環(huán)。這些引入了用于C1同化與異化（褐色）的新的反應(yīng)，新的C1異化為橙色，以 及新的C1同化為綠色。其余顏色如圖1描述的。
[0018] 圖3是存在于絲氨酸循環(huán)甲基營養(yǎng)生物中的代謝途徑，其中，用于C1同化的天然 的絲氨酸循環(huán)已經(jīng)失去作用（鮮紅的X)，并且如通過HPS和PHI的引入和表達(dá)已經(jīng)引入了 RuMP循環(huán)。其余的顏色如圖1和2中描述的。
[0019] 圖4是存在于絲氨酸循環(huán)甲基營養(yǎng)生物中的代謝途徑，其中，H4MPT-依賴的甲醛氧 化途徑和絲氨酸循環(huán)已經(jīng)失去作用（鮮紅的X)，排除了（^同化與異化二者的作用，并且如 通過HPS和PHI的引入和表達(dá)已經(jīng)引入了 RuMP循環(huán)。其余的顏色如圖1和2中描述的。
[0020] 圖5示出了制造為敲除絲氨酸循環(huán)中的hprA并且用編碼來自莢膜甲基球菌 (Methylococcus capsulatus)Bath的己酮糖6_磷酸合酶（HPS)和己酮糖6_磷酸異構(gòu) 酶（PHI)的基因?qū)⑵涮鎿Q的結(jié)構(gòu)（構(gòu)建體，construct)的質(zhì)粒圖譜。在pCM433[基因庫 (GenBank) :EU118176]的骨架上制造該結(jié)構(gòu)，其是8081bp長的具有ColEl復(fù)制起點和IncP 轉(zhuǎn)移起點的 CamR、TetR、△!!^/載體（Marx, BMC Research Notes 1:1 (2008)) 〇
[0021] 圖6示出了制造為敲除絲氨酸循環(huán)中的hprA并且用編碼來自莢膜甲基球菌Bath 的己酮糖6-磷酸合酶（HPS)和己酮糖6-磷酸異構(gòu)酶（PHI)的基因?qū)⑵涮鎿Q的結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒 圖譜。在PCM433 [基因庫：EU118176]的骨架上制造該結(jié)構(gòu)，其是8081bp長的具有ColEl復(fù) 制起點和 IncP 轉(zhuǎn)移起點的 CamR、TetR、AmpR載體（Marx, BMC Research Notes 1:1(2008))。
[0022] 圖7示出了制造為敲除扭脫甲基桿菌（M. extorquens) PAl中的mptG的結(jié)構(gòu) 的質(zhì)粒圖譜。在PCM433[基因庫：EU118176]的骨架上制造該結(jié)構(gòu)，其是8081bp長的具 有 ColEl 復(fù)制起點和 IncP 轉(zhuǎn)移起點的 CamR、TetR、Αηιρ1^^·^ (Marx, BMC Research Notes 1:1(2008))〇
【具體實施方式】
[0023] 本公開的實施方式包括含有一個或多個基因修飾的重組宿主微生物，所述基因修 飾導(dǎo)致減少的二氧化碳生成量以及流向生物量或副產(chǎn)物產(chǎn)量的伴隨的增加。本公開的實施 方式包括含有導(dǎo)致細(xì)胞增殖的增加的速率的一個或多個基因修飾的重組宿主微生物。本公 開的實施方式包括含有導(dǎo)致每單位基質(zhì)增加的生物量產(chǎn)量的一個或多個基因修飾的重組 宿主微生物。
[0024] 本公開的實施方式包括本文描述的重組宿主微生物，其已經(jīng)被進(jìn)一步基因修飾以 包括用于目標(biāo)含碳化合物的生物合成途徑。根據(jù)一個方面，重組宿主微生物已經(jīng)被基因修 飾以通過重組宿主微生物降低生產(chǎn)二氧化碳的碳原料的使用，導(dǎo)致碳生物量的增加的產(chǎn) 量。當(dāng)重組宿主微生物已經(jīng)被進(jìn)一步基因修飾以包括用于目標(biāo)含碳化合物的生物合成途徑 時，與本文描述的未經(jīng)重組修飾的宿主微生物相比，重組宿主微生物產(chǎn)生了更大量的目標(biāo) 化合物。
[0025] 本公開的方面涉及基因修飾的重組甲基營養(yǎng)微生物（recombinant methylotrophic microorganism)以增加來自低級含碳化合物，如C1化合物的總生物量產(chǎn) 量。甲基營養(yǎng)微生物是在作為碳源和能量源的以七合物像CH 4和CH 30H上生長的那些，如 細(xì)菌和一些真菌。甲基營養(yǎng)微生物也可以包括在除了 C1化合物之外的低級碳化合物如C2至C5碳化合物上生長的那些。
[0026] 本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的并且在以 下中進(jìn)行描述：Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E. F.和 Maniatis，Τ·，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed. ；Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989)和 Silhavy, T. J.，Bennan, M. L.和 Enquist, L. W.，Experiments with Gene Fusions ；Cold Spring Harbor Laboratory:CoId Spring Harbor, N. Y. , (1984)；以及 AusubeI, F. M.等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience (1987)，其中的每個通過引用將其整體結(jié)合于此。
[0027] 另外有用的方法在包括以下各項的手冊中進(jìn)行描述：Advanced Bacterial Genetics (Davis, Roth和Botstein, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980), Experiments with Gene Fusions (Silhavy, Berman 和 Enquist，Cold Spring Harbor Laboratory, 1984), Experiments in Molecular Genetics(Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)Experimental Techniques in Bacterial Genetics(Maloy, in Jones 和 Bartlett, 1990)，以及 A Short Course in Bacterial Genetics (Miller, Cold Spring Harbor Laboratory 1992)，其中的每個通過引用將其整體結(jié)合于此。
[0028] 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以基因修飾甲基營養(yǎng)微生物以剔除基因或 結(jié)合基因。待抑制的甲基營養(yǎng)微生物內(nèi)基因?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員是已知的或者使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的方法可以確定。加入至甲基營養(yǎng)微生物的基因組的基因或其同源物 是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以鑒定并獲得?？捎?于一些宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的載體和質(zhì)?？梢允浅Ｓ玫牟⑶铱缮藤徸匀鏘nvitrogen Corp. (Carlsbad, CA)、Stratagene(La Jolla, CA)和 New England Biolabs, Inc. (Beverly1MA) 的公司。其他生物體將要求寬的宿主范圍載體，如產(chǎn)生自最小的IncP復(fù)制子的pCM系列 (Marx 和 Lidstrom, Microbiology 147-2065-2075 (2001))，或者利用接合轉(zhuǎn)移以引入自殺 載體（Marx 和 Lidstrom, BioTechniques33:1062-106