專利名稱：包含突變spr基因以及野生型tsp基因的細(xì)菌宿主菌株的制作方法
包含突變SPR基因以及野生型TSP基因的細(xì)菌宿主菌株本發(fā)明涉及重組細(xì)菌宿主菌株，特別是大腸桿菌(E.Coli)。本發(fā)明還涉及在此細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
通常將細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。使用細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)有很多優(yōu)勢，具體而言是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞作為宿主細(xì)胞可以使得基因通過質(zhì)粒插入而具有多祥的屬性。大腸桿菌已經(jīng)用于很多重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，包括人胰島素。盡管使用細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)有很多優(yōu)勢，但是仍然有顯著的局限性，包括細(xì)菌細(xì)胞易于在目的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)過程中裂解。這種裂解表型可見于野生型細(xì)菌細(xì)胞，也可見于遺傳工程改造的細(xì)胞，如細(xì)菌蛋白酶缺陷的細(xì)胞。蛋白酶在轉(zhuǎn)換大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中老舊、損壞或折疊錯(cuò)誤的細(xì)胞上起到重要作用。細(xì)菌蛋白酶起降解目的重組蛋白質(zhì)的作用，因此常常顯著降低活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。因此，需要降低蛋白酶活性以降低目的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解。然而，缺乏蛋白酶如Tsp (也稱為Prc)的細(xì)菌菌株也表現(xiàn)有細(xì)胞裂解。Tsp (也稱為Prc)為一種60kDa的細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶。Tsp (prc)活性降低對降低目的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解是可取的。然而，發(fā)現(xiàn)缺少蛋白酶Prc的細(xì)胞在低滲透壓下顯示出熱敏感生長概況。Hara等人分離了 Tsp缺陷菌株，其為耐熱性回復(fù)突變株，含有基因夕卜抑制子(spr)突變(Hara 等人，Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996) )。Spr 為18kDa的膜結(jié)合細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶，spr的底物為Tsp以及外膜中參與細(xì)胞分裂中細(xì)胞壁水解的肽聚糖。spr基因標(biāo)記為UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_EC0LI)。攜帶有突變spr基因的蛋白酶缺陷細(xì)菌菌株已在Chen等人(Chen C，Snedecor B, Nishihara JC, JolyJCj McFarlandNj Andersen DC,Batters by JE，Champion KM. Biotechnol Bioeng. 2004Mar5;85(5) :463-74)中有描述，其中描述了攜帶prc (Tsp)及另ー種蛋白酶DegP不同突變組合的大腸桿菌菌株的構(gòu)建，是通過擴(kuò)增基因上游及下游區(qū)域并將其一起連接于包含選擇性標(biāo)記物及spr W174R突變體的載體上產(chǎn)生的。出乎意料地發(fā)現(xiàn)攜帶突變spr基因及野生型Tsp基因的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞為具有降低的裂解水平的細(xì)胞。因此，本發(fā)明人提供了新菌株，其具有用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的優(yōu)勢特性。出乎意料地，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞顯示出優(yōu)勢的生長及蛋白質(zhì)生產(chǎn)表型，因?yàn)橐阎?spr和Tsp為相互抑制子，因此，可以預(yù)測如果讓其中之一成為主導(dǎo)則細(xì)胞可以顯示出生長不良的表型，如變得滲漏或更傾向發(fā)生細(xì)胞裂解。然而，與野生型細(xì)胞相比以及包含敲除突變Tsp基因的細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞的細(xì)胞裂解表型有顯著的降低。發(fā)明概述本發(fā)明提供了重組的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其包含編碼突變spr蛋白質(zhì)的突變spr基因且其中細(xì)胞包含非重組野生型染色體Tsp基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，除了突變spr基因外，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的基因組與野生型細(xì)菌細(xì)胞基因組是同基因的(isogenic)。
本發(fā)明提供的細(xì)胞顯示出優(yōu)勢的生長以及蛋白質(zhì)生產(chǎn)表型。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)目的重組蛋白質(zhì)的方法，包括在如上文限定的重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)目的重組蛋白質(zhì)。附圖簡述圖I顯示了相比于野生型W3110和MXE001，MXE012和MXE017的生長概況。圖2顯示了相比于野生型W3110和MXE001，在MXE012和MXE017中抗-TNFaFab’的表達(dá)情況。 圖3顯示了在抗-TNFa Fab’生產(chǎn)發(fā)酵期間，W3110和MXE012的生長概況。圖4顯示了在抗づ,0 &13’生產(chǎn)發(fā)酵中13110和]\^^012(131108ロ『H119A)的細(xì)胞周質(zhì)抗-TNFa Fab的積累情況(實(shí)線及實(shí)心圖標(biāo))以及培養(yǎng)基Fab’的積累情況(虛線及空心圖標(biāo))。圖5顯示了表達(dá)抗-TNFa Fab’的菌株W3110和MXE012以及表達(dá)抗-TNF a Fab’及重組DsbC的菌株W3110和MXE012的生長概況。圖6顯示了表達(dá)抗-TNFa Fab’菌株W3110和MXE012以及表達(dá)抗-TNF a Fab’及重組DsbC的菌株W3110和MXE012的細(xì)胞周質(zhì)(陰影圖標(biāo))以及上清(空心非陰影圖標(biāo))中的抗-TNFa Fab’產(chǎn)量。圖7 顯示了菌株13110、]\^^001、]\^^008 和 MXE012 的 dsDNA 測定的結(jié)果。圖8顯示了菌株W3110、MXE001、MXE008和MXE012的蛋白質(zhì)測定的結(jié)果。圖9a顯示了野生型ptr (蛋白酶III)和敲除突變的ptr (蛋白酶III)的蛋白質(zhì)及基因序列的5’末端。圖9b顯示了野生型Tsp和敲除突變的Tsp的蛋白質(zhì)及基因序列的5’末端。圖9c顯示了野生型DegP及突變DegP蛋白質(zhì)及基因序列的區(qū)域。

圖10顯示了用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的細(xì)胞的載體的構(gòu)建。圖11顯示了表達(dá)抗-TNFa Fab’及重組DsbC的菌株MXE012的200L發(fā)酵物的生長概況。圖12顯示了表達(dá)抗-TNFa Fab’及重組DsbC的菌株MXE012的200L發(fā)酵物的抗-TNFa Fab’ 滴度。圖13顯示了表達(dá)抗-TNF a Fab’及重組DsbC的菌株MXE012的200L發(fā)酵物的活力。圖14顯示了表達(dá)抗-TNF a Fab’及重組DsbC的菌株MXE012的3000L發(fā)酵物的生長概況。圖15顯示了顯示了表達(dá)抗づ,0 &13’及重組0813(的菌株]\^^012的3000し發(fā)酵物的抗-TNFa Fab’滴度。序列簡述SEQ ID NO: I是野生型Tsp基因的DNA序列，包括起始密碼子上游的6個(gè)核苷酸ATGAAC。SEQ ID N0:2是野生型Tsp蛋白質(zhì)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 3是突變的敲除Tsp基因的DNA序列，包括起始密碼子上游的6個(gè)核苷酸 ATGAAT。
SEQID NO:4是野生型蛋白酶III基因的DNA序列。SEQID NO:5是野生型蛋白酶III蛋白質(zhì)的氨基酸序列。SEQID NO:6是突變的 敲除蛋白酶III基因的DNA序列SEQID NO: 7是野生型DegP基因的DNA序列。SEQID N0:8是野生型DegP蛋白質(zhì)的氨基酸序列。SEQID NO:9是突變DegP基因的DNA序列。SEQID NO: 10是突變DegP蛋白質(zhì)的氨基酸序列。SEQID NO: 11是抗-TNF抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQID NO: 12是抗-TNF抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQID NO: 13是抗-TNF抗體輕鏈的氨基酸序列。SEQID NO: 14是抗-TNF抗體重鏈的氨基酸序列。SEQID NO: 15是用于突變Tsp基因區(qū)域的3’寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點(diǎn)。SEQID NO: 16是用于突變Tsp基因區(qū)域的5’寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點(diǎn)。SEQID NO: 17是用于突變蛋白酶III基因區(qū)域的3’寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點(diǎn)。SEQID NO: 18是用于突變蛋白酶III基因區(qū)域的5’寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點(diǎn)。SEQID NO: 19是用于突變DegP基因區(qū)域的5’寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點(diǎn)。SEQID N0:20是用于突變DegP基因區(qū)域的3’寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點(diǎn)。SEQID NO:21是野生型spr基因的序列，包括信號(hào)序列，S卩，前26個(gè)氨基酸殘基。SEQID NO: 22是非突變spr基因序列，不包括信號(hào)序列。SEQID NO: 23是突變OmpT序列的核苷酸序列，包括D210A和H212A突變。SEQID NO: 24是突變OmpT序列的氨基酸序列，包括D210A和H212A突變。SEQID NO: 25是突變敲除OmpT序列的核苷酸序列。SEQID NO:26是帶his標(biāo)簽的DsbC的核苷酸序列。SEQID NO:27是帶his標(biāo)簽的DsbC的氨基酸序列。SEQID NO:28 顯示了 hTNF40 的 CDRHl 氨基酸序列。SEQID NO: 29顯示了 hTNF40的CDRH2的氨基酸序列，其為雜合CDR，其中C-端六個(gè)氨基酸來自人亞群3種系抗體(human subgroup3)的H2⑶R序列，且由此雜合產(chǎn)生的序列中氨基酸變化由下劃線標(biāo)出，如下WINITIGEPI YADSXKG。SEQID NO:30 顯示了 hTNF40 的 CDRH3 氨基酸序列。SEQID NO:31 顯示了 hTNF40 的 CDRLl 氨基酸序列。SEQID NO:32 顯示了 hTNF40 的 CDRL2 氨基酸序列。SEQID NO:33 顯示了 hTNF40 的 CDRL3 氨基酸序列。SEQID NO:34 顯示了 hTNF40 的 CDRH2 氨基酸序列。
SEQ ID N0:35顯示了 OmpA寡核苷酸轉(zhuǎn)接子的序列。SEQ ID N0:36顯示了編碼用于大腸桿菌Fab表達(dá)的基因間序列I (IGSl)的寡核苷酸盒。SEQ ID NO: 37顯示了編碼用于大腸桿菌Fab表達(dá)的基因間序列2 (IGS2)的寡核苷
酸盒。 SEQ ID NO: 38顯示了編碼用于大腸桿菌Fab表達(dá)的基因間序列3 (IGS3)的寡核苷酸盒。SEQ ID NO: 39顯示了編碼用于大腸桿菌Fab表達(dá)的基因間序列4 (IGS4)的寡核苷酸盒。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式詳述本發(fā)明提供了適合于表達(dá)目的蛋白質(zhì)的重組的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其包含突變spr基因及非重組野生型染色體Tsp基因。出乎意料地發(fā)現(xiàn)與野生型細(xì)胞相比或包含突變Tsp基因的細(xì)胞，攜帶突變spr及非重組野生型染色體Tsp的細(xì)胞顯示出細(xì)胞生長的改善，并顯示出降低的細(xì)胞裂解表型。進(jìn)ー步地，在一個(gè)實(shí)施方式中，與野生型細(xì)胞相比或包含突變Tsp基因的細(xì)胞，攜帶突變spr及非重組野生型染色體Tsp的細(xì)胞顯示出目的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的提高。提高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量可以是細(xì)胞周質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量及/或上清蛋白質(zhì)產(chǎn)量。在一個(gè)實(shí)施方式中，由于細(xì)胞滲漏減少，本發(fā)明的細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比顯示出提高的細(xì)胞周質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。由于細(xì)胞裂解減少，重組細(xì)菌細(xì)胞能夠延長地表達(dá)目的重組蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選地在細(xì)胞周質(zhì)及/或培養(yǎng)基中表達(dá)的目的蛋白質(zhì)的最大產(chǎn)量為大約 I. 0g/L、l. 5g/L、l. 8g/L、2. 0g/L、2. 4g/L、2. 5g/L、3. 0g/L、3. 5g/L 或 4. Og/L。與已知的遺傳工程改造菌株，如蛋白酶缺陷細(xì)菌菌株(先前產(chǎn)生此種菌株用以表達(dá)重組蛋白質(zhì))相關(guān)的缺點(diǎn)包括使用了參與細(xì)胞新陳代謝及DNA復(fù)制的基因突變，例如，大腸桿菌菌株中的phoA、fhuA、lac、rec、gal、ara、arg、thi和pro。這些突變可以對宿主細(xì)胞具有很多有害作用，包括對細(xì)胞生長、穩(wěn)定性、重組蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)量及毒性的作用。具有一種或多種這些基因組突變的菌株，特別是具有大量這些突變的菌株可以喪失健康，這使得細(xì)菌生長速率降低到不適合エ業(yè)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)的水平。進(jìn)ー步地，任何以上基因組突變可以以不可預(yù)測的有害方式順式或反式影響其他基因并由此改變菌株表型、健康以及蛋白質(zhì)概況。進(jìn)一歩地，使用嚴(yán)重突變的細(xì)胞一般不適合于生產(chǎn)用于商業(yè)化的重組蛋白質(zhì)，尤其是用于治療的蛋白質(zhì)，因?yàn)檫@些菌株一般具有缺陷的代謝途徑，因此在基本或化學(xué)限定的培養(yǎng)基中生長不良或根本不生長。在本發(fā)明ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞只攜帯能夠引入spr突變體的基因組最小突變。在此實(shí)施方式中，細(xì)菌細(xì)胞的基因組與野生型細(xì)菌細(xì)胞基因組的差異只有對spr基因的一個(gè)或兩個(gè)突變，且不攜帯任何其他可以對細(xì)胞生長和/或表達(dá)目的蛋白質(zhì)能力有不利作用的突變。因此，相比于包含對基因組序列有進(jìn)ー步遺傳工程改造突變的細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明的一種或多種重組宿主細(xì)胞展示了改進(jìn)的蛋白質(zhì)表達(dá)和/或改進(jìn)的生長特征。相比于包含對細(xì)胞基因組的其他破壞的細(xì)胞，本發(fā)明提供的細(xì)胞還更適合于用于產(chǎn)生治療用蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其含有編碼突變spr蛋白質(zhì)的突變spr基因，其中除了突變spr基因外細(xì)胞的基因組與野生型細(xì)菌細(xì)胞基因組是同基因的。在本發(fā)明的這個(gè)方面，所述細(xì)胞攜帯野生型Tsp基因。野生型染色體Tsp基因優(yōu)選地為非重組染色體Tsp基因。技術(shù)人員可容易地使用本領(lǐng)域熟知的方法，包括發(fā)酵方法、ELISA及蛋白質(zhì)G hplc，測試候選的細(xì)胞克隆以確定其是否具有目的蛋白質(zhì)的所需要產(chǎn)量。合適的發(fā)酵方法描述于 Humphreys D P 等人(1997)。Formation of dimeric Fabs inE. coli: effect of hinge size and isotype,presence of interchain disulphidebond，F(xiàn)ab’ expression levels,tail piece sequences and growth conditions.J. IMMUNOL. METH. 209:193-202;Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N.BoweringL.Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichiacoli,Journal Article. Research Support, Non-U. S. Govi t Journal of Biotechnology. I35 (4):358-65，2008 Jul 31;Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. Similarityof the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceuticalfermentation processes. [Journal Article]Proteomics. I (9) : 1133-48, 2001Sep;以及Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U.Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S.Pluckthun A.Riesenberg D. High volumetric yields of functional dimericminiantibodies in Eschericnia coli, using an optimized expression vector andhigh—cell—density fermentation under non—limited growth conditions, Journa丄Article. Research Support, Non-U. S. Govi t Applied Microbiology & Biotechnology.46(5-6) :524-32, 1996Dec。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地使用本領(lǐng)域熟知方法，如蛋白質(zhì)GHPLC、圓二色譜、NMR，X-光晶體成像及表位親和カ測量方法，測試分泌蛋白質(zhì)以確定蛋白質(zhì)是否正確折疊。在本發(fā)明ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞進(jìn)ー步包含編碼DsbC的重組多核苷酸。
現(xiàn)在將以更詳細(xì)的方式描述本發(fā)明。除非上下文另有說明，術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文交換使用?！半摹币庥复?0個(gè)或更少的氨基酸。除非上下文另有說明，術(shù)語“多核苷酸”包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等。如本文所使用的，術(shù)語“包含”在本說明書的上下文中應(yīng)解釋為“包括”。在本發(fā)明的上下文中，非突變的細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞指的是與本發(fā)明重組革蘭氏陰性細(xì)胞相同類型的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞未被修飾為攜帯突變spr基因。例如，非突變細(xì)胞可為野生型細(xì)胞，并可與本發(fā)明細(xì)胞在進(jìn)行修飾引入任何所述突變之前衍生自相同的宿主細(xì)胞群體。詞句“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”及“菌株”可交換使用。詞句“包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型”在本發(fā)明上下文中指的是帶有突變Tsp基因的細(xì)胞所表現(xiàn)出的表型。一般地，包含突變Tsp基因的細(xì)胞會(huì)裂解，尤其是在高細(xì)胞密度下。這些細(xì)胞的裂解引起任何重組蛋白質(zhì)滲漏入上清。攜帯突變Tsp基因的細(xì)胞還可以顯示出在低滲透壓下的熱敏型生長。例如，細(xì)胞顯示不出生長速率或生長速率降低，或在高溫(如40°C或更高)下，細(xì)胞在低滲培養(yǎng)基中死亡。術(shù)語“同基因的”在本發(fā)明的上下文中指的是與所述細(xì)胞來源的野生型細(xì)胞相比，本發(fā)明細(xì)胞的基因組除了突變SPR基因外具有幾乎相同或相同的基因組序列。在此實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞基因組不包含其他非天然發(fā)生的或遺傳工程改造的突變。在ー個(gè)實(shí)施方式中，考慮到任何可以發(fā)生的天然發(fā)生的突變，與野生型細(xì)胞相比，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞除了突變spr基因外有幾乎相同的基因組序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，與野生型細(xì)胞相比，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞除了突變spr基因外可以具有完全相同的基因組序列。在其中細(xì)胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸的本發(fā)明實(shí)施方式中，編碼DsbC的重組多核苷酸可存在于轉(zhuǎn)化入細(xì)胞及/或整合入宿主細(xì)胞基因組的合適的表達(dá)載體上。在其中編碼DsbC的重組多核苷酸插入宿主基因組的實(shí)施方式中，由于插入的編碼DsbC的重組多核苷酸，本發(fā)明的細(xì)胞也與野生型細(xì)胞不同。優(yōu)選地，編碼DsbC的重組多核苷酸是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體中，因此對宿主細(xì)胞基因組造成破壞最小。術(shù)語“野生型”在本發(fā)明的上下文中指的是可以在自然中發(fā)生或可分離自環(huán)境而不攜帶任何遺傳工程改造突變的革蘭氏陰性細(xì)胞菌株。大腸桿菌野生型菌株的ー個(gè)實(shí)例為W3110，如 W3110K-12 菌株。 任何合適的革蘭氏陰性細(xì)菌都可用作生產(chǎn)本發(fā)明重組細(xì)胞的親本細(xì)胞。合適的革蘭氏陰性細(xì)菌包括鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、突光假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、志賀桿菌(Shigella)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)及大腸桿菌。優(yōu)選地,親本細(xì)胞為大腸桿菌。大腸桿菌的任何合適菌株可用于本發(fā)明，但優(yōu)選地所使用的為野生型W3110菌株，如K-12W3110。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了突變SPR基因外細(xì)胞與野生型大腸桿菌細(xì)胞如W3110是同基因的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞包含編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸。在此實(shí)施方式中，編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸可包含在轉(zhuǎn)化入細(xì)胞和/或整合入宿主細(xì)胞基因組的合適的表達(dá)載體內(nèi)。在編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸插入宿主基因組的實(shí)施方式中，由于插入的編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸，本發(fā)明的細(xì)胞與野生型細(xì)胞也不同。優(yōu)選地，多核苷酸是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體中，因此對宿主細(xì)胞基因組造成破壞最小。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞攜帯野生型Tsp基因。在本發(fā)明的ー個(gè)方面，細(xì)胞攜帯野生型非重組染色體Tsp基因。野生型非重組染色體Tsp基因指的是染色體Tsp基因，其不是使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建、產(chǎn)生或插入染色體的。如本文所使用的，“Tsp基因”指的是編碼蛋白酶Tsp (也稱為Prc)的基因，Tsp是一種能夠作用于青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)-3 (PBP3)及噬菌體尾巴蛋白質(zhì)的細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶。野生型Tsp基因的序列顯示于SEQ ID NO: 1，野生型Tsp蛋白質(zhì)序列顯示于SEQ ID N0:2。Spr蛋白質(zhì)為18kDa的膜結(jié)合細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶，spr的底物為Tsp及外膜中參與細(xì)胞分裂期間細(xì)胞壁水解的肽聚糖。Spr蛋白質(zhì)的野生型氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:21 (包含在N-端的信號(hào)序列)及SEQ ID NO:22 (不含26個(gè)氨基酸的信號(hào)序列)(根據(jù)UniProt登記號(hào)P0AFV4)。本發(fā)明中Spr蛋白質(zhì)的氨基酸編號(hào)包括信號(hào)序列。因此，spr蛋白質(zhì)的I號(hào)氨基酸為顯示于SEQID N0:21中的第一個(gè)氨基酸(Met)。
突變spr基因優(yōu)選地為細(xì)胞的染色體spr基因。突變spr基因編碼能夠抑制包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。攜帯突變Tsp基因的細(xì)胞可具有良好的細(xì)胞生長速率，但是這些細(xì)胞的一個(gè)限制在于其易于裂解，尤其在高細(xì)胞密度下。因此，包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型為易于裂解，尤其在高的細(xì)胞密度下。攜帯突變Tsp基因的細(xì)胞還顯示了低滲透壓下的熱敏型生長方式。然而，本發(fā)明的細(xì)胞所攜帯的spr突變在引入攜帯突變Tsp基因的細(xì)胞中時(shí)抑制了突變Tsp表型，因此，(尤其在高細(xì)胞密度下)細(xì)胞顯示出裂解減少。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地測量搖瓶或高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)中的細(xì)胞的生長表型。相比于攜帶Tsp突變 體及野生型spr的細(xì)胞，從提高的生長速率及/或重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)(尤其是細(xì)胞周質(zhì)中)上可見攜帶spr突變體及Tsp突變體的細(xì)胞展示出對細(xì)胞裂解表型的抑制?？蓪pr基因進(jìn)行任何合適的突變或多種突變產(chǎn)生能夠抑制包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。該活性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過產(chǎn)生攜帯突變spr基因及突變Tsp基因的細(xì)胞并將其表型與只攜帯突變Tsp基因的細(xì)胞相比較而進(jìn)行測試。對Tsp基因進(jìn)行的合適突變在下文有詳細(xì)描述。除非另有說明，提到突變Tsp基因或編碼Tsp的突變Tsp基因指的是編碼具有降低蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)的突變Tsp基因或者敲除突變的Tsp基因。詞句“編碼具有降低蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)的突變Tsp基因”指的是相比于野生型非突變Tsp基因，Tsp基因不具有完全的蛋白酶活性。突變Tsp基因編碼的Tsp蛋白質(zhì)具有野生型非突變Tsp蛋白質(zhì)的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低、或者5%或更低的蛋白酶活性。突變的Tsp基因可以編碼不具有蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)。細(xì)胞沒有染色體Tsp缺陷，S卩，Tsp基因序列未經(jīng)刪除或突變以阻止任何形式的Tsp蛋白質(zhì)表達(dá)。任何合適的突變可引入Tsp基因以產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。自革蘭氏陰性細(xì)菌表達(dá)的Tsp蛋白質(zhì)的蛋白酶活性可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過任何本領(lǐng)域合適的方法進(jìn)行測試，如描述于Keiler等人(Identification of Active Site Residuesof the Tsp Protease*THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 270, No. 48, Issue ofDecember I, pp. 28864 - 28868, 1995Kenneth C. Keiler和 Robert T. Sauer)的方法,其中測試了 Tsp的蛋白酶活性。Keiler等人(見上文)已經(jīng)報(bào)道Tsp的活性位點(diǎn)包含殘基S430、D441和K455，且殘基G375、G376、E433和T452對Tsp的結(jié)構(gòu)維持很重要。Keiler等人(見上文)報(bào)道其發(fā)現(xiàn)突變的 Tsp 基因 S430A、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A 和 T452A 不可檢測到蛋白酶活性。進(jìn)ー步報(bào)道突變的Tsp基因S430C顯示出野生型活性的大約5-10%。因此，產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)的Tsp突變可包含突變，如對殘基S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452中的ー種或多種進(jìn)行錯(cuò)義突變。優(yōu)選地，產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)的Tsp突變可包含突變，如對殘基S430，D441和K455中的ー種或多種進(jìn)行錯(cuò)義突變。因此，突變的Tsp基因可包含 對S430的突變；或 對D441的突變；或
對K455的突變；或·對S430和D441的突變；或·對S430和K455的突變；或·對D441和K455的突變;或 對S430、D441和K455的突變。S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452中的一個(gè)或多個(gè)可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，產(chǎn)生蛋白質(zhì)具有降低的蛋白酶活性。合適的突變的實(shí)例為S430A、S430C、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A和T452A。突變Tsp基因可包含對活性位點(diǎn)殘基的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)突變，例如基因可包含
· S430A 或 S430C;和/或.D441A;和/或· K455A 或 K455H 或 K455R。優(yōu)選地，Tsp基因包含點(diǎn)突變S430A或S430C。詞句“敲除突變Tsp基因”指的是所述基因包含ー個(gè)或多個(gè)突變由此導(dǎo)致此基因編碼的蛋白質(zhì)不表達(dá)，造成細(xì)胞中由所述敲除突變基因編碼的蛋白質(zhì)缺陷。敲除基因可部分或全部地轉(zhuǎn)錄，但不翻譯為編碼的蛋白質(zhì)。敲除突變的Tsp基因可以任何合適的方式，例如通過刪除、插入、點(diǎn)突變、錯(cuò)義、無義及移碼突變中ー種或多種方式進(jìn)行突變，使得蛋白質(zhì)不表達(dá)。例如，基因可通過將外源DNA序列如抗生素抗性標(biāo)記物插入基因編碼序列而被敲除。突變的Tsp基因可包含基因起始密碼子和/或位于基因起始密碼子下游、基因終止密碼子上游的ー個(gè)或多個(gè)終止密碼子的突變，由此阻止Tsp蛋白質(zhì)表達(dá)。對起始密碼子的突變可為起始密碼子核苷酸中ー個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)核苷酸的錯(cuò)義突變。備選地或另外地，起始密碼子可通過插入或刪除移碼突變進(jìn)行突變。Tsp基因在編碼序列的5’末端包含兩個(gè)ATG密碼子，其中兩個(gè)ATG密碼子之一或全部可通過錯(cuò)義突變而進(jìn)行突變。Tsp基因可在第二個(gè)ATG密碼子(3號(hào)密碼子)處突變?yōu)門CG，如圖9b所示。Tsp基因可備選地或另外地包含位于基因起始密碼子下游、基因終止密碼子上游的ー個(gè)或多個(gè)終止密碼子。優(yōu)選地，敲除突變Tsp基因包含起始密碼子的錯(cuò)義突變以及ー個(gè)或多個(gè)插入的終止密碼子。Tsp基因可突變以刪除第五個(gè)密碼子中的“T”而形成移碼，在11和16號(hào)密碼子處產(chǎn)生終止密碼子，如圖9b所示。Tsp還可突變?yōu)椴迦階seI限制性位點(diǎn)而在21號(hào)密碼子處產(chǎn)生第三個(gè)框內(nèi)終止密碼子，如圖9b所示。敲除突變的Tsp基因可具有SEQ ID NO: 3的DNA序列，其包括起始密碼子上游的 6個(gè)核苷酸ATGAAT。SEQ ID NO: 3的敲除突變Tsp序列中所作出的突變顯示于圖％。在一個(gè)實(shí)施方式中，突變的Tsp基因具有SEQ ID NO: 3的7-2048號(hào)核苷酸的DNA序列。因此，一旦鑒定出攜帯有合適的突變Tsp基因的細(xì)胞，即可鑒定產(chǎn)生能夠抑制包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)的合適spr基因突變。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式的細(xì)胞包含編碼spr蛋白質(zhì)的突變spr基因，其在選自 N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147、H157和W174的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變，更優(yōu)選地在選自C94、S95、 V98、Y115、D133、V135、H145、G147、H157和W174的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。優(yōu)選地，突變spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)在選自 N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147和H157的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變，更優(yōu)選地，在選自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。優(yōu)選地，突變SPR基因編碼的spr蛋白質(zhì)在選自 N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144 和G147的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變，更優(yōu)選地，在選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。在本發(fā)明的ー個(gè)方面，提供了革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其包含突變spr基因，編碼的spr 蛋白質(zhì)在選自 C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147 和 H157 的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變，優(yōu)選地，在選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變，其中的細(xì)胞包含野生型Tsp基因。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。
野生型染色體Tsp基因優(yōu)選地為非重組染色體基因。優(yōu)選地，細(xì)胞還包含編碼DsbC的重組多核苷酸。對ー個(gè)或多個(gè)以上氨基酸的突變可以是對編碼所述氨基酸的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸的任何合適的錯(cuò)義突變。突變將氨基酸殘基變成任何合適的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑制包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型的突變SPR蛋白質(zhì)。錯(cuò)義突變可將氨基酸變?yōu)橄啾扔谝吧桶被岵煌笮〖?或具有不同化學(xué)特性的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，突變是對C94、H145和H157構(gòu)成的催化單分子中的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行的突變(Solution NMR Structure of the NlpC/P60Domain ofLipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel CysteinePeptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008，47，9715-9717)。因此，突變SPR基因可包含 對C94的突變；或 對H145的突變；或 對H157的突變；或·對C94和H145的突變;或 對C94和H157的突變；或·對H145和H157的突變;或 對 C94、H145 和 H157 的突變。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。C94、H145和H157中的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑制包含突變的Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。例如，C94、H145和H157中的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可突變?yōu)樾“被崛鏕ly或Ala。因此，spr蛋白質(zhì)可具有C94A、H145A和H157A突變中的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。優(yōu)選地，spr基因包含錯(cuò)義突變H145A，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生能夠抑制包含突變的Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。對本文的置換突變體的標(biāo)記由字母+數(shù)字+字母構(gòu)成。第一個(gè)字母標(biāo)記野生型蛋白質(zhì)中的氨基酸。數(shù)字指的是進(jìn)行氨基酸置換的位置，第二個(gè)字母標(biāo)記用于置換野生型氨基酸的氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，突變spr蛋白質(zhì)包含在選自N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144 和 G147 的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處的突變，優(yōu)選地為選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處的突變。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。因此，突變SPR基因可包含 對N31的突變；或 對R62的突變；或·對170的突變；或 對Q73的突變；或· 對S95的突變；或 對V98的突變；或 對Q99的突變；或 對RlOO的突變；或 對L108的突變；或 對Y115的突變；或 對D133的突變；或 對V135的突變；或 對L136的突變；或 對G140的突變；或 對R144的突變；或 對G147的突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，突變SPR蛋白質(zhì)包含多重氨基酸突變*595和丫115;或· N31、Q73、R100 和 G140 ;或· Q73、R100 和 G140 ;或.RlOO 和 G140;或.Q73 和 G140;或.Q73 和 R100;或· R62、Q99 和 R144 ;或.Q99 和 R144。氨基酸N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144和G147中的一個(gè)或多個(gè)可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑制包含突變的Tsp 基因的細(xì)胞的表型的 spr 蛋白質(zhì)。例如，N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140和R144中的一個(gè)或多個(gè)可突變?yōu)樾“被崛鏕ly或Ala。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)包含以下突變中的ー個(gè)或多個(gè)N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D 或 V135G、L136P、G140C、R144C和G147C。優(yōu)選地，spr蛋白質(zhì)包含以下突變中的ー個(gè)或多個(gè)S95F、V98E、Y115F、D133A、V13 或V135G和G147C。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不含有任何其他突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)具有選自N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D 或 V135G、L136P、G140C、R144C 和 G147C 的ー個(gè)突變。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。在一個(gè)進(jìn)ー步的實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)具有多重突變,選自.S95F 和 Y115F;
· N31Y、Q73R、R100G 和 G140C;· Q73R、R100G 和 G140C;· R100G 和 G140C; .Q73R 和 G140C;.Q73R 和 R100G;· R62C、Q99P 和 R144C;或.Q99P 和 R144C。在一個(gè)實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)具有突變W174R。在一個(gè)備選的實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)不具有突變W174R。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞包含突變SPR基因以及編碼DsbC的
重組多核苷酸。如本文所使用的，“重組多肽”指的是使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。編碼DsbC的多核苷酸序列可與細(xì)菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的編碼DsbC的內(nèi)源序列同一。備選地，編碼DsbC的重組多核苷酸序列為野生型DsbC序列的突變形式，例如，其有移除的限制性位點(diǎn)，如EcoRI位點(diǎn)，及/或具有編碼his標(biāo)簽的序列。用于本發(fā)明的經(jīng)修飾DsbC核苷酸序列的實(shí)例顯示于SEQ ID NO: 26，其編碼帶his標(biāo)簽的DsbC氨基酸序列，顯示于SEQ ID NO: 27。在本發(fā)明的ー個(gè)方面，提供了革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其包含編碼突變spr蛋白質(zhì)的突變spr基因以及編碼DsbC的重組的多核苷酸，并且其中細(xì)胞包含野生型Tsp基因。野生型Tsp基因優(yōu)選地為非重組染色體Tsp基因。DsbC是ー種發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中的原核蛋白質(zhì),其催化大腸桿菌中二硫鍵的形成。DsbC的氨基酸序列長度為236 (包括信號(hào)肽)，分子量為25.6KDa (UniProtNo. POAEGeXDsbC于 1994年首次發(fā)現(xiàn)(Missiakas等人The Escherichia coli dsbC(xprA)gene encodes a periplasmic protein involved in aisulfiae bond formation, TheEMBO Journal vol 13, no 8，ρ2013_2020, 1994 以及 Shevchik 等人 Characterization ofDsdC, a periplasmic protein of Erwinia cnrysantnemi and Escnerichia coil withdisulfide isomerase activity, The EMBO Jounral vol 13,no 8，p2007_2012，1994)。已知其與催化ニ硫鍵形成的蛋白質(zhì)共表達(dá)以改善宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。W098/56930公開了用于在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)異源的含ニ硫鍵的多肽的方法，其中原核的ニ硫鍵異構(gòu)酶如DsbC或DsbG與真核多肽共表達(dá)。US6673569公開了ー種人工操縱子，其包含編碼DsbA、DsbB, DsbC和DsbD各個(gè)的多核苷酸，用于生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。EP0786009公開了用于在細(xì)菌中生產(chǎn)異源多肽的過程，其中在誘導(dǎo)編碼異源多肽的核酸表達(dá)之前誘導(dǎo)編碼DsbA或DsbC的核酸表達(dá)。 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在包含突變SPR基因及野生型Tsp基因的細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)編碼DsbC的重組多核苷酸這一特定組合提供了用于表達(dá)目的蛋白質(zhì)的改良的宿主。出乎意料地發(fā)現(xiàn)與野生型細(xì)胞相比或包含突變Tsp基因的細(xì)胞，所述新菌株顯示出増加的細(xì)胞生長速率及増加的細(xì)胞存活時(shí)間。具體地，相比于攜帶突變Tsp基因的細(xì)胞，攜帯重組DsbC基因、spr突變及野生型Tsp的細(xì)胞顯示出細(xì)胞裂解減少的表型。在一個(gè)實(shí)施方式中 ，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞還進(jìn)ー步表達(dá)如下的ー種或多種蛋白質(zhì)· 一種或多種能夠促進(jìn)細(xì)胞折疊的蛋白質(zhì)，如FkpA、Skp、SurA, PPiA和PPiD ;和/或· ー種或多種能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分泌或易位的蛋白質(zhì),如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep ;和 / 或· ー種或多種能夠促進(jìn)ニ硫鍵形成的蛋白質(zhì),如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。可將ー種或多種以上蛋白質(zhì)整合入細(xì)胞基因組且/或插入表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞不含有編碼以下一種或多種其他蛋白質(zhì)的重組多核苷酸· 一種或多種能夠促進(jìn)細(xì)胞折疊的蛋白質(zhì)，如FkpA、Skp、SurA, PPiA和PPiD ;和/或· ー種或多種能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分泌或易位的蛋白質(zhì),如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep ;和 / 或· ー種或多種能夠促進(jìn)ニ硫鍵形成的蛋白質(zhì),如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。在本發(fā)明ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)ー步包含突變DegP基因和/或突變Ptr基因和/或包含突變OmpT基因，所述突變DegP基因編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)，其中突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白質(zhì)或?yàn)榍贸蛔働tr基因，其中突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)或?yàn)榍贸蛔僌mpT基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供重組的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其包含a.突變spr基因；b.野生型非重組染色體Tsp基因；以及c.編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)的突變的DegP基因，和/或突變OmpT基因，其中突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)或?yàn)榍贸蛔僌mpT基因。優(yōu)選地，在此實(shí)施方式中，除了以上突變之外所述細(xì)胞與野生型細(xì)菌細(xì)胞是同基因的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，包含a.突變SPR基因；b.野生型非重組染色體Tsp基因；以及c.突變ptr基因和/或突變OmpT基因，其中突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白質(zhì)或?yàn)橥蛔働tr基因，其中突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)或?yàn)榍贸蛔僌mpT基因。優(yōu)選地，在此實(shí)施方式中，除了以上突變之外所述細(xì)胞與野生型細(xì)菌細(xì)胞是同基因的。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了細(xì)胞，包含a.突變SPR基因；b.野生型非重組染色體Tsp基因；c.編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)的突變DegP基因；d.突變ptr基因，其中突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白質(zhì)或?yàn)橥蛔働tr基因；以及e.任選地，突變OmpT基因，其中突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)或?yàn)榍贸蛔僌mpT基因。 優(yōu)選地，在此實(shí)施方式中，除了以上突變之外所述細(xì)胞與野生型細(xì)菌細(xì)胞是同基因的。在本發(fā)明ー個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞攜帶突變DegP基因。如本文所使用的，“DegP”指的是編碼DegP蛋白質(zhì)(也稱為HtrA)的基因，其具有作為分子伴侶和蛋白酶雙重功能(Families of serine peptidases ；Rawlings ND,Barrett AJ. MethodsEnzymol. 1994;244:19-61)。非突變DegP基因的序列顯示于SEQ ID NO: 7，非突變的DegP氣基酸序列顯不于SEQ ID N0:8。在低溫下，DegP起分子伴侶的作用，在高溫下，DegP偏向于起蛋白酶的作用(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a WidelyConserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339 - 347.SpiessC,Beil A, Ehrmann M 以及 The proteolytic activity of the HtrA(DegP)proteinfrom Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J 等人 Microbiology2008，154，3649-3658)。 在這些細(xì)胞包含DegP突變的實(shí)施方式中，細(xì)胞中的DegP突變提供了突變DegP基因，其編碼具有分子伴侶活性但不具有完全蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)。詞句“具有分子伴侶活性”在本發(fā)明的上下文中指的是與野生型非突變DegP蛋白質(zhì)相比，突變DegP蛋白質(zhì)具有相同或幾乎相同的分子伴侶活性。優(yōu)選地，突變DegP基因編碼的DegP蛋白質(zhì)具有野生型非突變DegP蛋白質(zhì)的50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高或者95%的分子伴侶活性。更優(yōu)選地，與野生型DegP相比，突變DegP基因編碼的DegP蛋白質(zhì)具有相同的分子伴侶活性。詞句“具有降低的蛋白酶活性”在本發(fā)明的上下文中指的是與野生型非突變DegP蛋白質(zhì)相比，突變DegP蛋白質(zhì)不具有完全的蛋白酶活性。優(yōu)選地，突變DegP基因編碼的DegP蛋白質(zhì)具有野生型非突變DegP蛋白質(zhì)50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。更優(yōu)選地，突變DegP基因編碼的DegP蛋白質(zhì)不具有蛋白酶活性。所述細(xì)胞不是染色體DegP缺陷的，即，DegP基因序列未經(jīng)刪除或突變以阻止任何形式的DegP蛋白質(zhì)的表達(dá)。任何合適的突變可引入DegP基因以產(chǎn)生具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。表達(dá)自革蘭氏陰性細(xì)菌的DegP蛋白質(zhì)的蛋白酶和分子伴侶活性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過任何合適的方法進(jìn)行測試，如描述于Spiess等人的方法，其中對DegP的蛋白酶和分子伴侶活性的測試在DegP的天然底物MalS上進(jìn)行(A Temperature-Dependentbwitch from しhaperone to Protease in a Widely しonserved Heat Shock Protein.Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M);以及在 Theproteolytic activity of the HtrA (DegP)protein from Escherichia coli at lowtemperatures, Skorko-Glonek J 等人 Microbiology 2008, 154, 3649-3658 中描述的方法。DegP為絲氨酸蛋白酶，其活性中心由Hisl05、Aspl35和Ser210的氨基酸殘基組成的催化三分子構(gòu)成(Families of serine peptidases, MethodsEnzymol. , 1994, 244:19-61Rawlings N and Barrett A)。產(chǎn)生具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP突變可包含的突變?nèi)鐚isl05、Aspl35和Ser210中ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)的錯(cuò)義突變。因此，突變DegP基因可包含 對Hisl05的突變；或 對Aspl35的突變；或·對Ser210的突變；或·對 Hisl05 和 Aspl35 的突變；或·對 His 105 和 Ser210 的突變；或·對 Aspl35 和 Ser210 的突變；或·對 Hisl05、Aspl35 和 Ser210 的突變。Hisl05，Aspl35和Ser210中的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，產(chǎn)生具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。例如，Hisl05，Aspl35和Ser210中的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可突變?yōu)樾“被崛鏕ly或Ala。其他合適的突變是將Hisl05，Aspl35和Ser210中的ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)變?yōu)榫哂邢喾刺匦缘陌被幔鏏spl35突變?yōu)長ys或Arg，極性的Hisl05突變?yōu)榉菢O性氨基酸如Gly、Ala、Val或Leu，而小分子親水性Ser210突變?yōu)榇蠓肿踊蚴杷詺埢鏥al，Leu, Phe或Tyr。優(yōu)選地，DegP基因包含點(diǎn)突變S210A，如圖9c中顯示，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生了具有分子伴侶活性但不具有蛋白酶活性的蛋白質(zhì)(Ai'emperature-Dependent bwitch from Chaperone to Protease in a Widely しonservedHeat Shock Protein.Cell, Volume 97,Issue 3,Pages 339 - 347. Spiess C,BeiIA, Ehrmann M)。DegP具有兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，PDZl (260-358號(hào)殘基)和TOZ2 (359-448號(hào)殘基)，其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(A Temperature-Dependent Switch from Chaperoneto Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue3, Pages 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M)。在本發(fā)明白勺一個(gè)實(shí)施方式中，將 DegP基因突變以刪除rozi結(jié)構(gòu)域和/或Η)Ζ2結(jié)構(gòu)域。rozi和roz2的刪除導(dǎo)致相比于野生型DegP蛋白質(zhì)，DegP蛋白質(zhì)的蛋白酶活性完全喪失，且分子伴侶活性降低，而刪除rozi或roZ2之ー導(dǎo)致相比于野生型DegP蛋白質(zhì)，具有5%的蛋白酶活性和類似的分子伴侶活性(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a WidelyConserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97,Issue 3, Pages 339 - 347.SpiessC, Beil A, Ehrmann M)。 突變DegP基因還可包含沉默的非天然發(fā)生的限制性位點(diǎn)，如Asel，以助于鑒定和篩選方法，例如，如圖9c所示。SEQ ID N0:9中提供了突變DegP基因的優(yōu)選序列，其包含點(diǎn)突變S210A及Ase I限制性標(biāo)記物位點(diǎn)，所編碼的蛋白質(zhì)序列顯示于SEQ ID NO: 10。SEQ ID NO:9的突變DegP序列中所作出的突變顯示于圖9c。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，其中細(xì)胞包含突變DegP基因，其編碼的DegP蛋白質(zhì)具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性，相對于其中DegP基因突變?yōu)榍贸鼶egP而阻止DegP表達(dá)(如染色體缺陷DegP)的突變細(xì)胞，本發(fā)明提供的ー種或多種細(xì)胞可以提供產(chǎn)自所述細(xì)胞正確折疊蛋白質(zhì)的提高的產(chǎn)量。在包含敲除突變DegP基因而阻止DegP表達(dá)的細(xì)胞中，DegP的分子伴侶活性完全喪失，而根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞中，DegP的分子伴侶活性得到保留，同時(shí)卻喪失了全部的蛋白酶活性。在這些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的一種或多種細(xì)胞具有降低的蛋白酶活性而阻止蛋白質(zhì)的蛋白水解作用，同時(shí)卻保留了分子伴侶活性以使蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中得以正確的折疊和運(yùn)輸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域已知方法容易地測試分泌的蛋白質(zhì)以確定蛋白質(zhì)是否正確折疊，所述方法如蛋白質(zhì)G HPLC、圓二色譜、NMR、X-光晶體成像和表位親和測量方法。 在這些方法中，相比于攜帶突變敲除DegP基因而阻止DegP表達(dá)的細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明的一種或多種細(xì)胞具有改善的細(xì)胞生長。不意欲受到任何理論的約束，由于保持分子伴侶活性的DegP蛋白酶增加細(xì)胞處理所有需要分子伴侶活性的蛋白質(zhì)的能力從而顯示出細(xì)胞生長改善。因此，相比于攜帶DegP敲除突變的細(xì)胞，在本發(fā)明的一種或多種細(xì)胞中，產(chǎn)生對細(xì)胞的生長和繁殖必需的正確折疊蛋白質(zhì)有所増加，由此改善調(diào)控生長的細(xì)胞途徑。進(jìn)一歩地，已知的DegP蛋白酶缺陷菌株一般為溫度敏感型，一般在超過大約28°C的溫度下不生長。然而，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞是非溫度敏感型，可在28°C或更高的溫度下生長，包括大約30°C -大約37°C的溫度，這些溫度一般用于細(xì)菌生產(chǎn)蛋白質(zhì)的エ業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。在本發(fā)明ー個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞攜帶突變ptr基因。如本文所使用的，“ptr基因”指的是編碼蛋白酶III的基因，其為降解高分子量蛋白質(zhì)的蛋白酶。非突變Ptr基因的序列顯示于SEQ ID N0:4，非突變蛋白酶III蛋白質(zhì)的序列顯示于SEQ ID N0:5。除非另有說明。提到突變ptr基因或編碼蛋白酶III的突變ptr基因時(shí)，指的是編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III的突變Ptr基因或敲除突變Ptr基因。詞句“編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III的突變Ptr基因”在本發(fā)明的上下文中指的是相比于野生型非突變Ptr基因，突變ptr基因不具有完全的蛋白酶活性。優(yōu)選地，突變ptr基因編碼的蛋白酶III具有野生型非突變蛋白酶III蛋白質(zhì)的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。更優(yōu)選地，突變Ptr基因編碼的蛋白酶III蛋白質(zhì)不具有蛋白酶活性。在此實(shí)施方式中，細(xì)胞在染色體Ptr上沒有缺陷，即ptr基因序列未經(jīng)刪除或突變而阻止任何形式蛋白酶III蛋白質(zhì)的表達(dá)。任何合適的突變可引入ptr基因以產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III。表達(dá)自革蘭氏陰性細(xì)菌的蛋白酶III蛋白質(zhì)的蛋白酶活性可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過任何本領(lǐng)域合適的方法進(jìn)行測試。詞句“敲除突變ptr基因”在本發(fā)明的上下文中指的是所述基因包含ー個(gè)或多個(gè)突變，由此導(dǎo)致此基因編碼的蛋白質(zhì)不表達(dá)，造成細(xì)胞中由所述敲除突變基因編碼的蛋白質(zhì)缺陷。敲除基因可部分或全部地轉(zhuǎn)錄，但不翻譯為編碼的蛋白質(zhì)。敲除突變Ptr基因可以以任何合適的方式，例如通過刪除、插入、點(diǎn)突變、錯(cuò)義、無義及移碼突變中ー種或多種方式進(jìn)行突變，使得蛋白質(zhì)不表達(dá)。例如，基因可通過將外源DNA序列如抗生素抗性標(biāo)記物插入基因編碼序列而被敲除。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，基因不是通過將外源DNA序列如抗生素抗性標(biāo)記物插入基因編碼序列而突變的。優(yōu)選地，蛋白酶III基因包含對基因起始密碼子的突變和/或形成位于基因起始密碼子下游、基因終止密碼子上游的ー個(gè)或多個(gè)終止密碼子的突變，由此阻止蛋白酶III蛋白質(zhì)的表達(dá)。對靶標(biāo)敲除基因起始密碼子進(jìn)行突變引起起始密 碼子功能的喪失，并由此確保靶標(biāo)基因在編碼序列的起始不含有合適的起始密碼子。對起始密碼子的突變可為起始密碼子核苷酸中ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸的錯(cuò)義突變。備選地或另外地，起始密碼子可通過插入或刪除移碼突變進(jìn)行突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，ptr基因突變使得ATG起始密碼子變?yōu)锳TT，如圖9a。敲除突變ptr基因可備選地或另外地包含位于基因起始密碼子下游、基因終止密碼子上游的ー個(gè)或多個(gè)終止密碼子。優(yōu)選地，敲除突變ptr基因包含對起始密碼子的錯(cuò)義突變以及一個(gè)或多個(gè)插入的終止密碼子。所述ー個(gè)或多個(gè)插入的終止密碼子優(yōu)選地為框內(nèi)終止密碼子。然而，所述ー個(gè)或多個(gè)插入的終止密碼子可備選地或另外地為框外密碼子。當(dāng)框外起始密碼子通過插入或刪除移碼突變轉(zhuǎn)變?yōu)榭騼?nèi)起始密碼子時(shí)，需要一個(gè)或多個(gè)框外終止密碼子以終止翻譯?？赏ㄟ^任何合適的突變引入所述ー個(gè)或多個(gè)終止密碼子，所述突變包括無義點(diǎn)突變和移碼突變。優(yōu)選地，可通過移碼突變和/或插入突變引入所述ー個(gè)或多個(gè)終止密碼子，優(yōu)選地通過以包含終止密碼子的序列置換基因序列的一段而實(shí)現(xiàn)。例如，可插入AseI限制性位點(diǎn)，其包含終止密碼子TAA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，將ptr基因突變以通過插入Ase I限制性位點(diǎn)而插入框內(nèi)終止密碼子，如圖9a所示。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，敲除突變ptr基因具有SEQ IDNO:6的DNA序列。在SEQ ID NO:6所示的敲除突變ptr基因序列中所作出的突變顯示于圖9a。上文描述的敲除突變具有優(yōu)勢，因?yàn)槠鋵Π袠?biāo)敲除基因位點(diǎn)上游或下游的染色體DNA造成最小的破壞或無破壞，且不需要插入和保留外源DNA，如抗生素抗性標(biāo)記物，這些可以影響細(xì)胞用于表達(dá)目的蛋白質(zhì)，尤其是治療性蛋白質(zhì)的合適度。因此，相比于通過將外源DNA插入基因編碼序列而敲除蛋白酶基因的細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明的一種或多種細(xì)胞可以顯示出改善的生長特征和/或蛋白質(zhì)表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞攜帶突變OmpT基因。如本文所使用的，“OmpT基因”指的是編碼蛋白酶OmpT (外膜蛋白酶T)的基因，其為外膜蛋白酶。野生型非突變OmpT基因的序列為SWISS-PROT P09169。除非另有說明，提到突變OmpT基因或編碼OmpT的突變OmpT基因時(shí)，指的是編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)的突變OmpT基因或敲除突變OmpT基因，詞句“編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)的突變OmpT基因”在本發(fā)明的上下文中指的是相比于野生型非突變OmpT基因，突變OmpT基因不具有完全的蛋白酶活性。突變OmpT基因可以編碼的OmpT蛋白質(zhì)具有野生型非突變OmpT蛋白質(zhì)的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。突變OmpT基因可以編碼不具有蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)。在此實(shí)施方式中，細(xì)胞在染色體OmpT上沒有缺陷，即OmpT基因序列未經(jīng)刪除或突變而阻止任何形式的OmpT蛋白質(zhì)的表達(dá)。任何合適的突變可引入OmpT基因以產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。表達(dá)自革蘭氏陰性細(xì)菌的OmpT蛋白質(zhì)的蛋白酶活性可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過任何本領(lǐng)域合適的方法進(jìn)行測試，如描述于Kramer等人(Identification of essentialaciaic residues οι outer membrane protease OmpT supports a novel activesite, FEBS Letters 505 (2001)426-430)和 Dekker 等人(Substrate Specitificity ofthe Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed PeptideLibraries, Biochemistry 2001,40，1694-1701)的方法。Kramer等人(Identifixation of active site serine and histidine residuesin Escherichia coliouter membrane protease OmpT FEBS Letters 2000468,220-224)已經(jīng)報(bào)道了 OmpT，公開了由丙氨酸置換絲氨酸、組氨酸和酸性殘基導(dǎo)致活性降低對于 Glu27、Asp97、Asp208或HislOl活性降低 10倍，對于Ser99活性降低 500倍，對于Asp83、Asp85、Asp210或His212活性降低 10000倍。Vandeputte-Rutten等人(Crystal Structureof the Outer Memorane Protease OmpT irom Escherichia coli suggests a novelcatalytic site, The EMBO Journal2001, Vol 20No 185033-5039)提出具有活性中心，包含 Asp83_Asp85 對以及 His212_Asp210 對。進(jìn)一步地，Kramer 等人(Lipopolysaccharideregions involved in the activation of Escherichia coli outer memorane proteaseOmpT, Eur. J. Biochem. FEBS 2002,269，1746-1752)公開了 L4 環(huán)中的 D208A、D210A、H212A、H212N、H212Q、G216K/K217G、K217T和R218L突變，這些都導(dǎo)致酶活性部分或幾乎全部喪失。因此，產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的OmpT突變可以包含的突變?nèi)鐚27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218 和 E250中ー個(gè)或多個(gè)殘基的錯(cuò)義突變。E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218和E250中一個(gè)或多個(gè)可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸以產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。例如，E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218和E250中的ー個(gè)或多個(gè)可突變?yōu)楸彼?。合適的突變的實(shí)例為E27A、D43A、D83A、D85A、D97A、S99A、H101AE111A、E136A、E193A、D206A、D208A、D210A、H212A、H212N、H212Q、G216K、K217G、K217T、R218L 和 E250A.在一個(gè)實(shí)施方式中，突變 OmpT 基因包含D210A和H212A突變。包含D210A和H212A突變的合適的突變OmpT序列顯示于SEQ IDN0:23。詞句“敲除突變OmpT基因”在本發(fā)明的上下文中指的是所述基因包含ー個(gè)或多個(gè)突變由此導(dǎo)致此基因編碼的蛋白質(zhì)不表達(dá)，造成細(xì)胞中由所述敲除突變基因編碼的蛋白質(zhì)缺陷。敲除基因可部分或全部地轉(zhuǎn)錄，但不翻譯為編碼的蛋白質(zhì)。敲除突變OmpT基因可以任何合適的方式，例如通過刪除、插入、點(diǎn)突變、錯(cuò)義、無義及移碼突變中ー種或多種方式進(jìn)行突變，使得蛋白質(zhì)不表達(dá)。例如，基因可通過將外源DNA序列如抗生素抗性標(biāo)記物插入基因編碼序列而被敲除。在一個(gè)實(shí)施方式中，OmpT基因包含對基因起始密碼子的突變和/或位于基因起始密碼子下游、基因終止密碼子上游的ー個(gè)或多個(gè)終止密碼子的突變，由此阻止OmpT蛋白質(zhì)的表達(dá)。對起始密碼子的突變可為起始密碼子核苷酸中ー個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸的錯(cuò)義突變。備選地或另外地，起始密碼子可通過插入或刪除移碼突變進(jìn)行突變。合適的突變敲除OmpT序列顯示于SEQ ID N0:24。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞不攜帶有敲除突變OmpT基因，如染色體ompT缺陷。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞不攜帶有敲除突變DegP基因，如染色體degP缺陷。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞不攜帯突變DegP基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞不攜帶敲除突變ptr基因，如染色體Ptr缺陷。包括敲除突變在內(nèi)的許多遺傳工程改造突變涉及使用抗生素抗性標(biāo)記物，這樣能夠選擇和鑒定成功突變的細(xì)胞。然而，使用抗生素抗性標(biāo)記物有大量的不利之處。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，突變基因可包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物位點(diǎn)。因此，spr基因及/或編碼具有分子伴侶活性而不具有蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)的突變DegP基因及/或突變Ptr基因及/或突變OmpT基因可突變?yōu)榘粋€(gè)或多個(gè)限制性標(biāo)記物位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)通過遺傳工程改造而進(jìn)入基因，其為非天然發(fā)生的。限制性標(biāo)記物位點(diǎn)是有利的，因?yàn)槠淠軌蚴沟脤Π璧娜旧w突變的正確修飾的細(xì)胞進(jìn)行選擇和鑒定。經(jīng)修飾攜帯ー個(gè)或多個(gè)所述突變基因的細(xì)胞可通過對來自細(xì)胞裂解物的基因組DNA進(jìn)行PCR而進(jìn)行分析，其中所用的寡核苷酸對設(shè)計(jì)為擴(kuò)增包含非天然發(fā)生的限制性標(biāo)記物位點(diǎn)的基因組DNA 區(qū)域。隨后將擴(kuò)增的DNA與能夠在非天然發(fā)生限制性標(biāo)記物位點(diǎn)消化DNA的合適的限制性酶孵育之前和之后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。用限制性酶孵育后產(chǎn)生的DNA片段證實(shí)了細(xì)胞已經(jīng)成功地修飾為攜帯所述ー個(gè)或多個(gè)突變的基因。在細(xì)胞包含具有SEQ ID NO:6的DNA序列的敲除突變ptr基因的實(shí)施方式中，SEQID N0:17和SEQ ID NO: 18中所示的寡核苷酸引物序列可用于擴(kuò)增來自轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因組DNA中包含非天然發(fā)生的AseI限制性位點(diǎn)的DNA。擴(kuò)增的基因組DNA然后可與Ase I限制性酶一同孵育并通過凝膠電泳進(jìn)行分析以證實(shí)基因組DNA中有突變ptr基因存在。在細(xì)胞包含具有SEQ ID N0:9的DNA序列的敲除突變DegP基因的實(shí)施方式中，SEQID N0:19和SEQ ID NO: 20中所示的寡核苷酸引物序列可用于擴(kuò)增來自轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因組DNA中包含非天然發(fā)生的Ase I限制性位點(diǎn)的DNA。擴(kuò)增的基因組DNA然后可與Ase I限制性酶一同孵育并通過凝膠電泳進(jìn)行分析以證實(shí)基因組DNA中有突變DegP基因存在。一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)可通過任何合適的突變而引入，包括刪除、插入、點(diǎn)突變、錯(cuò)義、無義和移碼突變中的ー種或多種。限制性位點(diǎn)可通過對起始密碼子的突變及/或引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子的突變而引入，如上文所描述的。此實(shí)施方式是有利的，因?yàn)橄拗菩詷?biāo)記物位點(diǎn)是所弓I入的敲除突變的直接且唯一的標(biāo)記物?？刹迦氚騼?nèi)終止密碼子的限制性標(biāo)記物位點(diǎn)，如Ase I限制性位點(diǎn)。這一點(diǎn)尤其有利，因?yàn)椴迦氲南拗菩晕稽c(diǎn)同時(shí)起到限制性標(biāo)記物位點(diǎn)以及終止密碼子的作用，以阻止基因編碼序列的完全轉(zhuǎn)錄。例如，在通過引入Ase I位點(diǎn)向ptr基因引入終止密碼子的實(shí)施方式中，這還制造出限制性位點(diǎn)，如圖9a所示。
可通過突變起始密碼子和任選地ー個(gè)或多個(gè)其他點(diǎn)突變，將限制性標(biāo)記物位點(diǎn)插入。在此實(shí)施方式中，限制性標(biāo)記物位點(diǎn)優(yōu)選地為EcoR I限制性位點(diǎn)。這一點(diǎn)有其有利，因?yàn)閷ζ鹗济艽a子的突變還制造出限制性標(biāo)記物位點(diǎn)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，Ptr基因的起始密碼子變?yōu)锳TT,這制造出Eco R I標(biāo)記物位點(diǎn)，如圖9a所示。在細(xì)胞攜帶突變OmpT基因的本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述ー個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)可通過任何合適的突變引入，所述突變包括刪除、插入、點(diǎn)突變、錯(cuò)義、無義和移碼突變中的ー種或多種。例如，在OmpT基因包含D210A和H212A突變的實(shí)施方式中，這些突變引入的沉默的HindIII限制性位點(diǎn)，其可用作選擇性標(biāo)記物。在突變SPR基因和突變DegP基因中，標(biāo)記物限制性位點(diǎn)可使用沉默密碼子改變而引入。例如，AseI位點(diǎn)可用作沉默限制性標(biāo)記物位點(diǎn)，其中TAA終止密碼子在框外，如圖9c所示的DegP序列。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，其中ptr基因突變?yōu)榫幋a具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III，可使用沉默密碼子改變引入一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物限制性位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞可通過任何合適的方式產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可用于將染色體基因序列用突變的基因序列置換而引入spr突變體基因的合適的技木。可采用合適的載體，其能通過同源重組整合入宿主染色體。合適的基因置換的方法描述于，例如，Hamilton等人(New Method forvenerating Deletions and bene Replacements in Escherichia coli, Hamilton し· M.等人，Journal of Bacteriology Sept.1989,Vol. 171, No. 9p 4617-4622)、Skorupski 等入(Positive selection vectors for allelic exchange, bkorupski K 矛ロ TaylorR.K.，Gene, 1996，169，47-52)、Kiel 等人(A general method for the constructionof Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmidsegregation, Kiel J. A. K. ff.等人 Mol Gen Genet 1987，207:294-301 )、Blomfield 等人(Allelic exchange in Escherichia coil using the Bacillus subtilis sacB geneand a temperature sensitive pSClOl replicon, Blomfield I. C.等人,MolecularMicrobiology 1991，5 (6)，1447-1457)以及Ried等人(An nptl-sacB-sacR cartridge forconstructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by markerexchange-eviction mutagenesis, Ried J. L. and Collmer A. , Gene 57(1987)239-246)。能使同源重組/置換發(fā)生的合適質(zhì)粒為pK03質(zhì)粒(Link等人，1997，Journal ofBacteriology, 179, 6228-6237)。在細(xì)胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸的實(shí)施方式中，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可用于插入編碼DsbC的重組多核苷酸的合適技術(shù)?？墒褂煤线m的載體如pK03質(zhì)粒，將編碼DsbC的重組多核苷酸整合入細(xì)胞基因組。在細(xì)胞包含編碼目的蛋白質(zhì)的重組多核苷酸的實(shí)施方式中，本領(lǐng)域技術(shù)人員也了解可用于插入編碼目的蛋白質(zhì)的重組多核苷酸的合適技木。可使用合適的載體如PK03質(zhì)粒，將編碼目的蛋白質(zhì)的重組多核苷酸整合入細(xì)胞基因組。備選地或另外地，編碼DsbC的重組多核苷酸和/或編碼目的蛋白質(zhì)的重組多核苷酸可以不整合在重組表達(dá)盒中。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明采用了表達(dá)盒，以攜帶編碼DsbC和/或目的蛋白質(zhì)的多核苷酸以及ー種或多種調(diào)控表達(dá)序列。所述ー種或多種調(diào)控表達(dá)序列可包含啟動(dòng)子。所述ー種或多種調(diào)控表達(dá)序列還可包含3’不翻譯區(qū)如終止序列。合適的啟動(dòng)子在下文詳細(xì)討論。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明采用表達(dá)盒以攜帯編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸和/或編碼DsbC的重組多核苷酸。表達(dá)盒一般包含ー種或多種調(diào)控表達(dá)序列、編碼ー種或多種目的蛋白質(zhì)的ー種或多種編碼序列及/或編碼DsbC的編碼序列。所述ー種或多種調(diào)控表達(dá)序列可包括啟動(dòng)子。所述ー種或多種調(diào)控表達(dá)序列還可包含3’不翻譯區(qū)如終止序列。合適的啟動(dòng)子在下文詳細(xì)討論。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞包含ー種或多種載體，如質(zhì)粒。載體優(yōu)選地包含ー種或多種如上文限定的表達(dá)盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列和編碼DsbC的多核苷酸插入到ー個(gè)載體中。備選地，編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列和編碼DsbC的多核苷酸插入到分別的載體中。在目的蛋白質(zhì)為包含重鏈和輕鏈的抗體的實(shí)施方式中，可以用兩種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞 系，第一種載體編碼了輕鏈多肽，第二種載體編碼重鏈多肽。備選地，可使用單ー載體，此載體包括編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。備選地，編碼抗體的多核苷酸序列和編碼DsbC的多核苷酸插入到ー種載體。優(yōu)選地，此載體包含編碼抗體的輕鏈和重鏈多肽的序列。在細(xì)胞還表達(dá)ー種或多種其他如下蛋白質(zhì)的實(shí)施方式中， 一種或多種能夠促進(jìn)細(xì)胞折疊的蛋白質(zhì)，如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD;和/或· ー種或多種能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分泌或易位的蛋白質(zhì),如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep;和/或· ー種或多種能夠促進(jìn)ニ硫鍵形成的蛋白質(zhì),如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。所述ー種或多種其他蛋白質(zhì)可表達(dá)自ー種或多種與編碼DsbC的多核苷酸和/或編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列插入相同載體的多核苷酸。備選地，所述ー種或多種多核苷酸可插入分別的載體。用于本發(fā)明的載體可通過將如上文限定的一種或多種表達(dá)盒插入合適的載體而產(chǎn)生。備選地，用于指導(dǎo)多核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控表達(dá)序列可包含于載體中，因此，要完整地構(gòu)建載體只需要多核苷酸的編碼區(qū)域。合適地，編碼DsbC的多核苷酸和/或編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸插入可復(fù)制載體，一般為自主復(fù)制載體，以在細(xì)胞的合適的啟動(dòng)子控制下在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。本領(lǐng)域已知許多載體可用于此目的，選擇合適的載體取決于核酸大小以及特定的細(xì)胞類型。可用來將根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞的載體的實(shí)例包括·質(zhì)粒，如 pBR322 或 pACYC184 和/或·病毒載體如細(xì)菌噬菌體·轉(zhuǎn)座遺傳元件如轉(zhuǎn)座子這些載體通常包含DNA復(fù)制的質(zhì)粒起點(diǎn)、抗生素選擇性標(biāo)記物、啟動(dòng)子以和及轉(zhuǎn)錄終止子，由多克隆位點(diǎn)分隔開(表達(dá)盒)以及編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列。本發(fā)明采用的啟動(dòng)子可直接與相關(guān)的多核苷酸相連，或備選地可位于恰當(dāng)?shù)奈恢?，例如位于載體中，使得當(dāng)相關(guān)多核苷酸插入時(shí)，相關(guān)的啟動(dòng)子可對其起作用。在ー個(gè)實(shí)施方式中，啟動(dòng)子位于其作用的多核苷酸編碼部分之前，例如，相關(guān)的啟動(dòng)子在多核苷酸各個(gè)編碼部分之前。如本文所使用的，“在……之前”意為啟動(dòng)子位于相對編碼多核苷酸部分的5引物端。啟動(dòng)子可以為宿主細(xì)胞內(nèi)源或外源的。合適的啟動(dòng)子包括Lac、tac、trp、PhoA、Ipp、Arab、Tet 和 T7。所使用的一種或多種啟動(dòng)子可為可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
在其中的編碼DsbC的多核苷酸及編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸插入ー個(gè)載體的實(shí)施方式中，編碼DsbC和目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列可處于單一的啟動(dòng)子或分別的啟動(dòng)子的控制之下。在其中編碼DsbC和目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列處于分別的啟動(dòng)子控制下時(shí)，啟動(dòng)子可為獨(dú)立的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。用于細(xì)菌系統(tǒng)的表達(dá)單位通常還包含Shine-Dalgamo (S. D.)序列，其可操作地連接于編碼目的多肽的DNA。啟動(dòng)子可通過限制性酶消化從細(xì)菌來源的DNA移除并插入包含所需的DNA的載體。在其中的多核苷酸序列包含用于兩種或更多目的蛋白質(zhì)(例如抗體輕鏈和抗體重鏈)的兩種或更多編碼序列的本發(fā)明的實(shí)施方式中，多核苷酸序列可包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)核糖體插入位點(diǎn)(IRES)序列，其使得能夠在mRNA的中間起始翻譯。IRES序列可位于編碼的多核苷酸序列之間，以增強(qiáng)mRNA分別翻譯而產(chǎn)生多種編碼的多肽序列。表達(dá)載體優(yōu)選地還包含用于產(chǎn)生抗體或其抗原結(jié)合片段的雙順反子信息，如WO03/048208或W02007/039714 (其內(nèi)容并入本文作為參考)中所描述。優(yōu)選地，上游的順反子包含編碼抗體輕鏈的DNA，下游順反子包括編碼對應(yīng)的重鏈的DNA，雙順反子基因間序列(IGS)優(yōu)選地包含選自 IGSl (SEQ ID NO: 36)、IGS2 (SEQ ID NO: 37)、IGS3 (SEQ ID NO: 38)和 IGS4(SEQ ID NO:39)的序列。終止子可以是宿主細(xì)胞內(nèi)源或外源的。合適的終止子為rrnB。進(jìn)ー步的合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子包括啟動(dòng)子和終止子，蛋白質(zhì)靶向方法可見于“strategies for Achieving High-Level Expression of benes in Escherichiacoli” Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996,p 512-538。插入表達(dá)載體的DsbC多核苷酸優(yōu)選地包含編碼DsbC信號(hào)序列的核酸以及DsbC編碼序列。所述載體優(yōu)選地包含能夠使得載體在一種或多種所選的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，優(yōu)選地，其能夠不依賴宿主染色體而復(fù)制。對于多種細(xì)菌這樣的序列已經(jīng)熟知。在一個(gè)實(shí)施方式中，DsbC及/或目的蛋白質(zhì)在N-端及/或C-端包含組氨酸標(biāo)簽。抗體分子可分泌自細(xì)胞或通過合適的信號(hào)序列進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)。備選地，抗體分子可在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累。優(yōu)選地，抗體分子進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)。編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸可與另ー種多肽融合表達(dá)，另ー種多肽優(yōu)選地為信號(hào)序列或其他在成熟多肽的N-端具有特異性剪切位點(diǎn)的多肽。所選擇的異源信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)為可以被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工的肽。對于不能識(shí)別并加工原生或真核多肽信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，則用原核信號(hào)序列置換信號(hào)序列。合適的信號(hào)序列包括0mpA、PhOA、LamB、PelB、DsbA 和 DsbC。構(gòu)建包含ー種或多種上文列出的組分的合適的載體采用了標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)。對分離的質(zhì)?；駾NA片段進(jìn)行剪切、加尾并連接為產(chǎn)生所需質(zhì)粒要求的形式。在本發(fā)明ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了多順反子載體，其包含編碼DsbC的多核苷酸序列以及編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。多順反子載體可通過有利的克隆方法產(chǎn)生，其使多核苷酸序列以重復(fù)順序地克隆進(jìn)入載體。所述方法利用了一對限制性位點(diǎn)的可兼容末端，如AseI和NdeI限制性位點(diǎn)的“AT”末端。包含編碼序列并具有可兼容粘性末端的多核苷酸如AseI-NdeI片段，可克隆入載體中的限制性位點(diǎn)，如Ndel。多核苷酸序列的插入破壞了 5’限制性位點(diǎn)但創(chuàng)造出一個(gè)新的3’限制性位點(diǎn)，如Ndel，然后可插入包含可兼容粘性末端的其他多核苷酸序列。此過程然后可進(jìn)行重復(fù)以插入其他序列。插入載體的每段多核苷酸序列包含終止密碼子3’方向的非編碼序列，這段序列可包含Ssp I位點(diǎn)用以進(jìn)行選擇、Shine-Dalgarno核糖體結(jié)合序列、富含A的間隔子和編碼起始密碼子的NdeI位點(diǎn)。構(gòu)建包含編碼抗體輕鏈(LC)、抗體重鏈(HC)、DsbC多核苷酸序列以及進(jìn)一步的多核苷酸序列的載體示意圖顯示于圖10。成功突變的菌株可使用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行鑒定，包括菌落PCR DNA測序以及菌落PCR限制性酶切作圖。 在其中細(xì)胞包含兩種或更多種突變基因的實(shí)施方式中，突變的蛋白酶可在相同或不同載體上引入革蘭氏陰性細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞不攜帶敲除突變OmpT基因，如染色體ompT缺陷。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可以進(jìn)一歩包含編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可以為外源或內(nèi)源的。編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可整合入宿主染色體或可非整合的存在于載體中，通常為質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)。“目的蛋白質(zhì)”在本發(fā)明的上下文中意欲指代用于表達(dá)的多肽，通常為重組多肽。然而，目的蛋白質(zhì)可以為表達(dá)自宿主細(xì)胞中內(nèi)源基因的內(nèi)源蛋白質(zhì)。如本文所使用的，“重組多肽”指的是使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。目的蛋白質(zhì)可以為表達(dá)自外源載體的與內(nèi)源蛋白質(zhì)同一的外源序列或其突變形式(例如，其具有減弱的生物活性)或其片段。備選地，目的蛋白質(zhì)可為并非宿主細(xì)胞正常表達(dá)的異源蛋白質(zhì)。目的蛋白質(zhì)可以為任何合適的蛋白質(zhì)，包括治療性、預(yù)防性或診斷性蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)可用于治療包括炎性疾病及障礙、免疫疾病及障礙、纖維化障礙以及癌癥在內(nèi)的疾病或障礙。術(shù)語“炎性疾病”或“障礙”以及“免疫疾病或障礙”包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、斯蒂爾病(still’s disease)、Muckle Wells病、牛皮癖、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)、哮喘、過敏性關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、多發(fā)性硬化、脈管炎、I型糖尿病、器官移植以及移植物抗宿主病。術(shù)語“纖維化障礙”包括特發(fā)性肺纖維化(IPF)、系統(tǒng)性硬化(或硬皮病)、腎纖維化、糖尿病腎病、IgA腎病、高血壓、晩期腎病、腹膜纖維化(持續(xù)不臥床腹膜透析)、肝硬化、老年性黃斑退化癥(ARMD)、視網(wǎng)膜病、心反應(yīng)性纖維化、瘢痕、瘢痕瘤(keloid)、燒傷、皮膚潰瘍、血管成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈架搭橋術(shù)、關(guān)節(jié)成形術(shù)以及白內(nèi)障手木。術(shù)語“癌，，包括產(chǎn)生自上皮的惡性新生生長，其見于皮膚，或更通常地見于身體器官內(nèi)膜(lining)，例如乳腺、卵巣、前列腺、腎、胰腺、胃、膀胱或腸。癌傾向于浸潤進(jìn)入臨近阻止病擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)到遠(yuǎn)處器官，例如至骨、肝臟、肺或腦。所述蛋白質(zhì)可以為蛋白水解敏感型多肽，即，易于裂解、對裂解易感，或在原生狀態(tài)或在分泌過程中被一種或多種革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌、蛋白酶裂解。在一個(gè)實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)對選自DegP、蛋白酶III和Tsp的蛋白酶具有蛋白水解敏感性。在ー個(gè)實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)對蛋白酶Tsp具有蛋白水解敏感性。在一個(gè)實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)對蛋白酶DegP和蛋白酶III具有蛋白水解敏感性。在一個(gè)實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)對蛋白酶DegP和Tsp具有蛋白質(zhì)水解敏感性。在一個(gè)實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)對蛋白酶Tsp和蛋白酶III具有蛋白質(zhì)水解敏感性。在一個(gè)實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)對蛋白酶DegP、蛋白酶III和Tsp具有蛋白質(zhì)水解敏感性。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)為真核多肽。
由根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白質(zhì)可以是例如為免疫原，包含兩種異源蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)或抗體。作為目的蛋白質(zhì)的抗體包括單克隆、多價(jià)、多特異性、人源化、全長人抗體或嵌合抗體。所述抗體可來自任何物種，但其優(yōu)選地衍生自單克隆抗體、人抗體或人源化片段。抗體可衍生自免疫球蛋白分子的任何種型(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亞型，可獲自任何物種包括例如小鼠、大鼠、鯊魚、兔、豬、倉鼠、駱騎、美洲駝(Ilama)、山羊或人?？贵w片段的各個(gè)部分可獲自超過ー種物種，例如，抗體片段可以是嵌合的。在ー個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)來自一個(gè)物種而可變區(qū)來自另一物種?？贵w可以為具有全長重鏈和輕鏈或其片段，例如VH、VL、VHH、Fab、修飾的Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv片段、Fab-Fv的完整的抗體分子，或雙重特異性抗體如Fab_dAb，描述于 PCT/GB2008/003331?？贵w可特異于任何靶標(biāo)抗原?？贵w可以為細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，其存在于細(xì)胞上如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞；或其可為可溶性蛋白質(zhì)。目的抗原也可為任何醫(yī)療相關(guān)蛋白質(zhì)如在疾病或感染中上調(diào)的那些蛋白質(zhì)，例如受體及/或其對應(yīng)配體。細(xì)胞表面蛋白的具體實(shí)例包括粘附分子，例如整合素如β 整合素(如VLA-4)、E-選擇素、P-選擇素或L-選擇素、⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、⑶8、⑶I la、⑶I Ib、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、CSFl 或 CSFl-受體、DPCRl、DPCRl、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787, HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、nectin-樣蛋白 2、NKCC1、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、胚癌抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFG1和2)、1型MHC及II型MHC抗原、KDR和VEGF，恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候還包括其受體。可溶性抗原包括白介素如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16或IL-17，如IL17A和/或IL17F，病毒抗原如呼吸道合胞體病毒或巨細(xì)胞病毒抗原，免疫球蛋白如IgE，干擾素如α-干擾素、干擾素或Y-干擾素，腫瘤壞死因子TNF(之前稱為腫瘤壞死因子-α )，腫瘤壞死因子-β，集落刺激因子如G-CSF或GM-CSF，以及血小板衍生生長因子如I3DGF-α和PDGF-β，恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候還包括其受體。其他抗原包括細(xì)菌細(xì)胞表面抗原，細(xì)菌毒素，病毒如流感病毒、EBV、HepA、B和C，生化武器試劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液及毒素。
在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體可用于功能性地改變目的抗原的活性。例如，抗體可直接或間接地中和、拮抗或抵消所述抗原的活性。在本發(fā)明的ー個(gè)方面，提供了重組的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其包含編碼突變SPR蛋白質(zhì)的突變SPR基因，野生型Tsp基因以及編碼特異于TNF的抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸徐良。野生型染色體Tsp基因優(yōu)選地為非重組染色體Tsp基因。優(yōu)選地，細(xì)胞進(jìn)ー步包含編碼DsbC的重組多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，由根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白質(zhì)為抗-TNF抗體，更優(yōu)選地為抗-TNF Fab’，如W001/094585中所描述的(其內(nèi)容并入本文作為參考)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體具有針對人TNFa的特異性，其包含的重鏈中可變結(jié)構(gòu)域包含的CDR具有SEQ ID NO: 28所示的CDRHl序列，SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 34所示的CDRH2序列或SEQ ID NO:30所示的CDRH3序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包含的輕鏈中的可變結(jié)構(gòu)域包含的⑶R具有SEQ ID NO: 31所示的CDRLl序列，SEQ ID NO: 32所示的CDRL2序列或SEQ ID NO: 33所示的CDRL3序列。上文提到的SEQ IDS N0S: 28及30-34給出的CDR衍生自小鼠單克隆抗體hTNF40。然而，SEQ ID N0:29由雜合⑶R構(gòu)成。所述雜合⑶R包括來自小鼠單克隆抗體hTNF40的重鏈⑶R2的部分(SEQ ID NO:34)以及來自人3組種系區(qū)域V序列的重鏈⑶R2的部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包含重鏈和輕鏈，其重鏈中可變結(jié)構(gòu)域包含的⑶R具有SEQ ID NO: 28 所示的 CDRHl 序列，SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 34 所示的 CDRH2 序列或 SEQID NO: 30所示的⑶RH3序列；其輕鏈中可變結(jié)構(gòu)域包含的⑶R具有SEQ ID N0:31所示的CDRLl序列，SEQ ID NO:32所示的CDRL2序列或SEQ ID NO:33所示的CDRL3序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包含SEQ ID NO:28所示的CDRHl，SEQ ID NO:29或SEQID N0:34所示的CDRH2，SEQ ID NO:30 所示的 CDRH3，SEQ ID NO:31 所示的 CDRLl，SEQ IDN0:32所示的CDRL2以及SEQ ID NO: 33所示的CDRL3。優(yōu)選地，抗體包含SEQ ID NO: 29所示的CDRH2。抗-TNF抗體優(yōu)選地為植入⑶R的抗體分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，可變結(jié)構(gòu)域包含人受體框架區(qū)及非人供體⑶R。優(yōu)選地，抗體分子具有針對人TNF(之前稱為TNF a )的特異性的抗體分子，其中輕鏈包含SEQ ID N0:11的輕鏈可變區(qū)，其中重鏈包含SEQ ID N0:12的重鏈可變區(qū)。 抗-TNF抗體優(yōu)選地為Fab或Fab ’片段.優(yōu)選地，具有針對人TNF的特異性的抗體分子是Fab’，并且具有的輕鏈序列包含或由SEQ ID NO: 13組成，重鏈序列包含或由SEQ ID N0:14組成。在表達(dá)后，抗體片段可進(jìn)行進(jìn)一歩加工，例如通過綴合至另外的實(shí)體，如效應(yīng)子分子。例如，如本文所使用的術(shù)語效應(yīng)子分子包括抗腫瘤試劑、藥物、毒素(如細(xì)菌或植物來源的酶活性毒素或其片段，例如蓖麻毒素及其片段)、生物學(xué)活性蛋白質(zhì)例如酶、其他的抗體或抗體片段、合成或天然發(fā)生的多聚體、核酸及其片段(如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其是放射性碘素、放射性同位素)、螯合金屬、納米顆粒、及報(bào)告子基團(tuán)如熒光化合物或可由NMR或ESR光譜檢測到的化合物。效應(yīng)子分子可由任何合適的方法連接于抗體或其片段，例如抗體片段可經(jīng)過修飾連接于至少一種效應(yīng)子分子，如W005/003171或W005/003170(其內(nèi)容并入本文作為參考)所描述的。W005/003171或W005/003170也描述
了合適的效應(yīng)子分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，如果有需要，抗體或其片段如Fab是PEG化的，以產(chǎn)生具有所需(例如與完全抗體類似)特性的產(chǎn)物。例如，抗體可以為PEG化的抗-TNF-a Fab’，如W001/094585中所描述的，優(yōu)選地其在重鏈C末端的ー個(gè)半胱氨酸殘基上連接有賴氨酰-順丁烯ニ酰亞胺-衍生基團(tuán)，其中賴氨酸殘基的兩個(gè)氨基基團(tuán)中每個(gè)都與具有大約20，OOODa的分子量的甲氧基聚(こニ醇)殘基相連，這樣甲氧基聚(こニ醇)殘基的總平均分子量為大約40，OOODa,更優(yōu)選地，所述賴氨酰-順丁烯ニ酰亞胺-衍生基團(tuán)為[I-[ [ [2-[ [3- (2，5- ニ氧-I-批咯燒基)-1-氧丙基]氨基]こ基]氨基]-羧基]-1，5-戍燒ニ基]ニ·(亞胺擬基)。細(xì)胞還可包含編碼ー種或多種其他目的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，選擇ー種或多種在野生型時(shí)已知與目的重組蛋白質(zhì)在純化中共純化的大腸桿菌宿主蛋白質(zhì)進(jìn)行遺傳修飾，如描述于Humphreys等人“Engineering of Escnerichia coli to improve the purification oi periplasmicFab’ fragments: changing the pi of the chromosomalIy encoded PhoS/PstSprotein”，Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118 和 W004/035792 (其內(nèi)容并入本文作為參考)。使用這些修飾的宿主蛋白質(zhì)改善了目的蛋白質(zhì)(尤其是抗體)的純化過程，是通過改變所選的大腸桿菌蛋白質(zhì)的物理特性使之不再與重組抗體共純化而在大腸桿菌中生產(chǎn)。優(yōu)選地，受到改變的大腸桿菌蛋白質(zhì)選自ー種或多種磷酸結(jié)合蛋白質(zhì)(PhoS/PstS)、ニ肽結(jié)合蛋白質(zhì)(DppA)、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)和硫氧還蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，污染性宿主蛋白質(zhì)的物理特性通過向C端或N端添加氨基酸標(biāo)簽得到改變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，改變的物理屬性為等電點(diǎn)，氨基酸標(biāo)簽為連接于C末端的多天冬氨酸標(biāo)簽。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過添加所示標(biāo)簽得到改變的大腸桿菌蛋白質(zhì)為ニ肽結(jié)合蛋白質(zhì)(DppA)、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)、硫氧還蛋白和磷酸結(jié)合蛋白質(zhì)(PhoS/PstS)。在一個(gè)特異性實(shí)施方式中，大腸桿菌磷酸結(jié)合蛋白質(zhì)(PhoS/PstS)的pi通過添加多天冬氨酸標(biāo)簽(PolyD)由7. 2減少至5. 1，其C端包含了 6個(gè)天冬氨酸的標(biāo)簽。還優(yōu)選地是對污染性大腸桿菌蛋白質(zhì)的特定殘基進(jìn)行修飾以改變其物理特性，不管是單獨(dú)修飾還是與N或C末端添加標(biāo)簽相結(jié)合。這些改變可包括插入或刪除以改變蛋白質(zhì)大小，或氨基酸置換以改變PI或疏水性。在一個(gè)實(shí)施方式中，這些殘基位于蛋白質(zhì)表面。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，改變了 PhoS蛋白質(zhì)表面的殘基以降低蛋白質(zhì)的pi。優(yōu)選地，所提到的殘基對于磷酸結(jié)合(Bass，US5, 304，472)很重要，因此為了維持功能性PhoS蛋白質(zhì)要盡量避開。優(yōu)選地，靶向的是那些伸出蛋白質(zhì)表面很遠(yuǎn)或在堿性殘基大基團(tuán)之內(nèi)或附近的賴氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，PhoS蛋白質(zhì)具有連接于C末端的六聚多天冬氨酸標(biāo)簽，而分子相反的末端上帝表面殘基用于置換。優(yōu)選地，所選的賴氨酸殘基置換為谷氨酸或天冬氨酸以形成比將中性殘基變?yōu)樗嵝詺埢蟮腜l電勢變化。本文對于置換突變體的標(biāo)記由字母+數(shù)字+字母構(gòu)成。第一個(gè)字母標(biāo)記野生型蛋白質(zhì)中的氨基酸。數(shù)字指的是做出氨基酸置換的氨基酸位置，第二個(gè)字母標(biāo)記用于置換野生型氨基酸的氨基酸。在本發(fā)明優(yōu)選的PhoS突變中，275、107、109、110、262、265、266、309、313號(hào)賴氨酸殘基(K)以單ー或組合突變的形式置換為谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)，另外，318號(hào)賴氨酸(K)可以單ー或組合突變的形式置換為天冬氨酸(D)。優(yōu)選地，單ー突變?yōu)镵262E、K265E和K266E。優(yōu)選地，組合突變?yōu)镵265/266E和K110/265/266E。更優(yōu)選地，所有突變都與連接于C端的多天冬氨酸(polyD)標(biāo)簽相組合，優(yōu)選地還與K318D置換相組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些突變導(dǎo)致Pl降低至少2個(gè)單位。優(yōu)選地，本發(fā)明的突變將PhoS的pi從7. 2降低至大約4-大約5. 5。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用突變polyD K318D、polyD K265/266E和polyDK110/265/266E分別將大腸桿菌PhoS蛋白質(zhì)的pi從7. 2降低至大約4. 9、大約4. 8以及大約 4. 5。編碼 目的蛋白質(zhì)的多核苷酸可以以與另ー種多肽融合的形式表達(dá)，另ー種多肽優(yōu)選地為信號(hào)序列或其他在成熟多肽的N端有特異性剪切位點(diǎn)的多肽。所選的異源信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)為可由宿主細(xì)胞識(shí)別并加工的序列。對于不能識(shí)別和加工原生或真核多肽信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，信號(hào)序列由原核信號(hào)序列置換。合適的信號(hào)序列包括OmpA、PhoA、LamB,PelB、DsbA 和 DsbC。只要相關(guān)方面能適用于這些實(shí)施方式，則本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方式關(guān)于所述多核苷酸方面對本發(fā)明備選實(shí)施方式同等適用，例如載體、表達(dá)盒及/或包含其中所采用的組分的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)目的重組蛋白質(zhì)的方法，包括在有效表達(dá)目的重組蛋白質(zhì)的條件下，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上文所描述的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，以及從重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)和/或培養(yǎng)基中回收所述目的重組蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，其中細(xì)胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸，細(xì)胞是在有效表達(dá)編碼DsbC的重組多核苷酸的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的。本發(fā)明的方法中優(yōu)選采用的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞及目的蛋白質(zhì)已在上文詳細(xì)描述。當(dāng)編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸是外源吋，多核苷酸可使用任何本領(lǐng)域已知的合適方式并入宿主細(xì)胞。編碼DsbC的多核苷酸序列也可使用任何本領(lǐng)域已知的合適的方式并入宿主細(xì)胞。一般地，多核苷酸作為轉(zhuǎn)化入細(xì)胞的表達(dá)載體的一部分而并入。因此，在一方面，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞包含含有編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)盒以及含有編碼DsbC的多核苷酸的表達(dá)盒。編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列以及編碼DsbC的多核苷酸序列可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化入細(xì)胞，如使用氯化銣、PEG或電穿孔方法。根據(jù)本發(fā)明的方法還可采用選擇系統(tǒng)以促進(jìn)對成功轉(zhuǎn)化有編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸的穩(wěn)定細(xì)胞進(jìn)行選擇。選擇系統(tǒng)一般采用編碼選擇性標(biāo)記物的多核苷酸共轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方式中，每種轉(zhuǎn)化入細(xì)胞的多核苷酸進(jìn)一歩包含編碼ー種或多種選擇性標(biāo)記物的多核苷酸序列。因此，轉(zhuǎn)化編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸和任選的編碼DsbC的多核苷酸以及編碼標(biāo)記物的一種或多種多核苷酸可同時(shí)發(fā)生，然后采用選擇系統(tǒng)以選擇產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。能夠表達(dá)所述ー種或多種標(biāo)記物的細(xì)胞能夠在特定人工設(shè)置的條件下存活/生長/擴(kuò)增，例如在添加毒素或抗生素條件下，因?yàn)槠渲胁⑷氲亩嚯?基因或選擇系統(tǒng)的多肽組分提供了某些特性(例如，抗生素抗性)。不能表達(dá)所述一種或多種標(biāo)記物的那些細(xì)胞則不能在這些人工設(shè)置的條件下存活/生長/擴(kuò)增。可根據(jù)需要選擇更嚴(yán)格或不那么嚴(yán)格的的人工設(shè)置條件。本發(fā)明可采用任何合適的選擇系統(tǒng)。一般地，選擇系統(tǒng)可基于包括在載體中的一種或多種提供對已知抗生素抗性的基因，例如四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素或氨芐青霉素基因。選擇在相關(guān)抗生素存在下生長的細(xì)胞，因?yàn)槠浔磉_(dá)提供對抗生素抗性的基因以及所需要的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中可使用可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)或組成型啟動(dòng)子以表達(dá)目的蛋白質(zhì)及/或DsbC。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)子，誘導(dǎo)編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列以及編碼DsbC的重組多核苷酸的表達(dá)。合適的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)以及組成型啟動(dòng)子在本領(lǐng)域熟知?？墒褂萌魏芜m合的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞?？蔀榫唧w的選擇系統(tǒng)采用恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，例如培養(yǎng)基可以包含抗生素以使只有已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠在培養(yǎng)基中生長。
根據(jù)需要，可對獲自培養(yǎng)基的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)ー步的選擇和/或純化。根據(jù)需要，此方法可進(jìn)ー步包括一個(gè)或多個(gè)提取及純化目的蛋白質(zhì)的步驟?？蓮木曛谢厥斩嚯?，包括從細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)及/或上清中。用于純化蛋白質(zhì)的具體方法取決于蛋白質(zhì)類型。合適的方法包括在免疫親和或離子交換柱上的分級；こ醇沉淀；反相HPLC;疏水相互作用色譜；硅色譜；離子交換樹脂色譜如S-SEPHAR0SE和DEAE;層析聚焦；硫酸銨沉淀；以及凝膠過濾。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)ー步包括將目的重組蛋白質(zhì)與DsbC分離?？赏ㄟ^常規(guī)抗體純化步驟，合適地將抗體與培養(yǎng)基和/或細(xì)胞質(zhì)提取物和/或細(xì)胞周質(zhì)提取物分離，例如，通過蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠、蛋白質(zhì)G色譜，蛋白質(zhì)L色譜，嗜硫的、混合形式的樹脂，His-標(biāo)簽，F(xiàn)LAG標(biāo)簽，羥磷灰石色譜，凝膠電泳，透析，親和色譜，硫酸銨、こ醇或PEG分餾/沉淀，離子交換膜，擴(kuò)張的床吸附色譜(EBA)或模擬移動(dòng)床色譜。所述方法還可以包括進(jìn)ー步的步驟，測量目的蛋白質(zhì)表達(dá)量以及選擇具有高表達(dá)水平的目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。此方法還可包括ー個(gè)或多個(gè)其他下游加工步驟，如對目的蛋白質(zhì)如抗體或抗體片段進(jìn)行PEG化。本文所描述的ー個(gè)或多個(gè)方法步驟可在合適的容器如生物反應(yīng)器中組合進(jìn)行。實(shí)施例實(shí)施例I——產(chǎn)生細(xì)胞菌株MXE001 ( Δ Tsp)通過如下方法產(chǎn)生MXE001菌株將Tsp盒以Sal I、Not I限制性片段的形式移至進(jìn)行了類似的限制性酶切的pK03質(zhì)粒內(nèi)。ρΚ03質(zhì)粒使用pSClOl的溫度敏感型突變體的復(fù)制起點(diǎn)(RepA)以及氯霉素標(biāo)記物以加強(qiáng)和選擇染色體整合事件。編碼果聚糖蔗糖酶的sacB基因?qū)ιL于蔗糖上的大腸桿菌是致死的，因此(與氯霉素標(biāo)記物及PSClOl起點(diǎn)一同)用于加強(qiáng)并選擇去整合以及質(zhì)粒消除。此方法理論在之前有所描述(Hamilton等人，1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 以及 Blomfield 等人，1991，MolecularMicrobiology, 5，1447-1457)。除了插入的基因之外，pK03系統(tǒng)將所有選擇性標(biāo)記物從宿主基因組移除。構(gòu)建了以下質(zhì)粒。PMXE191 :包含如SEQ ID NO: 3所示的敲除突變Tsp基因，其包含EcoRI和AseI限制性標(biāo)記物。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)大腸桿菌W3110細(xì)胞,其使用Methods in MolecularBiology, vol. 47, Nickoloff, J. A. (ed. ), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)中Miller, E. M.和 Nickoloff, J. A.，“Escherichia coli electrotransformation，，的方法進(jìn)行制備。第I天將40 μ I的大腸桿菌細(xì)胞與(IOpg) I μ I的pK03DNA混合于冰冷的BioRadO. 2cm電穿孔小杯，然后以2500V、25yF、200Q進(jìn)行電穿孔。立即加入1000 μ I的2xPY，細(xì)胞在培養(yǎng)箱中30°C下、250rpm搖I小時(shí)進(jìn)行復(fù)蘇。將細(xì)胞進(jìn)行1/10的系列稀釋在2xPY中，然后將100 μ I的等分試樣鋪于30°C和43°C下預(yù)熱的、含有20 μ g/ml氯霉素的2xPY瓊脂 平板。將平板在30°C和43°C下孵育過夜。第2天在30°C下生長的菌落數(shù)量給出電穿孔效率的估算值，而在43°C下存活生長的菌落代表潛在的整合事件。挑取43°C平板上的単一菌落并重懸于IOml的2xPY中。將100 μ I的懸液鋪于含有5%(w/v)蔗糖并預(yù)熱到30°C的2xPY瓊脂平板上以產(chǎn)生單菌落。將平板在30°C V孵育過夜。第3天此時(shí)的菌落代表了潛在的自發(fā)去整合及質(zhì)粒消除的事件。如果去整合和消除事件在生長早期發(fā)生，則所述克隆實(shí)體的大部分是純系的(clonal)。挑取單ー菌落并將其復(fù)制物鋪于含有20 μ g/ml氯霉素或5%(w/v)蔗糖的2xPY瓊脂平板。將平板在30°C下孵育過夜。第4天在蔗糖上生長且在氯霉素中死亡的菌落代表了潛在的染色體置換質(zhì)粒消除事件。挑取這些菌落并通過使用突變特異性寡核苷酸的PCR進(jìn)行篩選。將產(chǎn)生具有正確大小陽性PCR條帶的菌落劃線至含有5%(w/v)蔗糖的2xPY瓊脂平板上并將平板在30°C孵育過夜產(chǎn)生單ー菌落。第5天使用PCR陽性、氯霉素敏感型以及蔗糖抵抗型大腸桿菌的單菌落制作甘油貯備株，制作化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞并用作PCR模板用于使用5’和3’兩側(cè)的寡核苷酸的PCR反應(yīng)，以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物用于使用Taq聚合酶的直接的DNA測序。通過對包含非天然發(fā)生Ase I限制性位點(diǎn)的Tsp基因區(qū)域(如圖la、lb、lc所示)使用寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以測試細(xì)胞菌株MXE001以確認(rèn)基因組DNA是否成功修飾為攜帶突變Tsp基因。隨后將擴(kuò)增的DNA區(qū)域與限制性酶Ase I孵育，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析孵育之前和孵育之后DNA所擴(kuò)增的區(qū)域以確認(rèn)非天然發(fā)生的Ase I限制性位點(diǎn)是否存在于突變的基因中。此方法按如下步驟進(jìn)行使用PCR及以下寡核苷酸對從MXE001和W3110的大腸桿菌細(xì)胞裂解物的制備的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增6284Tsp3， 5， -GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3’ (SEQ ID NO:15)6283Tsp5， 5’ -GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3， (SEQ ID NO:16)通過將單克隆細(xì)胞在20ul Ix PCR緩沖液中于95°C下加熱10分鐘制備裂解物。使混合物冷卻至室溫，然后在13，200rpm下離心10分鐘。移除上清并貼上“細(xì)胞裂解物”的標(biāo)簽。使用Tsp寡核苷酸對擴(kuò)增各菌株。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR步驟擴(kuò)增DNA。
Snl緩沖液 xlO (Roche)
IuIdN I P 潘合_ ( Eoche，IOinM mix)
l.SuI5’寡核苷酸(Spmol)UuI3’寡核著酸(5p_U
2ul細(xì)胞裂解物
(KSiilTaq DNA 聚合酶(Roche 5U/ul)
38.Snl H 20PCR 循環(huán)。
94 V I分鐘94 V I分鐘)
55 V I分鐘)重復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)
72 V I分鐘)
72 V 10分鐘反應(yīng)完成時(shí)，將25ul移至新離心管用Ase I進(jìn)行消化。向25ul的PCR反應(yīng)物中加入19ul的H20、5ul緩沖液3 (NEB)Uul的Ase I (NEB)，混合，在37°C下孵育2小時(shí)。向余下的PCR反應(yīng)物中加入5ul上樣緩沖液(x6)，取出20ul上樣于0. 8%TAE200ml瓊脂糖凝膠(Invitrogen)加溴化乙錠(5ul的10mg/ml儲(chǔ)備液),并于100伏電泳I小時(shí)。最后一個(gè)泳道上樣IOul的分子量標(biāo)記物(Perfect DNA marker 0. l_12Kb, Novagen)。在Ase I消化完成時(shí)，加入IOul上樣緩沖液(x6)，取20ul上樣于0. 8%TAE瓊脂糖凝膠(Invitrogen)加溴化乙錠(5ul的10mg/ml儲(chǔ)備液)并于100伏下電泳I小時(shí)。最后一個(gè)泳道加入了 IOul的分子量標(biāo)記物(Perfect DNA marker 0. l_12Kb, Novagen)。兩塊膠都使用UV透照儀進(jìn)行觀察。擴(kuò)增的基因組片段顯示Tsp的正確條帶大小，2. 8kb。以Ase I消化后確認(rèn)了在Tsp缺陷菌株MXEOOl中存在有引入的Ase I限制性位點(diǎn)，而在W3110對照中沒有。MXEOOl:使用Tsp引物組擴(kuò)增的基因組DNA，并將擴(kuò)增所產(chǎn)生的DNA用Ase I消化，產(chǎn)生2. 2和0. 6Kb的條帶。W31IOPCR擴(kuò)增的DNA無法由Ase I限制性酶進(jìn)行消化。實(shí)施例2 -產(chǎn)牛SDr突奪體使用互補(bǔ)測定法產(chǎn)生并選擇spr突變。使用C:IO丨1 tee丨1i(隨機(jī)誘變多樣性PCR試劑盒將Spr基因突變，該試劑盒在每IOOObp引入1-2個(gè)突變。將突變SPR PCR DNA克隆入表達(dá)CDP870Fab’及spr突變體的可誘導(dǎo)表達(dá)載體[pTTO⑶P870]。然后將此連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至使用Miller，E.M.和Nickoloff,J. A.，“Escherichia coli electrotransformation，”在Methods in MolecularBiology, vol. 47, Nickoloff, J. A. (ed. ), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)中的方法制備的大腸桿菌菌株MXEOOl (ATsp)。使用以下的操作流程將40ul的電感受態(tài)MXE001、2. 5ul的連接產(chǎn)物(IOOpg的DNA)加入0. 2cm的電穿孔小杯,使用BioRad Genepulser Xcell在2500V、25iiF、200Q的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化后，加入Iml的S0C(Invitrogen)(預(yù)熱至37°C)并對細(xì)胞輕柔搖動(dòng)，使之在37°C下復(fù)蘇I小時(shí)。將細(xì)胞鋪于低滲瓊脂糖平板(5g/L酵母提取物、2. 5g/L蛋白胨、15g/L瓊脂(皆為Difco)并于40°C孵育。將形成菌落的細(xì)胞在43°C下重新鋪于HLB以確認(rèn)MXEOOl菌株重新獲得了在高溫低滲條件下生長的能力。從所選的克隆制備質(zhì)粒DNA并對其測序以鑒定spr
突變。
使用此方法分離出與ATsp表型互補(bǔ)的spr蛋白質(zhì)的八個(gè)單一突變、一個(gè)雙突變以及兩個(gè)多重突變，如下I. V98E2. D133A3. V135D4. V135G5. G147C6.S95F 和 Y115F7. I70T8. N31T、Q73R、R100G、G140C9. R62C、Q99P、R144C10. L108S11. L136P
_2] 實(shí)施例3-產(chǎn)生攜帶spr突變的突變體大腸桿菌細(xì)胞菌株使用實(shí)施例2中鑒定的spr的1_5號(hào)個(gè)體突變以及三個(gè)催化三分子突變(C94A，H145A，H157A)和W174R產(chǎn)生新菌株，使用野生型W3110大腸桿菌菌株(基因型F-LAM-IN (rrnD-rrnE) lrphl (ATCC號(hào)27325))產(chǎn)生攜帶野生型非重組染色體Tsp基因的spr突變菌株或使用來自實(shí)施例I的MXEOOl ( A Tsp)菌株產(chǎn)生A Tsp/突變SPR組合突變菌株。以下突變體大腸桿菌細(xì)胞菌株是使用基因置換載體系統(tǒng)產(chǎn)生的，使用的是pK03同源重組 / 置換質(zhì)粒(Link 等人，1997，Journal of Bacteriology, 179，6228-6237),如實(shí)施例I中用于產(chǎn)生MXEOOl的方法。表I.
權(quán)利要求
1.重組革蘭氏陰性細(xì)胞，其包含編碼突變spr蛋白質(zhì)的突變spr基因，并且其中細(xì)胞包含非重組野生型染色體Tsp基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)在選自Hl45、N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、G147、H157和W174的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有選自H145A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、G147C、H157A 和 W174R 的ー個(gè)或多個(gè)突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所述spr蛋白質(zhì)的ー個(gè)或多個(gè)突變選自S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G 和 G147C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有突變S95F和Y115F。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所述spr蛋白質(zhì)突變?yōu)镠145A。
7.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細(xì)胞，其中除了突變spr基因外，所述細(xì)胞與野生型細(xì)菌細(xì)胞是同基因的。
8.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)ー步包含編碼DsbC的重組多核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何ー項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)ー步包含ー種或多種以下突變基因 a.編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)的突變DegP基因； b.突變Ptr基因，其中所述突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白質(zhì)或其為敲除突變Ptr基因；以及 c.突變OmpT基因，其中所述突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)或其為敲除突變OmpT基因。
10.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為大腸桿菌。
11.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含的載體含有編碼DsbC的重組多核苷酸 以及編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中所述載體包含控制編碼DsbC的重組多核苷酸以及編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的表達(dá)的啟動(dòng)子。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任何ー項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述目的蛋白質(zhì)為抗體或其抗原結(jié)合片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段對TNF具有特異性。
16.重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其包含編碼突變spr蛋白質(zhì)的突變spr基因、野生型Tsp基因以及編碼對TNF具有特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸。
18.用于生產(chǎn)目的重組蛋白質(zhì)的方法，包括于培養(yǎng)基中在能夠有效表達(dá)目的重組蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求1-17中任何ー項(xiàng)限定的重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，以及從所述重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)和/或培養(yǎng)基中回收目的重組蛋白質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述目的重組蛋白質(zhì)回收自細(xì)胞周質(zhì)和/或上清。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中所述細(xì)胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸，且細(xì)胞培養(yǎng)于能夠有效表達(dá)編碼DsbC的重組多核苷酸的條件下。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列以及編碼DsbC的重組多核苷酸的表達(dá)是通過向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)子而進(jìn)行誘導(dǎo)的。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的方法，其中所述方法進(jìn)ー步包括將目的重組蛋白質(zhì)與DsbC相分離。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其包含編碼突變SPR蛋白質(zhì)的突變SPR基因，且其中的細(xì)胞包含非重組野生型染色體Tsp基因。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102712694SQ201180005972
公開日2012年10月3日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者D·P·哈姆費(fèi)雷斯, M·埃里斯 申請人:Ucb醫(yī)藥有限公司