專利名稱：：用于預(yù)防和治療炎癥性腸病(ibd)和腸易激綜合征(ibs)的重組益生菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以下疾病的一般治療領(lǐng)域如炎癥性腸病(IBD)的消化道炎癥性疾病、如囊性纖維化和支氣管肺慢性阻塞性疾病(BPCO)的肺部疾病、炎癥性關(guān)節(jié)疾病(諸如骨關(guān)節(jié)炎)、炎癥性泌尿生殖系統(tǒng)疾病，以及如腸易激綜合征(IBS)的與慢性內(nèi)臟疼痛癥狀相關(guān)的疾病。發(fā)明背景治療如IBD的慢性炎癥性病癥是重大的醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)，因為這些病癥折磨著數(shù)百萬人。其在發(fā)達國家中的發(fā)病率最高并且在過去三十年內(nèi)不斷增加。目前的IBD療法強烈需要得到改進，高比例(20與40%之間)的患者對于任何形式的治療都有抗藥性，嚴重的副作用和較高的成本也與目前可利用的藥物(糖皮質(zhì)激素和單克隆抗體療法)相關(guān)。另外，涉及IBD發(fā)病的機制尚未完全得到了解，并且用于IBD的更有效治療或甚至治愈方法的開發(fā)取決于對炎癥性反應(yīng)進行調(diào)控的更好了解。一些研究已經(jīng)證明蛋白酶在維持胃腸道(GIT)的慢性炎癥性反應(yīng)中的關(guān)鍵作用[VergnolIe,N.2005；Cenac,N.等，2007;Hyun,E.等，2008；Vergnolle1N.等，2004]。因此，內(nèi)源性蛋白酶抑制劑對于控制腸道炎癥性反應(yīng)似乎是關(guān)鍵性的?；谶@方面的知識，本發(fā)明人提出遞送那些蛋白酶抑制劑至GIT中可用于治療IBD和/或腸易激綜合征(IBS)。使用益生菌來治療IBD現(xiàn)在已被提出了好幾年，并且不同的研究已經(jīng)報導(dǎo)經(jīng)過單獨或組合測試的這些益生菌的一些有益效果[Hedin，C.等，2007；Sartor,R.B.2004]。在粘膜層面，使用重組非病原性食品級細菌作為消炎分子的遞送載體的策略已經(jīng)用于遞送消炎細胞因子IL-IO[Steidler，L.等，2000]。I期臨床試驗已經(jīng)證明，口服給予的表達IL-10細胞因子的乳酸乳球菌(LactococcusIactis)菌株是安全的，因為在那些患者中未發(fā)生嚴重的副作用[Braat，H.等，2006]。然而，在用IL-10重組乳酸乳球菌治療的克羅恩氏病(Crohn’sdisease)患者中疾病活性的降低在某種程度上是有限的。這種有限的效力可由以下事實來解釋報導(dǎo)總是指出IL-10遞送對于結(jié)腸炎的發(fā)病僅具有零散的有益效果[Braat,H.等，2003]。因此，對待由乳酸乳球菌遞送的消炎分子的性質(zhì)的較好選擇可大大改善治療效力。在本文中，本發(fā)明人提出使用食品級細菌來表達抗蛋白酶trappin-2并將其遞送至消化道中。發(fā)明概述本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有治療相比，使用食品級細菌來遞送如trappin-2的消炎分子可提供安全性和更好的效率。因此，本發(fā)明涉及選自以下的分子trappin-2蛋白質(zhì)或trappin-2蛋白質(zhì)的活性部分、WAP家族蛋白質(zhì)成員或WAP家族蛋白質(zhì)成員的活性部分，或絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)家族蛋白質(zhì)成員或絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白質(zhì)成員的活性部分，所述分子是用于治療腸易激綜合征(IBS)。本發(fā)明的另一目標涉及重組食品級細菌，其包含選自以下的基因編碼trappin-2蛋白質(zhì)或trappin-2蛋白質(zhì)的活性部分的基因、編碼WAP家族蛋白質(zhì)成員或WAP家族蛋白質(zhì)成員的活性部分的基因，或編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白質(zhì)成員或絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白質(zhì)成員的活性部分的基因。本發(fā)明的另一個方面涉及包含如上文定義的重組食品級細菌的治療組合物。發(fā)明詳述定義如本文所使用，WAP家族的術(shù)語“trappin-2”(又稱為抑彈性酶蛋白、抑彈性酶蛋白特異性抑制劑(ESI)或SKALP，即皮膚抗白細胞蛋白酶)表示在呼吸道中分泌的HNE(人中性粒細胞彈性蛋白酶)和蛋白酶3的低分子量(9.9kDa)抑制劑[Sallenave等，1991和1993]。trappin-2與(Al-Pi)和SLPI—起構(gòu)成肺中的‘抗彈性蛋白酶防護’的完整部分。人trappin-2基因的示例性序列以入藏登記號S58717寄存在數(shù)據(jù)庫Genbank中。如本文所使用，用于“乳清酸性蛋白質(zhì)”的術(shù)語“WAP家族”表示含有trappin-2和ps20的蛋白質(zhì)家族。如本文所使用，用于絲氨酸蛋白酶抑制劑的術(shù)語“絲氨酸蛋白酶抑制劑家族”表示在氨基酸序列和抑制機制方面相似，但是在其針對蛋白分解酶的特異性方面不同的絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。這個家族包括αI-抗胰蛋白酶(Al-Pi)、血管緊縮素原、卵白蛋白、抗纖溶酶、αI-抗胰凝乳蛋白酶、甲狀腺素結(jié)合蛋白、補體I滅活劑、抗凝血酶III、肝素輔因子II、纖溶酶原滅活劑、基因Y蛋白質(zhì)、胎盤纖溶酶原激活物抑制劑，和大麥Z蛋白質(zhì)。這個家族不包括分泌白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)[ThierryMoreau等，2008]。絲氨酸蛋白酶抑制因子家族的一些成員可為絲氨酸內(nèi)肽酶的底物而不是抑制劑，并且一些絲氨酸蛋白酶抑制劑在植物中出現(xiàn)，其功能不詳。如本文所使用，術(shù)語“αI-抗胰蛋白酶蛋白質(zhì)”表示糖蛋白。α1_抗胰蛋白酶也稱為ct-I蛋白酶抑制劑(AlPI),因為其為抑制多種蛋白酶的絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)。其保護組織免受炎癥細胞的酶，尤其彈性蛋白酶的影響。人αI-抗胰蛋白酶基因的示例性序列以入藏登記號NC008290寄存在數(shù)據(jù)庫Genbank中。如本文所使用，術(shù)語“活性部分”表示具有完全蛋白質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)部分”。例如,trappin-2蛋白質(zhì)的活性部分表示保存了抑制HNE能力的蛋白質(zhì)部分,或絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白質(zhì)的活性部分表示保存了抑制能力的蛋白質(zhì)部分。如本文所使用，術(shù)語“食品級細菌”表示廣泛用于發(fā)酵食品中并且具有分別由美國和歐洲共同體的GRAS(通常公認為安全)和QPS(安全資格認定)狀態(tài)所確認的完善安全特性細菌。此類細菌可安全地用于功能食品或食品添加劑中，并且聲稱涉及維持良好健康狀態(tài)和安康或預(yù)防疾病。如本文所使用，術(shù)語“益生菌”表示攝入足夠數(shù)量的活細菌時，可對人的健康發(fā)揮有益效果的細菌。其現(xiàn)在廣泛被用作食品添加劑，以達到其促進健康的效果。大多數(shù)益生菌為乳酸菌(LAB),其中乳酸桿菌(Lactobacillus)屬和雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬的菌株為最廣泛使用的益生菌。如本文所使用，術(shù)語“thyA基因”表示編碼胸苷酸合成酶的基因，所述胸苷酸合成酶是產(chǎn)生單磷酸胸苷(dTMP)的酶，該單磷酸胸苷隨后被磷酸化為用于DNA合成和修復(fù)中的三磷酸胸苷。如本文所使用，術(shù)語“腸易激綜合征(IBS)”是在胃腸道中造成不適的各種病理學(xué)病狀的術(shù)語。其為一種機能性腸障礙，特征是在不存在任何器官原因的情況下出現(xiàn)慢性腹部疼痛、不適、腫脹和排便習(xí)慣變化。如本文所使用，術(shù)語“炎癥性腸病(IBD)”是一組結(jié)腸和小腸炎癥性疾病。IBD的主要類型是克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎和憩室炎。蛋白質(zhì)和其用途本發(fā)明的第一目標涉及選自以下的分子trappin_2蛋白質(zhì)或trappin-2蛋白質(zhì)的活性部分、WAP家族蛋白質(zhì)成員或WAP家族蛋白質(zhì)成員的活性部分的分子，或選自絲氨酸蛋白酶抑制劑家族或絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的活性部分，所述分子是用于治療腸易激綜合征(IBS)。在一個優(yōu)選實施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員是αI-抗胰蛋白酶蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白質(zhì)部分包含相對所述蛋白質(zhì)的至少75%—致性、甚至更優(yōu)選至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的一致性。通常情況下，所述蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)部分可與消炎劑組合使用。本發(fā)明蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)部分可通過在本領(lǐng)域中本身已知的任何技術(shù)來產(chǎn)生，所述技術(shù)例如而不限于單獨或組合的任何化學(xué)、生物、基因或酶促技術(shù)。在知道所需序列的氨基酸序列的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的標準技術(shù)來容易地產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分的相關(guān)部分。例如，技術(shù)人員可使用眾所周知的固相方法，優(yōu)選使用可商購的蛋白質(zhì)合成儀器(如由AppliedBiosystems,FosterCity,California制造的儀器)并且遵照制造商說明書來合成?；蛘撸景l(fā)明蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)部分可通過如現(xiàn)在本領(lǐng)域中眾所周知的重組DNA技術(shù)來合成。例如,這些片段可在將編碼所需多肽的DNA序列并入表達載體中并且將此類載體引入要表達所需蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分的合適真核或原核宿主中之后，以DNA表達產(chǎn)物的形式來獲得，所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分可稍后使用眾所周知的技術(shù)從所述宿主中。本發(fā)明蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)部分可以(例如，純化)形式使用或含于載體，例如膜或脂質(zhì)囊泡(例如脂質(zhì)體)中。食品級細菌本發(fā)明的另一目標涉及重組食品級細菌，其包含選自以下的基因編碼trappin-2蛋白質(zhì)或trappin-2蛋白質(zhì)的活性部分的基因、編碼WAP家族蛋白質(zhì)成員或WAP家族蛋白質(zhì)成員的活性部分的基因，或編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白質(zhì)成員或絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白質(zhì)成員的活性部分的基因。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌是益生菌。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的益生菌包含有缺陷的營養(yǎng)缺陷型基因，由此，所述細菌的存活嚴格依賴于特定化合物的存在。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的營養(yǎng)缺陷型基因是編碼胸苷酸合成酶的thyA基因。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的營養(yǎng)缺陷型基因是丙氨酸消旋酶(air)基因ron等，2002)。根據(jù)本發(fā)明的益生菌的thyA基因的滅活使得其對于胃腸道(GIT)中不存在的胸苷呈營養(yǎng)缺陷型。此重組thyA突變體能夠遞送其目標蛋白質(zhì)但是不能存活并因此繼續(xù)留存在GIT中，從而限制其播散并且向重組細菌賦予所要求的生物防范作用。可用air基因獲得相似的結(jié)果。在另個優(yōu)選實施方案中，將選定的基因插入thyA基因中。優(yōu)選地，重組基因位于染色體中的thyA基因座位中，因而通過基因破壞來滅活。如本文所使用，術(shù)語“基因破壞”表示通過插入DNA片段來破壞、通過缺失基因或其部分來破壞，以及由另一DNA片段替換基因或其部分來破壞，并且通過重組DNA技術(shù)，而非通過自發(fā)突變來誘導(dǎo)破壞。優(yōu)選地，破壞是由另一功能基因替換基因或其部分。優(yōu)選地，缺陷型重組thyA基因是非回復(fù)突變基因。如本文所使用，術(shù)語“非回復(fù)突變體”表示回復(fù)頻率低于10_8，優(yōu)選回復(fù)頻率低于10_1(1，甚至更優(yōu)選，回復(fù)頻率低于10_12，甚至更優(yōu)選，回復(fù)頻率低于10_14，最優(yōu)選地，回復(fù)頻率是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法不可檢測的。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的基因編碼αI-抗胰蛋白酶蛋白質(zhì)，或絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的另一個成員，如抗纖溶酶、αI-抗胰凝乳蛋白酶。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌菌株是乳酸乳球菌菌株或干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)菌株或乳酸乳球菌htrA菌株[Poquet等,2000]或長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)菌株的植物乳桿菌(Lactobacilluspiantarum)菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌菌株是干酪乳桿菌菌株。在最優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的基因編碼trappin-2。事實上，本發(fā)明人證明trappin_2天然地表達于人結(jié)腸粘膜中，并且主要表達于腸道上皮細胞中(Motta等),而與健康受試者相比，患有IBD的患者顯示組織中的trappin-2下調(diào)(Motta等)。此外，本發(fā)明人證明在結(jié)腸炎的不同模型中，trappin-2過度表達具有針對結(jié)腸炎發(fā)病的保護作用(在組成型表達和瞬間表達中)。此外，結(jié)腸炎模型中的trappin-2過度表達能夠完全抑制與結(jié)腸炎相關(guān)的彈性蛋白酶和胰蛋白酶樣活性的增加。最后，小鼠中的trappin-2過度表達還能夠顯著抑制結(jié)腸炎誘導(dǎo)的促炎癥性細胞因子和趨化因子(IL-6、Il-17A、TNF-a、干擾素-Y、MCP-1和KC)的增加。所有這些結(jié)果有利于遞送trappin-2和來自WAP或絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的其它蛋白酶，所述其它蛋白酶具有用以治療IBD的相似性質(zhì)。如以下結(jié)果顯示，食品級細菌是遞送此類型的蛋白酶至消化道的最安全和有效的方法。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的基因編碼αI-抗胰蛋白酶蛋白質(zhì)。事實上，αI-抗胰蛋白酶蛋白質(zhì)抑制與IBD(如結(jié)腸炎)相關(guān)的胰蛋白酶樣活性，因而具有與trappin-2相似的效果。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌菌株是干酪乳桿菌菌株，其包含編碼trappin-2的基因。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌菌株是干酪乳桿菌菌株，其包含插入thyA基因中的編碼trappin-2的基因。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌適用治療腸道炎癥性病狀。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌適用于治療IBD和/或IBS。炎癥性病狀可選自IBD、IBS、炎癥性肺病、炎癥性關(guān)節(jié)疾病或炎癥性泌尿生殖系統(tǒng)疾病。組合物本發(fā)明的另一目標涉及包含根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌的治療組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的治療組合物欲粘膜施用于受試者。在另一優(yōu)選施用中，根據(jù)本發(fā)明的治療組合物欲口部施用于受試者。例如，組合物可呈懸浮液、片劑、藥丸、膠囊、顆?；蚍勰┬问?。在液體治療組合物中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌可自由并不受固定地存在于懸浮液中。懸浮液具有確保益生菌的生理條件的組成，以使得尤其是細胞內(nèi)的滲透壓力不會導(dǎo)致溶菌。在固體治療組合物中，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌可以自由、優(yōu)選凍干形式，或以固定形式存在。例如，根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌可封閉于為細胞提供保護的凝膠基質(zhì)中。欲進行口部施用并且含有固定或非固定形式的根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌的固體治療組合物優(yōu)選具備對于胃液有抵抗力的包衣。因而，確保治療組合物中含有的食品級細菌可不受阻礙并且不被損壞地通過胃并且食品級細菌的釋放首先在上腸道區(qū)域中發(fā)生。在本發(fā)明的另一個方面，治療組合物含有足夠菌落形成單位(CFU)的能夠形成根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的食品級細菌，以使得根據(jù)患者通過來多次施用治療組合物，從而治愈IBD或IBS狀態(tài)，停止IBD或IBS進展，且/或可減輕IBD或IBS癥狀。根據(jù)本發(fā)明，尤其提供治療組合物，其含有IXIO8-IX1011，優(yōu)選IXIO9-IXIO10CFU的根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，含有食品級細菌的治療組合物在直腸內(nèi)施用。直腸施用優(yōu)選以栓劑、灌腸劑或發(fā)泡體形式來進行。直腸內(nèi)施用尤其適合于影響下腸道部分(例如結(jié)腸)的慢性炎癥性腸道疾病。鼻內(nèi)施用也適合于治療慢性肺病，例如囊性纖維化和BPCO。在另一個方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌的食品組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的食品組合物欲口部施用于受試者。例如，組合物可呈懸浮液、片劑、藥丸、膠囊、顆粒、粉末或乳酪形式。在一個優(yōu)選實施方案中，食品組合物可含有IXIO8-IXIO11,優(yōu)選IXIO9-IXIOltlCFU的根據(jù)本發(fā)明的食品級細菌。在一個優(yōu)選實施方案中，食品組合物可以101°個細菌的每日劑量施用于患者。本發(fā)明進一步通過以下附圖和實施例來說明。然而，這些實施例和附圖無論如何不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的限制。附圖圖I:來自小鼠的結(jié)腸組織的重量差異(A)、肉眼觀察的得分⑶、壁厚(C)和髓過氧物酶(MPO)活性(D)，所述小鼠飲用了其飲用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型乳酸乳球菌，或表達抑彈性酶蛋白或IL-10的重組乳酸乳球菌菌株的口服治療7天。記錄與接受DSS的PBS治療的小鼠相比的顯著差異為ρ〈0·05,**為p〈0.01并且***為ρ〈0.005。記錄與野生型乳酸乳球菌治療的小鼠相比的顯著差異Ψ為ρ〈0.05,ψΨ為p〈0.Ol并且ΨΨΨ為ρ〈0·05。記錄PBS+DSS組與PBS-水組之間的顯著差異:#為ρ〈0·05，##為p〈0.01并且###為ρ〈0.005。記錄與IL-10重組乳酸乳球菌組相比的顯著差異ω為ρ〈0·05,ωω為ρ〈0·01并且ωωω為ρ〈0·005。來自小鼠的結(jié)腸腔洗滌液的胰蛋白酶樣活性(A)和彈性蛋白酶活性(B)，所述小鼠飲用了其飲用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型乳酸乳球菌，或表達抑彈性酶蛋白或IL-10的重組乳酸乳球菌菌株的口服治療7天ε是指不可檢測到的水平。記錄與接受DSS的PBS治療的小鼠相比的顯著差異為ρ〈0.05,**為ρ〈0.01。記錄與野生型乳酸乳球菌治療小鼠相比的顯著差異Ψ為Ρ〈0.05。記錄PBS+DSS組與PBS-水組之間的顯著差異#為Ρ〈0·05，##為p〈0.01并且###為ρ〈0·005。來自小鼠的結(jié)腸組織的肉眼觀察的得分㈧、壁厚(B)，和髓過氧物酶(MPO)活性(C)，所述小鼠飲用了其飲用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型干酪乳桿菌，或表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌菌株的口服治療7天。記錄與接受DSS的PBS治療的小鼠相比的顯著差異:*為ρ〈0·05,**為p〈0.01并且林*為ρ〈0·005。記錄與野生型干酪乳桿菌治療小鼠相比的顯著差異Ψ為ρ〈0.05,ΨΨ為p〈0.01并且ψψψ為ρ〈0·005ο來自小鼠的結(jié)腸腔洗滌液的胰蛋白酶樣活性(A)和彈性蛋白酶活性(B)，所述小鼠飲用了其飲用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型干酪乳桿菌，或表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌菌株的口服治療7天。記錄與接受DSS的PBS治療小鼠相比的顯著差異*為ρ〈0.05，并且記錄與野生型干酪乳桿菌治療小鼠相比的顯著差異Ψ為ρ〈0·05并且ΨΨ為ρ〈0·01。圖5:來自小鼠的結(jié)腸組織中檢測到的RANTES(A)、INFα(B)、IL_6(C)、MCP_1⑶、KC(E),INFy(F)和IL_17(G)的蛋白質(zhì)濃度，所述小鼠飲用了其飲用瓶中獲得水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型干酪乳桿菌，或表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌經(jīng)口治療7天。ε是指不可檢測到的水平。記錄與接受DSS的PBS治療小鼠相比的顯著差異為ρ〈0·05,**為p〈0.01并且林*為ρ〈0·005。Ψ顯示與用野生型乳酸乳球菌治療小鼠相比的顯著差異為Ρ〈0.05。記錄PBS+DSS組與PBS-水組之間的顯著差異··#為ρ〈0.05，##為p〈0.01并且###為ρ〈0·005。圖6:來自小鼠的結(jié)腸組織中檢測到的IL_2(A)、IL_4(B)、IL-5(C)、IL-IO(D)和IL-13(E)的蛋白質(zhì)濃度，所述小鼠飲用了其飲用瓶中的水或水+DSS(10%)，并且每天接受以野生型干酪乳桿菌，或表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌的口服治療7天。記錄與接受DSS的PBS治療小鼠相比的顯著差異為p〈0.05并且**為p〈0.01。記錄與野生型干酪乳桿菌治療小鼠相比的顯著差異Ψ為P〈0.05并且ψΨ為p〈0.01。圖7:小鼠的疼痛行為總數(shù)(A)或腹部收縮和舔舐、伸展和擠壓行為的次數(shù)(B)，所述小鼠結(jié)腸內(nèi)接受了PBS(n=5)，或芥子油(乙醇70%中的O.01%(v/v)),并且在先前7天中接受了口服管飼的PBS(n=8)、野生型乳酸乳球菌(n=8)，或表達抑彈性酶蛋白(n=8)或IL-10(n=5)的重組乳酸乳球菌的預(yù)治療。記錄與接受芥子油的PBS治療的小鼠相比的顯著差異:*為Ρ〈0·05,**為p〈0.01并且***ρ〈0·005。Ψ顯示與用野生型乳酸乳球菌治療小鼠相比的顯著差異為ρ〈0.05。圖8:由乳酸乳球菌Wt和htrA菌株分泌的抑彈性酶蛋白。以抗抑彈性酶蛋白抗體對于野生型(Wt)或htrA(htrA)菌株的細胞(C)和上清液(S)提取物執(zhí)行的蛋白質(zhì)印跡實驗。通過乳酸鏈球菌素從wt或htrA菌株的指數(shù)期培養(yǎng)物來誘導(dǎo)抑彈性酶蛋白產(chǎn)生(兩種菌株都含有可通過添加乳酸鏈球菌素來誘導(dǎo)抑彈性酶蛋白基因表達的表達載體)。圖9乳酸乳球菌Wt和htrA突變菌株在DSS5%誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的保護效果。評估了用水(陰性對照)或用DSS5%治療的10只小鼠的不同組中的肉眼觀察的(A)、組織損傷(B)和MPO活性(C)。兩個第一對照組i)用水治療并且口部饋入PBS(陰性對照組)并且ii)用DSS5%治療并且口部饋入PBS(陽性對照組)。其它組全部用DSS5%和wt菌株(WT)、表達抑彈性酶蛋白的wt菌株(抑彈性酶蛋白)和表達抑彈性酶蛋白的htrA突變菌株(抑彈性酶蛋白+)來治療。圖10:干酪乳球菌wt菌株和表達S0D，表達抑彈性酶蛋白和表達IL-10的干酪乳球菌菌株在DSS5%誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型中的保護效果。評估了用水(陰性對照)或用DSS5%治療的10只小鼠的不同組中的肉眼觀察的(A)、組織損傷⑶和MPO活性(C)。兩個第一對照組i)用水治療并且口部饋入PBS(陰性對照組)并且ii)用DSS5%治療并且口部饋入PBS(陽性對照組)。其它組全部用DSS5%和干酪乳球菌wt菌株(WT)或表達過氧化物歧化酶(SOD)、抑彈性酶蛋白(抑彈性酶蛋白)或IL-10的干酪乳球菌菌株來治療。*和**指示數(shù)據(jù)與通過干酪乳球菌wt獲得的數(shù)據(jù)顯著不同(P〈0.05)。圖11:來自小鼠的結(jié)腸組織中的髓過氧物酶(MPO)活性(D)。測量來自小鼠的結(jié)腸組織中的髓過氧物酶(MPO)活性(D)，所述小鼠飲用了其飲用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以i)WT乳酸乳球菌、重組乳酸乳球菌和表達抑彈性酶蛋白或IL-10的乳酸乳球菌htrA菌株和以ii)干酪乳球菌wt菌株和表達S0D，表達抑彈性酶蛋白和表達IL-10的干酪乳球菌菌株的口服治療7天。*和**指示數(shù)據(jù)與通過干酪乳球菌wt獲得的數(shù)據(jù)顯著不同(Ρ〈0·05)。胤抑彈性酶蛋白基因在EDTA可誘導(dǎo)啟動子的控制下得以表達的乳酸乳球菌WT菌株中的抑彈性酶蛋白釋放[LlullD和PoquetI.2004；ΕΡI537215和FR9816462]。表達抑彈性酶蛋白的乳酸乳球菌WT菌株在存在(+)或不存在(-)EDTA、螯合劑的情況下生長過夜(在此建構(gòu)物中，抑彈性酶蛋白基因表達由可通過添加EDTA來誘導(dǎo)的乳球菌啟動子來控制在染色體上，此啟動子控制編碼對于鋅具有特異性的ABC吸收系統(tǒng)的基因的表達，并且在可通過添加EDTA來模擬的鋅饑餓條件來進行遏制)。然后，將蛋白質(zhì)提取并且在細胞組分(C)與上清液組分(S)之間進行分級并且使用抗抑彈性酶蛋白抗體來進行蛋白質(zhì)印跡實驗。實施例材料和方法重組乳酸細菌(乳酸乳球菌和干酪乳桿菌)中的抑彈性酶蛋白的克隆抑彈性酶蛋白在乳酸細菌中的克隆和表達編碼抑彈性酶蛋白的基因從質(zhì)粒DK6-抑彈性酶蛋白(14)PCR擴增。所用的引物序列是5’正向抑彈性酶蛋白(CCAATGCATCAGCAGCTGTCACGGGAGTTCC)(SEQIDN。I)和3’反向抑彈性酶蛋白(GGACTAGTCCTCACTGGGGAACGAAACAGGCC)(SEQIDN。2)。引物經(jīng)過設(shè)計以消除編碼信號肽(SP)的抑彈性酶蛋白區(qū)域的第一密碼子并且替換為Usp45蛋白質(zhì)(PSusp45)的SP，所述Usp45蛋白質(zhì)主要從乳酸乳球菌分泌。為了實現(xiàn)這一目標，將PCR產(chǎn)物消化、純化，并且在PSEC，即乳酸乳球菌分泌載體中克隆。在所得到的質(zhì)粒pSEC:抑彈性酶蛋白中，抑彈性酶蛋白與編碼RBS和PSusp45的DNA片段同框融合。盒(cassette)的表達由活性取決于所用乳酸鏈球菌素濃度的可誘導(dǎo)啟動子？-來控制。然后，將此質(zhì)粒引入乳酸乳球菌菌株中，所述菌株具有乳酸鏈球菌素調(diào)控基因nisR和nisK(乳酸乳球菌NZ9000)，從而產(chǎn)生重組菌株NZ(pSEC:抑彈性酶蛋白)。所用工具(復(fù)制子、啟動子、RBS和SP)在如干酪乳桿菌和植物乳桿菌的乳桿菌菌株中發(fā)揮功能。選擇這兩種菌株(各自在其染色體上具有基因nisRK)是因為其在消化道中的持久性能力(多達4天，與乳酸乳球菌中的24至48hr形成對比。另外，我們最近已證明干酪乳桿菌BL23菌株在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中具有消炎性質(zhì)[Rochat等，2007]。因此，我們對具有弱持久性(乳酸乳球菌)和強持久性(植物乳桿菌)的非免疫調(diào)節(jié)性菌株以及強持久性(干酪乳桿菌)的免疫調(diào)節(jié)性菌株進行處理，使得我們可評價將所用菌株的內(nèi)在消炎效果與過度表達分子的消炎效果組合的可行性。為了誘導(dǎo)PnisA啟動子，將乳酸乳球菌重組菌株培養(yǎng)至0D_=04-0.6并且然后用10ng/ml的乳酸鏈球菌素(Sigma)在Ih期間進行誘導(dǎo)。然后如下測試此誘導(dǎo)的功能性將NZ(pSEC:抑彈性酶蛋白)培養(yǎng)物(最終OD6qq=I)分離成球團和上清液并且抑彈性酶蛋白含量通過ELISA和/或蛋白質(zhì)印跡來測量。動物C57B16小鼠(6-8周齡)從Janvier(StQuentinFallavier)獲得并且在12h光/暗循環(huán)下保持于室溫下并且可自由采食食物和水，例外是在誘導(dǎo)結(jié)腸炎之前一天，使其禁食12h。所有程序由機構(gòu)動物護理委員會和獸醫(yī)服務(wù)部門批準。誘導(dǎo)結(jié)腸炎和研究設(shè)計通過用葡聚糖硫酸鈉(DSS)的治療來誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥。詳細來說，將DSS溶解于飲用水(3或5%Wt/vol)中并且動物自由飲用此溶液7天。測量DSS治療組中的水消耗量并且與飲用水的原始小鼠組相比未觀察到飲用水和飲用DSS的小鼠之間所消耗液體的體積的差異。小鼠每天以100μI的5.IO9菌落形成單位(cfu)的野生型、抑彈性酶蛋白重組乳酸乳球菌或干酪乳桿菌，或單獨細菌培養(yǎng)基來口服治療。第一次治療起始于將DSS加入飲用水的同時并且最后一次治療在處死當天(第7天)。在誘導(dǎo)結(jié)腸炎之后每天測量體重和存活率。將DSS加入其飲用水之后第7天，將小鼠處死并且收獲結(jié)腸以測量炎癥的若干參數(shù)肉眼觀察的得分、腸厚度、髓過氧物酶(MPO)活性、蛋白質(zhì)分解活性、細胞因子表達。炎癥參數(shù)的測量肉眼觀察的損傷如前所述(5’15’16)來評估。簡單地說，在觀察到以下現(xiàn)象時，給予以下參數(shù)得分I:出血、浮腫、縮窄、潰瘍、糞便有血、粘液和腹瀉。取決于患病區(qū)域長度，紅斑最大得分為2(O:不存在，I:小于lcm，2:大于lcm)。粘連基于其嚴重程度來得分(O:不存在，I:中度，2:嚴重)。在處死時收獲的結(jié)腸組織中，如前所述(5，15’16)來測量作為粒細胞浸潤指標的MPO0使組織樣品在O.5%十六烷基三甲基溴化銨的磷酸鹽緩沖液(pH6)溶液中勻漿化，并且在13OOOXG下離心2min。將上清液加入含有1%過氧化氫和鄰聯(lián)大茴香胺鹽酸鹽(O-dianisidinedihydrochloride)的緩沖液。在450nm下讀取酶溶液的光密度讀數(shù)2min。為了測量細胞因子和趨化因子蛋白質(zhì)，將處死時收獲的冷凍結(jié)腸樣品使用polytron在4°C下，在補充有抗蛋白酶(RocheDiagnostics,Meylan,France)混合物的500μL的細胞溶解緩沖液(20mMTris-Hcl,pH7.5,150mMNaCl,ImMNa2EDTA,ImMEGTA,l%TritonX-100,2.5mM焦磷酸鈉，ΙπιΜβ-甘油磷酸鹽，ImMNa3V04,1μg/ml亮肽素；CellSignalling,Sigma)中勻衆(zhòng)化30s。在離心(lOOOOXg,10min,4°C)之后，將上清液在QIAshredder管柱(Qiagen,France)上過濾，并且將50微升此均衆(zhòng)使用突光細胞分選儀FACSCalibur上的細胞計數(shù)球珠陣列來用于同時計量細胞因子和趨化因子。將原始數(shù)值相對于組織重量進行標準化(平均30至50mg)并且細胞因子濃度借助于FCAPArray軟件而從標準曲線外推。根據(jù)制造商的信息，只考慮高于細胞因子檢測限度的數(shù)值。結(jié)腸組織和管腔洗滌液中的絲氨酸蛋白酶活性如前所述(17)，在處死后，將整個結(jié)腸切除并且將ImlPBS注入并經(jīng)由內(nèi)腔洗滌兩次。測量那些腸腔洗滌液中的蛋白質(zhì)分解活性(胰蛋白酶樣和彈性蛋白酶活性)。胰蛋白酶樣和彈性蛋白酶樣活性分別使用甲苯磺?；?Gly-Pro-Arg-對硝基苯胺(150μΜ,Sigma)和MeO-玻拍酸基-Ala-Ala-Pro-Val-對硝基苯胺(100μΜ,Sigma,SaintQuentinFallavier,France)作為底物來測量。將樣品(20μI用于胰蛋白酶活性或10μI用于彈性蛋白酶活性)重新懸浮于其各自的緩沖液中對于胰蛋白酶活性來說為IOOmMTris/HCl,ImMCaCl2,ρΗ=8，而對于彈性蛋白酶活性來說為50mMTris-HCl,500mMNaCl,0.1%TritonXlOOo在37°C下用微板閱讀儀N0V0star(BMGLabtech,France)對405nm下的吸光率變化進行30分鐘測定。將活性與來自豬胰腺的胰蛋白酶(Sigma)或人中性粒細胞彈性蛋白酶(Sigma)的已知標準稀釋液相比較。腸腔洗滌液中的蛋白質(zhì)濃度使用微板(BCAkit,Pierce,ThermoScientific,Courtaboeuf,France)上的二喹啉甲酸的比色計量進行測定并且用于將各樣品中的蛋白質(zhì)分解活性標準化。誘導(dǎo)和測量響應(yīng)于芥子油的內(nèi)臟疼痛行為在30°C下在沒有振蕩的情況下，將乳酸乳球菌的三種菌株(乳酸乳球菌wt、乳酸乳球菌-抑彈性酶蛋白、乳酸乳球菌-IL-10)在補充有葡萄糖(0.5%)補充有氯霉素(10yg/mL)的M17培養(yǎng)基(Oxoid)中進行培養(yǎng)。將來自過夜培養(yǎng)物的細菌在1/50(v/v)的新鮮培養(yǎng)基中生長直到0D_=0.4至0.6為止。然后，將細菌用所添加的使得能夠進行重組蛋白表達的乳酸鏈球菌素(lng/mL)再培養(yǎng)一小時。細菌通過在450g下離心來收獲并且以無菌PBS洗滌。將球團以5X1010cfu/mL的最終濃度重新懸浮于無菌PBS中。將4至8只小鼠的多個組通過胃內(nèi)施用，每天以IOOyL(SXlO9Cfu)的細菌懸浮液來治療7天。在第8天，通過結(jié)腸內(nèi)注入向小鼠施用50μL的PBS或芥子油(乙醇70%中的0.01%(v/v))，這是在輕微異氟醚麻醉下執(zhí)行。然后，將疼痛相關(guān)行為反應(yīng)(腹部凹陷、舔舐腹部、伸展，和抵靠地面擠壓下腹部)的次數(shù)計數(shù)20min。統(tǒng)計資料各組之間的比較使用學(xué)生雙尾t測試伴以邦費羅尼(Bonferroni)校正來進行。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM，并且小于O.05的P值被認為具有顯著性。表達抑彈性酶蛋白的重組乳酸乳球菌對小鼠中DSS結(jié)腸炎的發(fā)病具有保護作用如所預(yù)料，與引用水的對照小鼠相比，在所有小鼠組中，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎(5%DSS)造成嚴重的重量損失。沒有一種乳酸細菌治療可顯著改良這種重量損失(圖1A)。飲用水中的DSS還造成結(jié)腸組織的肉眼觀察的損傷，壁厚增加和MPO活性增加(圖1B、圖1C、圖1D)。用野生型乳酸乳球菌治療的小鼠不顯示結(jié)腸壁厚和MPO活性的顯著減小，與單獨DSS治療小鼠相比，在這一組中只觀察到肉眼觀察的損傷得分的輕微減少。相比之下，用表達抑彈性酶蛋白的重組乳酸乳球菌治療的小鼠在誘導(dǎo)DSS結(jié)腸炎之后顯示顯著降低的肉眼觀察的損傷得分和結(jié)腸壁厚的顯著更小增加，但是MPO活性與單獨DSS組沒有不同(圖1B、圖1C、圖1D)。另外，用表達IL-10細胞因子的重組乳酸乳球菌治療的小鼠在誘導(dǎo)DSS結(jié)腸炎之后顯示降低的肉眼觀察的損傷得分和MPO活性，但是與單獨DSS相比，壁厚未通過這一治療得到改善(圖1B、圖1C、圖1D)。在非發(fā)炎小鼠中，與原始對照小鼠相比，沒有一種治療可以改善炎癥參數(shù)。DSS誘導(dǎo)的胰蛋白酶樣活性的增加在用表達抑彈性酶蛋白的重組乳酸乳球菌治療的小鼠中顯著降低，但是在用野生型乳酸乳球菌或表達IL-10的重組乳酸乳球菌治療的小鼠中未改變(圖2A)。只有用表達抑彈性酶蛋白的重組乳酸乳球菌治療能夠顯著降低DSS誘導(dǎo)的彈性蛋白酶活性增加(圖2B)。表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌對小鼠中的DSS結(jié)腸炎發(fā)病具有保護作用雖然用野生型干酪乳桿菌治療小鼠顯著降低誘導(dǎo)DSS結(jié)腸炎之后觀察到的肉眼觀察的得分，但是與單獨DSS相比，這一治療未能降低壁厚和MPO活性增加(圖3A、圖3B、圖3C)。相比之下，用表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌治療顯著降低炎癥的所有參數(shù)肉眼觀察的損傷得分、結(jié)腸壁厚和MPO活性(圖3A、圖3B、圖3C)。與用野生型干酪乳桿菌治療的小鼠相比，在用表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌治療的小鼠中，DSS誘導(dǎo)的胰蛋白酶樣活性增加顯著降低(圖4A)。與用野生型干酪乳桿菌治療的發(fā)炎(結(jié)腸炎)小鼠相比，或甚至與用PBS治療的發(fā)炎小鼠相比，在用表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌治療的患有結(jié)腸炎(DSS)的小鼠中，彈性蛋白酶活性水平也顯著降低(圖4B)。在觀察時間點(開始DSS治療之后7天)，趨化因子RANTES的蛋白質(zhì)表達未因DSS結(jié)腸炎而顯著增加。野生型或分泌抑彈性酶蛋白的干酪乳桿菌未能改良DSS治療小鼠中的RANTES表達水平(圖5A)。在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎之后7天，TNFα、IL-6、MCPl、KC、INFY和IL-17A全部因DSS結(jié)腸炎而顯著增加(圖5Β至圖5G)。用表達抑彈性酶蛋白的重組干酪乳桿菌治療小鼠顯著降低了IL-6、MCP1、KC和IL-17的蛋白質(zhì)表達(圖5C、圖5D、圖5E、圖5G)，但是未能降低其它促炎癥性細胞因子如TNFa和INFy的表達水平(圖5B和圖5F)。值得關(guān)注的是，雖然DSS結(jié)腸炎未引起細胞因子IL-2、IL-4、IL_5、IL-10和IL-13的任何增加(圖6A至圖6E)，但是用抑彈性酶蛋白的干酪乳桿菌重組體治療小鼠顯著提高了那些細胞因子的表達，但是這只在結(jié)腸炎情形中(DSS治療之后)發(fā)生。Th2細胞因子響應(yīng)于抑彈性酶蛋白的干酪乳桿菌重組體的這一增加可至少部分地解釋此重組細菌的消炎效果。在發(fā)炎(DSS)或非發(fā)炎小鼠中，IL2、IL-4、IL_5、IL-10和IL-13水平都沒有因任何其它治療而得到改善(圖6A至圖6E)。表達抑彈性酶蛋白的重組乳酸乳球菌減少內(nèi)臟疼痛行為結(jié)腸內(nèi)施用芥子油造成疼痛行為次數(shù)顯著增加腹部凹陷次數(shù)和如舔舐、伸展，和抵靠地面擠壓的綜合疼痛行為次數(shù)(圖7A和圖7B)。將所有行為在一起考慮，用野生型、IL-IO重組體或分泌抑彈性酶蛋白的乳酸乳球菌來治療沒有效果(圖7A)。只考慮綜合疼痛行為，抑彈性酶蛋白，而不是IL-IO-重組乳酸乳球菌或野生型顯著降低了疼痛行為次數(shù)(圖7B)。此外，與PBS治療或野生型乳酸乳球菌治療相比，只有表達抑彈性酶蛋白的重組乳酸乳球菌誘導(dǎo)疼痛行為次數(shù)的顯著減少(圖7B)。htrA菌株的結(jié)果乳酸乳球菌只表達一種稱為htrA的持家(housekeeping)細胞外蛋白酶,其使所有未折疊的輸出蛋白質(zhì)降解(Poquet等，2000和專利申請US6，994，997和FR2787810)。構(gòu)建htrA基因的經(jīng)過滅活的乳酸乳球菌突變菌株并且其允許增加乳酸乳球菌中的多種異源分泌蛋白質(zhì)的產(chǎn)生率(Poquet等,2000和Miyoshi等,2002)。根據(jù)本發(fā)明，在htrA突變體中克隆抑彈性酶蛋白表達組件。htrA突變體和野生型(wt)菌株中的抑彈性酶蛋白產(chǎn)生水平通過蛋白質(zhì)印跡實驗來比較(圖8)。與wt菌株相比，觀察到htrA突變體上清液中的分泌抑彈性酶蛋白顯著增加。因此，htrA菌株允許抑彈性酶蛋白的較高產(chǎn)生和釋放水平。、然后在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型中測試這兩種菌株，并且在活體內(nèi)證實與Wt菌株相t匕，htrA突變體可更好地保護小鼠免受結(jié)腸炎損傷(圖9A、圖9B和圖9C)。比較結(jié)果在DSS5%誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型中并行評估產(chǎn)生IL-10、過氧化物歧化酶(SOD)和抑彈性酶蛋白的干酪乳球菌菌株的保護效果。應(yīng)注意，與乳酸乳球菌相比，干酪乳球菌具有兩個主要差異i)在GIT中的較高持久性和ii)內(nèi)在消炎性質(zhì)(Rochat等，2007;Watterlot等，2010)。如圖10A/B/C中所示，可通過產(chǎn)生抑彈性酶蛋白的干酪乳球菌菌株來獲得對于三種標準(肉眼觀察的，組織學(xué)的和MPO活性)的最佳保護效果，接著用產(chǎn)生SOD的干酪乳球菌菌株來獲得對于三種標準的最佳保護效果。產(chǎn)生IL-10的干酪乳球菌菌株只能提供不良的效果。此外，與兩種乳酸乳球菌菌株(wt乳酸乳球菌和htrA菌株)相比，產(chǎn)生抑彈性酶蛋白的干酪乳球菌菌株提供更好的保護(圖11)?？紤]到抑彈性酶蛋白具有活體外和活體內(nèi)抗細菌活性的事實[SimpsonAJ等，1999]，這些結(jié)果非常令人驚喜。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將預(yù)期細菌宿主產(chǎn)生的效果不佳或根本不產(chǎn)生效果。相反，本發(fā)明人獲得的結(jié)果顯示益生菌很好地產(chǎn)生抑彈性酶蛋白，因此具有治療效果。此外，活體外和活體內(nèi)研究(包括臨床研究)顯示缺乏宿主抗微生物防護在結(jié)腸疾病中可能是有害的[SalzmanNH等，2003和BevinsCL等，2009]。因此，與IL-10相比，抑彈性酶蛋白的多效抗菌/消炎活性使得其成為具備潛質(zhì)的候選治療分子。EDTA誘導(dǎo)乳酸乳球菌中的由啟動子鋅(PZn)ZitR控制的表達在用ImMEDTA誘導(dǎo)Ih之后，通過蛋白質(zhì)印跡分析來測試乳酸乳球菌中的由PZnZitR起動的抑彈性酶蛋白的產(chǎn)生[LlullD和PoquetI.2004]。未經(jīng)過誘導(dǎo)的培養(yǎng)物樣品、細胞球團(C)和上清液(S)產(chǎn)生很低水平的抑彈性酶蛋白以及分泌，而經(jīng)過誘導(dǎo)的培養(yǎng)物產(chǎn)生較高水平的表達和分泌(圖12)。參考文獻本申請全文中，各種參考文獻描述本發(fā)明所涉及的技術(shù)現(xiàn)狀。這些參考文獻的公開內(nèi)容以引用方式并入本公開中。BevinsCL，StangeEFjWehkampJ.DecreasedPanethcelldefensinexpressioninilealCrohn’sdiseaseisindependentofinflammation,butlinkedtotheNOD21007fsgenotype.Gut.2009年6月；58(6):882-3。BraatjΗ.,Μ.P.Peppelenbosch和D.W.Hommes.2003.Interleukin-lO-basedtherapyforinflammatoryboweldisease.Expert.Opin.Biol.Ther.3:725—731。BraatjH.，P.RottiersjD.W.HommesjN.HuyghebaertjE.RemautjJ.P.RemonjS.J.vanDeventer,S.Neirynck，M.P.Peppelenbosch和LSteidler.2006.AphaseItrialwithtransgenicbacteriaexpressinginterleukin-10inCrohnisdisease.Clin.Gastroenterol.Hepatol.4:754—759。BronPeterA.,MarcosG.BenchimoljJolandaLambert,EmmanuellePalumbojMarieDeghorainjJeanDelcourjWillemM.deVosjMichielKleerebezem和PascalHols.UseoftheairGeneasaFood-GradeSelectionMarkerinLacticAcidBacteria.EnvironmentalMicrobiology，2002年11月，第5663-5670頁。CenacjN.，C.N.Andrews,M.HolzhausenjK.Chapman,G.Cottrell，P.Andrade-GordonjM.Steinhoff，G.Barbara,P.Beck,N.W.BunnettjK.A.Sharkey,J.G.Ferraz，E.Shaffer和N.Vergnolle.2007.Roleforproteaseactivityinvisceralpaininirritablebowelsyndrome.J.Clin.Invest117:636—647。Hedin，C.，K.Whelan和J.0.Lindsay.2007.Evidencefortheuseofprobioticsandprebioticsininflammatoryboweldisease:areviewofclinicaltrials.Proc.Nutr.Soc.66:307-315.SallenavejJ.-M.Biol.Chem.Hoppe-Seyler372(1991)，第13-21頁。HyunjE.,P.Andrade-GordonjM.Steinhoff和N.Vergnolle.2008.Protease-activatedreceptor-2activation:amajoractorinintestinalinflammation.Gut57:1222-1229。LlullD.和I.Poquet.NewExpressionSystemTightlyControlledbyZincAvailabilityinLactococcuslactis.EnvironmentalMicrobiology，2004年9月，第5398-5406頁。MottaJean-PauljLaurentMagnejDelphyneDescampsjCorinneRollandjCamilaSquarzoni-DalejPerrineRoussetjLaurenceMartin,NicolasCenacjVivianeBalloyjMichelHuerrejDieterJennejJulienWartellejAzzaqBelaaouajjEmmanuelMasl，Jean-PierreVineljLaurentAlricjMichelChignardjNathalieVergnollejJean-MichelSallenave.Modifyingtheprotease,anti-proteasepatternbyelafinover-expressionprotectsmicefromcolitis.Gastroenterology2011，InPress。PoquetI，SaintV,SeznecE，SimoesNjBolotinA，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