專利名稱：分離核酸的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及核酸的分離和純化。更具體而言，提供了一種使用棉或其衍生物分離和純化核酸的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
核酸提取方法(protocol)可以大致分為基于二氧化硅的方法和非基于二氧化硅的方法。現(xiàn)有的二氧化硅和非二氧化硅的方法不能進(jìn)行水洗以除去非核酸成分，并且需要其中含有一定百分比的醇的水洗液。在洗脫的核酸溶液中存在醇會抑制聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，因此這兩種方法通常都要求高速旋轉(zhuǎn)或其它方法以除去殘余的醇，和用室溫或高溫水性緩沖液(aqueous buffer)進(jìn)行核酸洗脫。在一些情況下，這兩種方法都需要高鹽濃度，同時使用聚乙二醇或水性醇(aqueous alcohol)洗滌。高鹽濃度和水性醇的使用會對核酸的洗脫造成限制，如在核酸洗脫前嚴(yán)格去除這些成分或者使用離心分離等。因此現(xiàn)有的基于二氧化娃或非基于二氧化娃的方法沒有一個能夠用于快速診斷(point of care (POC)(床旁分析))，因為離心分離會產(chǎn)生氣溶膠。如下給出文獻(xiàn)中報道的一些非基于二氧化硅的方法US 7264927該文件描述了纖維素或纖維素紙的使用，涉及使用聚亞烷基二醇和高鹽濃度以進(jìn)行結(jié)合，并最終在緩沖液或去離子水中洗脫核酸。US 6084091描述了使用纖維素粉(如馬鈴薯淀粉)用于核酸分離的方法。US 5804684描述了使用濾紙用于核酸提取的方法，其中將濾紙置于如塑料滴頭的裝置中，同時用軟薄紙或一團(tuán)棉作為過濾器或屏障以支撐濾紙。所有上述工藝要么使用市售可得的硅膠柱進(jìn)行最終的核酸分離，要么需要更長的樣品處理時間(高于30分鐘)或者涉及在基質(zhì)的洗滌過程中采用高鹽濃度或涉及使用離心分離等。這些基于纖維素的核酸提取方法沒有一個采用100%水性緩沖液或水洗滌核酸，而是一般含有一定比例的醇或含多羥基的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本公開涉及一種從樣品中分離核酸的方法，所述方法包括下列步驟(a)向含有核酸的樣品中加入裂解緩沖液以得到裂解溶液，或者(b)向樣品中加入裂解緩沖液和結(jié)合緩沖液以得到裂解溶液，(C)向步驟(a)的溶液中加入結(jié)合緩沖液以將核酸結(jié)合到基質(zhì)或直接將步驟(b)的溶液結(jié)合到基質(zhì)，以及(d)洗滌并洗脫與基質(zhì)結(jié)合的核酸以分離并純化核酸。本公開還涉及一種從樣品中分離核酸的試劑盒，所述試劑盒包括基質(zhì)和緩沖液。


結(jié)合附圖，從以下的描述和所附的權(quán)利要求，本發(fā)明的特征將變得的更為明顯。應(yīng) 該理解的是，通過采用這些附圖，本公開將描述的更加具體和詳盡，但這些附圖僅是描繪了根據(jù)本公開的幾個實施例，因此其不能被認(rèn)為是對保護(hù)范圍的限制
圖I :棉裝載在[a]注射器、[b]注射器針、[c]附于注射器上的塑料模具[d]螺帽塑料瓶、[e]玻璃試管、[f]螺帽玻璃瓶中。圖2 :棉裝載在[a] —次性塑料滴管、[b]模塑巴斯德塑料吸液管、[c]玻璃巴斯德塑料吸液管、[d]有橡膠頭的塑料滴管、[e]棉拭子、[f]模塑塑料吸液管中。圖3 :棉裝載在[a]埃彭道夫管(微量離心管)、[b]螺帽玻璃管、[c]模塑塑料ImL滴頭、[d]帶橡膠帽的一次性玻璃刻度吸液管、[e]粘膠拭子、[f]帶塑料和橡膠頭的玻璃吸液管中。圖4 :通過不同方法純化的DNA樣品用PCR進(jìn)行擴增。泳道I :分子量標(biāo)記物；泳道2 :裝于ImL吸液管滴頭的粘膠；泳道3 :市售粘膠拭子；泳道4 :裝于ImL吸液管滴頭的棉；泳道5 :市售硅膠柱；泳道6 :用市售棉拭子純化的DNA ;泳道7 :未擴增的DNA ;泳道8 :空白水。圖5 :通過不同方法純化的DNA樣品用PCR進(jìn)行擴增。泳道I :裝于ImL吸液管滴 頭的棉；泳道2 :空白水；泳道3 :裝于2mL注射器的棉；泳道4 :市售娃膠柱；泳道5 :分子量標(biāo)記物。圖6 :通過不同方法純化的DNA樣品用PCR進(jìn)行擴增。泳道I :分子量標(biāo)記物；泳道2 :市售二氧化硅方法；泳道3 :裝于ImL吸液管滴頭的棉；泳道4 :裝于吸液管滴頭的Whatman I號濾紙；泳道5 FTA卡方法。圖7 :通過不同方法純化的30ct RNA樣品用RT-PCR進(jìn)行擴增。泳道I :分子量標(biāo)記物；泳道2 :藥棉；泳道3 :高壓蒸汽處理棉；泳道4 :氫氧化鈉水洗棉；泳道5 :鹽酸水洗棉；泳道6 :吸收棉(absorbing cotton);泳道7 Qiagen娃膠柱；泳道8 FTA卡。圖8 :用于自動化核酸提取的用棉填裝的藥筒的元件。
具體實施例方式發(fā)明詳述在下文中，將參照作為本發(fā)明一部分的附圖，進(jìn)行詳細(xì)說明。在說明書、附圖和權(quán)利要求書中詳細(xì)描述的示例性實施方式并不意欲構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在沒有偏離本發(fā)明在此提出的技術(shù)方案的精神或范圍的情況下，可以利用其他的實施方式，并且可以做出其他的改變。容易理解的是，如通常在此所述以及附圖中所圖釋的，本公開的各個方面可以以各種各樣的變化方式進(jìn)行結(jié)合，所有這些變化都是明確可預(yù)期的并且構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本公開涉及一種從樣本中分離核酸的方法，所述方法包括步驟(a)將裂解緩沖液加入到含有核酸的樣本中以得到裂解溶液；或者(b)將裂解緩沖液連同結(jié)合緩沖液一起加入到樣本中以得到裂解溶液；(c)將結(jié)合緩沖液加入到步驟(a)的溶液中以使核酸與基質(zhì)結(jié)合，或者使步驟(b)的溶液與基質(zhì)直接結(jié)合；和(d)洗滌和洗脫與基質(zhì)結(jié)合的核酸以分離和純化核酸。在本公開的一個實施方式中，所述核酸選自包括DNA、RNA和PNA的組中。在本公開的另一個實施方式中，所述樣本為生物或非生物樣本。在本公開的又一個實施方式中，所述生物樣本選自包括血液、痰液、血清、唾液或組織提取液的組中，以及所述非生物樣本選自包括化學(xué)合成的PNA的組中。在本公開的再一個實施方式中，所述裂解緩沖液選自包括硫氰酸胍、鹽酸胍、EDTA、Tris、洗滌劑、多元醇、含有IA族陽離子的單價鹽或含有IIA族陽離子的二價鹽、消化蛋白質(zhì)的酶、非必需的尿素、或其任何組合的組中。在本公開的再一個實施方式中，所述EDTA的濃度在約IOmlT約300mM的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約lOOmM。在本公開的又一個實施方式中，所述硫氰酸胍或所述鹽酸胍的濃度在約O. 1M"約7M的范圍內(nèi)。在本公開的又一個實施方式中，所述尿素的濃度在約O. OllT約7M的范圍內(nèi)。
在本公開的又一個實施方式中，所述Tris的濃度在約O. OlmlT約IOOmM的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約20mM。在本公開的又一個實施方式中，所述多元醇的濃度在約O. OP/Γ約30%(v/v)的范圍內(nèi)。在本公開的又一個實施方式中，所述洗滌劑選自包括月桂硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、TritonX-100、吐溫20和NP-40或其任何組合的組中，以及其中，所述消化蛋白質(zhì)的酶為蛋白酶K。在本公開的又一個實施方式中，所述結(jié)合緩沖液為非必需地帶有多元醇或非多元醇的水。在本公開的又一個實施方式中，所述多元醇包括選自聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇中的水溶性多元醇化合物。在本公開的又一個實施方式中，所述非多元醇包括由甲醇、乙醇、丙醇構(gòu)成的醇；或任何具有酸、胺、醇、酚、酰胺或酯的官能團(tuán)作為官能團(tuán)之一的水溶性液體；或其任何組
口 ο在本公開的又一個實施方式中，分別使用洗滌緩沖液和洗脫緩沖液進(jìn)行所述洗滌和洗脫。在本公開的又一個實施方式中，所述洗滌包括使用包含約P/Γ約99%(v/v)、優(yōu)選約30% 約70%&八)且最佳約50%(v/v)的水性醇的洗滌緩沖液進(jìn)行第一洗滌，然后使用包含100%的水的洗滌緩沖液進(jìn)行多次洗滌。在本公開的又一個實施方式中，所述水性醇選自包括乙醇、甲醇、正丙醇、異丙醇、甘油、PEG、PPG、乙二醇和丙二醇的組中。在本公開的又一個實施方式中，所述水選自包括去離子水、無DNA酶水、無RNA酶水、MilliQ水、過濾水、自來水和地下水或其任何組合的組中。在本公開的又一個實施方式中，所述洗滌緩沖液可以非必需地包含選自包括MgCl2,CaCl2,NaCl和KCl的組中的鹽或pH在約5 約12的范圍內(nèi)的選自包括N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES, TES、硼酸鹽、TAPS、CHES, CAPS、乙醇胺和哌啶的組中的緩沖劑。在本公開的又一個實施方式中，所述洗脫緩沖液包含溫度在約45° (Γ約99° C范圍內(nèi)的溫水和pH在約8 約11的范圍內(nèi)的緩沖劑或鹽。在本公開的又一個實施方式中，所述水選自包括去離子水、無DNA酶水、無RNA酶水、MilliQ水、過濾水、自來水、地下水或其任何組合的組中。在本公開的又一個實施方式中，所述緩沖劑選自包括N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸鹽、TAPS、CHES, CAPS、乙醇胺、哌啶或其任何組合的組中，所述緩沖劑的pH在約5 約12的范圍內(nèi)，或者所述緩沖劑的pKa在約7 約10的范圍內(nèi)。在本公開的又一個實施方式 中，所述鹽選自包括MgCl2、CaCl2、NaCl、KCl或其任何組合的組中，濃度在約O. OlrnT約IOOmM的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約5π Γ約50mM的范圍內(nèi)。在本公開的又一個實施方式中，所述基質(zhì)選自包括棉、棉衍生物、具有棉共混物的合成聚合物或其任何組合的組中。在本公開的又一個實施方式中，所述棉選自包括天然棉、藥棉、臨床級棉、商品棉、棉紗、水洗棉、酸或堿洗棉、高壓蒸汽處理棉、pH在約f約14范圍內(nèi)的緩沖液處理棉、鹽溶液處理棉、有機溶劑處理棉、壓縮棉和加工棉的組中。本公開進(jìn)一步涉及一種用于從樣本中分離核酸的試劑盒，所述試劑盒包括基質(zhì)和緩沖液。在本公開的一個實施方式中，所述基質(zhì)選自包括棉、棉衍生物、具有棉共混物的合成聚合物或其任何組合的組中。在本公開的另一個實施方式中，所述棉選自包括天然棉、藥棉、臨床級棉、商品棉、棉紗、水洗棉、酸或堿洗棉、高壓蒸汽處理棉、pH在約f約14范圍內(nèi)的緩沖液處理棉、鹽溶液處理棉、有機溶劑處理棉、壓縮棉和加工棉的組中。在本公開的再一個實施方式中，所述緩沖液選自包括如上所述的裂解緩沖液、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液的組中。在本公開的又一個實施方式中，所述樣本包括生物或非生物樣本。在本公開的又一個實施方式中，所述生物樣本選自包括血液、痰液、血清、唾液或組織提取液的組中，以及所述非生物樣本選自包括化學(xué)合成的PNA的組中。本公開涉及一種使用棉構(gòu)建核酸提取系統(tǒng)的方法。所述棉以如下方式被裝入在核酸提取過程中提及的全部溶液都將與棉相互作用。在另一個實施方式中，下面將提供對本公開中使用的各種材料的具體說明棉、棉衍生物、包含棉的材料和棉類似材料:由棉樹的棉籽周圍的棉桃得到蓬松的棉。就核酸提取而言，棉是作為基質(zhì)的優(yōu)選材料。棉的形式可為天然棉、藥棉、臨床級棉、商品棉、棉紗、水洗棉、酸或堿洗棉、高壓蒸汽處理棉、緩沖液(pH 1-14)處理棉、鹽溶液處理棉、有機溶劑處理棉、壓縮棉和加工棉等，都是適合的。任何棉織物或不同形式的棉或具有棉共混物的合成聚合物或含棉材料均可用于核酸提取。表現(xiàn)為與棉相似的纖維的如羊毛、絲、開士米等的材料也被認(rèn)為是本公開的部分。有機農(nóng)業(yè)或使用農(nóng)藥和殺蟲劑制造的棉也被認(rèn)為是本公開的部分。橫越不同地理生產(chǎn)的棉將在組成、結(jié)構(gòu)、顏色和品質(zhì)上略有不同，并且橫越世界所有地區(qū)生長的棉被認(rèn)為是本公開的部分。任何來源于棉的產(chǎn)品或在其制造過程中使用棉的材料被認(rèn)為是本公開的部分，并且能夠用于核酸提取。裂解緩沖液所述裂解緩沖液包含高濃度的EDTA以使核酸能夠與棉結(jié)合，并且也用于處理不同種類的樣本(血液、痰液、血清、唾液、組織提取液等)。鹽組分的變化是可以的，并且EDTA的使用是作為實例給出的，不應(yīng)認(rèn)為構(gòu)成對本公開的內(nèi)容的限制。通常，任何高濃度的帶負(fù)電荷的分子都能夠排斥溶液中的核酸并且增強與棉的結(jié)合。所述裂解緩沖液包括硫氰酸胍或鹽酸胍、EDTA、Tris、洗滌劑、非必需的尿素、多元醇、含有IA族陽離子的單價鹽和/或含有IIA族陽離子的二價鹽、和蛋白酶K或任何消化蛋白質(zhì)的酶。硫氰酸胍或鹽酸胍的濃度可為O. 1 7M間的任一濃度。在一些應(yīng)用中可以用鹽酸胍或尿素代替硫氰酸胍，其濃度也可在O. f7M之間變化。尿素用于使蛋白質(zhì)變性，而且它將補足胍鹽的功能并且濃度可在(Γ7Μ之間變化。通常，大多數(shù)文獻(xiàn)報道的用于血液的裂解方法包含l-20mM的EDTA。我們的裂解緩沖液能夠包含顯著不同的EDTA用量，優(yōu)選10-300mM，更優(yōu)選約lOOmM。對于如RNA和PNA的其他核酸而言，可以調(diào)整EDTA濃度，但是總體上，我們發(fā)現(xiàn)，更高的EDTA濃度有助于改進(jìn)PCR和RT-PCR的循環(huán)次數(shù)(Ct)和信號強度。顯著不同的EDTA濃度有助于捕獲血紅蛋白(對于血液)中存在的鐵，抑制DNA酶和RNA酶的活性，以及產(chǎn)生其中核酸能夠與棉結(jié)合的高負(fù)性氛圍。其重要方面在于，該實施方式是在堿性條件下完成DNA與基質(zhì)結(jié)合的第一個實例。重要的是，溶液的結(jié)合pH對DNA/RNA與棉的結(jié)合具有重要作用，因此，對于結(jié)合而言，優(yōu)選PH為約8-10，但是也可以使用pH為約7. 1-12的溶液。通常以更高濃度使用氯化鎂使RNA酶失活，因此，在DNA裂解方法中，不使用或最低限度地使用氯化鎂(在20mM以內(nèi))。此外，使用EDTA也使RNA酶失活，并且使用MgCl2不必是必需的，其對 任何核酸應(yīng)用而言是可選擇的。對于裂解，Tris是緩沖液的選擇，并且我們發(fā)現(xiàn)，可以使用
O-lOOmM，而且通常約20mM是最佳的。應(yīng)當(dāng)注意的是，在我們的裂解緩沖液中，Tris的作用是用來幫助裂解，而且可以使用任何合適的緩沖液代替。在結(jié)合緩沖液中使用多元醇用于改進(jìn)裂開和變性的蛋白質(zhì)的溶解性。多元醇在結(jié)合緩沖液中的百分比可為0-30%(v/v)。在一些應(yīng)用中，不加入單獨的結(jié)合緩沖液，而在裂解之后核酸可以直接結(jié)合到基質(zhì)上。所有這些緩沖液通常均在去離子水中制成，而對于RNA應(yīng)用，可以非必需地用DEPC和高壓滅菌處理所述水。對于血液、痰液、唾液、精液等，在加入上述裂解緩沖液之前，可以先完成蛋白酶K裂解，而且，非必需地，可以和裂解緩沖液一起完成蛋白酶K裂解。我們發(fā)現(xiàn)，蛋白酶K處理在上述裂解緩沖液中是有效的，因此，對于任一種含有核酸的液體樣本而言，這種處理既可在加入裂解緩沖液之前進(jìn)行，又可連同裂解緩沖液一起進(jìn)行。在裂解緩沖液中使用的洗滌劑可以選自包括SLS(月桂硫酸鈉)、SDS、Triton X-100、吐溫20或本領(lǐng)域已知的任何其他的常用離子、非離子洗滌劑。結(jié)合緩沖液在裂解后加入結(jié)合緩沖液以開始核酸與棉的結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)，結(jié)合緩沖液在組成和PH方面非常靈活。結(jié)合緩沖液如此靈活，以至于僅僅加入水就足以稀釋裂解緩沖液中的鹽的濃度，并且觀察到了核酸與棉的良好結(jié)合。在裂解過程中或者在加入結(jié)合緩沖液之后，可以加入棉以進(jìn)行相互作用以從給定樣本中提取核酸。對于實踐目的，結(jié)合緩沖液組合物的PH可為4-12間的任一 pH，優(yōu)選為7-10。對如血液、痰液或唾液的復(fù)雜樣本而言，結(jié)合緩沖液可以含有一定百分比的如PEG、甘油、PPG、乙二醇、丙二醇等的水溶性多元醇化合物。PEG和PPG的分子量可為200-200，000，而且對于全部實踐目的，其將為1000-20, 000。多元醇化合物在結(jié)合溶液中的百分比可為最高至50% (v/v)，但是對于全部實踐應(yīng)用，其將為1-30%(ν/ν)。多元醇化合物用于確保裂解成分的完全相容性，并且，如果蛋白酶K裂解是完全的，那么多元醇百分比可以降低至1%。本領(lǐng)域中已知的緩沖劑包括N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、Tris, HEPES, CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES, TES、硼酸鹽、TAPS、CHES, CAPS、乙醇胺、哌啶等，在pH5_12的范圍內(nèi)，優(yōu)選在7-10的范圍內(nèi)，可以用來制備結(jié)合緩沖液，并且緩沖劑的存在不是強制性的，而是取決于樣本類型、樣本體積、溫度、裂解緩沖液組成，可以使用它。如果使用緩沖鹽，其濃度可在1-200禮，優(yōu)選在Ι-lOOmM，且最優(yōu)選在5_50mM之間變化。上述濃度是結(jié)合溶液的濃度，并且在加入到裂解緩沖液之后，濃度將改變，其取決于裂解緩沖液的組成。此外，上述限定的PH為結(jié)合緩沖液制成時的pH，并且在加入到裂解緩沖液中時，混合溶液(裂解緩沖液+結(jié)合緩沖液)的PH會改變。盡管如甲醇、乙醇和丙醇的醇不是多元醇，但是它們也能夠用于制備結(jié)合緩沖液。通常，也可以使用任何具有酸、胺、醇、酚、酰胺或酯的官能團(tuán)作為官能團(tuán)之一的水溶性液體。
洗滌緩沖液洗滌緩沖液是一種溶液，其將有選擇地洗掉棉中的非核酸成分。如果臨床樣本是血液，在結(jié)合之后，棉將變成棕色，并且為了除去顏色，我們發(fā)現(xiàn)洗滌緩沖液(稱為洗滌緩沖液I)中存在一定百分比的乙醇有助于除去顏色。特別是，使用包含約
1-99%(v/v)、優(yōu)選約30-70%(v/v)且更優(yōu)選50%(v/v)乙醇的緩沖液或水進(jìn)行第一洗漆。如需要，可以進(jìn)行多次含水乙醇洗滌以除去非核酸成分，并且其可以根據(jù)樣本而定。甲醇、正丙醇、異丙醇、甘油、PEG、PPG、乙二醇、丙二醇或任何其他水溶性醇可以代替洗滌溶液中的乙醇。可以使用洗滌緩沖液2，其中存在單價或二價陽離子，連同洗滌緩沖液I 一起使用作為其組成。洗滌緩沖液I和2還可以具有相同組成并且包含水、醇和單價或二價陽離子。使用洗滌緩沖液I和2洗滌棉的次數(shù)可為0-10次，并且理想地為1-3次。隨后的洗滌通常用去離子水，并且洗滌次數(shù)可為1-10，優(yōu)選2-5，且更優(yōu)選3-5。在洗滌步驟中使用的去離子水可以用無DNA酶和RNA酶的水，或MilliQ水或過濾水或自來水或地下水代替。我們觀察到最初用含水醇洗滌趨向除去大多數(shù)非核酸成分，然后接著多次水(100%水)洗滌除去殘留的醇。水洗滌確保獲得的核酸是不含或最小限度含有PCR抑制劑的PCR可立即使用的。所述洗滌緩沖液可以非必需地包含鹽(如MgCl2、CaCl2、NaCl、KCl)或緩沖劑(如pH 5-12范圍內(nèi)的N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES, TES、硼酸鹽、TAPS、CHES, CAPS、乙醇胺、哌啶等)。緩沖劑或鹽或他們的組合的濃度可為Ι-lOOOmM，優(yōu)選為20-200mM，且更優(yōu)選為約lOOmM。洗脫緩沖液任何溫?zé)岬?45-99° C)水性緩沖劑溶液都可以從棉中洗脫核酸。我們發(fā)現(xiàn)洗脫PH是關(guān)鍵性的，但是優(yōu)選pH在8-11的范圍內(nèi)，而且為了完全回收核酸，應(yīng)當(dāng)在45-99° C的溫度下進(jìn)行洗脫。在洗脫步驟中緩沖液制備中使用的去離子水可以用無DNA酶和RNA酶的水，或Mi 11 iQ水，或過濾水，或自來水，或地下水代替。本領(lǐng)域已知的緩沖劑包括N- 二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、Tris, HEPES, CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES, TES、硼酸鹽、TAPS、CHES, CAPS、乙醇胺、哌啶等，pH 在 5-12 的范圍內(nèi)，可以用于洗脫，但是，最優(yōu)選的是具有7-10范圍內(nèi)的pKa的緩沖劑。每當(dāng)棉用于洗脫結(jié)合的核酸時，洗脫緩沖液應(yīng)當(dāng)是溫?zé)岬?，而且對于實踐考慮，應(yīng)在45-99° C的范圍內(nèi)。這與大多數(shù)文獻(xiàn)報道的方法形成鮮明對比，其中，使用去離子水在溫?zé)釛l件下進(jìn)行洗脫，但是結(jié)合于棉的核酸不能用溫?zé)崴耆疵?，緩沖液或鹽的存在是關(guān)鍵性的。鹽可為MgCl2、CaCl2, NaCl、KCl等，濃度為O-lOOmM，優(yōu)選為5_50mM。緩沖劑可以選自緩沖液組(即N- 二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、Tris, HEPES, CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES, TES、硼酸鹽、TAPS、CHES, CAPS、乙醇胺、哌啶)中。 核酸的回收使用當(dāng)前系統(tǒng),核酸回收依賴于所使用的裂解緩沖液、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液及其組合。依賴于這種組合，核酸回收可與任何基于二氧化硅的核酸提取系統(tǒng)媲美。還觀察到，使用低滴定度的樣本，我們的基于棉的核酸提取方法的效率有時優(yōu)于二氧化娃。棉的數(shù)暈棉的數(shù)量取決于臨床樣本的體積，并且我們發(fā)現(xiàn)，對于1-300 μ I范圍內(nèi)的樣本，5-30mg棉是足夠的。對于毫升級別的樣本體積，50mg以上的棉是必要的?？傮w上I毫克至10克的棉足以從任何臨床、環(huán)境或現(xiàn)場樣本中提取核酸。每個測定的價格因為在本發(fā)明的方法中使用的棉是在任何藥店或零售店中可商購的藥棉(可被高壓蒸汽處理或進(jìn)行純化)，每個核酸提取的價格是最小的并且是迄今文獻(xiàn)中報道的最便宜的方法之一。此外，考慮到排除了核酸洗脫液中存在的偶然的PCR抑制齊U，POC使用的簡單性和適應(yīng)性、容易自 動操作等使該方法更加出眾，每次提取的費用很可能是附加的收獲。溶液的成分和處理的安全性基于棉的核酸提取系統(tǒng)利用大多數(shù)水性來源的緩沖液，使用這種緩沖液，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以安全有效地處理廢物。棉可被填充到藥筒中，并且所有的裂解、結(jié)合、洗滌溶液都可被置于該藥筒用于快速診斷(POC)用途，這樣醫(yī)務(wù)工作者或分析員無需處理廢物并且所述藥筒是配套齊全的。提取的核酸的使用使用該實施方式中所述的棉方法提取的核酸可以直接用在PCR或RT-PCR中。所述的棉方法的其他的應(yīng)用為用于從臨床樣本中回收核酸用于存檔、貯藏、進(jìn)一步的生化或分子生物學(xué)使用等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將不時發(fā)現(xiàn)，提取的核酸可用于任何的生化或分子生物學(xué)應(yīng)用。以適用于核酸提取的形式使用棉該實施方式是為了以最少的裝備要求(如離心或其他的旋轉(zhuǎn)裝備)使用棉以‘PCR可立即使用的形式’提取核酸。根據(jù)樣本的數(shù)量、樣本的性質(zhì)和樣本的來源，棉可以任何適于核酸提取的形式填充。優(yōu)選地，在溶液或乳液中獲得核酸，根據(jù)所述的裂解、結(jié)合、洗滌和洗脫系統(tǒng)對其進(jìn)行處理。因此，棉填充是核酸提取的關(guān)鍵部分，并且棉能夠與含有核酸的溶液接觸的任何性質(zhì)被認(rèn)為是本公開的部分。圖1-3顯示了棉可被填充的一些方式，但是其不應(yīng)以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。簡言之，棉以棉接觸含有核酸的溶液或者棉接觸液體的這樣的方式被填充，并且其時本公開的部分。在另一個實施方式中，棉可被填充到改性塑料ImL吸管端、改性塑料2mL吸管端、15mL falcon 管、50mL falcon 管、L 5mL eppendorf 管、2mL eppendorf 管、5mL 砸娃玻璃試管、4mL螺旋帽塑料瓶、3mL塑料Pasteur吸量管、玻璃Pasteur吸量管、具有橡膠球的玻璃Pasteur吸量管、具有橡膠球的塑料Pasteur吸量管、具有球形橡膠和塑料模具的玻璃吸量管、具有塑料蓋的2mL玻璃管形瓶、一次性高壓滅菌的IOmL塑料注射器、連接至5mL注射器的塑料模具、連接至50mL注射器的一次性單元等。所述棉還可制成棉頭拭子，并且所述棉頭拭子可為人造的或機器造的。圖3[e]顯示了由纖維膠和任何棉混聚合物(廣100%)或著化學(xué)或物理改性的棉(廣100%)制成的棉頭拭子，其被認(rèn)為是本公開的一部分。使用棉儲存臨床樣本所述棉可直接暴露于樣本并且為吸收劑，所述棉將以安全的形式穩(wěn)定和儲存樣本。所述安全的形式被定義為這樣一種裝置，在該裝置中所加入的樣本的核酸內(nèi)含物不會被顯著降解。結(jié)合可以以可逆的形式，其中，使用這個實施方式中描述的核酸提取方法可以提取所述核酸。棉可被非必需地和穩(wěn)定劑一起被嵌入，這樣將提高樣本和樣本組分的穩(wěn)定性。非必需地，棉可和酶或化學(xué)藥品或在這個方法中報道的裂解緩沖液或含有蛋白酶K的裂解緩沖液、或連同穩(wěn)定緩沖劑的鹽一起的蛋白酶K 一起被嵌入。所述棉可為EDTA處理過的、疊氮化鈉處理過的、堿處理過的、酸處理過的、裂解緩沖液處理過的、蜂蜜處理過的、任何抗菌劑處理過的、任何抗微生物劑處理過的、任何抗病毒化合物處理過的，或者用EDTA和疊氮化鈉、抗菌劑、抗微生物劑、抗病毒劑、抗凝血劑、本領(lǐng)域中已知的臨床樣本的穩(wěn)定劑、蜂蜜或其任何組合進(jìn)行處理。加入到棉中存儲的樣本的體積可為任何體積，但是對于所有的實踐目的，其可為I μ f20mL，并且所用的棉的數(shù)量可為任何用量，而且對于所有的實踐目的，其可為ImglO克。在收集樣本時，其可在裂解緩沖液浸潰過的棉上進(jìn)行，而且也被認(rèn)為是本發(fā)明公開的一部分。用于核酸提取的棉填充系統(tǒng)的使用方法如圖1-3所舉例說明的，使用報道的在這個實施方式中描述的核酸提取方法，在設(shè)備中填充棉。棉與在這個實施方式中描述的裂解、結(jié)合、洗滌和洗脫系統(tǒng)進(jìn)行相互作用的途徑可為加熱、搖動、渦旋、攪拌、不斷移動、吸液、或使固體和液體進(jìn)行相互作用的其他方式。本質(zhì)上，含有核酸的液體將與棉纖維發(fā)生接觸。在另一個實施方式中，本方法是文獻(xiàn)中報道的最簡單的和最靈活的核酸提取方法 之一。幾乎所有文獻(xiàn)方法都需要離心以旋下內(nèi)含物，或需要磁體來以完整狀態(tài)固定磁性顆粒，或同時需要二者，而在這個實施方式中報道的方法徹底排除了對離心機或磁體的需要?，F(xiàn)有的核酸方法在樣本的體積上有限制，或者對于更大體積的樣本，需要多次處理。這個方法可以使用單個一次性提取系統(tǒng)在幾乎相同時間內(nèi)處理事實上任何數(shù)量的樣本(就實踐目的而言，I μ r20mL)。本方法制造的核酸可以立即用于進(jìn)一步表征和下游處理(如PCR、序列測定或印跡)。這個系統(tǒng)的簡單性使其同樣地適用于快速診斷(POC)或建好的實驗室，這是第一次在文獻(xiàn)中這樣報道。 在這個實施方式中描述的棉的方法具有突出的特點，如排除了離心機的使用，最低限度的使用者對使用者的變化，可與二氧化硅方法媲美的效率，與任何現(xiàn)有的核酸方法相比容易使用，能夠處理任何數(shù)量的樣本，出色的核酸回收，能夠撿取低滴定度的樣本，容易自動化操作，同時適合于已建好的醫(yī)院設(shè)施和快速診斷裝備，以及核酸回收和質(zhì)量的高
一致性。在另一個實施方式中，在本公開所描述的方法以PCR或逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR (RT-PCR)或序列測定或印跡可立即使用的形式用如棉的纖維狀材料從幾乎任何生物來源的臨床或分析樣本中提取核酸。該過程包括裂解、核酸與棉的結(jié)合、用水溶液洗滌結(jié)合了核酸的棉以及在含有如KCl的鹽的緩沖液中洗脫核酸。在二氧化硅或非二氧化硅方法中的典型裂解緩沖液包含如EDTA (螯合劑)的四或二堿離子，其與血液中的鐵結(jié)合。在該報道的方法中，為了創(chuàng)造所有核酸選擇性地與棉結(jié)合的環(huán)境，加入高濃度的EDTA (10-300mM)。通常，將裂解緩沖液的pH調(diào)節(jié)至6以確保結(jié)合于基質(zhì)(二氧化硅或非二氧化硅)，在這種情況下，大多數(shù)蛋白質(zhì)和其他成分是中性的或帶正電荷的，然而核酸仍然帶負(fù)電荷并且與基質(zhì)相互作用。在當(dāng)前系統(tǒng)中，結(jié)合pH應(yīng)當(dāng)為堿性(pH 8-11)，并且過量的帶負(fù)電荷的EDTA(10-300mM)本身擔(dān)當(dāng)緩沖劑并且使PH到8左右。我們的方法是第一種核酸被裂解并且能夠在堿性pH下與基質(zhì)結(jié)合的方法。結(jié)合緩沖液可為水，任何pH在3-11范圍內(nèi)的水性緩沖液，或含有聚乙二醇(PEG，1-30%)或甘油(1-30%)或聚丙二醇(PPG，l-30%)或乙二醇(1-50%)或丙二醇(1-50%)或任何水溶性醇或上述物質(zhì)的組合的水。結(jié)合緩沖液目的是確保稀釋裂解緩沖鹽，在富含EDTA的氛圍中增強核酸的結(jié)合以及穩(wěn)定裂解顆粒。所報道的方法可以容忍寬范圍的具有不同PH值的結(jié)合緩沖液，這也是文獻(xiàn)中第一次提出結(jié)合緩沖液pH或組成是如此靈活。較長的樣本處理時間、對樣本體積的限制和核酸定量的不可行性是FTA卡片的相關(guān)缺點，而在這個實施方式中報道的使用棉的核酸提取方法不存在這樣的缺點。最后，所有報道的文獻(xiàn)的方法都在室溫下或者偶爾在升高的溫度下在水性緩沖液或水中進(jìn)行洗脫，而我們的核酸洗滌在室溫下用水進(jìn)行以及洗脫在升高的溫度(50-99° C)下進(jìn)行。使用在這個實施方式中限定的方法和基質(zhì)，熱的去離子水將不會洗脫全部的結(jié)合核酸，必須存在緩沖劑或鹽或它們的組合。這也與大多數(shù)文獻(xiàn)報道的方法形成鮮明對比，其可在熱的去離子水中從基質(zhì)中洗脫結(jié)合核酸(二氧化硅或非二氧化硅的方法都允許熱水洗脫核酸)。洗脫緩沖液可為PH 8-10間的任一pH，說明洗脫pH是靈活的，并且為了有效地從棉中洗脫結(jié)合核酸，一些濃度的鹽(如KCl)是優(yōu)選的。
在另一個實施方式中，下述方法中，棉和其他的基于棉的纖維狀材料用于在特殊的裂解、結(jié)合、洗滌和對于從棉中洗脫核酸是獨特的洗脫條件下定量提取核酸。在一個方面，本公開提供了一種使用棉從任何環(huán)境、臨床、細(xì)菌、真菌和動物來源的樣本中提取核酸的快速核酸分離系統(tǒng)。所述樣本可為細(xì)胞裂解物、體液、植物、組織、以及細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)胞裂解物。棉和纖維膠分別是天然或人工獲得的纖維狀材料，我們發(fā)現(xiàn)，棉和纖維膠在特定條件下結(jié)合核酸。通過DNA和RNA，舉例說明核酸結(jié)合和核酸在棉上的選擇性保留以及核酸在特定洗脫條件下的釋放的過程。在另一個實施方式中，在典型的從如血液的臨床樣本中提取DNA的過程中，使用含有硫氰酸胍、EDTAjB Tris的緩沖劑、如triton X-100的洗滌劑、非必需的尿素、、多元醇、含有IA族陽離子的單價鹽和/或含有IIA族陽離子的二價鹽、和如蛋白酶K的蛋白質(zhì)裂解酶。硫氰酸胍的濃度可為O. 1 7M間的任一濃度。在一些應(yīng)用中可以使用鹽酸胍代替硫氰酸胍，并且其濃度也可在f6M間變化。尿素用于使蛋白質(zhì)變性，而且它將補足胍鹽的功能并且濃度可在(Γ7Μ間變化。通常，大多數(shù)文獻(xiàn)報道的用于血液的裂解方法包含20mM范圍的EDTA。為了使核酸有效地結(jié)合于棉，我們的裂解緩沖液可以具有顯著更高用量的EDTA，濃度為10-300mM，優(yōu)選約lOOmM。對于如RNA和PNA的其他核酸而言，可以調(diào)整EDTA濃度，但是總體上，我們發(fā)現(xiàn)，更高濃度的EDTA有助于改進(jìn)PCR和RT-PCR的循環(huán)次數(shù)(Ct)和信號強度。顯著更高濃度的EDTA有助于捕獲血紅蛋白(對于血液)中存在的鐵，抑制任何DNA酶的活性，以及產(chǎn)生其中核酸能夠與棉結(jié)合的高負(fù)性氛圍。本發(fā)明的重要方面在于，在緩沖液中加入顯著更高濃度的EDTA使緩沖液的pH為堿性，并且據(jù)我們所知，該實施方式是第一個在堿性條件下進(jìn)行DNA與基質(zhì)的結(jié)合的實例。重要的是，溶液的結(jié)合pH必須是堿性的以使核酸能夠與棉結(jié)合，這是因為在非常酸性的PH下，EDTA可能會從裂解緩沖液中沉淀出來，因此，對于結(jié)合而言，PH在8以上是優(yōu)選的。通常，高濃度使用氯化鎂以使RNA酶失活，因此，在核酸裂解方法中，可以使用它。Tris是裂解緩沖劑的選擇，并且我們發(fā)現(xiàn)，可以使用O-lOOmM，而且通常約20mM是最佳的。在裂解或結(jié)合緩沖液中使用多元醇目的是增加蛋白酶K的活性并改善裂解蛋白質(zhì)的溶解性。多元醇在裂解緩沖液中的百分比可為0-30%(v/v)。所有這些緩沖液均在去離子水中制成，并且對于RNA應(yīng)用，所述水可以用DEPC進(jìn)行處理并高壓滅菌。對于血液、痰液、唾液等，蛋白酶K裂解可以在加入上述裂解緩沖液之前完成，而對于尿、汗等可以和裂解緩沖液一起進(jìn)行。我們發(fā)現(xiàn)，蛋白酶K處理在上述裂解緩沖液中是有效的，因此，對于任一種含有核酸的臨床樣本而言，這種處理可在加入裂解緩沖液之前進(jìn)行，或可連同裂解緩沖液一起進(jìn)行。在另一個實施方式中，在裂解后加入結(jié)合緩沖液以開始核酸與棉的結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)，結(jié)合緩沖液在組成方面非常靈活。結(jié)合緩沖液如此靈活，以至于僅僅加入水就足以稀釋裂解緩沖液中的鹽的濃度，并且觀察到了核酸與棉的良好結(jié)合。在裂解過程中或者在加入結(jié)合緩沖液之后，可以加入棉以發(fā)送相互作用。結(jié)合緩沖液組合物的PH可為5-12之間的任一 pH，優(yōu)選為7-10。對如血液、痰液或唾液的復(fù)雜樣本而言，結(jié)合緩沖液可以含有一定百分比的如PEG、甘油、PPG、乙二醇、丙二醇等的多元醇化合物。我們發(fā)現(xiàn)，如乙醇或含水乙醇的傳統(tǒng)使用的結(jié)合溶液(對于基于二氧化硅的核酸洗脫)降低了核酸對面的結(jié)合親和力，即，我們發(fā)現(xiàn)，在結(jié)合步驟過程中乙醇的存在降低了核酸結(jié)合于棉的效率。在另一個實施方式中，洗滌緩沖液是一種選擇性地洗去棉中的非核酸成分的溶液。如果臨床樣本是血液，在結(jié)合之后，棉顏色將變成棕色，并且為了除去顏色，我們發(fā)現(xiàn)洗滌緩沖液(稱為洗滌緩沖液I)中的一定百分比的乙醇有助于除去顏色。特別是，使用包含約1-99%(v/v)、優(yōu)選約30-70%(v/v)且更優(yōu)選50%(v/v)乙醇的緩沖液或水進(jìn)行第一洗漆。甲醇、正丙醇、異丙醇、甘油、PEG、PPG、乙二醇、丙二醇或任何其他水溶性醇都可以代替該洗滌溶液中的乙醇?？梢允褂孟礈炀彌_液2，其中存在單價或二價陽離子，連同洗滌緩沖液I一起使用作為其組成。洗滌緩沖液I和2還可以具有相同組成并且包含水、醇和單價或二價陽離子。使用洗滌緩沖液洗滌棉的次數(shù)可為0-10次，并且理想地為1-3次。隨后的洗滌通常用去離子水，并且洗滌次數(shù)可為1-10，優(yōu)選2-5，且更優(yōu)選3-5。在洗滌步驟中使用的去離子水可以用無DNA酶和RNA酶的水，或MilliQ水或過濾水或自來水或地下水代替。在另一個實施方式中，可以使用任何水性緩沖液從棉中洗脫核酸。在洗脫緩沖液中，所述緩沖劑的濃度需要為f200mM，優(yōu)選為5-50mM，更優(yōu)選為30_70mM。本領(lǐng)域中已知的緩沖劑包括N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、TriS、HEPES、CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bi s-tri s、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸鹽、TAPS、乙醇胺、CHES、CAPS、乙醇胺、哌啶等，pH在5-12的范圍內(nèi)，優(yōu)選在7-10的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在8-10的范圍內(nèi)，將在熱條件下用于洗脫棉中的核酸。從棉中洗脫核酸需要在5(Tl00°C、優(yōu)選在70-95°C、更優(yōu)選在約85°C的提高的溫度下進(jìn)行。在另一個實施方式中，純化的核酸可為10-100%純，并且通常將是PCR可立即使用的。核酸的純度取決于裂解、結(jié)合、洗滌和洗脫緩沖液與純化基質(zhì)(棉或棉衍生物或棉混材料)的最佳組合。我們發(fā)現(xiàn)，在這些緩沖液組合中，F(xiàn)TA卡片或纖維素結(jié)合顆粒，或纖維素濾紙不是有效的，說明對于與核酸的相互作用而言，棉與其他形式的纖維素是不同的。在相關(guān)方法中，本公開提供了一種使用下列通用方法使用棉或棉衍生物或棉混材料作為固體基質(zhì)從含有核酸的樣本中分離核酸的方法。a)將含有核酸的樣本加入到裂解緩沖液中。所述裂解緩沖液由硫氰酸胍、EDTA、Tris、洗滌劑、非必需的尿素、多元醇、含有IA族陽離子的單價鹽和/或含有IIA族陽離子的二價鹽、和蛋白酶K組成。將所述核酸樣本和裂解緩沖液混合并在50-95° C加熱1-20分鐘。b)將結(jié)合緩沖液加入到上述溶液中，并且結(jié)合緩沖液可為水、pH 4-11的緩沖液、 或含有多元醇的溶液。所述結(jié)合緩沖液的體積可為裂解緩沖液體積的0.1-10倍。
c)使上述溶液與棉進(jìn)行相互作用，優(yōu)選在室溫下幾秒或幾分鐘。d)然后特定地使用由水性醇或單獨由水組成的洗滌緩沖液洗滌棉(第I洗滌)。e)隨后使用水或緩沖液洗滌上述棉，直到從棉中清除殘留的醇。f)使用由如KCl的鹽(含有IA族陽離子或含有IIA族陽離子的鹽)和/或N-二(羥乙基)甘氨酸樣緩沖劑組成的緩沖液洗脫核酸，并且洗脫的核酸通常可直接用于PCR或RT-PCR。借助下列表格，進(jìn)一步詳細(xì)描述本公開 ，下列表格提供了本公開使用的方法和現(xiàn)有技術(shù)中使用的方法的比較說明。針對用于表征用于分離核酸的方法的各種方法，表格比
較了一些重要方面。表I :核酸分離中涉及的重要方面的對比說明
樣品使用棉的核酸基于纖維素基使用市售硅膠八一？"
特性b涂覆的磁性納米
編號提取質(zhì)的核酸提取柱的核酸提取 M i
顆粒的核酸提取
pH為8以上的裂
1是否否否解緩沖液
可能，但一般
對于 DNA/RNA
2是可能采用不同的方可能 的單-"·方法
法
用pH 7的水/緩沖
不旦旦旦
^門疋疋疋
液洗脫核酸
權(quán)利要求
1.一種從樣本中分離核酸的方法，所述方法包括下列步驟 (a)將裂解緩沖液加入到含有核酸的樣本中以得到裂解溶液；或者 (b)將裂解緩沖液連同結(jié)合緩沖液一起加入到樣本中以得到裂解溶液； (C)將結(jié)合緩沖液加入到步驟(a)的溶液中以使核酸與基質(zhì)結(jié)合，或者使步驟(b)的溶液與基質(zhì)直接結(jié)合；和 (d)洗滌和洗脫與基質(zhì)結(jié)合的核酸以分離和純化核酸。
2.如權(quán)利要求I所述的方法,其中，所述核酸選自包括DNA、RNA和PNA的組中。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述樣本為生物或非生物樣本。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述生物樣本選自包括血液、痰液、血清、唾液或組織提取液的組中，以及所述非生物樣本選自包括化學(xué)合成的PNA的組中。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述裂解緩沖液選自包括硫氰酸胍、鹽酸胍、EDTA、Tris、洗滌劑、多元醇、含有IA族陽離子的單價鹽或含有IIA族陽離子的二價鹽、消化蛋白質(zhì)的酶、非必需的尿素、或其任何組合的組中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述EDTA的濃度在約IOmT約300mM的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約lOOmM。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述硫氰酸胍或所述鹽酸胍的濃度在約O.IM^約7M的范圍內(nèi)。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述尿素的濃度在約O.01M"約7M的范圍內(nèi)。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述Tris的濃度在約O.OlmT約IOOmM的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約20mM。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述多元醇的濃度在約O.019Γ約30%(v/v)的范圍內(nèi)。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述洗滌劑選自包括月桂硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、Triton X-100、NP-40、吐溫20或其任何組合的組中，以及其中，所述消化蛋白質(zhì)的酶為蛋白酶K。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述結(jié)合緩沖液為水，非必需地含有多元醇或非多元醇。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述多元醇包括選自聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇中的水溶性多元醇化合物。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述非多元醇包括由甲醇、乙醇、丙醇構(gòu)成的醇；或任何具有酸、胺、醇、酚、酰胺或酯的官能團(tuán)作為官能團(tuán)之一的水溶性液體；或其任何組口 ο
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述洗滌和洗脫分別使用洗滌緩沖液和洗脫緩沖液進(jìn)行。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述洗滌包括使用包含約19Γ約99%(v/v)、優(yōu)選約309Γ約70%(v/v)且最佳約50%(v/v)的水性醇的洗滌緩沖液進(jìn)行第一洗滌，然后使用包含100%的水的洗滌緩沖液進(jìn)行多次洗滌。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述水性醇選自包括乙醇、甲醇、正丙醇、異丙醇、甘油、PEG、PPG、乙二醇和丙二醇的組中。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述水選自包括去離子水、無DNA酶水、無RNA酶水、MilliQ水、過濾水、自來水、地下水或其任何組合的組中。
19.如權(quán)利要求15和16所述的方法，其中，所述洗滌緩沖液可以非必需地包含選自包括MgCl2、CaCl2, NaCl和KCl的組中的鹽或pH在約5 約12的范圍內(nèi)的選自包括N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、Tris, HEPES, CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bis_tris、PIPES、ACES、BES, TES、硼酸鹽、TAPS、CHES, CAPS、乙醇胺和哌啶的組中的緩沖劑。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述洗脫緩沖液包含溫度在約45°(Γ約99° C范圍內(nèi)的溫水，同時含有pH在約8 約11的范圍內(nèi)的緩沖劑或鹽。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述水選自包括去離子水、無DNA酶水、無RNA酶水、MilliQ水、過濾水、自來水、地下水或其任何組合的組中。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述緩沖劑選自包括N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸鹽、醋酸鹽、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸鹽、TAPS、CHES, CAPS、乙醇胺、哌啶及其任何組合的組中，所述緩沖劑的pH在約5 約12的范圍內(nèi)，或者所述緩沖劑的pKa在約T約10的范圍內(nèi)。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述鹽選自包括MgCl2、CaCl2,NaCl和KCl或其任何組合的組中，濃度在約O. OlrnT約IOOmM的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約5π Γ約50mM的范圍內(nèi)。
24.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述基質(zhì)選自包括棉、棉衍生物、具有棉共混物的合成聚合物或其任何組合的組中。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述棉選自包括天然棉、藥棉、臨床級棉、商品棉、棉紗、水洗棉、酸或堿洗棉、高壓蒸汽處理棉、pH在約f約14范圍內(nèi)的緩沖液處理棉、鹽溶液處理棉、有機溶劑處理棉、壓縮棉和加工棉的組中。
26.一種用于從樣本中分離核酸的試劑盒，所述試劑盒包括基質(zhì)和緩沖液。
27.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，所述基質(zhì)選自包括棉、棉衍生物、具有棉共混物的合成聚合物或其任何組合的組中。
28.如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中，所述棉選自包括天然棉、藥棉、臨床級棉、商品棉、棉紗、水洗棉、酸或堿洗棉、高壓蒸汽處理棉、pH在約f約14范圍內(nèi)的緩沖液處理棉、鹽溶液處理棉、有機溶劑處理棉、壓縮棉和加工棉的組中。
29.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，所述緩沖液選自包括如權(quán)利要求5 11中所述的裂解緩沖液、如權(quán)利要求12 14中所述的結(jié)合緩沖液、如權(quán)利要求15和19中所述的洗滌緩沖液以及如權(quán)利要求15和2(Γ23中所述的洗脫緩沖液的組中。
30.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，所述樣本包括生物或非生物樣本。
31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中，所述生物樣本選自包括血液、痰液、血清、唾液或組織提取液的組中，以及所述非生物樣本選自包括化學(xué)合成的PNA的組中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用棉從固體或液體樣本中分離天然和人工核酸(如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和肽核酸(PNA))的方法。棉以如下方式填充含有核酸的溶液通過它并且溶液中的核酸在最適于結(jié)合的介質(zhì)中與棉結(jié)合。核酸與棉的結(jié)合以如下方式進(jìn)行結(jié)合的核酸能夠經(jīng)受住水性液體的多次洗滌，并且在如下的水性緩沖液中被洗脫掉用該水性緩沖液洗脫的核酸能夠直接用于使用PCR的擴增或者用于任何其他的生物化學(xué)或分子生物學(xué)需要。
文檔編號C12N15/10GK102725407SQ201180005674
公開日2012年10月10日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月7日
發(fā)明者帕尼·庫馬爾·普萊拉, 桑托什·庫馬爾·甘達(dá)瓦拉, 皮拉里斯蒂·文卡塔·蘇巴拉奧, 穆拉克卡普爾斯·納拉亞南·馬努基, 米切爾·普里坦·平托, 錢德拉塞卡爾·巴斯卡拉·奈爾 申請人:比格科技私人有限公司