專利名稱：：細(xì)菌視紫紅質(zhì)多位點(diǎn)突變基因和蛋白質(zhì)及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物分子電子學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種具有質(zhì)子泵功能的基因，其編碼的蛋白質(zhì)，含有該質(zhì)子泵功能基因的載體，制備突變基因、突變蛋白質(zhì)的方法，以及該基因產(chǎn)物細(xì)菌視紫質(zhì)分子作為3D立體光學(xué)信息存儲(chǔ)材料，在制備高密度3D立體光學(xué)信息存儲(chǔ)器的材料中的用途。
背景技術(shù)：
：信息時(shí)代對器件更小型化和更高集成度的需求，激發(fā)了人們對生物分子電子學(xué)的極大興趣。目前計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)展的主要限制是隨機(jī)存儲(chǔ)器的尺寸和數(shù)據(jù)傳輸帶寬，而這些性質(zhì)是由構(gòu)成器件的材料決定的。生物分子電子學(xué)是在分子水平上研究信息的編碼、處理和恢復(fù)，從而明顯降低了器件特征尺寸和門傳導(dǎo)延遲。以分子材料為基礎(chǔ)構(gòu)成的分子計(jì)算機(jī)能夠23倍地小于由大量邏輯門所組成的半導(dǎo)體計(jì)算機(jī)，從而大幅度地提高計(jì)算機(jī)速度和存儲(chǔ)密度。天然的和修飾的生物分子(色素或蛋白質(zhì)等)已經(jīng)在電子或光子器件中表現(xiàn)出非常大的應(yīng)用前景。目前盡管已報(bào)道了幾種蛋白質(zhì)在器件應(yīng)用上的可能性，但細(xì)菌視紫質(zhì)(BR)分子是公認(rèn)的最有應(yīng)用前途的蛋白質(zhì)。以BR為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)光子和電子器件有巨大的應(yīng)用潛力，如用于數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、處理和超速光探測領(lǐng)域，以及作為新能源一新的光電轉(zhuǎn)換材料等。特別是以BR為基礎(chǔ)的存儲(chǔ)介質(zhì)很輕，可防輻射，有高的熱穩(wěn)定性G40。C)，高的空間分辨率(5000線/ram)，高的光靈敏度，高的循環(huán)次數(shù)，良好的非線性光學(xué)特性，并且比較便宜，其優(yōu)勢超過了現(xiàn)在使用的各種有機(jī)和無機(jī)材料。BR分子是一種膜結(jié)合的光能轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)，其功能是光驅(qū)質(zhì)子泵。BR光循環(huán)的兩個(gè)中間體BR和M態(tài)是形成光開關(guān)的基礎(chǔ)。如BR分子用于2D存儲(chǔ)器中，當(dāng)存儲(chǔ)信號(hào)的斑點(diǎn)為IO納米時(shí)，其存儲(chǔ)密度為1012bits/cm2,比目前市場上的商品高4個(gè)量級(jí)。但基于B—M態(tài)的光子和全息存儲(chǔ)也只限于二維存儲(chǔ)體系，不能夠有效的作為雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)來利用。另外，M態(tài)的壽命以及破壞性寫入和讀出的操作問題，也是限制因素。所以，兩種狀態(tài)的光學(xué)體系通常不可能用于立體光學(xué)存儲(chǔ)。而利用BR分支光循環(huán)特性構(gòu)建的3D存儲(chǔ)器與2D存儲(chǔ)器相比，又可使同樣體積內(nèi)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)能力提高3001000倍，因此可以稱其為超高密度存儲(chǔ)器。在BR的光化學(xué)反應(yīng)中，分支反應(yīng)對于3D存儲(chǔ)器的運(yùn)行至關(guān)重要。當(dāng)BR分子吸收光子后，伴隨著質(zhì)子泵功能經(jīng)歷一個(gè)光循環(huán)過程，產(chǎn)生J、K、L、M、N、O—系列中間態(tài)。其中O態(tài)經(jīng)光照時(shí)，出現(xiàn)含有P和Q態(tài)的一個(gè)稱為分支光循環(huán)過程。當(dāng)沒有藍(lán)光條件下，Q態(tài)非常穩(wěn)定，用Q態(tài)存儲(chǔ)的資料可保存520年。BR的分支光循環(huán)為實(shí)現(xiàn)3D信息存儲(chǔ)提供了重要的途徑，可以通過規(guī)定B態(tài)為二進(jìn)制O,P和Q態(tài)為二進(jìn)制1，制成BR分支光循環(huán)3D立體存儲(chǔ)器。然而，天然的蛋白質(zhì)對上述3D光學(xué)存儲(chǔ)器而言，并非是最理想的。因?yàn)橐吧虰R雖然具有進(jìn)入分支光循環(huán)的能力，但是量子效率極低，一般僅為10—310—4。分支光循環(huán)3D存儲(chǔ)系統(tǒng)需要解決的主要問題是提高B—0—P態(tài)的量子效率。至今所有的研究中，化學(xué)修飾和定點(diǎn)突變是最常用的用來產(chǎn)生優(yōu)化的蛋白質(zhì)的技術(shù)，然而化學(xué)方法雖然可以成功地修飾蛋白質(zhì)特定的特性，但代價(jià)是損失了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、循環(huán)周期和壽命。定點(diǎn)突變是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系最有效的方法，它也是目前優(yōu)化BR的主要方法?，F(xiàn)在已經(jīng)通過單位點(diǎn)的定點(diǎn)突變產(chǎn)生出了幾百個(gè)BR突變子。最突出的突變子是BR—D96N，可作為BR處理器材料；還有藍(lán)色突變子BR—D85N，可作為BR存儲(chǔ)器材料。美國康涅狄格大學(xué)化學(xué)系的Birge教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，研究了用BR為材料的3D光學(xué)存儲(chǔ)器。他們利用定點(diǎn)突變，產(chǎn)生了延長了O態(tài)壽命的突變體。還通過半隨機(jī)突變獲得了三個(gè)一組的突變，已經(jīng)使蛋白質(zhì)在3D性質(zhì)上獲得了700倍的改進(jìn)[Wise，K丄，etal.(2002):Optimizationofbacteriorhodopsinforbioelectronicdevices.7T五jVD51/"20,387-394.]。但以上這些突變還不能完全滿足分支光循環(huán)3D存儲(chǔ)器材料的要求，因?yàn)閷τ谟袘?yīng)用價(jià)值的3D存儲(chǔ)器材料要求5個(gè)變量同時(shí)優(yōu)化即0態(tài)的形成時(shí)間(使最小化)，0態(tài)的衰減(使最優(yōu)化)，0—P光化學(xué)轉(zhuǎn)變的量子效率(使最大)，P—Q水解效率(最大化)，還有Q態(tài)的壽命(最大化)。正因?yàn)?D存儲(chǔ)器綜合體系有太多的變量，希望通過單突變或雙突變能同時(shí)完成這些任務(wù)是不可能的。對于象BR大小的蛋白質(zhì)(248個(gè)殘基)，要在現(xiàn)有水平上獲得有效的突變，總的突變數(shù)量是4712個(gè)單位點(diǎn)突變和11056708個(gè)雙位點(diǎn)突變，這還不包括三個(gè)以上多位點(diǎn)突變。這一方面說明蛋白質(zhì)分子有極大的可修飾空間；另一方面，如此大的突變工作量，既不可能完成，也不一定能得到符合要求的正突變。所以如何在如此大量的突變中，找出真正有益的突變位點(diǎn)組合，是最關(guān)鍵的問題。據(jù)目前研究表明，BR分子某些重要區(qū)域的單位點(diǎn)突變，可以有限地影響B(tài)R分子的功能。本研究在前期工作中發(fā)現(xiàn)，三位點(diǎn)突變子、I119T/T121S/A126T和四如;子泵，光循環(huán)等物理特性的影響更大。并且;現(xiàn)，BR質(zhì)子泵功能和M態(tài)的壽命與0態(tài)的形成量是有密切聯(lián)系的。質(zhì)子泵功能的下降和M態(tài)壽命的延長會(huì)導(dǎo)致0態(tài)形成量的增加。因此在分析內(nèi)容方面，以M態(tài)的動(dòng)力學(xué)和質(zhì)子泵功能作為重要的參考指標(biāo)，可以快速地進(jìn)行有益突變的篩選。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)菌視紫紅質(zhì)多位點(diǎn)突變基因，一種分離的6叩基因，其序列為SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，具有SEQIDNo.l所示的6印突變基因含有789bp。(該基因含有多個(gè)位點(diǎn)的突變的核苷酸)，能高效表達(dá)突變的細(xì)菌視紫紅質(zhì)分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種突變的蛋白質(zhì)細(xì)菌視紫紅質(zhì)分子，一種分離的&op基因，其序列為SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)含有多個(gè)位點(diǎn)的突變的氨基酸，因此具有更加優(yōu)良光致變色性能，如0態(tài)形成量增加，即量子效率提高；P—Q水解效率增大；Q態(tài)的壽命延長等。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種制備突變的質(zhì)子泵6oP基因的方法，該方法簡單易行，得到的6印基因重組載體對BR蛋白質(zhì)表達(dá)量高。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)分子在制備高性能3D光信息存儲(chǔ)器的材料中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明涉及一種重組載體，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2005年12月19日，保藏編號(hào)CCTCCNO:M205155,分類命名Esc/im'c/i/aJC4/pUCl8-—t39sc/a柳t/g"5a/G619c。本發(fā)明還涉及一種重組表達(dá)載體，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2005年12月19日，保藏編號(hào)CCTCCNO:M205156，分類命名^Esr/zm.CcWJC4/pXLNovR-6opt395C/a40ot/g"5a/G619C。本發(fā)明還涉及一種重組表達(dá)載體為鹽沼鹽桿菌，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2005年12月19日，保藏編號(hào)CCTCCNO:M205157,分類命名//a/oZwc"/ww^//"a〃wwL33JC4/pXLNovR-&OPT395C/A400T/G415A/G6I9C。一種分離的6o/7基因，其序列為SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，具有SEQIDNo.l所示的6印突變基因含有789bp。本發(fā)明還公開了一種由SEQIDNo.l所示的核苷酸序列編碼產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，一種分離的6印基因，其序列為SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。SEQIDNo.2所示的序列編碼一個(gè)由248個(gè)氨基酸組成的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)分子，蛋白質(zhì)分子量約為26kD。本發(fā)明還公開了一種制備突變的質(zhì)子泵基因6o;基因的方法，包括下列步驟A.6op基因的定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)a)6w基因上、下游引物①k^基因上游引物FP:5'-CCGG|GGATCC|GACGTGAAGATGGGGCTC-3'(方框內(nèi)為BamHI酶切位點(diǎn))；②6印基因下游引物rp:5'-tcKagcti1gtgcgatcagtcgctggtcg-3'(方框內(nèi)為HindIII酶切位點(diǎn));b)Zw/7G619C單位點(diǎn)突變上、下游引物①6opG619C單位點(diǎn)突變上游引物FMl的序列為5'-CGTGTGGCTGATCGGCAGC^AAGGTGC-3'(方框內(nèi)為突變位點(diǎn))；②6opG619C單位點(diǎn)突變下游引物RM1的序列為5'-GCACCn@GCTGCCGATCAGCCACACG-3'(方框內(nèi)為突變位點(diǎn))；c)6印T395C/A400T/G415A突變基因上、下游引物①^/T395C/A400T/G415A突變基因上游引物FM2的序列為5'TGAgCGG嘲CCGGCCTGGTCGGC囚CAC3'灘內(nèi)為突變位點(diǎn))；②ZwpT395C/A400T/G415A突變基因下游引物RM2的序列為5'GTG@GCCGACCAGGCCGG^CCCG@TCA3，(框內(nèi)為突變位點(diǎn))B.6印G6i9C基因的的構(gòu)建a)重疊延伸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變原理如圖1所示，以質(zhì)粒？1}(>18-&印(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005,32(6):529-534.)為模板，用FP和RM1作為一對引物，進(jìn)行PCR1，擴(kuò)增出片段A，以RP和FM1作為另一對引物，進(jìn)行PCR2，擴(kuò)增出片段B。PCR的反應(yīng)條件如下所有的PCR反應(yīng)中，Taq酶均為1.2U;引物的濃度均為lOpmol/pl;模板DNA的濃度約為l5ng/pl;且所有PCR反應(yīng)中的混合液配制如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>PCR反應(yīng)體系為混合液6.5|xlDNA溶液l^ilFP或RP1^1RM1或FM11^1Taq酶1.2^1ddH2014，總體積25^1;上述PCR反應(yīng)條件為95。C5分鐘；94。C30秒，60°C30秒，72°C1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72'C10分鐘；然后以片段A和B作為下一輪重組PCR的模板，以FP和RP為引物，進(jìn)行PCR3，合成6o/7C619C;重疊延伸PCR分兩步進(jìn)行，第一步先不加引物，4個(gè)循環(huán)，第二步加入引物FP和RP，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件同上;PCR3產(chǎn)物即為^/7G619C基因；b)克隆載體構(gòu)建將上述擴(kuò)增出來的60/7(J6i9C基因及啟動(dòng)子片段以lX瓊脂糖電泳后，用DNA回收試劑盒回收(DNA回收試劑盒購自MBI公司，回收方法參照試劑盒的說明書)，將回收的6甲基因和質(zhì)粒pUC-18(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005,32(6):529-534.)均用BamHI和HindIII雙酶切，酶切體系如下pUC-18質(zhì)?；?op基因10^110xbuffer2^15謡HI0.5nl(6U)飾孤0.5^1(7.5U)ddH207^1總體積20pl;然后將酶切產(chǎn)物回收后，按照外源片段的摩爾數(shù)是載體摩爾數(shù)的310倍，進(jìn)行連接，連接體系如下酶切的pUC-18質(zhì)粒1^1酶切的k^基因片段6^1T4連接酶(3U(weiss)爾l)0.5^110XT4連接酶Buffer1^1ddH201.5pl總體積lO^ll;C)轉(zhuǎn)化大腸桿菌取適量(DNA的量〈00ng)連接產(chǎn)物(一般取5nl)轉(zhuǎn)化lOOpl大腸桿菌DH5a(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005,32(6):529-534.)感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法如下①挑取大腸桿菌DH5a單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過夜，按l^的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)活化3hr，至OD6oo約為0.5;②將活化好的菌旋液于冰浴中放置10分鐘，取1.5ml菌液，于4'C4000rpm離心35分鐘，倒掉上清；③加入冰預(yù)冷的0.lmol/L的CaC12懸浮菌體，4000rpm離心去上清，收集菌體，再加入冰預(yù)冷的O.lmol/L的CaC12，重懸細(xì)胞，于4'C放置備用；取出4'C放置12-24hr的感受態(tài)細(xì)胞，加入連接產(chǎn)物約5ul，混勻，在冰浴中放置30分鐘；再將其立即放置于42。C的水浴鍋中熱激90秒；◎熱激后快速將試管放入到冰浴中，冷卻2分鐘；⑦取培養(yǎng)物涂布到含有氨芐青霉素(60ug/ml)的固體LB平板上，于37'C培養(yǎng)；于次日挑選轉(zhuǎn)化子。d)PCR鑒定挑取在含有氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌DH5a單菌落，接入含有氨芐青霉素(60pg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)812hr，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定體系如下混合液6，菌液2plFPlplRPlplTaq酶1.2^1ddH2013単總體積25plPCR反應(yīng)的條件為95°C5分鐘；94°C30秒，60°C30秒，72°C90秒，共30個(gè)循環(huán)；72'C10分鐘；PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌株；e)酶切鑒定取PCR鑒定為陽性的大腸桿菌DH5a菌株提取質(zhì)粒pUC-18-6opG619C，進(jìn)行酶切鑒定；質(zhì)粒提取液如下溶液I:50mmol/葡萄糖；25mmol/Tris.Cl(pH8.0);10mmol/EDTA(pH8.0);溶液II:1%SDS;0.2mol/LNaOH(臨時(shí)配制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員均能配制)；溶液III:5mol/L乙酸鉀60ml;冰乙酸11.5ml;雙蒸水28.5ml;pUC-18-6o;Q619C質(zhì)粒的提取方法如下①取大腸桿菌DH5a轉(zhuǎn)化子菌液1.5ml，6000r/分鐘離心5分鐘，收集菌體；②加入150pl質(zhì)粒提取溶液I，懸浮菌體，加入現(xiàn)配的質(zhì)粒提取溶液II30(^1，混勻后，放置冰上5分鐘，裂解細(xì)胞至透明；③加入25pl質(zhì)粒提取溶液in，顛倒混勻后，置于冰上5分鐘；10000r/分鐘，IO分鐘離心，去除部分變性的蛋白，轉(zhuǎn)移上清至另一干凈小管中；◎加入等體積的酚氯仿(1:1),振蕩混勻后，10000r/分鐘，離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈的小管中；⑥再加入等體積的氯仿，振蕩混勻后，10000r/分鐘，IO分鐘離心，轉(zhuǎn)移上清，加入等體積的異丙醇，于4'C沉淀DNA約20分鐘；⑦10000r/分鐘離心10分鐘，去上清，用50(^170%乙醇洗滌管內(nèi)的沉淀兩次，于室溫(20-25°C，下同)干燥；⑧在干燥后的管中加入30^1TE溶液(lmmol/LEDTA，pH8.0;10mmol/lTris-Cl，pH8.0)，禾口lnlRNA酶，37。C水浴降解RNA后，于-20x:保存；將提取的pUC-18-6o;G6wc質(zhì)粒用5awHI和歷m/ffl雙酶切，酶切體系如下:pUC-18-—G6i9C5^110xKbuffer1^101歷"孤ddH20，總體積2(^1用1%的瓊脂糖電泳檢測酶切片段。鑒定含有目的片段的陽性克隆子命名為pUC-18-%G619c。送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。C.6opT395C/A400T/G415A基因的構(gòu)建a)6o;T395C/A400T/G415A基因的定點(diǎn)誘變重疊延伸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變原理如圖1所示，以質(zhì)粒pUC-18-6印為模板，用FP和RM2作為一對引物，進(jìn)行PCR1，擴(kuò)增出片段B，以FM2和RP作為另一對引物^進(jìn)行PCR2，擴(kuò)增出片段A。PCR的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如上述步驟B.a)所示；然后以片段A和B作為下一輪重組PCR的模板，以FP和RP為引物，進(jìn)行PCR3，合成60PT395C/A柳T/G4!5A。重疊延伸PCR分兩步進(jìn)行，第一步先不加引物，t個(gè)循環(huán)，第二步加入引物FP和RP，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件如上述步驟B.a)所示。PCR3產(chǎn)物即為三突變基因6opT395C/A4oOT/G415A;b)克隆載體構(gòu)建將上述擴(kuò)增出來的6印T395C/A400T7G415A基因用1%瓊脂糖電泳后，用DNA回收試劑盒回收，回收的產(chǎn)物和質(zhì)粒pUC-18均用BamHI和HindIII雙酶切，酶切體系和連接體系如上述步驟B.b);c)轉(zhuǎn)化大腸桿菌取適量(DNA的量〈00ng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法如上述步驟B.c);d)PCR鑒定挑取在含有氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌DH5a單菌落，接入含有氨芐青霉素(60嗎/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)812hr，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定體系和PCR反應(yīng)的條件如上述步驟B.d);將PCR產(chǎn)物采用l。/。的瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌株；e)酶切鑒定經(jīng)PCR鑒定為陽性的大腸桿菌DH5a菌株提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，質(zhì)粒的提取方法如上述步驟B.e)所示；用1%的瓊脂糖電泳檢測酶切片段；鑒定為含有目的片段的陽性克隆子命名為pUC-lS-&叩送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。D.AopT395C/A400T/G415A/G619C基因的構(gòu)建重疊延伸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變原理如圖1所示，以質(zhì)粒pUC-18-6o/T395C/A400T/G415A為模板，用FP和RM1作為一對引物，進(jìn)行PCR1，擴(kuò)增出片段A,以FM1和RP作為另一對引物，進(jìn)行PCR2，擴(kuò)增出片段B。PCR的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如上述步驟B.a)所示；然后以片段A和B作為下一輪重組PCR的模板，以FP和RP為引物，進(jìn)行PCR3,合成^PT395C/A4Q()T/G415A/G619C;重疊延伸PCR分兩步進(jìn)行，第一步先不加引物，4個(gè)循環(huán)，第二步加入引物FP和RP，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件如上述步驟B.a);PCR3產(chǎn)物即為6c^T395C/A柳T/G415A/G619C基因；b)克隆載體構(gòu)建將上述擴(kuò)增出來的6叩T395C/A400T/G415A/G619C基因及啟動(dòng)子片段用1。^瓊脂糖電泳后，用DNA回收試劑盒回收，將回收的6印基因和質(zhì)粒pUC-18均用BamHI和HindIII雙酶切，酶切體系和連接體系如上述步驟B.b)所示；c)轉(zhuǎn)化大腸桿菌取適量(DNA的量〈100ng)連接產(chǎn)物(一般取5pl)轉(zhuǎn)化100^1大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法如上述步驟B.c)所示；d)PCR鑒定挑取轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在LB固體培養(yǎng)基上長出的單菌落于5ml含有氮芐青霉素(60pg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)812hr，取菌液PCR鑒定，鑒定體系和PCR反應(yīng)的條件如
發(fā)明內(nèi)容B.d)，將PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌株；e)酶切鑒定將PCR鑒定為陽性的大腸桿菌DH5cx菌株提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，質(zhì)粒的提取方法上述歩驟B.e)所示；用1%的瓊脂糖電泳檢測酶切片段。鑒定含有目的片段的陽性克隆子命名為pUC-18-60/7T395C/A柳T/G4i5A/G6!9C,送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。含有突變的to/7T395C/A4G()T/G415A/G619C基因核苷酸序列的重組載體為大腸桿菌(^■sc/jen'c/n.aco/z')DH5aJC4，(pUC-18-6o;t395C/a4oot/g415a/g619c)，CCTCCNO.M205155。含有突變的^/B95CM4(K)T/G4I5A/G619C基因核苷酸序列的重組表達(dá)載體(pXLNovR-^/7T395C/A4ooT/G41WG619C)的構(gòu)建方法，包括以下步驟E.表達(dá)載體構(gòu)建將以上測序正確的pUC-18-%T395C/A4(M)T/G415A/G619C重組質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒pXLNovR(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005,32(6):529-534.)用SawH和///mffll雙酶切，以T4連接酶連接，酶切體系如下pXLNovR20|al6op基因片段16pl10xKbuffer爭10xKbuffer3plS"附HI2)il5awHI0.8^1所"孤2nl歷禮I0単ddH20，ddH209牟總體積40[iltotal3(^1然后將酶切產(chǎn)物回收后用1X瓊脂糖電泳確定DNA的大概的濃度，按適當(dāng)?shù)谋壤B接，其中外源片段的摩爾數(shù)是載體摩爾數(shù)的310倍，連接體系如下酶切的pXLNovR2^1酶切的6o;基因片段5plT4連接酶(3U(weiss)4U)0.5|al10XT4連接酶Buffer1^1ddH20總體積10^1F.轉(zhuǎn)化大腸桿菌取適量(DNA的量<100嗎)連接產(chǎn)物(一般取5^1)轉(zhuǎn)化100^1大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法除固體LB平板中氨芐青霉素?fù)Q為四環(huán)素(50ng/ml)夕卜，其余如在上述步驟B.c)所述。G.PCR鑒定挑取轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在LB固體培養(yǎng)基上長出的單菌落于5ml含有四環(huán)素(50嗎/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)812hr，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定體系和PCR反應(yīng)的條件如
發(fā)明內(nèi)容B.d);將PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌株。H.酶切鑒定將PCR鑒定為陽性的大腸桿菌DH5ot菌株提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，質(zhì)粒的提取方法如上述步驟B.e)所述；用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段，鑒定含有目的片段的陽性克隆子命名為p乂LNovH-^0/T395C/A400T/G415A/G619C。含有突變的6o;T395C/A4(K)T/g415a/G619C基因核苷酸序列的重組表達(dá)載體為大腸桿菌C&r/zm'c/z/acW)DH5cJC4，(pXLNovR-6o/t395C/A40ot/G415A/g619C)'CCTCCNO.M205156。含有突變的^;7T395C/M()(nvc^5A/c^9C基因核苷酸序列的重組表達(dá)載體為鹽沼鹽豐T菌(Z/a/o6a"n'm/nsoZ/wan'Mw)L33JC4，(pXLNovR-6opt395C/a4oot/g4isa/G619c)，CCTCCNO.M205157。含有突變的6印T395C/A棚T/G4,WG6WC基因核苷酸序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟I.鹽沼鹽桿菌的轉(zhuǎn)化將含有pXLNovR-6。;T395c/A柳T/G化A/G6!9c的大腸桿菌接種于含四環(huán)素(50ng/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用1%的瓊脂糖凝膠電泳確定質(zhì)粒的大概濃度，然后轉(zhuǎn)化鹽沼鹽桿菌L33，轉(zhuǎn)化方法如下①按2%的接種量將鹽沼鹽桿菌L33細(xì)胞接種于HB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)至OD55Q為1.01.5，取5ml培養(yǎng)物，離心去上清，收集菌體；②用1000u1原生質(zhì)形成液懸浮菌體，再加入100ii10.5MEDTA混勻，鏡檢觀察鹽沼鹽桿菌L33細(xì)胞形成原生質(zhì)體的情況；③分別取200ul原生質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)到分別含有約110ugpXLNovR-bopG619C、pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A和pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C質(zhì)粒的試管中；同時(shí)取200y1原生質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)到含有20u1蒸餾水的管中作為陰性對照，于室溫放置20min;④再向每管中緩慢加入等體積(220u1)過濾除菌的PEG-600(濃度為60%，W/V，純化的PEG-600/未加緩沖液的原生質(zhì)形成液)，混勻，于室溫放置20min;⑤每管加入lml原生質(zhì)體稀釋液，混勻后2000rpm離心3045min，去上清，每管加入lml的再生液體培養(yǎng)基重新懸浮，于37'C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜；J.陽性克隆的篩選將培養(yǎng)液分別與含新生霉素(0.3pg/ml)的再生半固體培養(yǎng)基混合，鋪在含有同樣濃度新生霉素的再生固體培養(yǎng)基的平板上面，于37'C避光培養(yǎng)，挑取紫色菌落，用液體冊培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒并送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果正確的即為陽性轉(zhuǎn)化子。K紫膜蛋白的提取挑取、陽性轉(zhuǎn)化的鹽沼鹽桿菌L33單菌落于含新生霉素(1.0pg/ml)的HB液體培養(yǎng)基(NaCl,250g;蛋白胨，5g;酵母浸出物，3g;檸檬酸三鈉，3g;KC1，2g;MgS04.7H20，20g，水，加至1000ml,調(diào)pH至7.0)中37°C，240rpm/min培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接至新鮮的含新生霉素的HB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，條件同前，再擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)約5070hr后，將搖床的轉(zhuǎn)速降低至150rpm/mki，繼續(xù)培養(yǎng)47天后收集菌體，采用差速離心的方法提取紫膜，其操作步驟如下①13000g、4。C離心15min后收集菌體；②將收集的菌體用基本鹽培養(yǎng)基懸浮，并加入DNA酶I，于400ml0.1MNaCl溶液中透析過夜；③透析液用低溫離心機(jī)，4°C，10000g離心5min后棄沉淀，取上清；將上清液于40000g、4'C離心35min，去上清，用0.1MNaCl溶液懸浮沉淀；⑤再于40000g離心35min，去上清，重復(fù)洗滌23次；再用雙蒸水懸浮沉淀，40000g離心35min，去上清，重復(fù)該操作12次；⑦提取的紫膜用少許蒸餾水懸浮后，用真空冷凍干燥機(jī)凍干保存。L.含有突變的6印T395C/A柳T腦w③9C基因核苷酸序列表達(dá)并分離的四突變體BRI119T/T121S/A126T/E194Q的PVA復(fù)合膜的制備方法，包括以下步驟取3gPVA與0.5gHEPES混合后，在雙蒸水中加熱至溶解，PVA在溶液中的濃度約為15%(W/V);取BR水溶液25(Hd(22mg/ml),加入1.Omol/L磷酸緩沖液6^1和744pl上述PVA溶液，充分混勻后，測得pHK7.0，除去氣泡，將混合物涂在經(jīng)強(qiáng)酸和酒精處理過的載玻片上，35'C下干燥3小時(shí)后，即可得BR/PVA復(fù)合膜。M.紫外一可見光譜測定將提取的BR蛋白分別命名為野生型BR蛋白BRw，單突變體BRE194Q，三突變體BRm9Trn2,s/紐6T和四突變體BRE194Q/I119Tm21s/A126T。取待測BR的水溶液和BR/PVA復(fù)合膜，使用紫外—可見分光光度儀(HitchiU-2010)在室溫下對BR蛋白進(jìn)行紫外一可見吸收光譜的測定。P.拉曼光譜的測定突變體BRE194Q/1119T/T121S/A126T水溶液和PVA復(fù)合膜的共振拉曼光譜測定使用RM1000型LaserConfocalRamanMicrospectroscopy(英國，Renishaw公司)，Ar+激光器，激發(fā)光波長為514.5nm，狹縫寬度50pm，掃描范圍200—3200cm"，輸出功率為4.8mW，在室溫下連續(xù)掃描5次后取平均值。Q.M態(tài)壽命的測定M態(tài)壽命檢測的原理因?yàn)樵诩す獾恼丈湎拢珺R會(huì)發(fā)生光致變色現(xiàn)象，所以可以利用顯微視頻錄像技術(shù)可以觀測光致變色發(fā)生的時(shí)間，但顯微視頻技術(shù)無法觀測毫秒量級(jí)的時(shí)間變化，用PVA作為介質(zhì)可以將BR的M態(tài)壽命延長至秒，所以可以采用顯微視頻技術(shù)測定BR/PVA復(fù)合膜的M態(tài)壽命；M態(tài)壽命的檢測方法是將待測的BR樣品制成PVA復(fù)合膜，制備方法如
發(fā)明內(nèi)容L所述，利用顯微視頻技術(shù)測定M態(tài)壽命，激發(fā)光波長為650nm。獲得的BR的單突變體BRE194Q、三突變體BRI119Tm21s/A126T和四突變體BREmQ/m9mmsw26T的結(jié)構(gòu)變化均對其光譜學(xué)特性和中間態(tài)壽命有明顯的影響。從共振拉曼光譜可以看出，在水溶液中，本發(fā)明四突變體BR，4QnmTTrms/AU6T與其他三個(gè)樣品(即野生型BR、單突變體BRm94Q和三突變體BRmwrms/A,26T)的差別顯著，主要集中在指紋區(qū)出現(xiàn)明顯的兩條帶1322cnTi和1334cm—、以及在1654cm—1附近的兩條帶1567cm—1和1573cm—1;綜合比較水溶液中四個(gè)樣品的拉曼光譜，可以發(fā)現(xiàn)，四突變體BRm9TAm!s/An6T/m94Q除了有M態(tài)的累積外，還有L態(tài)及N態(tài)的累積；在PVA薄膜中，雖然四突變體BRE194Q/m9Tm21s/A126T的1564cm—1帶的強(qiáng)度明顯高于其他三個(gè)樣品(即野生型BR、單突變體BRE194(3和三突變體BRI119Tm21s/A126T)，但出乎意料的是，通過顯微視頻記錄表明，四突變體BRm9T/Tms/Ai26T/EmQ的M態(tài)壽命反而比三突變體的短；由此可見，四突變體的M態(tài)壽命并未在單突變體和三突變體的基礎(chǔ)上簡單的累積；曾有研究發(fā)現(xiàn)，單突變體BReu94q対BR的M態(tài)累積作用的影響是很小的，這與水溶液中BRE194Q突變體與WT-BR的拉曼光譜變化一致在單突變體BREWQ中出現(xiàn)了強(qiáng)度較弱的1564cm—]帶，而野生型BR中無此帶。另外，己有報(bào)道三突變體BRm9Tm21S/A126T的M態(tài)壽命比WT-BR長；比較四突變體BRm9T7m^Ai26T/EW4Q在水溶液和PVA膜中的共振拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，在PVA膜中，指紋區(qū)的1334cm^和1332cm—1帶消失，出現(xiàn)與野生型BR水溶液相似的單一1329cm—1帶，說明使L態(tài)穩(wěn)定的因素在PVA中被消除或減弱了；再者，BR7PVA復(fù)合膜的1549cm—i帶幾乎消失，說明在PVA中，N態(tài)雙烯鍵振動(dòng)減小，使N態(tài)變得不穩(wěn)定，由于在N態(tài)向O態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中伴隨著重新質(zhì)子化的視黃醛發(fā)生構(gòu)型改變，雙烯鍵的振動(dòng)變?nèi)?，勢必影響視黃醛的異構(gòu)化，進(jìn)而影響O態(tài)的形成時(shí)間和壽命；從拉曼光譜可以看出，四個(gè)樣品在PVA膜中相對結(jié)構(gòu)變化不大，在PVA膜中，由于N態(tài)的不穩(wěn)定性，會(huì)有O態(tài)的形成的增加和壽命的改變，最終導(dǎo)致分支光循環(huán)量子效率的明顯提高；因而，四突變體服E194Q/IU9T/T121S/A126T可以作為制備3D立體光學(xué)信息存儲(chǔ)材料，構(gòu)建高密度3D立體光學(xué)信息存儲(chǔ)器中的應(yīng)用。本發(fā)明采用基因定點(diǎn)突變的方法，另辟蹊徑，在質(zhì)子途徑、視黃醛結(jié)合位點(diǎn)、視黃醛結(jié)合區(qū)域(特別是環(huán)己烯環(huán))和膜外環(huán)部位這些影響B(tài)R分子功能的重要結(jié)構(gòu)部分引入多重位點(diǎn)突變，其目的是擴(kuò)大變異范圍和變異幅度，研究BR分子結(jié)構(gòu)與分支光循環(huán)功能之間的關(guān)系，并從這些突變子中，首先篩選獲得O態(tài)形成量增加(即量子效率提高)的突變子，再從上述突變子中篩選出其他性質(zhì)發(fā)生改變的有益突變子，如O態(tài)的衰減最優(yōu)化；P—Q水解效率增大；Q態(tài)的壽命延長。本項(xiàng)目的成果用作3D立體光學(xué)信息存儲(chǔ)器的材料。獲得的光致變色突變BR材料同時(shí)可應(yīng)用于全息存儲(chǔ)器、相連存儲(chǔ)器、光學(xué)雙穩(wěn)態(tài)光開關(guān)等器件中。圖l&0/7基因重疊延伸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變示意2表達(dá)載體的構(gòu)建流程3為WT-BR和突變型BR在水溶液和PVA膜中的紫外可見吸收光譜其中A為WT-BR,BRe194Q，BRjii9T/T121S/A126T和BRjii9T/T121S/A126T/E194Q在水溶液中的紫外可見吸收光譜B為WT-BR，BRe194Q，BRm9Tm21S/A126T禾口BRii9簡21S/AU6T歸4Q在PVA膜中的紫外可見吸收光譜l.WT隱BR;2.BRe194Q;3.BRui9T/t121s/a126t;4.BRui9T/t121s/a126t/e194q圖4WT-BR和突變型BR在水溶液中的拉曼光譜示意圖1:WT-BR;2:BRe194Q;3:BRui9T/t121s/a126t;4:BRui9T/t121s/a126t/e194q圖5WT-BR和突變型BR在水溶液共振拉曼光譜示意圖圖6WT-BR和突變型BR的光致變色膜示意圖a,b,c禾口d分另ll是WT-BR,BREi94Q，BRjii9T/T121S/A126T禾口BRui9t/T121S/A126T/e194q的PVA膜在激光激發(fā)前的光致變色照片；A,B,C和D分別是WT-BR，BRE194Q，BRni9Tm2is/Ai26TandBRm9irri2is/Ai26T/Ei94Q的PVA膜在激光激發(fā)后的光致變色照片具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例。進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中具體實(shí)驗(yàn)條件和方法通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)等書中所述的條件，或接照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l^/7基因的定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)a)6印基因上、下游引物①的/基因上游引物FP:5-CCGG|GGATCC|GACGTGAAGATGGGGCTC-3'(方框內(nèi)為BamHI酶切位點(diǎn))；②&o;基因下游引物RP:5'-TC|AAGCT，GTGCGATCAGTCGCTGGTCG-3'(方框內(nèi)為HindIII酶切位點(diǎn))；b)6印G619C單位點(diǎn)突變上、下游引物①6opG619C單位點(diǎn)突變上游引物FM1的序列為5'-CGTGTGGCTGATCGGCAGC^AAGGTGC-3'(方框內(nèi)為突變位點(diǎn))；②6opG619C單位點(diǎn)突變下游引物RM1的序列為5'-GCACCTT§GCTGCCGATCAGCCACACG-3'(方框內(nèi)為突變位點(diǎn))；c)6c^T395C/A400T/G415A突變基因上、下游引物①6印T395C/A400T/G415A突變基因上游引物FM2的序列為5'TGA@CGGG@CCGGCCTGGTCGGC@CAC3，(框內(nèi)為突變位點(diǎn))；②6opT395C/A400T/G415A突變基因下游引物RM2的序列為5'GTG@GCCGACCAGGCCGG^CCCG§TCA3'(框內(nèi)為突變位點(diǎn))實(shí)施例26op(36i9C基因的的構(gòu)建a)重疊延伸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變原理如圖1所示，以質(zhì)粒pUC-18-6叩(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005,32(6):529-534.)為模板，用FP和RM1作為一對引物，進(jìn)行PCR1，擴(kuò)增出片段A，以RP和FM1作為另一對引物，進(jìn)行PCR2，擴(kuò)增出片段B。PCR的反應(yīng)條件如下所有的PCR反應(yīng)中，Taq酶均為1.2U;引物的濃度均為lOpmol/pl;模板DNA的濃度約為15ng/pl;且所有PCR反應(yīng)中的混合液配制如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>PCR反應(yīng)體系為:混合液6.5nlDNA溶液1^1FP或RP1^1RM1或FM11^1Taq酶1.2nlddH2014.3^1總體積25^1;上述PCR反應(yīng)條件為95。C5分鐘；94'C30秒，60。C30秒，72°C1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72"C10分鐘；然后以片段A和B作為下一輪重組PCR的模板，以FP和RP為引物，進(jìn)行PCR3，合成6opG6wc;重疊延伸PCR分兩步進(jìn)行，第一步先不加引物，4個(gè)循環(huán)，第二步加入引物FP和RP，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件同上;PCR3產(chǎn)物即為60pG619C基因；b)克隆載體構(gòu)建將上述擴(kuò)增出來的6cpcj6wc基因及啟動(dòng)子片段以1%瓊脂糖電泳后，用DNA回收試劑盒回收(DNA回收試劑盒購自MBI公司，回收方法參照試劑盒的說明書)，將回收的k^基因和質(zhì)粒pUC-18(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005,32(6):529-534.)均用BamHI和HindIII雙酶切，酶切體系如下pUC-18質(zhì)?；?op基因10^110xbuffer2pltaHI0，(6U)倫孤0.5[il(7.5U)ddH207^1總體積20pl;然后將酶切產(chǎn)物回收后，按照外源片段的摩爾數(shù)是載體摩爾數(shù)的310倍，進(jìn)行連接，連接體系如下酶切的pUC-18質(zhì)粒1^1酶切的6印基因片段6^1T4連接酶(3U(weiss)4d)0.5^d10XT4連接酶Buffer1^1ddH201.5pl總體積lO^ll;C)轉(zhuǎn)化大腸桿菌取適量(DNA的量〈100ng)連接產(chǎn)物(一般取5nl)轉(zhuǎn)化10(^1大腸桿菌DH5a(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005，32(6):529-534.)感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法如下①挑取大腸桿菌DH5ot單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)過夜，按lX的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)活化3hr，至OD6(w約為0.5;②將活化好的菌旋液于冰浴中放置10分鐘，取1.5ml菌液，于4'C4000rpm離心35分鐘，倒掉上清；③加入冰預(yù)冷的0.lmol/L的CaC12懸浮菌體，4000rpm離心去上清，收集菌體，再加入冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2，重懸細(xì)胞，于4'C放置備用；取出4'C放置12-24hr的感受態(tài)細(xì)胞，加入連接產(chǎn)物約5ii1，混勻，在冰浴中放置30分鐘；◎再將其立即放置于42。C的水浴鍋中熱激90秒；◎熱激后快速將試管放入到冰浴中，冷卻2分鐘；⑦取培養(yǎng)物涂布到含有氨芐青霉素(60yg/ml)的固體LB平板上，于37'C培養(yǎng)；于次日挑選轉(zhuǎn)化子。d)PCR鑒定挑取在含有氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌DH5a單菌落，接入含有氨芐青霉素(6(Hig/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)812hr，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定體系如下PCR反應(yīng)的條件為95°C5分鐘；94°C30秒，60°C30秒，72°C90秒，共30個(gè)循環(huán)；72'C10分鐘；PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌株；e)酶切鑒定取PCR鑒定為陽性的大腸桿菌DH5a菌株提取質(zhì)粒pUC-18-6c^G619C，進(jìn)行酶切鑒定；質(zhì)粒提取液如下溶液I:50mmol/葡萄糖；25mmol/Tris.Cl(pH8.0);10mmol/EDTA(pH8.0);溶液II:1%SDS;0.2mol/LNaOH(臨時(shí)配制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員非常清楚配制)；溶液III:5mol/L乙酸鉀60ml;冰乙酸11.5ml;雙蒸水28.5ml;pUC-18-k^(j619C質(zhì)粒的提取方法如下①取大腸桿菌DH5a轉(zhuǎn)化子菌液1.5ml，6000r/分鐘離心5分鐘，收集菌體；②加入150ul質(zhì)粒提取溶液I，懸浮菌體，加入現(xiàn)配的質(zhì)粒提取溶液II300ul，混勻后，放置冰上5分鐘，裂解細(xì)胞至透明；③加入25p1質(zhì)粒提取溶液ni，顛倒混勻后，置于冰上5分鐘；10000r/分鐘，10分鐘離心，去除部分變性的蛋白，轉(zhuǎn)移上清至另一干凈小管中；⑤加入等體積的酚氯仿(1:1),振蕩混勻后，10000r/分鐘，離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈的小管中；◎再加入等體積的氯仿，振蕩混勻后，10000r/分鐘，10分鐘離心，轉(zhuǎn)移上清，加入等體積的異丙醇，于4。C沉淀DNA約20分鐘；⑦10000r/分鐘離心IO分鐘，去上清，用500"170%乙醇洗滌管內(nèi)的沉淀兩次，于室溫干燥；⑧在干燥后的管中加入30ulTE溶液(lmmol/LEDTA，pH8.0;10咖ol/lTris-Cl，pH8.0)，和1w1RNA酶，37。C水浴降解RNA后，于-2(TC保存；將提取的pUC-18-辦op側(cè)9c質(zhì)粒用5"wffl和///"dll雙酶切，酶切體系如下用1%的瓊脂糖電泳檢測酶切片段。鑒定含有目的片段的陽性克隆子命名為pUC-18-^pG619c。送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。實(shí)施例360PT395C/A400T/G415A基因的構(gòu)建a)6opT395C/A400T/G415A基因的定點(diǎn)誘變重疊延伸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變原理如圖l所示，以質(zhì)粒pUC-18-6o;7為模板，用FP和RM2作為一對引物，進(jìn)行PCR1，擴(kuò)增出片段B，以FM2和RP作為另一對引物^進(jìn)行PCR2，擴(kuò)增出片段A。PCR的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如
發(fā)明內(nèi)容中B.a)所示；然后以片段A和B作為下一輪重組PCR的模板，以FP和RP為引物，進(jìn)行PCR3，合成&opT395C/A400T/G415A。重疊延伸PCR分兩步進(jìn)行，第一步先不加引物，4個(gè)循環(huán)，第二步加入引物FP和RP，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件如
發(fā)明內(nèi)容中B.a)。PCR3產(chǎn)物即為三突變基因ZwpT395C/A400T/G415A;b)克隆載體構(gòu)建將上述擴(kuò)增出來的b(jpT395C/A400T/G415A基因用1%瓊脂糖電泳后，用DNA回收試劑盒回收，回收的產(chǎn)物和質(zhì)粒pUC-18均用BamHI和HindIII雙酶切，酶切體系和連接體系
發(fā)明內(nèi)容中B.b)所示；c)轉(zhuǎn)化大腸桿菌取適量(DNA的量<100嗎)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法如
發(fā)明內(nèi)容中B.c)所示；d)PCR鑒定挑取在含有氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌DH5a單菌落，接入含有氨芐青霉素(60^ig/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)812hr，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定體系和PCR反應(yīng)的條件如
發(fā)明內(nèi)容中B.d)所示；將PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌株；e)酶切鑒定經(jīng)PCR鑒定為陽性的大腸桿菌DH5a菌株提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，質(zhì)粒的提取方法
發(fā)明內(nèi)容中B.e)所示；用1%的瓊脂糖電泳檢測酶切片段；鑒定為含有目的片段的陽性克隆子命名為pUC-18-5印T395C/A4衡G415A。送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。實(shí)施例4ZOPT395C/A400T/G415A/G619C基因的構(gòu)建重疊延伸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變原理如圖1所示，以質(zhì)粒pUC-18-6o;pUC-18如1QxKbuffer5pl0.5^10.5nl，20^1歷《孤ddH20總體積T395C/A400T/G4I5A為模板，用FP和RM1作為一對引物，進(jìn)行PCR1，擴(kuò)增出片段A，以FM1和RP作為另一對引物，進(jìn)行PCR2，擴(kuò)增出片段B。PCR的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如
發(fā)明內(nèi)容中B.a)所示；然后以片段A和B作為下一輪重組PCR的模板，以FP和RP為引物，進(jìn)行PCR3，合成60pt395c/a柳t/g化a/g6!9c;重疊延伸PCR分兩步進(jìn)行，第一步先不加引物，4一個(gè)循環(huán)，第二步加入引物FP和RP，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件如
發(fā)明內(nèi)容中B.a)所示；PCR3產(chǎn)物即為60/T395c/a柳t/g化a/G619c基因；b)克隆載體構(gòu)建將上述擴(kuò)增出來的k^T395C/A400T/G415A/G619C基因及啟動(dòng)子片段用1%瓊脂糖電泳后，用DNA回收試劑盒回收，將回收的6op基因和質(zhì)粒pUC-18均用BamHI和HindIII雙酶切，酶切體系和連接體系如
發(fā)明內(nèi)容中B.b)所示；c)轉(zhuǎn)化大腸桿菌取適量(DNA的量〈100ng)連接產(chǎn)物(一般取5^1)轉(zhuǎn)化10(^1大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法如B.c)所示；d)PCR鑒定挑取轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在LB固體培養(yǎng)基上長出的單菌落于5ml含有氨芐青霉素(60pg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)812hr，取菌液PCR鑒定，鑒定體系和PCR反應(yīng)的條件如
發(fā)明內(nèi)容中B.d)所示，將PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌株；e)酶切鑒定將PCR鑒定為陽性的大腸桿菌DH5a菌株提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，質(zhì)粒的提取方法B.e)所示；用1。^的瓊脂糖電泳檢測酶切片段。鑒定含有目的片段的陽性克隆子命名為pUC-18-^^T395C/A4(K)T/G415A/G6l9C，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。實(shí)施例5表達(dá)載體構(gòu)建將以上測序正確的pUC-18-Z>o;t395c/a4(k)t/g415a/g619c重組質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒pXLNovR(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005，32(6):529-534.)用5awH和雙酶切，以T4連接酶連接，酶切體系如下pXLNovR6w基因片段10xKbuffer10xKbuffer3^12^10単//感10単ddH20，ddH209牟總體積40^1total30nl然后將酶切產(chǎn)物回收后用1X瓊脂糖電泳確定DNA的大概的濃度，按適當(dāng)?shù)谋壤B接，其中外源片段的摩爾數(shù)是載體摩爾數(shù)的310倍，連接體系如下酶切的pXLNovR2^1酶切的6op基因片段5^1T4連接酶(3U(weiss)/^d)0.5^110XT4連接酶Buffer1^1ddH201.5^1總體積實(shí)施例6轉(zhuǎn)化大腸桿菌取適量(DNA的量〈00ng)連接產(chǎn)物(一般取5pl)轉(zhuǎn)化100|al大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌DH5cx感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法除固體LB平板中氨芐青霉素?fù)Q為四環(huán)素(50嗎/ml)夕卜，其余如在
發(fā)明內(nèi)容中B.c)所述。實(shí)施例7PCR鑒定挑取轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在LB固體培養(yǎng)基上長出的單菌落于5ml含有四環(huán)素(50pg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)812hr，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定體系和PCR反應(yīng)的條件如
發(fā)明內(nèi)容中B.d)所示；將PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌株。實(shí)施例8酶切鑒定將PCR鑒定為陽性的大腸桿菌DH5ot菌株提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，質(zhì)粒的提取方法如
發(fā)明內(nèi)容中B.e)所述；用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段，鑒定含有目的片段的陽性克隆子命名為pXLNovR_-6opT395C/A400T/G415A/G619C。實(shí)施例9鹽沼鹽桿菌的轉(zhuǎn)化將含有pXLNovR-^pT395C/A4ooT/(}415A/c}619C的大腸桿菌接種于含四環(huán)素(5(Hig/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用1%的瓊脂糖凝膠電泳確定質(zhì)粒的大概濃度，然后轉(zhuǎn)化鹽沼鹽桿菌L33，轉(zhuǎn)化方法如下①按2%的接種量將鹽沼鹽桿菌L33細(xì)胞接種于HB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)至OD柳為1.01.5，取5ml培養(yǎng)物，離心去上清，收集菌體；②用1000y1原生質(zhì)形成液懸浮菌體，再加入100u10.5MEDTA混勻，鏡檢觀察鹽沼鹽桿菌L33細(xì)胞形成原生質(zhì)體的情況；③分別取200ul原生質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)到分別含有約110ugpXLNovR-bopG619C、pXLNovR—bopT395C/A400T/G415A禾口pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C質(zhì)粒的試管中；同時(shí)取200w1原生質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)到含有20iU蒸餾水的管中作為陰性對照，于室溫放置20min;再向每管中緩慢加入等體積(220ul)過濾除菌的PEG-600(濃度為60%，W/V，純化的PEG-600/未加緩沖液的原生質(zhì)形成液)，混勻，于室溫放置20min;⑤每管加入lml原生質(zhì)體稀釋液，混勻后2000卬m離心3045min,去上清，每管加入lml的再生液體培養(yǎng)基重新懸浮，于37'C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜；實(shí)施例10陽性克隆的篩選將鹽沼鹽桿菌L33培養(yǎng)液分別與含新生霉素(0.3pg/ml)的再生半固體培養(yǎng)基混合，鋪在含有同樣濃度新生霉素的再生固體培養(yǎng)基的平板上面，于37'C避光培養(yǎng)，挑取紫色菌落,用液體HB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒并送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果正確的即為陽性轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例ll紫膜蛋白的提取挑取陽性轉(zhuǎn)化的鹽沼鹽桿菌L33單菌落于含新生霉素(1.0ng/ml)的HB液體培養(yǎng)基(NaCl，250g;蛋白胨，5g;酵母浸出物，3g;檸檬酸三鈉，3g;KC1，2g;MgS04.7H20，20g，水，加至1000ml,調(diào)pH至7.0)中37°C,240rpm/min培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接至新鮮的含新生霉素的HB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，條件如
發(fā)明內(nèi)容K中所述，再擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)約5070hr后，將搖床的轉(zhuǎn)速降低至150rpm/min，繼續(xù)培養(yǎng)47天后收集菌體，采用差速離心的方法提取紫膜，其操作歩驟如下①13000g、4'C離心15min后收集菌體；②將收集的菌體用基本鹽培養(yǎng)基懸浮，并加入DNA酶I，于400ml0.1MNaCl溶液中透析過夜；③透析液用低溫離心機(jī)，4'C，10000g離心5min后棄沉淀，取上清；④將上清液于40000g、4'C離心35min，去上清，用0.1MNaCl溶液懸浮沉淀；⑤再于40000g離心35min，去上清，重復(fù)洗滌23次；⑥再用雙蒸水懸浮沉淀，40000g離心35min，去上清，重復(fù)該操作12次；⑦提取的紫膜用少許蒸餾水懸浮后，用真空冷凍干燥機(jī)凍干保存。實(shí)施例12BR1119Tm21s/A126T/E194Q的PVA復(fù)合膜的制備方法含有突變的60pT395C/A4G()T/G415A/G619C基因核苷酸序列表達(dá)并分離的四突變體BRn附m房甜6聖94Q的PVA復(fù)合膜的制備方法，包括以下步驟取3gPVA與0.5gHEPES混合后，在雙蒸水中加熱至溶解，PVA在溶液中的濃度約為15%(W/V);取BR水溶液250^1(22mg/ml)，加入1.0mol/L磷酸緩沖液6pl和744pl上述PVA溶液，充分混勻后，測得pH-7.0，除去氣泡，將混合物涂在經(jīng)強(qiáng)酸和酒精處理過的載玻片上，35'C下干燥3小時(shí)后，即可得BR/PVA復(fù)合膜。實(shí)施例13紫外一可見光譜測定將提取的BR蛋白分別命名為野生型BR蛋白BRw,單突變體BRE194Q，三突變體BR,U9T7m,s/A,26T和四突變體BRE194Q/I119Tm21s/A126T。取待測BR的水溶液和BR/PVA復(fù)合膜，使用紫外一可見分光光度儀(HitchiU-2010)在室溫下對BR蛋白進(jìn)行紫外一可見吸收光譜的測定。用BR水溶液樣品測定吸收光譜，WT-BR、單突變體BRE194Q、三突變體BRm9T/T121S/A126T和四突變體BRnOT"ms/^26T/EWQ的紫外可見吸收光譜如圖3(A)所示；從圖中可以看出單突變體的最大特征吸收峰在574nm處，比WT-BR(圖3A，曲線1)的發(fā)生了輕微紅移(2nm)，這與其水溶液帶較深的藍(lán)色是相符的(圖3A，曲線2)。三突變體(圖3A,曲線3)和四突變體(圖3A，曲線4)的最大吸收峰則分別發(fā)生了llnm和12nm明顯的藍(lán)移，說明突變以后，導(dǎo)致BR的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，視黃醛分子的微環(huán)境受到了干擾；BR/PVA復(fù)合膜的紫外可見吸收光譜如圖3(B)所示。與野生型樣品相比，三種蛋白的最大特征吸收峰，均發(fā)生了不同程度的藍(lán)移，其中四突變體的的吸收峰為557nm，藍(lán)移程度最大，達(dá)13nm。這是由于在干燥的BR/PVA復(fù)合膜中，水分子減少，使蛋白質(zhì)的活動(dòng)空間和視黃醛的構(gòu)型變化受到限制，從而影響了希夫堿基的活動(dòng)所致。實(shí)施例14拉曼光譜的測定突變體BRE194Q/m9T/T121S/A126T水溶液和PVA復(fù)合膜的共振拉曼光譜測定使用RM1000型LaserConfocalRamanMicrospectroscopy(英國，Renishaw公司)，Ar+激光器，激發(fā)光波長為514.5nm，狹縫寬度50nm，掃描范圍200—3200cm"，輸出功率為4.8mW，在室溫下連續(xù)掃描5次后取平均值。測定了WT-BR及三種突變體(即單突變體BREW4Q、三突變體BRm9Tn"ms/AmT和四突變體BRIll9Tm21s/A126T/E194Q)水溶液的共振拉曼光譜，其結(jié)果如表1和圖4所示；其中WT-BR的共振拉曼光譜圖與文獻(xiàn)報(bào)道的BR570共振拉曼光譜基本相符，具有光適應(yīng)BR的典型拉曼譜帶(見表l);表lWT-BR和突變型BR在水溶液中的拉曼光譜峰WT-BR_BRei94QBRiii9tth2is/ai26tBRni9T/Ti2is/Ai26T/Ei94Qassignment960960960960C-C-Hbendout-of-plane1007100710071007C9-CH3，Ci3-CH3stretch1121112111211121Ci4-Ci5stretch1133113311331133Ci4-Ci5stretch一118711871187C-Cstretch,CH3rock1200120012001200C-Cstretch,CH3rodc1254125112511251isoprenoidchainmotionsinvolvingtheShiffbaselinkage1273127312731273C-C-Hbend+C=CorC-Cstretch130213021302no4C13methylsymmetricdeformationregion13301331簡1322C13methylsymmetricdeformationregion一一133613341377137713771377C9methylsymmetricdeformation1398———WO1442145114421456152()153015301530C=Cstrecth156415701567C=Cstrecth-—一-一15731582--——一簡15941602一—一—C=Nunprotonatedstrecth164216421642薩C-N"Hstrecth"一"表示無此峰，陰影部分為發(fā)生相對變化的拉曼峰。與WT-BR相比，三個(gè)突變體(即單突變體BREi94Q、三突變體BRI119Tm21s/A126T和四突變體BRm9TAmis/AmT/Ei94Q)均出現(xiàn)了明顯的U87cm—1和1564cm—l帶；Marcus等在測定暗適應(yīng)的BR560時(shí)，能夠清楚地分辯出1187cml帶，而在光適應(yīng)光譜中卻很難分辨出來；此帶為N態(tài)的典型特征帶(ColemanM,NilssonA,RussellTS.,W"/.Biochemistry[J],1995,34,1559-15606.)。而在本研究中的三個(gè)突變體(即單突變體BRE194Q、三突變體BRI119Tm21s/A126T和四突變體BRI119Tm21S/A126T/E194Q)的光適應(yīng)光譜中，此帶均表現(xiàn)得更加明顯；說明突變后，使生色團(tuán)C13的微環(huán)境發(fā)生了變化，推測導(dǎo)致了N態(tài)的積累明顯增加；此外，三突變體BRm9T/rms/^26T和四突變體BRm9Tm21s/A126T/E194Q的1549cm—1帶明顯，而野生型與單突變體BREW4(3在此處沒有發(fā)現(xiàn)明顯的帶，此帶為N態(tài)中雙烯鍵的伸縮振動(dòng)；另外，1328cm—l和1530cm—l都是N態(tài)特征帶，這些帶的出現(xiàn)，說明突變體有比野生型穩(wěn)定的N態(tài)；在典型的N態(tài)中，三突變體(三突變體BRiH9T/T121S/A126T)和四突變體(四突變體BRI119Tm2lS/A126T/E194Q)與單突變體(單突變體BRE194Q)和WT-BR還有一個(gè)非常不同之處，就是在單突變體BRm94Q光譜中有1331cm—l帶，而在三突變體BRI119Tm21s/A126T和四突變體BRii19Tm21s/A126T/Ei94Q中各分為1328cm—l和1322cm—l帶；并且在四突變體BRm9T/T121S/A126T/E194Q和三突變體BRI119Tm21S/A126T中還分別發(fā)現(xiàn)了1336CIIl—1和1334cm—1兩條帶，這兩條帶的應(yīng)為L態(tài)特征帶(SonarS,MartinT,RathP，Wa/.TheJournalofBiochemistry[J],1994，269:28851-28858.)，而在野生型與單突變體BRE194Q中均未發(fā)現(xiàn)這些帶；1564cm—l為M態(tài)特征帶，在WT-BR的光譜中未測出此帶，而在突變體的光譜中均測出此帶，說明在這種測試環(huán)境中，突變體的M態(tài)較穩(wěn)定；但盡管這三種突變體在此處都出現(xiàn)有帶，它們之間也有很大區(qū)別，單突變體BREW4Q為單一的1564cm—l帶，三突變體8111119饑121^1261~紅移至1570cm—l，四突變體BRm9Trm!s/A!26T/Ei94Q在此處為明顯的1567cm—l和1573cm—l兩個(gè)帶；推測1567cm—l為M態(tài)C=C的伸縮振動(dòng)，在以前的研究中均無類似的發(fā)現(xiàn)(MendelsohnR.NATURE[J〗，1973,243:22-24);在三個(gè)突變體(即單突變體BRm94Q、三突變體BRm9T/rms/M26T和四突變體BRui9mi2is/Ai26T/Ei94Q)的拉曼光譜中，均未發(fā)現(xiàn)1582cm—l和1602cm—1帶，但出現(xiàn)了1593cm—l帶。與WT-BR的1642cm—l帶相對應(yīng)的是四突變體BRm9Tm2is/M26T/Ei94Q出現(xiàn)了1640cm—l帶，但其頻率明顯降低，此帶為希夫堿C=N+H的拉伸振動(dòng)，其頻率的降低，說明希夫堿基處于質(zhì)子化狀態(tài)(宋景嬌，鐘聲，張悅，曹軍衛(wèi)，胡坤生，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005,32(6):529-534.);三突變體BR脂mms/A!26T在相對應(yīng)于WT-BR的1440cm—l帶附近出現(xiàn)兩個(gè)小帶，即1451cm—l和M56cm—l，為C9和C13的非對稱性甲基變形；此外，突變體的拉曼光譜未發(fā)現(xiàn)1582cm—l帶，而1602cm—l帶則移至1593cm—l帶。相對應(yīng)于WT-BR的1302cm—l帶，在四突變體中變化為1304cm—l帶；1100-1400cm—l區(qū)域?yàn)槔庾V的指紋區(qū)域，而拉曼光譜的指紋區(qū)域受BR結(jié)構(gòu)變化的影響最為敏感；突變體在以上拉曼光譜指紋區(qū)域的變化和其他區(qū)域的變化顯示出，突變后的BR蛋白及其視黃醛構(gòu)型上的變化引起了某些中間態(tài)的變化；圖5為WT-BR及三種突變體BR(即單突變體BRE194Q、三突變體BRlU9T/Ti2iS/A126T和四突變體BRI119T/Tl21S/Ai26T/E194Q)在PVA薄膜中的共振拉曼光譜；可以看出，各種突變體和WT-BR在指紋區(qū)的光譜圖帶型沒有發(fā)生明顯變化，但與圖4相比，都出現(xiàn)了較弱的1187cm—l和強(qiáng)度增加了的1564cm—l帶，且四突變體BRI119Tm21s/A126T/E194q^1564cm—l帶的拉曼強(qiáng)度明顯高于其它三種；由此可見，在PVA中，確實(shí)使M態(tài)壽命延長;此外，四突變體BRI119Tm21S/A126T/E194Q在1448cm—l處的強(qiáng)度則明顯降低，相對略有紅移；四種蛋白(艮PWT-BR、單突變j本BRe194Q、三突變體BRiU9T/T121S/A126T禾口四突變體BRiu9T/T121S/A126T/E194Q)的拉曼光譜上均出現(xiàn)了1582cm—l、1600cm—l、1620cm—l和1642cm—l帶，其中1582cm—l和1600cm—l帶在不同的樣品之間有相對較小的變化，而1620cm—l帶在四突變中的強(qiáng)度顯著增加，此帶為C-N未質(zhì)子化的伸縮振動(dòng)，而在圖4中，各譜帶中均未出現(xiàn)該帶；說明在PVA膜中，水分子的減少，使與希夫堿基共價(jià)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)減少，視黃醛的構(gòu)型也隨之發(fā)生了改變。實(shí)施例15M態(tài)壽命的測定M態(tài)壽命檢測的原理因?yàn)樵诩す獾恼丈湎?，BR會(huì)發(fā)生光致變色現(xiàn)象，所以可以利用顯微視頻錄像技術(shù)可以觀測光致變色發(fā)生的時(shí)間，但顯微視頻技術(shù)無法觀測毫秒量級(jí)的時(shí)間變化，用PVA作為介質(zhì)可以將BR的M態(tài)壽命延長至秒，所以可以采用顯微視頻技術(shù)測定BR/PVA復(fù)合膜的M態(tài)壽命；M態(tài)壽命的檢測方法是將待測的BR樣品制成PVA復(fù)合膜，制備方法如前
發(fā)明內(nèi)容Q中所述，利用顯微視頻技術(shù)測定M態(tài)壽命，激發(fā)光波長為650nm。用650nm波長的激光激發(fā)后，通過顯微視頻錄像技術(shù)可以看到光激發(fā)樣品后M態(tài)的產(chǎn)生和衰退變化過程；為了方便使用視頻顯微系統(tǒng)測量BR的壽命，選用了能使BR壽命延長的PVA作為載體介質(zhì)，制成BR薄膜；圖6為光激發(fā)前后樣品的變色照片，其中WT-BR的M態(tài)壽命很短，觀察不到光致變色現(xiàn)象，激光作用前后，樣品的顏色沒有發(fā)生任何變化，說明WT-BR在PVA膜中的壽命為毫秒量級(jí)，視頻顯微系統(tǒng)無法觀測到這樣快的過程，單突變體BREWQ的M態(tài)壽命小于l.Os，三突變體BRm9Tm21s/A126T的M態(tài)壽命為3.0s，四突變體BRui9T/T121S/A126T/E194Q的M態(tài)壽命為2.0s。從以上結(jié)果可見，本發(fā)明獲得的三種BR的突變體(即單突變體BRm94Q、三突變體BRm9Tym!s/AU6T和四突變體BRm9Tm2iS/A126T/E194Q)的結(jié)構(gòu)變化均對其光譜學(xué)特性和中間態(tài)壽命有明顯的影響。從共振拉曼光譜可以看出，在水溶液中(pH=7.0)，四突變體BRm9T/rms/AU6T/m94Q與其他三個(gè)樣品的差別顯著，主要集中在指紋區(qū)出現(xiàn)明顯的兩條帶1322cm—i和1334cm—1，以及在1654cm—〗附近的兩條帶1567cm—5和1573cttT1;綜合比較水溶液中四個(gè)樣品(即WT-BR、單突變體BRE闊、三突變體BRlll醫(yī)121S/A126T禾口四突變體BRui瞎i21S/A126T/E194Q)的拉曼光譜，可以發(fā)現(xiàn)，四突變體BRm9Tm，M26T/EmQ除了有M態(tài)的累積外，還有L態(tài)及N態(tài)的累積；在PVA薄膜中，雖然四突變體BRm9Tm21s/A126T/E194Q的1564cm—1帶的強(qiáng)度明顯高于其他三個(gè)樣品，但出乎意料的是，通過顯微視頻記錄表明，g突變體BRm9Tm2ls/Al26T/E194Q的M態(tài)壽命反而比三突變體BRm9T/rms/A!26T的短，由此可見，四突變體BR19Tm21s/A126T/E194Q的M態(tài)壽命并未在單突變和三突變的基礎(chǔ)上簡單的累積；曾有研究發(fā)現(xiàn)，單突變體BREmQ對BR的M態(tài)累積作用的影響是很小的，這與水溶液中BR^94Q突變體與WT-BR的拉曼光譜變化一致在E194Q突變體中出現(xiàn)了強(qiáng)度較弱的1564cm—i帶，而WT-BR中無此帶。另外，已有報(bào)道三突變體BRI119Tm21s/A126T的M態(tài)壽命比WT-BR長；比較四突變體BRm9T/xms/A,26T/m94Q在水溶液和PVA膜中的共振拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，在PVA膜中，指紋區(qū)的1334cm—1和1332cm—1帶消失，出現(xiàn)與WT-BR水溶液相似的單一1329cm—1帶，說明使L態(tài)穩(wěn)定的因素在PVA中被消除或減弱了；再者，BRyPVA復(fù)合膜的1549cm^帶幾乎消失，說明在PVA中，N態(tài)雙烯鍵振動(dòng)減小，使N態(tài)變得不穩(wěn)定，由于在N態(tài)向O態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中伴隨著重新質(zhì)子化的視黃醛發(fā)生構(gòu)型改變，雙烯鍵的振動(dòng)變?nèi)?，勢必影響視黃醛的異構(gòu)化，進(jìn)而影響O態(tài)的形成時(shí)間和壽命；有研究表明，單突變體BRE^4q可以顯著增加O態(tài)的累積，三突變體BRm9T/rms/a!26T具有比WT-BR更長的O態(tài)壽命，從拉曼光譜可以看出，四個(gè)樣品(即WT-BR、單突變體BRE194Q、三突變體BRui9Tm21S/a126t和四突變體BRI119t/t21s/a126t/e194q)在PVA膜中相對結(jié)構(gòu)變化不大，在PVA膜中，由于N態(tài)的不穩(wěn)定性，會(huì)有O態(tài)的形成的增加和壽命的改變。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>細(xì)菌視紫紅質(zhì)多位點(diǎn)突變基因和蛋白質(zhì)及制備方法和應(yīng)用<130>細(xì)菌視紫紅質(zhì)多位點(diǎn)突變基因和蛋白質(zhì)及制備方法和應(yīng)用<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>789<212>DNA<213>鹽沼鹽桿菌<400>1atgttggagttattgcc犯c鄉(xiāng)3gtggagggggtatcgcaggcccagatcaccggacgt60ccggagtggatctggctagcgctcggtacggcgctaatgggactcgggacgctctatttc120ctcgtga犯gggatgggcgtctcggacccagatgca冊gaaattctacgcC3tC3Cg3Cg180ctcgtcccagccatcgcgttcacgatgtacctctcgatgctgctggggtatggcctcaca240stgg"UccgttcggtggggagceigaBccccatctactgggcgcggtacgctgactggctg300ttcaccacgccgctgttgttgttagacctcgcgttgctcgttgacgcgga360atccttgcgctcgtcggtgccgacggcatcatgaccgggtccggcctggtcggcacactg420acgaaggtctactcgtaccgcttcgtgtggtgggcgatcagcaccgcagcgatgctgtac480atcctgtacgtgctgttcttcgggttcacctcg卿gccg幼Eigcatgcgccccgaggtc540gcatccacgttc犯agtactgcgtaacgttaccgttgtgttgtggtccgcgtatcccgtc600gtgtggctgatcggcagcca鄉(xiāng)tgcgggaatcgtgccgctg犯catccagacgctgctg660ttcatggtgcttgacgtgagcgcga鄉(xiāng)tcggcttcgggctcatcctcctgcgcagtcgt720gcgatcttcggCg卿CCg3agcgccggagccgtccgccggcgacggcgcggccgcgacc780agcgactga789<210>2<211>248〈212〉PRT<213>鹽沼鹽桿菌<400>2GinAlaGinlieThrGlyArgProGluTrplie1510ThrAlaLeuMetGlyLeuGlyThrLeuTyrPhe2025GlyValSerAspProAspAlaLysLysPheTyr3540ValProAlalieAlaPheThrMetTyrLeuSer5055TrpLeuAlaLeuGly15LeuValLysGlyMet30AlalieThrThrLeu45MetLeuLeuGlyTyr6024GlyLeu65AlaArgLeuAlaGlyAlaLysVal130MetLeu145GluSerValThrSerGinMetVal210ArgSer225GlyAspThrTyrLeuAsp115TyrTyrMetValGly195LeuArgGlyMetAlaLeu100GlySerlieArgVal180AlaAspAlaAlaValAsp85VallieTyrLeuPro165LeuGlyVallieAla245Pro70TrpAspMetArgTyr150GluTrplieSerPhe230AlaPheLeuAlaThrPhe135ValValSerValAla215GlyThrGlyPheAspGly120ValLeuAlaAlaPro200LysGluSerGlyThrGin105SerTrpPheSerTyr185LeuValAlaGluGinAsnPro75ThrProLeuLeu90GlyThrlieLeuGlyLeuValGly125TrpAlalieSer140PheGlyPheThr155ThrPheLysVal170ProValValTrpAsnlieGluThr205GlyPheGlyLeu220GluAlaProGlu235lieLeuAla110ThrThrSerLeuLeu190LeulieProTyrTrp80LeuAsp95LeuValLeuThrAlaAlaLysAla160ArgAsn175lieGlyLeuPheLeuLeuSerAla240權(quán)利要求1、一種分離的bop基因，其序列為SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2、一種分離的^;基因，其序列為SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。3、一種含有bopT395C/a柳t/G4!5a/G6!9C基因核苷酸序列的重組載體，其特征在于重組載體為大腸桿菌Esc/7ehc/h'flfco//JC4/pUC18-6o/t395C/A400T/G415A/G619C，CCTCCNO:M205155。4、一種含有6o外395c/A柳T/G化c/G6!9c基因核苷酸序列的重組表達(dá)載體，其特征在于重組表達(dá)載體為大腸桿菌￡^c/m'cWaco"'JC4/pXLNovR-—T395C/A400T/G415A/G619C'CCTCCNO:M205156。5、一種含有6印t395c/a40()t/g4!5c/gw9c基因核苷酸序列的重組表達(dá)載體，其特征在于重組表達(dá)載體為鹽沼鹽桿菌//a/WacWww^//"ar/wwL33JC4/pXLNovR陽6opT395C/A400T/G4i5A/G6i9C，CCTCCNO:M2051S7。6、一種細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)分子在制備3D信息存儲(chǔ)器的材料中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種細(xì)菌視紫紅質(zhì)多位點(diǎn)突變基因和蛋白質(zhì)及制備方法和應(yīng)用，其特征是SEQIDNo.1所示的核苷酸和SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，步驟是A.bop基因的定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)，B.bop_G619C基因的的構(gòu)建，C.bop_{T395C/A400T/G415A}基因的構(gòu)建，D.bop_{T395C/A400T/G415A/G619C}基因的構(gòu)建，E.表達(dá)載體構(gòu)建，F(xiàn).鹽沼鹽桿菌的轉(zhuǎn)化，G.突變的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)的表達(dá)，H.突變的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)的提取，I.BR_{I119T/T121S/A126T/E194Q}/PVA復(fù)合膜的制備，J.BR/PVA復(fù)合膜在高性能3D信息存儲(chǔ)器的材料中的應(yīng)用。本發(fā)明篩選獲得0態(tài)量子效率高、0態(tài)的衰減最優(yōu)化、P→Q水解效率增大、Q態(tài)的壽命延長的突變蛋白。用于3D立體光學(xué)信息存儲(chǔ)器材料。獲得的光致變色突變BR材料同時(shí)應(yīng)用于全息存儲(chǔ)器、相連存儲(chǔ)器、光學(xué)雙穩(wěn)態(tài)光開關(guān)器件中。文檔編號(hào)C12N15/74GK101285069SQ200710051819公開日2008年10月15日申請日期2007年4月9日優(yōu)先權(quán)日2007年4月9日發(fā)明者曹軍衛(wèi),金衛(wèi)華申請人:武漢大學(xué)