專利名稱：組織特異性表達啟動子p的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域。具體涉及一種DNA片段的分離克隆、功能驗證和應用。所述的DNA片段包含一個編碼水稻光系統(tǒng)II 10 kD蛋白的基因D54O的啟動子，它能夠在水稻的綠色組織中表達，且在胚和胚乳中不表達。將該片段與報告基因GUS連接后直接轉入植物體，轉基因植株中的報告基因僅在葉和葉鞘等綠色組織中表達。將該片段與抗蟲的Bt基因融合后轉入水稻，遺傳轉化植株在田間自然發(fā)蟲的條件下表現(xiàn)出對蟲害的抗性。
背景技術：
水稻是世界上主要的糧食作物之一，全世界有超過20億的人口以水稻為主食，而蟲害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，使用化學殺蟲劑是減少蟲害的重要方法，為減少蟲害損失起到了巨大作用。但是，化學殺蟲劑的使用會不可避免的造成環(huán)境污染以及威脅人類健康。
在人們對食物的安全性和環(huán)保性日益重視的今天，減少甚至杜絕化學殺蟲劑的使用是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的新要求。轉基因抗蟲作物就可以很好地做到這一點。這是一種新的抗病蟲害技術，從1996年開始在世界范圍內(nèi)大規(guī)模應用。這些轉基因作物可以表達一種細菌Bacillus thuringiensis(Bt)來源的殺蟲蛋白。這種細菌作為一種生物殺蟲劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上已經(jīng)使用了60多年的歷史了。Bt作物在農(nóng)業(yè)上的使用可以大幅度的減少殺蟲劑的使用量，這不僅直接降低了種植者的種植成本，而且對保護人類的健康和生態(tài)環(huán)境都有積極的意義。
日本的研究者石渡于1901年在感病的家蠶體液中分離到了Bt細菌。1915年，Berliner重新分離到了這種菌株，并命名為“Bacillus thuringiensis n.sp.”。1938年，第一種商品化的Bt殺蟲劑(商品名Sporeine)在法國上市。在上世紀50年代，Bt殺蟲劑在美國開始大規(guī)模推廣(Martin和Travers，1989)。1987年，獲得了第一批Bt轉基因植物，包括煙草，番茄等作物(Barton et al.，1987；Fischhoffet al.，1987；Vaeck et al.，1987)。1995年，轉Bt作物首次在美國和加拿大實現(xiàn)了商品化種植。2004年，全球Bt作物的種植面積達到了2240萬公頃(James，2004)。
在1997年，中國批準了第一個轉基因植物——耐貯藏番茄的商品化生產(chǎn)。同年，中國批準了轉基因Bt棉(Bollgard棉，美國Monsanto公司)在河北省的種植，正式成為了種植轉Bt作物的國家之一(Shelton et al.，2002)。在水稻的應用上，Wunn等在1996年首次獲得了轉Bt基因的秈稻。1999年，首次報道了獲得了雙價的Bt水稻，使用的兩個Bt基因分別是Cry1Ac和Cry2A(Maqbool et al.，1999)。2000年，首次報道了對Bt水稻進行的田間評價(Tu et al.，2000)。到目前為止，已經(jīng)有大量的轉Bt水稻的試驗被報道(Fujimoto et al.，1993；Nayak et al.，1996；Wuun et al.，1996；Ghareyazie et al.，1997；Wu et al.，1997；Cheng et al.，1998；Alam et al.，1999；Tu et al.，2000；Ye et al.，2001；Khanna et al.，2002；Wang et al.2002；Wu et al.，2002；Ramesh et al.；2004)。
這些抗蟲害的基因雖然已經(jīng)克隆出來，有些還已應用與生產(chǎn)實踐，取得了良好的效果，但是，隨之而來的轉基因安全性問題已越來越受人關注。因為抗病蟲害的功能基因必須通過轉基因發(fā)揮其功能，而目前的轉化體系存在一些不足，很重要的一點便是轉化載體中的啟動子大多是組成型表達的。這不僅造成了植物體的負擔，使植物表達額外的蛋白，造成了浪費，嚴重的還造成了植物體生理和代謝的紊亂，致其死亡(Karlowski etal.，2003；Ehsani et al.，2003；Miyao et al.，2003)；更重要的是外源基因在果實或人類食用的器官的表達量很豐富，由此引發(fā)了轉基因安全性的擔憂。而另一方面，Bt蛋白在植物體內(nèi)的高劑量表達對害蟲造成較高的選擇壓力，有可能促使害蟲產(chǎn)生變異，很快獲得對Bt蛋白的耐受性。Tabashnik等(1990)報道了在田間發(fā)現(xiàn)了對Bt蛋白產(chǎn)生抗性的小菜蛾(diamond moth，Plutella xylostella)，這是第一例的在自然條件下發(fā)現(xiàn)的對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的昆蟲。
為了解決以上問題，一些改進措施已經(jīng)開始運用，如標記基因的消除技術(陳穎等，2001)和植物來源的特異性啟動子的應用。啟動子是一段對基因的表達起調(diào)控作用的DNA片段。特異性的啟動子分為兩類，一是受誘導表達的特異啟動子，還有組織特異性表達的啟動子。誘導性的啟動子對外界的某些物質，如病原物，化學物質或逆境做出反應，啟動基因表達。組織特異性的啟動子則驅動基因在特定的組織中表達。植物來源的啟動子不會造成基因的逃逸，而特異性的啟動子又避免了基因過量表達對植物體的傷害，同時也可以避免外源基因在人們食用的部位表達，解除人們對食品安全性問題的顧慮。而且組織特異性的表達減少了Bt蛋白的表達量，避免了高濃度的抗蟲蛋白對害蟲的高選擇壓力。因此，分離和克隆不同特異性的啟動子，以此驅動外源基因的表達，是轉基因作物中外源基因表達的最佳途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是分離克隆水稻品種農(nóng)墾58中攜帶的一個編碼類光系統(tǒng)II的10 kD蛋白的基因D54O啟動子區(qū)的DNA片段，利用這個啟動子一方面驅動抗蟲基因在水稻植株中表達，增強其抗蟲性；另一方面在胚和胚乳中不表達該抗蟲基因，以此增強稻米的安全性。這個啟動子被命名為PD54O。
本發(fā)明的第二個目的是將所克隆的啟動子在培育轉基因水稻中的應用。該轉基因水稻在特異組織中表達抗蟲基因，使其抗蟲性增強。
本發(fā)明涉及分離和應用一種包含D54O基因啟動子的DNA片段(PD54O)，該片段包含調(diào)控在葉和葉鞘等綠色組織中表達而在胚和胚乳中不表達的調(diào)控元件。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO.1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的PD54O啟動子作探針，從基因組文庫中篩選到本發(fā)明的啟動子或同源啟動子。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術，也可以從基因組擴增到本發(fā)明的啟動子以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術，可以分離得到包含PD54O啟動子的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉入植物細胞，產(chǎn)生轉基因植物。
本發(fā)明為增強植物轉基因的安全性提供了一種新的方法。這些方法包括將該片段和需要的功能基因連接轉入植物，由于該啟動子不在胚和胚乳中表達，避免了轉基因水稻可能產(chǎn)生的食品安全問題。
將克隆的啟動子連接抗蟲基因轉入植物，可以避免植物過量表達目標基因造成的不利影響，這是傳統(tǒng)的組成型啟動子在轉基因的過程中無法做到的本發(fā)明能夠進一步提供或應用利用上述DNA片段獲得的抗蟲的轉基因植株和相應的種子，以及用本發(fā)明的啟動子或基于該啟動子的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種子，可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的啟動子轉入其它的植株。
在本發(fā)明的實施例部分，申請人闡述了分離、驗證和應用PD54O啟動子的過程以及該啟動子的特點。


序列表SEQ ID No1.本發(fā)明分離克隆的PD54O啟動子序列。
圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻組織特異表達啟動子PD54O以及驗證其功能的流程圖。
圖2.cDNA芯片上每個方格中cDNA克隆的排列方式。字母排列成的方框表示cDNA芯片上一個方格，每個方格中有8個位點。每個克隆占據(jù)兩個位點。A、B、C和D分別代表不同cDNA克隆。
圖3.利用cDNA芯片檢測不同組織差異表達的cDNA克隆。箭頭表示在左右對比的圖像中差異表達的cDNA克隆。1和2分別為兩次重復試驗A探針來自水稻灌漿期的胚和胚乳的RNA；B探針來自水稻根、葉片、葉鞘和莖RNA的混合物。
圖4.RNA雜交分析D54O基因的表達譜。分別從水稻根、葉片、葉鞘、花期莖和灌漿期穗組織中抽提RNA。由圖可以看出，D54O基因在水稻葉和葉鞘中表達，在根、莖和穗中不表達。
圖5.D54O基因啟動子(PD54O)的基本結構。預測的啟動子包括從-2134到+41的共2175bp的區(qū)段。+1是預測的翻譯起始位點；-113是預測的CAAT框控制轉錄起始的頻率。
圖6.遺傳轉化載體pCAMBIA1381的結構。
圖7.用D54O基因啟動子PD54O驅動報告基因GUS表達。PD54O包含D54O基因的-2134至+41區(qū)段。+1是預測的D54O基因的翻譯起始位點。
圖8.轉基因水稻植株的GUS基因表達模式。組織染色的結果表明，PD54O調(diào)控的GUS基因在水稻葉、葉舌、幼嫩的穎殼和葉鞘中可以檢測到表達(藍色示GUS活性)，但是在水稻根、莖、胚乳和成熟的穎殼中檢測不到表達。a，葉鞘；b，葉舌；c，根；d，成熟穎殼；e，幼嫩穎殼；f，葉；g，莖；h，胚和胚乳。
圖9.在PD54O-Cry1Ac質粒載體中PD54O啟動子調(diào)控抗蟲基因Cry1Ac的表達。
圖10.攜帶PD54O-Cry1Ac的轉基因水稻植株在成熟的胚和胚乳中檢測不到Bt蛋白。利用BT-Cry1Ab/1Ac金標免疫快速檢測試紙條(購自北京銀土地生物技術公司)檢測混合的轉基因水稻植株胚和胚乳樣品，在樣品中檢測不到Bt蛋白的表達。1，陽性對照；2和3，胚和胚乳的混合樣品。
圖11.攜帶PD54O-Cry1Ac的轉基因水稻植株的抗蟲效果。轉基因水稻植株在田間自然條件感染三化螟后，未轉基因的對照水稻植株(A)出現(xiàn)嚴重的蟲害，而轉基因水稻植株(B)較好地抵抗了螟蟲的侵染。
具體實施例方式
以下實施例中進一步定義本發(fā)明，圖1描述了鑒定和分離克隆PD54O啟動子的流程。根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例1分離克隆PD54O啟動子1.利用cDNA芯片技術鑒定水稻中的組織特異表達基因本發(fā)明利用中國普遍推廣應用的一個水稻品種明恢63(Oryza sativa ssp.indica)的全生育期平衡化cDNA文庫進行cDNA芯片分析。該文庫由水稻不同生長時期和不同生理狀態(tài)下的15種不同組織的cDNA組成(Chu等，2003)。芯片的制作和分析采用已發(fā)表的方法(Zhou等，2002)。為了保證雜交結果的可靠性，在cDNA芯片上每個cDNA克隆有兩個位點，它們位于同一方格的對稱位置(圖2)。
本發(fā)明利用來自水稻葉片、葉鞘、莖、根和胚及胚乳中的總RNA分別反轉錄成cDNA并標記放射性同位素作探針，分別與cDNA芯片雜交通過分析不同探針雜交的同一cDNA位點的雜交信號的變化，鑒定出在胚和胚乳中特異不表達，而在其它組織中表達的基因(圖3)。其中有一基因經(jīng)序列檢索分析表明編碼一個水稻光系統(tǒng)中的10 kD蛋白，我們將其命名為D54O。
為進一步確定該基因的表達情況，在明恢63的葉、葉鞘、莖、根及穗中取樣抽提RNA，用D54O基因的cDNA做探針，進行RNA雜交分析。RNA雜交方法同已經(jīng)發(fā)表的方法(Zhou等，2002)。分析表明該基因僅在葉和葉鞘中表達(圖4)，這與cDNA芯片雜交的結果一致。
2.從水稻品種農(nóng)墾58中分離克隆包含PD54O啟動子的亞克隆片段本發(fā)明以上述cDNA克隆做探針，從水稻品種農(nóng)墾58(一個中國常用品種)的BAC文庫中篩選到一個陽性克隆119H12。用HindIII限制性內(nèi)切酶消化這個BAC克隆，然后做DNA雜交分析；分析方法同已經(jīng)發(fā)表的方法(Chen等，2002)；雜交探針是D54O基因的cDNA。確定一個包含該基因的約6.5 kb的片段。用HindIII消化BAC克隆119H12，將酶切片段與HindIII處理的pUC19載體(購自美國Amersham Biosciences公司)連接，電轉化(Sambrook和Russell，2001)大腸桿菌DH10B(購自美國Invitrogen公司)，制備亞克隆。經(jīng)擴增檢測，獲得插入片段為6.5 kb包含D54O基因啟動子片段的陽性亞克隆。
3.測序分析克隆119H12的6.5kb片段的亞克隆本發(fā)明采用Shotgun的方法進行測序(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。根據(jù)此方法，首先將該片段用超聲波(23300Hz，作用2秒)打斷，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離大約1kb的DNA片段，純化后用T4-DNA聚合酶補平末端；將這些片段與限制性內(nèi)切酶Sma I處理的pUC18載體(購自美國Amersham Biosciences公司)連接，電轉化大腸桿菌DH10B，挑克隆檢測插入片段大小。選擇插入片段在1kb左右的克隆進行測序。
采用M13-R和M13-F通用引物(購自寶生物工程(大連)有限公司)、美國PerkinElmer公司的測序試劑盒(Big Dye Kit)、根據(jù)試劑盒的使用說明書所介紹的雙脫氧核苷酸末端終止法分別從每個亞克隆的兩端測序。共計對17個亞克隆進行了測序。使用Sequencher 4.1軟件(美國Gene Codes Corporation)拼接序列。用該軟件自動去除末端測序較差的序列和pUC18載體序列。在重疊序列長度大于40bp、重疊序列的一致性大于95％的條件下進行序列拼接，得到一段長6204bp的序列。目標基因區(qū)段的每一個堿基都參照重疊在該位點的多個Shotgun片段的序列來確定。
4.PD54O啟動子的分離和結構分析將測序得到的序列分別用玉米和用擬南芥做參考模型采用GenScan軟件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)進行基因結構預測分析，兩者預測的目標基因編碼區(qū)結構和位置完全相同，分析結果表明該亞克隆包含一個完整的基因，即D54O基因。采用一系列啟動子分析軟件，如Softberry網(wǎng)站(http://www.softberry.com)的TSSP軟件、PROSCAN軟件(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan)、PLACE(A Database ofPlant Cis-acting Regulatory DNA Elements)中的Signal Scan分析工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)、TESS軟件(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/gene-search.html)、Match 1.0軟件(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi)、以及AliBata2.1軟件(http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibata2/index.html)等分析D54O基因啟動子的結構。發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)段包含在-2134到+41的2175bp片段內(nèi)，在-113bp的位置含有調(diào)控轉錄頻率的CAAT盒(圖5)。
實施例2PD54O啟動子的功能驗證1.遺傳轉化載體的構建所用pCAMBIA1381載體(圖6)是國際上常用的植物農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004)的系列載體。該載體攜帶無啟動子的報告基因GUS，由澳大利亞CAMBIA實驗室(Centerfor the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture)惠贈。
根據(jù)序列的分析結果，選取限制性內(nèi)切酶SmaI和SphI，消化119H12的6.5kb片段的亞克隆，得到約2.1kb的啟動子片段，該片段包含了從-2134到+41的區(qū)域(相對與翻譯起始密碼子ATG為+1)，命名為PD54O。得到的片段用T4 DNA聚合酶抹平酶切片段末端；同時用平端的限制性內(nèi)切酶SmaI酶切遺傳轉化載體pCAMBIA1381；酶切完畢，用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，純化酶切產(chǎn)物；然后用去磷酸化酶Alk對純化的酶切產(chǎn)物進行去磷酸化處理；用包含PD54O啟動子的酶切片段和去磷酸化的pCAMBIA1381載體做連接反應，使其驅動報告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶基因)的表達(圖7)。獲得的重組質粒被命名為D54O。將D54O質粒電轉化(Sambrook和Russell，2001)進入農(nóng)桿菌菌株EHA105(Sun等，2004)。
2.PD54O啟動子的功能驗證采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法(Hiei等，1994)將EHA105菌株攜帶的D54O導入水稻品種牡丹江8(Oryza sativa ssp.japonica)。本發(fā)明共獲得轉化水稻植株36株。在T0代植株中，對不同的組織進行GUS染色檢測(Jefferson and Bevan，1987)，發(fā)現(xiàn)GUS活性僅在葉、葉舌和葉鞘中檢測到；而在莖、根中無法檢測到；在穗發(fā)育的初期，穎殼中GUS呈陽性，而在灌漿期開始漸漸減弱，直至消失。在胚和胚乳中全生育期都沒有檢測出GUS的活性(圖8)。這些結果說明PD54O是綠色組織特異表達啟動子，是在胚和胚乳中特異不表達的啟動子。
實施例3PD54O啟動子的應用1.PD54O與抗蟲基因Bt的融合載體的構建及轉化為了檢驗PD54O啟動子在水稻抗蟲中的應用價值，本發(fā)明將前述pCAMBIA1381載體中的報告基因GUS用Bt抗蟲基因Cry1Ac(Cheng等，1998)替代，采用實施例2所述的方法將PD54O啟動子與攜帶Cry1Ac基因的pCAMBIA1381載體連接。獲得的重組質粒被命名為PD54O-Cry1Ac(圖9)。將PD54O-Cry1Ac質粒電轉化(Sambrook和Russell，2001)進入農(nóng)桿菌菌株EHA105(Sun等，2004)。
采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法(Hiei等，1994)將EHA105菌株攜帶的PD54O-Cry1Ac質粒導入水稻品種牡丹江8中，獲得20株陽性獨立轉化植株。利用BT-Cry1Ab/1Ac金標免疫快速檢測試紙條(購自北京銀土地生物技術公司)和廠商(北京銀土地生物技術公司)提供的分析方法檢測轉基因植株的胚和胚乳樣品，沒有檢測到抗蟲蛋白Cry1Ac(圖10)。
2.攜帶PD54O-Cry1Ac轉基因植株的抗蟲表現(xiàn)本發(fā)明在大田中對轉基因植株的抗蟲性進行了檢測。大田的抗蟲試驗在一塊不施任何農(nóng)藥而自然發(fā)蟲的田地中進行。在試驗中，轉基因植株表現(xiàn)出對螟蟲較好的抗性，有效地抵抗了螟蟲對水稻的侵害。在轉基因的受體材料牡丹江8(對照)的大部分葉片已經(jīng)枯黃、卷曲的情況下，轉基因植株未見明顯蟲害(圖11)。統(tǒng)計結果顯示，總共20株轉基因水稻中，有7株未見明顯蟲害，8株僅一片葉被蟲害(蟲害的葉片卷曲，褪綠)，4株有2片蟲害的病葉，僅1株有3片葉遭到蟲害，總體結果較好，顯示出了良好的轉基因抗蟲應用前景。
采用“三夾板”ELISA的方法(EnvironLogix，Portland，USA)分析轉基因植株葉片中Bt蛋白Cry1Ac的表達量。Bt蛋白的測定采用EnvironLogix公司(EnvironLogix，Portland，USA)的Bt蛋白ELISA檢測試劑盒EnvironLogix kits APP003。檢測的方法如下首先從田間采集新鮮的水稻材料，每個材料取大約20mg并精確稱重。用500μl檢測試劑盒提供的蛋白抽提液在研缽中將材料磨成漿。然后轉移到1.5ml的離心管中靜置5min，10,000r/min離心2min。最后，用新的1.5ml離心管取上清。在測量Bt蛋白濃度前，用相應的抽提液將樣品稀釋50倍。按照試劑盒的說明書對稀釋后的樣品進行測定和計算。檢測的結果表明轉基因植株抗蟲的效果與植株中抗蟲基因的表達量密切相關，如果植株體內(nèi)的Bt蛋白可以達到3μg/g鮮組織重以上的表達量則抗蟲的效果良好，植株上蟲害的葉片少于等于1片；而低于此濃度的植株則表現(xiàn)為一定程度的蟲害。與此同時，轉基因植株抗蟲的效果與基因的拷貝數(shù)無關，在高拷貝的植株中表達量不一定比低拷貝數(shù)的植株高，因此抗蟲的效果也不一定更好(表1)。
以上結果表明，PD54O啟動子確實可以抑制Bt蛋白在胚和胚乳中的表達，而且抗蟲的效果和Bt蛋白的表達量呈正相關。
表1.轉基因植株(PD54OCry1Ac-)的Cry1Ac基因拷貝數(shù)、Cry1Ac表達量及抗蟲效果

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1.一種在植物綠色組織中表達、在胚和胚乳中不表達的啟動子PD54O，它是SEQ ID NO1所示的DNA序列。
2.一種使植物在綠色組織中表達目標基因而種子中不表達該基因的方法，包括將權利要求1所述的DNA片段連接上合適的基因后轉入植物體，使植物組織特異性的表達所述的基因。
3.權利要求1所述的啟動子PD54O在增加水稻對蟲害抗性中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及包含水稻組織特異表達啟動子P
文檔編號C12N15/82GK101016546SQ20071005144
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月31日 優(yōu)先權日2007年1月31日
發(fā)明者王石平, 蔡萌, 魏君 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學