專利名稱：甘藍型油菜木質素單體合成基因f5h及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H序列，同時本發(fā)明還涉及這種甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H在油菜中的用途。
背景技術：
木質素是由多種苯基類丙烷醇縮合而成的多聚物，是植物維管組織次生細胞壁的主要組分，決定細胞壁的強度和剛性，其代謝途徑與植物其它次生物質代謝途徑相互交叉，故其代謝與植物的抗病、抗倒等抗逆生理都有一定的相關性，在與病原菌相互作用中，寄主細胞壁木質化是抗病反應的特征之一，木質素作為植物體內(nèi)一種重要的物理抗菌物質，能夠沉積于細胞壁中富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)上，作為結構屏障，加固細胞壁，保護細胞免受病原菌的侵染。被子植物中，木質素主要為G-木質素(愈創(chuàng)木基木質素)和S-木質素(紫丁香基木質素)的混合體。G-木質素相比S-木質素，結構單元間含更大比例不易斷裂的C-C連接，從而使木質結構更加致密。被子植物具不同S/G比值，可通過轉基因的方法改變S/G比值。
近年來，突變體及通過轉基因植物對木質素生物合成調(diào)控的研究主要表現(xiàn)在3個方面一是苯丙酸途徑上的調(diào)控，涉及3種酶PAL(phenylalanineammonia-lyase)、C4H(cinnamate 4-hydroxylase)和4CL(4-coumarateCoA ligase)，它們的表達決定木質素總量；二是木質素特異合成途徑上的調(diào)控，主要集中于3種酶，即COMT(caffeic acid O-methyltransferase)、CCoAOMT(caffeoyl-CoAO-methyltransferase)和F5H(ferulate 5-hydroxylase)，這些酶類的表達對木質素含量尤其木質素單體的特異合成影響較大，決定了各種單體在木質素總量中的比例；三是對木質素特異合成途徑下游酶類的調(diào)控，包括兩種還原酶CAD(cinnamylalcohol dehydrogenase)和CCR(cinnamoyl-CoA reductase)，它們負責將各種羥基肉桂酰-輔酶A(CoA)酯最終還原成各種木質素單體。在小麥中克隆的COMT基因在根、莖、葉中均有表達，莖稈中COMT基因的表達水平與小麥的抗倒性相關，COMT基因的表達可能增強了莖稈的硬度和抗倒伏的能力。對玉米抗倒伏性進行QTL定位研究中，在與莖桿強度QTL置信區(qū)間相互重疊的基因中，發(fā)現(xiàn)有參與木質素合成的基因。
F5H是G結構單元向S結構單元轉化反應的關鍵酶，對木質素單體的特異合成起決定性作用。在缺乏F5H活性的擬南芥突變體中，僅含有微量的S-木質素，并且由于不能合成主要在葉表皮近軸積累的熒光次生代謝物芥子蘋果酸酯(sinapoyl malate)，僅表現(xiàn)葉腋葉肉內(nèi)葉綠素的暗紅熒光，野生型則為淺藍熒光；將F5H應用擬南芥C4H啟動子在該突變體中過量表達時，轉基因植物中的木質素基本上都是由S木質素組成的；將該基因應用擬南芥C4H啟動子在正常植株過量表達，也會使S木質素含量增多，且使其在植物中的組織分布特異性消失。調(diào)控F5H的轉基因研究均為過量表達以提高S/G比值，即會提高S木質素在木質素總量中的比例，以提高制漿效率為目標，對紙漿生產(chǎn)極為有利。
RNA干涉(RNAi)是由雙鏈RNA分子介導的、在轉錄后mRNA水平關閉相應基因表達的過程。RNAi技術簡單易行，抑制基因表達效率高，已被廣泛應用于真核生物基因功能的研究。理論上，幾乎所有生物中的基因表達都可能被RNAi阻斷，同樣RNA沉默也可能使基因表達的抑制子失活，從而使某些基因順利表達，這為RNAi技術提供了廣闊的應用前景。目前將此技術應用于植物木質素合成調(diào)控的研究還未見報導。
總之，在本發(fā)明申請之前，國內(nèi)沒有人公開或發(fā)表過甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H基因序列及其在植物中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H。該基因是調(diào)控S木質素合成的關鍵基因，該基因在油菜中抗菌核病和抗倒伏的能力強，對于植物木質素的組分改造很有意義。
本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H在油菜抗菌核病中的應用。
本發(fā)明的再一個目的在于提供了一種甘藍油菜木質素單體合成基因F5H在油菜抗倒伏中的應用。
為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采用以下技術措施一種甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H，它包括下列步驟1)在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索與F5H(Ferulate 5-hydroxylase)同源的核苷酸序列并下載其mRNA序列及CDs(coding domain)。用DNAMAN及DNAStar軟件(通過商業(yè)途徑市場購買獲得，下同)對檢索到的完整mRNA序列進行比對分析，在基因編碼序列的兩側及保守區(qū)段設計(引物正向引物[5’-ATGGAGTCTTCTATATCACAAACACTAAG-3’]；表反向引物[5’-TTA(a，g)A(c，g)AG(a，c)ACA(a，g)AT(a，c)AGGCG(t，c)GTG-3’]，下同)。
2)以cDNA為模板進行RT-PCR擴增，擴增得到的片段進行測序，得到了F5H基因序列(SEQ ID NO1)。
通過上述方法獲得了甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H，該基因在油菜抗菌核病和抗倒伏中有廣泛的應用，采用一種反義RNA技術抑制F5H基因表達活性的轉基因油菜，其特征在于轉基因植物表現(xiàn)為木質素含量增加，比受體對照(非轉基因植株)木質素含量增加5％以上，抗菌核病和抗倒伏能力提高，轉基因植株比受體對照(非轉基因植株)病斑擴展面積變小30％以上，莖桿強度則比對照(非轉基因植株)增強在10％以上。
在本發(fā)明中為了達到上述目的采用以下技術方法，提供了一種質粒表達載體pBI121(從商業(yè)途徑獲得，中國科學院遺傳與發(fā)育研究所購置，下同)，它含有特異表達啟動子(木質部特異表達的C4H啟動子)和翻譯控制件。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種可在植物中表達的宿主菌，本發(fā)明優(yōu)先的是農(nóng)桿菌，更優(yōu)選的是根癌農(nóng)桿菌LBA4404(從商業(yè)途徑獲得，中國科學院遺傳與發(fā)育研究所購置，下同)。本發(fā)明也提供了一種將所述載體導入植物細胞的方法，如基因槍注射法，細菌導入法。本發(fā)明優(yōu)選農(nóng)桿菌導入法，如農(nóng)桿菌LBA4404油菜子葉柄導入法。
本發(fā)明提供了一種反義RNA技術抑制F5H基因表達活性的轉基因油菜的方法，其特征在于油菜木質素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力增強。該方法包括下列步驟1)克隆的油菜木質素單體合成基因F5H連接到質粒pBI121上，形成可轉化或表達的載體；2)將步驟1)中制備的載體轉入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，再導入甘藍型油菜植株中；3)篩選陽性植株。
在本發(fā)明中，①取油菜mRNA，用DNAMAN及DNAStar軟件對檢索到的完整mRNA序列進行比對分析，在基因編碼序列的兩側及保守區(qū)段設計特異引物進行RT-PCR擴增，得到了基因序列(SEQ ID NO1)。用HindIII/BamHI分別雙酶切C4H啟動子PCR產(chǎn)物和PBI121質粒，將PCR酶切片段和PBI121質粒酶切大片段連接后，轉化到感受態(tài)細胞DH5α(從商業(yè)途徑獲得，如從由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所購置)中擴增，然后再將F5H基因引入到該載體(PBI121)中，并取代載體中原有的GUS序列，而載體中的35S啟動子序列則被C4H啟動子序列所取代，構建植物反義表達載體重新命名為pC4HBnF5。②將含有F5H基因的載體轉染根癌農(nóng)桿菌LBA4404，培養(yǎng)農(nóng)桿菌于YEP液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCl5g)，并將無菌苗在農(nóng)桿菌菌液中浸泡。③在加Kan的選擇培養(yǎng)基篩選陽性克隆。
在本發(fā)明的一個具體實施例中，植株無菌苗選自油菜，通過選擇培養(yǎng)基最后篩選到油菜木質素單體合成基因F5H反義表達的植株，植株表現(xiàn)出木質素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力提高10-30％。
本發(fā)明中所用的術語“轉基因植物”是指含有導入的基因并能夠穩(wěn)定地增強或抑制所導入的基因表達并產(chǎn)生具有特定的生物學性狀的植物。
本發(fā)明中的“植物細胞”是指植物的各種末成熟胚，或愈傷組織，或懸浮細胞，或原生質體。這些植物細胞在適當?shù)臈l件下均能再生成植物。
克隆本發(fā)明中所述的油菜木質素單體合成基因F5H的方法是本領域中所常采用的方法。提取mRNA的方法也有多種成熟的技術(如采用TRIzol Reagent，Invetrogen)，提取mRNA試劑盒如可從商業(yè)途徑獲得，而構建cDNA文庫也是常用的分子生物學技術。構建本發(fā)明中所述的載體和將載體轉染入植株也是本領域中所常采用的方法。其中所涉及的質粒(如質粒表達載體pBI121)，轉染用媒體(如根癌農(nóng)桿菌LBA44040和所用試劑可從商業(yè)途徑獲得)。
本發(fā)明是國內(nèi)首次公開甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H序列及其在油菜中的應用，并首次利用RNAi技術調(diào)控植物木質素的合成，增加提高G/S比值，即提高了G木質素在木質素總量中的比例，轉基因植物木質素含量比受體對照(非轉基因植株)木質素含量增加5％以上，轉基因植株比受體對照(非轉基因植株)病斑擴展面積變小30％以上，莖桿強度比對照(非轉基因植株)增強在10％以上，大大地提高了油菜的抗菌核病和抗倒伏的能力。此方法也為作物抗病、抗倒伏研究及育種開辟了一條新的思路。


圖1RT-PCR擴增的F5H cDNA目標片段示意2植物表達載體示意圖Kan為卡那抗性，C4H為啟動子，反義的F5H基因為克隆基因插在C4H啟動子之后。
圖3C4H啟動子的轉反義F5H基因油菜的PCR結果1-11樣為轉基因植株，12為對照野生植株，14為陽性對照。結果顯示轉基因植株2，3，4，7，98成功導入了反義基因。
具體實施例方式
通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等人(Blackwell科學出版社，1988)所述的條件，或按照所用試劑制造廠商所建議的條件。
實施例1(基因的克隆及測序)利用NCBI數(shù)據(jù)庫，用DNAMAN及DNAStar軟件對檢索到的序列進行比對分析，在基因編碼序列的兩側及保守區(qū)段設計引物(正向引物[5’-ATGGAGTCTTCTATATCACAAACACTAAG-3’]；反向引物[5’-TTA(a，g)A(c，g)AG(a，c)ACA(a，g)AT(a，c)AGGCG(t，c)GTG-3’])，用來從油菜中擴增F5H的對應序列。
1、提取油菜mRNA。
RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)液氮研磨100mg材料。
A.加1mlTRIZOL，室溫(20-25℃，下同)放置5min。
B.加入200ul氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置2min。
C.12000g，15min，4攝氏度。取上清至新管中，加入500ul異丙醇，混勻后室溫放置15min。
D.12000g，15min，4攝氏度。去上清，加入1ml70％乙醇。
E.7500g，7min，4攝氏度。去上清，空氣干燥。
F.DEPC-H2O溶解。
2、cDNA第一鏈的反轉錄采用RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas)，操作參照所用試劑盒說明進行。
3、在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索，用DNAMAN及DNAStar軟件對檢索到的序列進行比對分析，在基因編碼序列的兩側及保守區(qū)段設計引物，用來從油菜中擴增F5H的對應序列。
4、以cDNA為模板進行RT-PCR擴增，得到了基因序列(SEQ ID NO1)。實施例2(載體構建)利用PCR反應在C4H啟動子5’端和3’端分別引入HindIII和BamHI酶切位點序列，然后用HindIII/BamHI分別雙酶切C4H啟動子PCR產(chǎn)物和PBI121質粒，將PCR酶切片段和質粒酶切大片段連接后，轉化到感受態(tài)細胞DH5α請寫明DH5α耒源，中擴增，然后再將反義的F5H片段引入到該載體(PBI121)中并取代載體(PBI121)中原有的GUS序列，而載體中的35S啟動子序列則被C4H啟動子序列所取代(如圖2示)，其插入片段經(jīng)DNA測序鑒定。
實施例3(植株的轉化與篩選)油菜的農(nóng)桿菌LBA4404轉化A.無菌苗的準備種子經(jīng)70％7醇1min，HgCl2浸泡13-15min，ddH2O洗5次后，平鋪于MS于培養(yǎng)基(PH 5.8)中，瓊脂濃度0.8％。油菜無菌苗備用。
B.油菜子葉柄轉化接種根癌農(nóng)桿菌LBA4404(含F(xiàn)5H基因)于固體培養(yǎng)基LB上，兩天后挑取單菌落于50ml YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取4-5天無菌苗子葉柄，于菌液中浸泡5-8min，其間輕搖，而后倒去菌液，以無菌濾紙吸去外植體上殘留菌液。置于共培養(yǎng)基耒源上培養(yǎng)2-3天。
C.將共培養(yǎng)后的外植體轉入只含Car不含Kan的分化培養(yǎng)基中，黑暗條件的溫室中進行脫菌與分化培養(yǎng)5-7d。再繼代在添加Kan篩選壓的選擇培養(yǎng)基(MS+3mg/L 6BA+0.1mg/L NAA+5mg/L AgNO3+400mg/L Car+10～15mg/L Kan；pH5.8)中，進行篩選，待分化出再生綠芽。
D.待再生芽長至1cm時切取小芽移至生根培養(yǎng)基(MS+0.2mg/L NAA+10mg/L Kan+400mg/L Car；pH5.8)上，用加Car與Kan的固體MS培養(yǎng)基篩選。
E.苗生根后，移栽入蛭石。10天后移栽下土缽。
實施例4(轉化植株的核酸分析-PCR鑒定)
(1)用于PCR的轉化植株總DNA的提取A.70％乙醇擦洗葉片，稱取大約100mgB.加入600ul抽提緩沖液(0.2M Tris-Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，室溫快速研磨。
C.1.5ml Ependorff管中渦旋混勻5~10sD.12000rpm，25min，室溫。取上清，加等體積異丙醇，-20攝氏度沉淀過夜。
E.12000rpm，15min，室溫。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。
F.12000rpm，15min，室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。
G.加無菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計測定或電泳估測其濃度。
H.以總DNA為模板，進行PCR。
(2)PCR程序PCR反應混合液的配比同質粒(含F(xiàn)5H基因)PCR鑒定，反向引物[5’-GATTGCTTTGATATTGTCACGGGT-3’]和對應于NOS終止子的正向引物[5’-AAGACCGGCAACAGGATTCAAT-3’]，反應的時間和溫度作如下94攝氏度3min94℃30s，55℃1min，72℃1.5min，30cycles72攝氏度5min結果如圖3示實施例5(轉基因油菜木質素含量及抗菌核病和莖桿強度的測定)(1)木質素含量的測定將切取的莖段部分在烘箱中烘干至恒重，用粉碎機充分粉碎后，稱取0.3g樣品，加入7.5ml 72％的硫酸，30℃消化1h，然后用蒸餾水將消化液稀釋至硫酸濃度為4％，121℃下處理1h，冷卻至室溫后，單層濾紙過濾，最后將殘渣烘干后稱重，計算木質素的含量(％)。
(2)菌核病抗性鑒定A)油菜苗期采用離體葉接種菌核鑒定。在油菜抽苔前，從同一部位剪取葉片，將葉片放入白磁盤，每盤兩組，每組8片葉，葉柄用濕紗布保濕。菌絲片倒置于葉片的主脈上部葉肉。接種后用透明塑料薄膜覆蓋保濕100％，23℃溫育2d后，調(diào)查病斑直徑(cm)。三次重復，每次重復5-7片葉，計算其平均病斑面積(cm2)。
B)油菜終花期采用牙簽法進行田間鑒定。牙簽在沸水中煮沸15min，撿出放入到PDA液體培養(yǎng)中，高壓滅菌，然后成放射狀排列于含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，中心放上直徑為8mm菌絲塊。23℃培養(yǎng)3～5d，待牙簽上長滿菌絲，然后將牙簽接種在距地面30cm的油菜莖桿上，一周后測量病斑長度(cm)。每個小區(qū)測定15株，計算平均值。
(3)莖桿強度測定在油菜成熟期間，用倒伏試驗器DIK-7401(購置日本)對油菜的莖稈強度進行測定。選取生長正常的油菜，每個小區(qū)測定15株，于莖桿中部處截去上層冠層部分，用稈強儀將植株彎成一定的角度(45°)，測定莖桿強度(N/莖)，計算其平均值。
SEQUENCE LISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所<120>甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H及應用<130>甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H及應用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1560<212>DNA<213>油菜<400>1atggagtctt ctatatcaca aacactaagt caattattag atcccacaac ggctattctc 60atcatcgtct cacttttcat attcatcggc ctcatcacac gacggcgaag gtcttaccca 120cccggtccac gtggttggcc catcataggc aatatgttaa tgatggacca actcacccac 180cgtggtttag ccaacttagc taaaaaatat ggcggcttgt gccatctccg catgggcttc 240ctccatatgt atgccgtctc atcacctcat gtggctcgac aagtcctcca agtccaagac 300agcatcttct cgaaccggcc ggcaacgata gctataagct atttgactta tgaccgagcc 360gacatggcgt tcgctcacta cggaccgttt tggagacaga tgaggaaagt gtgtgtcatg 420aaggtgttta gccgtaaacg cgcggagtca tgggcttctg ttcgagatga agtggacaaa 480atgatccggt cggtatctag taacgttggt aagtctataa acgtcgggga gcaaactttc 540gccctgaccc gaaacataac ttaccgggca gcgttcgggt cagcttgcga aaagggacaa 600gatgagttca taagaatctt acaagagttc tctaagcttt ttggagcctt caacgtagca 660gatttcatac catattttgg gtggatcgat ccacaaggga taagcaagcg gctcgtgaag 720gcccgtaatg atctagacgg atttattgac gatatcatcg acgaacatat gaagaagaaa 780gagaatcaaa acactgttga tgatggagat gttggtgata ccgatatggt tgatgatctt 840cttgcttttt acagtgaaga ggccaaatta gtgagcgaga caacggatct tcagaattct 900atcaaactta cccgtgacaa tatcaaagca atcatcatgg acgtcatgtt cggaggaacg 960gaaacggtag cttctgcaat agagtgggcc ttaacggagt tattacggag ccccgaggat1020
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權利要求
1.一種分離的基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一種甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H在油菜抗菌核病中的應用。
3.一種甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H在油菜抗倒伏中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H及應用。該基因合成首先是在NcBI數(shù)據(jù)庫中檢索與F5H同源的核苷酸序列，對檢索到的序列設計正向和反向引物；其次以cDNA為模板進行擴增，得到了基因序列SEQ ID NO1，該甘藍型油菜木質素單體合成基因F5H在油菜抗菌核病和抗倒伏中的應用，轉基因植物表現(xiàn)為木質素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力提高10－30％。
文檔編號C12N15/82GK101041821SQ20071005156
公開日2007年9月26日 申請日期2007年2月16日 優(yōu)先權日2007年2月16日
發(fā)明者王漢中, 師竹娟, 劉貴華, 楊向東, 王新發(fā), 楊慶, 沈金雄, 鄭元本 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所