一種改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復系及其改良方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物育種技術領域，具體涉及一種改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性 不育恢復系及其改良方法。
【背景技術】
[0002] 蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復系（oguracytoplasmicmalesterility，oguraCMS) 在 1968 年首次在蘿卜（Raphanussativus)資源中被發(fā)現(xiàn)（OguraH.Studiesonthe malesterilityinJapaneseradishwithspecialreferencetotheutilization ofthissterilitytowardsthepracticalraisingofhybridseed[J].MemFac AgricKagoshimaUniv，1968,6:39 - 78·)，其不育性穩(wěn)定徹底，是由細胞質(zhì)中線粒體 嵌合基因 0rfl38 (BrownGG，F(xiàn)ormanovaN，JinH，etalTheradishRforestorergene ofOguracytoplasmicmalesterilityencodesaproteinwithultiplepenta tricopeptiderepeats[J].PlantJ,2003,35(2):262 - 272. ；DesloireS,GherbiH,Laloui W，etal.Identificationofthefertilityrestorationlocus,Rfo,inradish，a samememberofthepentatricopeptide-repeatproteinfamily[J].EMBORep, 2003, 4(6):588 - 594.)和一對隱性細胞核基因（rfrf)共同控制（BonhommeS，BudarF， LancelinD，etal.SequenceandtranscriptanalysisoftheNco2. 50gura-specific fragmentorrelatedwithcytoplasmicmalesterilityinBrassicahybrids[J].Mol GenGenet，1992, 235 (2) :340 - 348.)的。
[0003]因為所有甘藍型油菜品種均可以很好地保持其不育性，所以被認為是轉(zhuǎn)育高產(chǎn)、 高含油量油菜不育系的首選途徑。但由于油菜品種中不存在OguraCMS系的恢復源，所以 油菜蘿卜質(zhì)雄性不育三系利用的主要任務是選育甘藍型油菜OguraCMS的恢復系。
[0004]然而，研究（GiancolaS，MarhadourS，DesloireS，etal·Characterization ofaradishintrogressioncarryingtheOgurafertilityrestorergeneRfoin rapeseed，usingtheArabidopsisgenomesequenceandradishgeneticmapping[J]. 11^(^4??1661^^，2003，107(8):1442 - 1451.)表明，把恢復基因?qū)胗筒说耐瑫r也導致 了恢復系農(nóng)藝性狀不良和籽粒硫代含量的增加，并且利用各種傳統(tǒng)育種技術很難有效降低 后代植株籽粒的硫甙含量（文雁成，張書芬，王建平，等.甘藍型油菜蘿卜質(zhì)雄性不育恢復 系的篩選和初步研究[J].華北農(nóng)學報，2010, 25(4) : 102 - 106.)，法國INRA(1987)報道了 將帶有恢復基因的蘿卜染色體片段導入到了油菜中，利用γ射線誘變獲得了低硫甙含量 的OguraCMS恢復系R2000,并且由其研究出的用于甘藍型油菜蘿卜質(zhì)不育雙低恢復系選 育的PCR標記也取得了較好的效果。隨后，各國研究者開展了對OguraCMS恢復系的改良和 相關遺傳研究。通過遺傳定位、測序等方法，已有許多報道關于導入油菜的帶有恢復基因的 蘿卜染色體片段的核酸信息。因此，至今已經(jīng)獲得了部分與這些關鍵恢復基因緊密連鎖的 分子標記。這為開展Ogura恢復系創(chuàng)新過程中用分子標記作為輔助手段提供了必要條件。
[0005]自獲得甘藍型油菜Ogura CMS恢復系后，育種家和研究者們開展了大量的回交和 系譜選育，以期獲得強恢復力和低硫苷的油菜恢復系材料。遺憾的是，通過以上方法獲得的 Ogura CMS恢復系并未得到實質(zhì)性改良。這是因為常規(guī)雜交的遺傳基礎是染色體重組，其本 身所帶有的染色體片段（不利基因）無法剔除。因此，若要打破不利基因（硫苷）的連鎖， 縮短蘿卜染色體片段需采用其他方法。
[0006] 采用輻照（物理誘變）的方法，可以隨機打斷植物細胞中的染色體，從而創(chuàng)造新材 料。基于此原理，將導入油菜中的外源蘿卜染色體片段打斷，縮短其長度是可行的。法國 INRA的研究者Primar-Brisset等（2005)采用輻照方法獲得了新型恢復系R2000,較以往 的恢復系版本有了很大的改良。然而，恢復系R2000的外源蘿卜染色體片段仍然太長，這對 其農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的表現(xiàn)具有很大的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供了一種改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性 不育恢復系，該雄性不育恢復系農(nóng)藝性狀優(yōu)良，為強優(yōu)勢雜交組合選育提供了基礎。同時， 本發(fā)明另一個所要解決的技術問題在于提供了一種改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不 育恢復系的改良方法。
[0008]-種改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復系，它由以下方式改良：
[0009] (1)以甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育系為母本，以甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性 不育恢復系為父本，雜交獲得匕代種子；
[0010] ⑵對h代種子進行輻照處理，輻照處理后將Fi代種子播種，得到F玳植株；
[0011] (3)以甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育系為母本，以匕代植株為父本，雜交獲得種 子，將種子播種，得到后代植株；
[0012] (4)對所述后代植株中的可育株進行單株分子標記篩選；
[0013] 最終獲得所述改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復系。
[0014] 本發(fā)明采用輻照處理和分子標記篩選相結合的方法，剔除了外源蘿卜染色體片段 中幾個與恢復基因緊密連鎖的分子標記，篩選獲得外源蘿卜染色體片段比原始恢復系更短 的改良型甘藍型油菜Ogura CMS恢復系，有效解決了原始恢復系雜種優(yōu)勢不強，生育期遲、 植株矮小，生長勢弱、品質(zhì)差等問題。
[0015] 本發(fā)明中，所述甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育系為不育系Fu58Drakkar;所述 甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復系為恢復系R2000。不育系Fu58Drakkar和恢復系 R2000 均購自法國INRA(2010 年 1 月 8 日，No.lOOlLi)。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟（2)中，采用6°C〇y射線對F1代種子進行均勻輻照，輻照劑量為 1200 ~2600Gy，劑量率為 1. 2Gy/min。
[0017] 作為進一步優(yōu)選，步驟（2)中，采用6°Co對F1代種子進行均勻輻照，輻照劑量為 2000Gy，劑量率為 1. 2Gy/min。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟（4)中，所述分子標記包括G26;以及BonJon、0PF10或0PN20中的 至少一種。其中，G26是基于恢復基因本身的分子標記，而Bonjon、0PF10和0PN20則是與 恢復基因緊密連鎖的分子標記。在改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復系中，G26 必須存在，它的存在表明恢復系對Ogura CMS不育系仍然具有恢復育性的能力；而Bonjon、 0PF10和0PN20則需要被剔除，因其會給恢復系帶來不良的農(nóng)藝性狀。
[0019] 作為優(yōu)選，所述分子標記篩選包括：分別提取可育株單株的基因組DNA，并以基因 組DNA為模板，利用引物進行PCR擴增，根據(jù)擴增結果篩選改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄 性不育恢復系；
[0020] 其中，第一對引物（用于擴增分子標記Bonjon)為：
[0021] 上游引物：5' -GATCCGATTCTTCTCCTGTTG-3' ；
[0022] 下游引物：5 ' -GCCTACTCCTCAAATCACTCT-3 ' ；
[0023] 第二對引物（用于擴增分子標記0PF10)為：
[0024]上游引物：5 ' -AACTTTTTGTGTTTGATTTCTTGC-3 '；
[0025]下游引物：5 ' -ACTCCTTCTAAACAAAACCAAACA-3 '；
[0026] 第三對引物（用于擴增分子標記0PF20)為：
[0027]上游引物：5 ' -CCTTAGTTTAGTTGTAGGTGGTGG-3 '；
[0028]下游引物：5 ' -AGAAACCGCTCAATITTAACATAA-3 '；
[0029] 第四對引物（用于擴增分子標記G26)為：
[0030]上游引物：5 ' -GCTCACCTCATCCATCTTCCTCAG-3 '；
[0031]下游引物：5 ' -CTCGTCCTTTACCTTCTGTGGTTG-3 '。
[0032] 本發(fā)明第三個所要解決的技術問題在于提供了分子標記組合物在篩選改良型甘 藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復系中的應用，所述分子標記組合物為G26、B〇nJ〇n、0PF10 和 0PN20〇
[0033] 作為優(yōu)選，所述應用包括：
[0034](1)以甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育系為母本，以甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性 不育恢復系為父本，雜交獲得匕代種子；
[0035] (2)對匕代種子進行輻照處理，輻照處理后將Fi代種子播種，得到F 植株；
[0036] (3)以甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育系為母本，以匕代植株為父本，雜交獲得種 子，將種子播種，得到后代植株；
[0037] (4)利用上述四對引物對所述后代植株中的可育株進行單株分子標記篩選，獲得 所述改良型甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復系。
[0038] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0039] 本發(fā)明采用輻照處理和分子標記篩選相結合的方法，在保證恢復系對OguraCMS 不育系具有恢復育性能力的同時，剔除了外源蘿卜染色體片段中三個與恢復基因緊密連鎖 的分子標記，篩選獲得外源蘿卜染色體片段比原始恢復系更短的改良型甘藍型油菜Ogura CMS恢復系，為強優(yōu)勢雜交組合選育提供了基礎。
【附圖說明】