r>[0040]圖1為本發(fā)明一種改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系的改良方法的 流程圖；
[0041] 圖2為RC947單株與原始恢復(fù)系R2000的分子標(biāo)記篩選結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 一種改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系的改良方法，包括以下步驟 (其流程圖見圖1):
[0045] (1)以甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系Fu58Drakkar(以下簡稱不育系 Fu58Drakkar)為母本，以甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系R2000(以下簡稱恢復(fù)系 R2000)為父本，雜交獲得種子；
[0046] 本實(shí)施例中，為擴(kuò)大母本和父本的種源，先用保持系G142(為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所油菜育種組自育材料，后更名為浙油50)將不育系Fu58Drakkar 保持一代，同時恢復(fù)系R2000自交一代；再以不育系Fu58Drakkar或保持系G142保持的不 育系Fu58Drakkar BC0(其與不育系Fu58Drakkar的基因型相同）為母本，與父本恢復(fù)系 R2000雜交，獲得Fjf種子約500g。
[0047] (2)對匕代種子進(jìn)行輻照處理，輻照處理后將Fi代種子播種，得到F玳植株；
[0048] 以6°Co作為輻照源，分別以lOOOGy，2000Gy，3000Gy和4000Gy為輻照劑量，劑量率 均為1. 2Gy/min。對匕代種子進(jìn)行輻照處理（室溫下進(jìn)行），輻照處理在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué) 院作物與核技術(shù)利用研究所浙江省輻照中心內(nèi)完成，以篩選合適的半致死劑量。最終確定 的輻照劑量為2000Gy、劑量率為1. 2Gy/min。
[0049] (3)以不育系Fu58Drakkar BC0為母本，以Fi代植株為父本，雜交獲得種子，將種 子播種，得到后代植株；
[0050] (4)淘汰后代植株中的不育株，對可育株進(jìn)行單株分子標(biāo)記篩選，獲得改良型甘藍(lán) 型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系。
[0051] 具體地：分別提取可育株單株幼嫩葉片的基因組DNA，并以基因組DNA為模板，利 用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0052]用于篩選的分子標(biāo)記為Bonjon(參見Primard-Brisset Cet al. 2005. A new recombined double low restorer line for the Ogu-INRAcms in rapeseed(Brassica napus L.).Theor.Appl. Genet. Ill:736-746. )、0PF10(參見Wu Yet al. 2000. Abinary vector-based large insert library for Brassica napus and identification of clones linked to a fertility restorer locus for Ogura cytoplasmic male sterile(CMS) .Genome 43:102-109.)、0PN20和G26(Christopher PS et al.2005. Improved fertility restoration for Ogura cytoplasmic male sterile Brassica and method. W02005074671A1, World Intellectual Property Organization·)，根據(jù)分子標(biāo)記 的序列分別設(shè)計(jì)引物并委托上海生物工程有限公司合成。合成后的引物序列見表1。
[0053]表1
[0054]
[0055]PCR程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性30s，55°C退火30s(退火溫度依據(jù)梯 度PCR結(jié)果而定），72°C復(fù)性45s，循環(huán)35次；最后72°C保溫lOmin。
[0056] 將PCR產(chǎn)物保存于4°C冰箱備用。PCR產(chǎn)物電泳后用凝膠成像儀（北京君意東方， JY04S-3D)記錄結(jié)果。
[0057] 本實(shí)施例中，改良型恢復(fù)系R2000的篩選程序?yàn)椋?br>[0058] ①利用檢測0PN20的引物對每株可育株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測可育株 是否缺失該標(biāo)記，篩選出缺失0PN20的可育株；
[0059] ②利用檢測0PF10的引物對每株缺失0PN20的可育株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 篩選出缺失0PN20-0PF10的可育株；
[0060] ③利用檢測Bonjon的引物對每株缺失0PN20-0PF10的可育株的基因組DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，篩選出缺失0PN20-0PF10-BonJon的可育株；
[0061] ④利用檢測G26的引物對每株缺失0PN20-0PF10-BonJon的可育株的基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出缺失0PN20-0PF10-BonJon但具備G26的可育株即為改良型恢復(fù)系 R2000〇
[0062] 通過以上程序最終篩選出一株編號為RC947的可育單株，即為本實(shí)施例的改良型 恢復(fù)系R2000。RC947單株與原始恢復(fù)系R2000的分子標(biāo)記比對分析結(jié)果見表2和圖2。
[0063]表2
[0064]
[0065] 由表2可見，在原始恢復(fù)系R2000中四個分子標(biāo)記均被檢測到，而在RC947單株中 均無檢測到0PN20、0PF10、Bonjon，但G26仍然存在；這表明RC947單株的恢復(fù)基因仍然存 在，對Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育系仍然具有恢復(fù)育性能力，同時也缺失了原始恢復(fù)系R2000所 具備的不良農(nóng)藝性狀。
[0066]因此，RC947單株含有更短的蘿卜恢復(fù)基因片段，是獲得的新恢復(fù)株系，可作為Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育三系雜交育種的新恢復(fù)材料。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系，其特征在于，它由以下方式改 良： (1) 以甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育 恢復(fù)系為父本，雜交獲得匕代種子； (2) 對h代種子進(jìn)行輻照處理，輻照處理后將Fi代種子播種，得到F植株； (3) 以甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以匕代植株為父本，雜交獲得種子， 將種子播種，得到后代植株； (4) 對所述后代植株中的可育株進(jìn)行單株分子標(biāo)記篩選； 最終獲得所述改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系。2. 如權(quán)利要求1所述的改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系，其特征在于， 步驟（4)中，所述分子標(biāo)記包括G26 ;以及Bonjon、0PF10或0PN20中的至少一種。3. -種改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系的改良方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1) 以甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育 恢復(fù)系為父本，雜交獲得匕代種子； (2) 對匕代種子進(jìn)行輻照處理，輻照處理后將Fi代種子播種，得到F植株； (3) 以甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以匕代植株為父本，雜交獲得種子， 將種子播種，得到后代植株； (4) 對所述后代植株中的可育株進(jìn)行單株分子標(biāo)記篩選，獲得所述改良型甘藍(lán)型油菜 蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系。4. 如權(quán)利要求3所述的改良方法，其特征在于，所述甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育 系為不育系Fu58Drakkar。5. 如權(quán)利要求3所述的改良方法，其特征在于，所述甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育 恢復(fù)系為恢復(fù)系R2000。6. 如權(quán)利要求3所述的改良方法，其特征在于，步驟⑵中，采用6°Coγ射線對F1代 種子進(jìn)行均勻輻照，輻照劑量為1200~2600Gy，劑量率為1. 2Gy/min。7. 如權(quán)利要求3或6所述的改良方法，其特征在于，步驟（2)中，采用6°Coγ射線對F1 代種子進(jìn)行均勻輻照，輻照劑量為2000Gy，劑量率為1. 2Gy/min。8. 如權(quán)利要求3所述的改良方法，其特征在于，步驟（4)中，所述分子標(biāo)記包括G26 ;以 及Bonjon、0PF10或0PN20中的至少一種。9. 如權(quán)利要求3或8所述的改良方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記篩選包括：分別提取 可育株單株的基因組DNA，并以基因組DNA為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果篩 選改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系； 其中，第一對引物為： 上游引物：5' -GATCCGATTCTTCTCCTGTTG-3' ； 下游引物：5' -GCCTACTCCTCAAATCACTCT-3' ； 第二對引物為： 上游引物：5' -AACTTTTTGTGTTTGATTTCTTGC-3' ； 下游引物：5' -ACTCCTTCTAAACAAAACCAAACA-3' ； 第三對引物為： 上游引物：5' -CCTTAGITTAGTTGTAGGTGGTGG-3' ； 下游引物：5' -AGAAACCGCTCAATTTTAACATAA-3' ； 第四對引物為： 上游引物：5' -GCTCACCTCATCCATCTTCCTCAG-3' ； 下游引物：5' -CTCGTCCTTTACCTTCTGTGGTTG-3'。10.分子標(biāo)記組合物在篩選改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系中的應(yīng)用， 其特征在于，所述分子標(biāo)記組合物為G26、Bonjon、0PF10和0PN20。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改良型甘藍(lán)型油菜蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系及其改良方法，該改良方法包括：以甘藍(lán)型油菜Ogura？CMS不育系為母本，以甘藍(lán)型油菜Ogura？CMS恢復(fù)系為父本，雜交獲得F1代種子；對F1代種子進(jìn)行輻照處理，輻照處理后播種得到F1代植株；以甘藍(lán)型油菜Ogura？CMS不育系為母本，以F1代植株為父本，雜交獲得種子，種子播種后得到后代植株；對后代植株中的可育株進(jìn)行單株分子標(biāo)記篩選，獲得改良型甘藍(lán)型油菜Ogura？CMS恢復(fù)系。本發(fā)明剔除了外源蘿卜染色體片段中幾個與恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，篩選獲得具有更短外源蘿卜染色體片段的改良型恢復(fù)系，改良型恢復(fù)系具有優(yōu)良農(nóng)藝形狀和更高籽粒產(chǎn)量。
【IPC分類】A01H1/04, A01H1/06, A01H1/02
【公開號】CN105248273
【申請?zhí)枴緾N201510741364
【發(fā)明人】華水金, 張冬青, 張永平
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 溫州嘉友生物科技有限公司
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月4日