專利名稱：雙黃連制劑在抑制病毒誘導Hela細胞凋亡中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及雙黃連制劑在抑制病毒誘導Hela細胞凋亡中的應用以及Hela細胞培養(yǎng)液，Hela細胞凋亡的檢測方法。
背景技術：
Hela細胞凋亡的檢測方法對于篩選治療病毒性疾病的藥物有幫助。雙黃連制劑抑制病毒誘導Hela細胞凋亡中的應用尚未見報道。
流行性感冒簡稱流感。流感病毒是流感的病原體，流感病毒極易產(chǎn)生變異，形成新的病毒株，因人群對新毒株無免疫力，故常引起流行，對人類危害很大，因此，抗流感病毒藥物研究倍受關注。20世紀60年代以來，抗流感病毒藥物陸續(xù)出現(xiàn)，常用的有①離子通道劑，作用靶點為流感病毒基質蛋白-2，如金剛烷胺等；②神經(jīng)胺酸酶抑制劑，作用靶點為流感病毒的神經(jīng)胺酸酶如神經(jīng)胺酸酶抑制劑。③其它藥作用靶點為流感病毒的核酸，如病毒唑。上述藥物雖有可觀的療效，但毒性大，而且易產(chǎn)生耐藥性。近年來人們?yōu)榱藢ふ依硐氲目沽鞲兴幬镎τ谘邪l(fā)中草藥，并已發(fā)現(xiàn)有不少中草藥可以抗流感病毒。常見的有野菊花、大青葉、板蘭根、金銀花和黃岑等。它們的作用靶點為流感病毒及其組成成分。
由于分子生物學飛速發(fā)展，多學科滲透推動了病毒學的發(fā)展，目前研究已證明流感病毒可在體內和體外誘導宿主細胞凋亡，產(chǎn)生炎癥改變，這是流感病毒引起疾病的重要機制。
細胞壞死和細胞凋亡是細胞死亡兩種完全不同的方式，二者具有本質不同。后者為細胞在基因控制下，主動的程序化死亡。凋亡細胞形態(tài)學改變是判斷細胞凋亡的重要指標。凋亡細胞經(jīng)染色，在光鏡下觀察，其特征為核固縮，核斷裂，形呈新月形，花瓣狀，黑洞狀，八字形等改變。依此可計算出凋亡率(AI)和抑制率(IR)。凝膠電泳中，核酸片段形成梯帶狀。細胞凋亡技術的應用促進了抗病毒藥物機理研究，開創(chuàng)了一新的研究途徑，增加了尋找藥物抗病毒作用新靶點手段?，F(xiàn)已有實驗研究報道某些抗流感病毒藥物如魚金及穿琥寧等，可抑制流感病毒誘導宿主細胞凋亡。這是藥物抗流感病毒作用的新靶點。
雙黃連常被用于防治流感，并且已獲得了令人可喜的效果。傳統(tǒng)的研究采用動物及細胞水平的方法進行抑毒試驗證明雙黃連抗流感病毒作用的靶點是病毒粒子。病毒包膜和病毒的吸附。然而，雙黃連是否能影響流感病毒宿主細胞，可否找到與上不同的作用靶點在國內國外至今沒有見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供雙黃連制劑在抑制病毒誘導Hela細胞凋亡中的應用以及Hela細胞培養(yǎng)液，Hela細胞凋亡的檢測方法。
本發(fā)明的技術方案為雙黃連制劑在抑制病毒誘導Hela細胞凋亡中的應用。
Hela細胞培養(yǎng)液，其中Hela細胞培養(yǎng)液是添加體積百分濃度0.25％的胰蛋白酶，體積百分濃度0.02％EDTA組成的消化液。
Hela細胞凋亡的檢測方法，其中按下列步驟操作A、制備細胞B、制備流感病毒C、測試藥物毒性限量D、測病毒EID50E、雙黃連抑制病毒誘導細胞凋亡試驗分組F、試驗步驟G、流式細胞儀測試本發(fā)明的主要實驗儀器如下CO2培養(yǎng)箱(SL-SHELDON，USA)；超低溫冰箱(SANYO，JAPAN)；低溫冰箱(-20℃，中國上海)；II級生物安全操作柜(哈爾濱儀器廠制)；凈化工作臺(江蘇凈化設備廠)；電子天秤(EK-120，JAPAN)；倒置顯微鏡(日本歐olympus-ckx41)；流式細胞儀(FACS Calibur，BD公司USA)；臺式高速(TGL-16G，上海安享)；電熱恒溫箱(上海躍進醫(yī)療儀器廠)；50ml細胞培養(yǎng)瓶、24孔、96孔組織培養(yǎng)板(Costor公司、USA)；移液器(Glison公司，USA)(八頭、單頭)各一把。
本發(fā)明的主要實驗材料和試劑如下甲1型流感病毒感病毒株(A/南昌/692/97(H1N1)由南昌大學醫(yī)學院微生物教研室分離獲得、經(jīng)世界衛(wèi)生組織和美國疾病控制中心鑒定。甲1型流感病毒是經(jīng)經(jīng)世界衛(wèi)生組織和美國疾病控制中心鑒定的標準病毒，也可以通過其他科研機構購買。
HeLa細胞中的宮頸癌(Hela)傳代細胞(購自武漢大學生命科學院物種保藏中心)。
HeLa細胞還可以由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心或山東省醫(yī)學科學院藥物研究所提供。
HeLa細胞來源廣泛，是最常見的應用于藥物研究的細胞。
雞胚(購自南昌市種蛋廠)。
DMEM基礎培養(yǎng)基(Gibco公司，USA)。
牛血清白蛋白及胰蛋白酶(Sigma公司，USA)。
胎牛血清(海克隆公司，USA)。
Annexin V及PI(美國BD公司)。
雙黃連注射液(含金銀花、黃芩、連翹)黑龍江多得藥業(yè)有限公司，批號2005081312。
本發(fā)明涉及的雙黃連制劑是一種市場上可以購買到的常規(guī)的藥品，主要是雙黃連注射液，雙黃連注射液拼音名Shuanghuanglian Zhu sheye其標準編號WS3-B-2104-96，配方為金銀花250g、黃芩250g、連翹500g，制法以上三味，黃芩酌予碎斷，加水煎煮二次，每次1小時，分次濾過，合并濾液，濾液用鹽酸(2mol/L)調pH而得?；蛘唠p黃連制劑按中國藥典記載的方法獲得。
實驗數(shù)據(jù)效果(1)雙黃連制劑對Hela細胞毒性范圍與無毒界限(見表1)表1 雙黃連細胞毒性試驗結果


注+-++++表示產(chǎn)生細胞病變的程度表1結果表示，不同濃度的雙黃連組中，以1∶64為無毒界限。
(2)雙黃連制劑抑制流感病毒誘導Hela細胞凋亡結果，采用Anuexinl及PI雙染法用流式細胞儀測試，詳細結果見表2及

圖1。
表2流式細胞儀測試結果(X±S，n＝3)

※與病毒感染組比較P＜0.01(3)采用金銀花、黃芩、連翹(1∶64～1∶256濃度)測試結果與上述相同。
(4)結論本發(fā)明采用Hela細胞為靶細胞，以雙染法在流式細胞儀上測試了雙黃連對流感病毒甲型誘導細胞凋亡的影響。結果病毒感染組與試驗組比較，細胞凋亡率有非常顯著的差異(P＜0.01)，試驗組與其它組比較無顯著差異，證明雙黃連可抑制流感病毒誘導Hela細胞凋亡。雙黃連抗流感病毒不僅是單純抑制流感病毒，還作用流感病毒宿主細胞即靶細胞凋亡，首次發(fā)現(xiàn)雙黃連抗流感病毒的新靶點。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果雙黃連制劑抗流感病毒，一方面直接作用病毒顆粒，破壞病毒包膜，阻斷病毒復制，作用靶點為病毒。另一方面雙黃連制劑抑制流感病毒誘導細胞凋亡，抵抗炎癥消除疾病。從分子生物學水平上揭示了雙黃連有新的抗流感病毒作用部位即新靶點。增加了中草藥抗病毒理論知識點，對完善知識結構，促進學科發(fā)展具有重要的作用。
證明了雙黃連制劑抗流感病毒作用有新靶點，多一個靶點，則多一個作用，比只有一個靶點作用強。這是雙黃連在臨床療效好應用多的原因之一。
具體實施例方式
實施例1、雙黃連制劑在抑制病毒誘導Hela細胞凋亡中的應用。
實施例2、Hela細胞培養(yǎng)液，其中Hela細胞培養(yǎng)液是添加體積百分濃度0.25％的胰蛋白酶，體積百分濃度0.02％EDTA組成的消化液。
Hela細胞培養(yǎng)液還可以是其他種類的，但采用本實施例的Hela細胞培養(yǎng)液，可以較好的保持Hela細胞活性，并配合其他步驟獲得有效的Hela細胞凋亡的檢測方法。
實施例3、Hela細胞凋亡的檢測方法，其中按下列步驟操作A、制備細胞①取帶有生長液的長成單層的Hela細胞一瓶，以磷酸緩沖鹽液洗滌三次；其中的HeLa細胞來源廣泛，是最常見的應用于藥物研究的細胞；HeLa細胞可以由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心或山東省醫(yī)學科學院藥物研究所、武漢大學生命科學院物種保藏中心提供；②再添加體積百分濃度0.25％的胰蛋白酶，體積百分濃度0.02％EDTA組成的消化液37℃培育5～10分鐘，輕輕搖動至細胞脫落；③再添加體積百分濃度10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的生長液制成細胞懸液；④將Hela細胞分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，24孔板和96孔細胞培養(yǎng)板中，供用；B、制備流感病毒①取-70℃凍存甲1型流感病毒行加稀釋液作10倍系列稀釋得到稀釋的病毒液；稀釋液為添加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基；②稀釋的病毒液接種Hela細胞，在培養(yǎng)箱中37℃、體積混合比例為5∶95的CO2和空氣的混合氣體條件下孵育3-5天；無菌收集，-70℃存放備用；C、測試藥物毒性限量①取24孔細胞培養(yǎng)板長成單層的Hela細胞；②棄添加體積百分濃度10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的生長液，以磷酸緩沖鹽液洗三次；③取雙黃連注射液加稀釋液作2倍系列稀釋得到雙黃連注射液稀釋樣品，稀釋液為添加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基，雙黃連注射液稀釋樣品平行的放置在3個孔中；④在培養(yǎng)箱中37℃、體積混合比例為5∶95的CO2和空氣的混合氣體條件下孵育3-5天；⑤每日觀察細胞病變；D、測病毒EID50①取10日齡雞胚，消毒打孔；②將甲1型流感病毒液加稀釋液作10倍系列稀釋接種雞胚尿囊腔，每腔接種0.2ml，每稀釋度接種4只胚，37℃孵育；稀釋液為添加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基；③3天后收集各胚尿囊腔液測紅細胞凝集滴度，記錄EID50；E、雙黃連抑制病毒誘導細胞凋亡試驗分組①細胞對照組Hela細胞加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基作為維持液；②藥物對照組藥物加Hela細胞加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基作為維持液；③病毒對照組Hela細胞加病毒加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基作為維持液；④試驗組Hela細胞加病毒加藥物加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基作為維持液；F、試驗步驟①取形成單層的Hela細胞4瓶，棄上清，以磷酸緩沖鹽液洗3次；②同時加入流感病毒100EID50，加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基的維持液稀釋的藥液，稀釋度為1∶128，在培養(yǎng)箱中37℃、體積混合比例為5∶95的CO2和空氣的混合氣體的條件下孵育；③設病毒對照，藥液對照和細胞對照組；④每天觀察細胞，待細胞產(chǎn)生病變時，分別收集各組細胞進行測試；G、流式細胞儀測試①取各組試驗細胞，分別以磷酸緩沖鹽液洗3次；過濾使細胞分散；②將細胞濃度調至1×106/ml；③取100μl細胞懸液置專用試管中，加5μ1Annexin V及10μlPI，立即加100μl緩沖工作液混勻；④置4℃冰箱30分鐘；⑤加400μl工作液；⑥檢測Hela細胞凋亡數(shù)據(jù)；計算10000個細胞，每標本測試3次。
實施例3、Hela細胞培養(yǎng)液添加體積百分濃度0.25％的胰蛋白酶，體積百分濃度0.02％EDTA組成的消化液。
權利要求
1.雙黃連制劑在抑制病毒誘導Hela細胞凋亡中的應用。
2.Hela細胞培養(yǎng)液，其特征在于Hela細胞培養(yǎng)液是添加體積百分濃度0.25％的胰蛋白酶，體積百分濃度0.02％EDTA組成的消化液。
3.Hela細胞凋亡的檢測方法，其特征在于按下列步驟操作A、制備細胞①取帶有生長液的長成單層的Hela細胞一瓶，以磷酸緩沖鹽液洗滌三次；②再添加體積百分濃度0.25％的胰蛋白酶，體積百分濃度0.02％EDTA組成的消化液37℃培育5～10分鐘，輕輕搖動至細胞脫落；③再添加體積百分濃度10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的生長液制成細胞懸液；④將Hela細胞分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，24孔板和96孔細胞培養(yǎng)板中，供用；B、制備流感病毒①取-70℃凍存甲1型流感病毒行加稀釋液作10倍系列稀釋得到稀釋的病毒液；稀釋液為添加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基；②稀釋的病毒液接種Hela細胞，在培養(yǎng)箱中37℃、體積混合比例為5∶95的CO2和空氣的混合氣體條件下孵育3-5天；無菌收集，-70℃存放備用；C、測試藥物毒性限量①取24孔細胞培養(yǎng)板長成單層的Hela細胞；②棄添加體積百分濃度10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的生長液，以磷酸緩沖鹽液洗三次；③取雙黃連注射液加稀釋液作2倍系列稀釋得到雙黃連注射液稀釋樣品，稀釋液為添加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基，雙黃連注射液稀釋樣品平行的放置在3個孔中；④在培養(yǎng)箱中37℃、體積混合比例為5∶95的CO2和空氣的混合氣體條件下孵育3-5天；⑤每日觀察細胞病變；D、測病毒EID50①取10日齡雞胚，消毒打孔；②將甲1型流感病毒液加稀釋液作10倍系列稀釋接種雞胚尿囊腔，每腔接種0.2ml，每稀釋度接種4只胚，37℃孵育；稀釋液為添加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基；③3天后收集各胚尿囊腔液測紅細胞凝集滴度，記錄EID50；E、雙黃連抑制病毒誘導細胞凋亡試驗分組①細胞對照組Hela細胞加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基作為維持液；②藥物對照組藥物加Hela細胞加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基作為維持液；③病毒對照組Hela細胞加病毒加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基作為維持液；④試驗組Hela細胞加病毒加藥物加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基作為維持液；F、試驗步驟①取形成單層的Hela細胞4瓶，棄上清，以磷酸緩沖鹽液洗3次；②同時加入流感病毒100EID50，加體積百分濃度4％白蛋白的DMEM培養(yǎng)基的維持液稀釋的藥液，稀釋度為1∶128，在培養(yǎng)箱中37℃、體積混合比例為5∶95的CO2和空氣的混合氣體的條件下孵育；③設病毒對照，藥液對照和細胞對照組；④每天觀察細胞，待細胞產(chǎn)生病變時，分別收集各組細胞進行測試；G、流式細胞儀測試①取各組試驗細胞，分別以磷酸緩沖鹽液洗3次；過濾使細胞分散；②將細胞濃度調至1×106/ml；③取100μl細胞懸液置專用試管中，加5μlAnnexin V及10μlPI，立即加100μl緩沖工作液混勻；④置4℃冰箱30分鐘；⑤加400μl工作液；⑥檢測Hela細胞凋亡數(shù)據(jù)；計算10000個細胞，每標本測試3次。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙黃連制劑在抑制病毒誘導Hela細胞凋亡中的應用以及Hcla細胞培養(yǎng)液，Hela細胞培養(yǎng)液是添加體積百分濃度0.25％的胰蛋白酶，體積百分濃度0.02％EDTA組成的消化液。Hela細胞凋亡的檢測方法，其中按下列步驟操作A.制備細胞；B.制備流感病毒；C.測試藥物毒性限量；D.測病毒EID
文檔編號C12Q1/18GK101020923SQ20071005166
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月12日 優(yōu)先權日2007年3月12日
發(fā)明者孫堅, 何士勤, 王農(nóng)榮, 楊斌 申請人:孫堅