檢測轉(zhuǎn)基因玉米t4-1-1外源基因純合/雜合狀態(tài)的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種對轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的檢測方 法，本發(fā)明還涉及針對上述檢測所用的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因作物的檢測中，不僅需要知道樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，含有何種轉(zhuǎn)基 因成分，有時還需要確認(rèn)外源DNA插入的純合或雜合狀態(tài)。這種轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測亦 稱為篩選檢測。
[0003] 轉(zhuǎn)基因成分檢測中，可以將外源DNA看作一個基因座位。純合體的2倍體基因組 中檢測靶標(biāo)核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)為2;雜合體的2倍體基因組中外 源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)為1;非轉(zhuǎn)基因材料中則為0。因此，轉(zhuǎn)基因檢測過程中，必需 對原材料中靶標(biāo)核酸序列的遺傳特性進(jìn)行確認(rèn)，即確認(rèn)外源DNA插入所產(chǎn)生的特征序列是 純合還是雜合狀態(tài)。此外，在轉(zhuǎn)基因作物遺傳育種過程中，往往需要將轉(zhuǎn)基因材料與其它材 料進(jìn)行雜交、轉(zhuǎn)育以獲得適合的栽培品種，利用分子生物學(xué)手段快速、簡便鑒定純合體/雜 合體育種材料，也有利于縮短育種進(jìn)程。
[0004] 迄今未止，國內(nèi)外還沒有針對轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因純合/雜合狀態(tài)的檢測 方法，只能確定轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分或含有何種轉(zhuǎn)基因成分。
[0005] 因此，找到能直接鑒別玉米T4-1-1樣品中外源DNA插入的純合或雜合狀態(tài)的方法 并開發(fā)相應(yīng)的檢測試劑，很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種針對轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀 態(tài)的檢測方法，并開發(fā)針對上述檢測所用的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明首先設(shè)計了一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合 狀態(tài)的PCR檢測引物。根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源插入片段旁側(cè)序列信息，在玉米染色體 部分設(shè)計出一對能夠準(zhǔn)確檢測轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的PCR 檢測引物，其核苷酸序列分別為SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示。
[0009] 本發(fā)明提供了一種針對轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的檢 測方法，其步驟為：
[0010] (1)提取待檢測水稻樣品的DNA;
[0011] (2)以上述提取的DNA為模板，以SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列 為擴增引物，建立PCR擴增體系，并進(jìn)行PCR擴增；
[0012] 如果僅擴增出一條SEQIDNo. 3所示核苷酸序列的片段，鑒定為純合轉(zhuǎn)基因玉米 T4-1-1；
[0013] 如果擴增出分別為SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示核苷酸序列的兩條片段，鑒 定為雜合轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1 ;
[0014] 如果僅擴增出一條SEQIDNo. 4所示核苷酸序列的片段，鑒定為不是轉(zhuǎn)基因玉米 T4-1-1。
[0015] 其中，所述的從待檢測玉米樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA 的各種常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或經(jīng)驗證適用于植物DNA提取的試劑盒等各 種方法。
[0016] 本發(fā)明中所述的PCR擴增體系可參考以下方法建立：反應(yīng)體系的總體積為 25.〇4 1^，其中，10\1^丁&9 811打6111(]\%2卞1118)緩沖液2.5 4 1^丁&1^1^11^丁&9(51]/^1) 聚合酶0·25μL，dNTPMixture(2·5mMeach)4·0μL，10μmol/LSEQIDNo·l所示的引物 lμL，10μmol/LSEQIDNo·2所示的引物lμL，25ng/μLDNA模板2μL，余量為雙蒸水。
[0017] 所述的PCR擴增條件優(yōu)選為：94°C變性lmin;(94°C20s，65°C5min)30個循環(huán)； 72°C延伸 5min。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種用于轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的 PCR檢測試劑盒，其特征是包括有一對PCR檢測引物，所述引物的核苷酸序列分別為SEQID No. 1 和SEQIDNo. 2 所示。
[0019] 本發(fā)明檢測方法能夠準(zhǔn)確的檢測出轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜 合狀態(tài)，為轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1成分檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制、轉(zhuǎn)基因定量檢測、樣品鑒定奠定了 基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0020] 圖1PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1純合體瓊脂糖凝膠電泳圖；其中
[0021] M:Trans2KplusIIDNAMarker;1 :空白對照；2 :T4-1-1 純合體；3 :T4-1-1 受 體和Τ4-1-1純合體混合樣品；4 :陰性對照。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實施例僅是范例性的，本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形 式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0023] 實施例1轉(zhuǎn)基因玉米Τ4-1-1外源基因純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測方法的建立
[0024]1、引物設(shè)計及序列
[0025] 該轉(zhuǎn)化體外源整合結(jié)構(gòu)位于玉米基因組1號染色體上，其中，引物T4-1-1-F位于 5'端玉米基因組上；引物T4-1-1-R位于3'端玉米基因組上。
[0026] 引物序列
[0027]T4-1-1-F：TTAGCAGAGTCGTGAGAGTTTAG(SEQIDNo. 1)
[0028]T4-1-1-R：TAGTAAATGTGATGAAACCATGAA(SEQIDNo. 2)
[0029] 2、PCR擴增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序：
[0030]反應(yīng)體系：10XLATaqBufferII(Mg2+Plus)緩沖液2. 5yL，TaKaRaLATaq(5U/ μ1)聚合酶 0· 25μL，dNTPMixture(2. 5mMeach) 4. 0μL，10μmol/LSEQIDNo. 1 所示的 引物lμL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物lμL，25ng/μLDNA模板2μL，用去離子水 補至25μL。
[0031]PCR擴增程序：94°C變性lmin;(94°C20s，65°C5min)30 個循環(huán)；72°C延伸 5min。
[0032] 3、結(jié)果判定
[0033] 純合轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1中僅能擴增出一條4419bp的片段；雜合轉(zhuǎn)基因玉米 T4-1-1同時擴增出兩條片段，一條為4419bp，另一條為386bp;而非轉(zhuǎn)基因玉米中只能擴增 出一條386bp片段。
[0034] 實施例2轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測的應(yīng)用實驗
[0035] 一、植物材料
[0036] 1、轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1純合體；
[0037] 2、非轉(zhuǎn)基因水稻：T4-1-1受體；
[0038] 3、Τ4-1-1受體和轉(zhuǎn)基因玉米Τ4-1-1純合體混合樣品。
[0039] 二、實驗方法
[0040] (一）、植物基因組DNA的提取與檢測
[0041] 1.植物材料DNA提取
[0042] 采用植物基因組DNA提取試劑盒DP305 (天根生化科技有限公司）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因玉 米Τ4-1-1及其受體玉米基因組DNA提取和純化。提取步驟參見試劑盒說明書。
[0043] 2.DNA檢測
[0044] 采用紫外分光光度計檢測DNA濃度與純度時，DNA應(yīng)在0D260處有顯著吸收峰， 0D260/0D280 比值應(yīng)為L7-L9。
[0045](二）、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序的建立
[0046] 按照實施例1所述的PCR擴增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行。
[0047] 三、實驗結(jié)果
[0048] 實驗結(jié)果如圖1所示；純合體Τ4-1-1僅能擴增出一條4419bp的片段；Τ4-1-1受 體和T4-1-1純合體混合樣品擴增出兩條片段，一條為4419bp，另一條為386bp;非轉(zhuǎn)基因玉 米只能擴增出一條386bp片段。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測引物對，其核 苷酸序列分別為SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所示。2. -種用于測定轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測試劑 盒，其特征是包括有權(quán)利要求1所述的PCR檢測引物對。3. -種檢測轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的方法，其步驟為： (1) 提取待檢測水稻樣品的DNA; (2) 以上述提取的DNA為模板，以SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列為引 物，建立PCR擴增體系，并進(jìn)行PCR擴增； ⑶根據(jù)擴增出的DNA片段，確定外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)： 如果僅擴增出一條SEQIDNo.3所示核苷酸序列的片段，鑒定為純合轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1 ； 如果擴增出分別為SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示核苷酸序列的兩條片段，鑒定為 雜合轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1 ; 如果僅擴增出一條SEQIDNo.4所示核苷酸序列的片段，鑒定為不是轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1。4. 權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴增體系按照以下方式建立：反應(yīng) 體系的總體積為25.〇4 1^，其中，10\1^丁&9 811打6111(]\%2卞1118)緩沖液2.5 4 1^了&1^1^ LATaq(5U/μl)聚合酶0·20μL，dNTPMixture(2·5mMeach)4·0μL，10μmol/LSEQID No. 1 所示的引物 1yL，10ymol/LSEQIDNo. 2所示的引物 1yL，25ng/yLDNA模板2yL， 余量為雙蒸水。5. 權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴增條件為：94°C變性lmin; (94°C，20s，65°C，5min) 30 個循環(huán)；72°C延伸 5min。 6. SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示序列的核苷酸在制備檢測轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源 基因插入的純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測試劑中的應(yīng)用。 7. SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示序列的核苷酸在檢測轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因 插入的純合/雜合狀態(tài)中的應(yīng)用。 8. SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示序列的核苷酸在檢測轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因 插入的純合/雜合狀態(tài)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種針對轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的檢測方法。本發(fā)明設(shè)計了PCR檢測引物。以從待檢測樣品提取的DNA為模板，用所述引物進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)擴增出的DNA片段，可以確定出外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)。本發(fā)明還提供了用于測定轉(zhuǎn)基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測試劑盒。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105274229
【申請?zhí)枴緾N201510728614
【發(fā)明人】張維, 周正富, 余桂容, 郭翠, 徐利遠(yuǎn), 林敏
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年10月30日