專利名稱：恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒及方法
恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織近期發(fā)表的《2010年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)》報(bào)告顯示，由于轉(zhuǎn)基因作物帶來(lái)的巨大益處，過(guò)去15年內(nèi)大約有I億人次的農(nóng)民做出種植決定。自轉(zhuǎn)基因作物投入商業(yè)化種植15年來(lái),全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積累計(jì)已經(jīng)超過(guò)10億公頃。2010年,全球29個(gè)國(guó)家的1540萬(wàn)農(nóng)民種植了共I. 48億公頃的轉(zhuǎn)基因作物。自1996年至2010年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增加了 87倍。種植轉(zhuǎn)基因 作物排名前十位的國(guó)家種植面積首次均超過(guò)了 100萬(wàn)公頃。這些國(guó)家按照作物種植面積的大小排列分別是美國(guó)(6680萬(wàn)公頃)、巴西(2540萬(wàn)公頃)、阿根廷(2290萬(wàn)公頃)、印度(940萬(wàn)公頃)、加拿大(880萬(wàn)公頃)、中國(guó)(350萬(wàn)公頃)、巴拉圭(260萬(wàn)公頃)、巴基斯坦(240萬(wàn)公頃)、南非(220萬(wàn)公頃)和烏拉圭(110萬(wàn)公頃)。目前，世界各國(guó)已進(jìn)行田間試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因作物超過(guò)5000種，批準(zhǔn)商品化的轉(zhuǎn)基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、木瓜、甜菜、煙草、水稻等。轉(zhuǎn)基因玉米作為目前世界上最主要的轉(zhuǎn)基因作物之一，占全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積的30%以上，僅次于轉(zhuǎn)基因大豆。.轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034是由美國(guó)孟山都公司研發(fā)的一種表達(dá)cry 1A. 105和cry2Ab2基因，對(duì)鱗翅類害蟲(chóng)具有抗性的轉(zhuǎn)基因玉米品系，目前已被授權(quán)用于加拿大牲畜飼料，其代表性種子保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)為PTA-7455。2010年11月29日，一批從美國(guó)進(jìn)口的5. 4萬(wàn)噸的轉(zhuǎn)基因玉米就曾因?yàn)楸粰z出轉(zhuǎn)基因成分M0N89034，而被作出退貨決定。從世界范圍看，轉(zhuǎn)基因玉米的推廣已經(jīng)帶來(lái)了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。然而轉(zhuǎn)基因玉米在帶來(lái)巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也存在許多問(wèn)題，主要集中在轉(zhuǎn)基因食品的安全性以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全性方面，包括對(duì)人和動(dòng)物健康的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)非目標(biāo)生物的風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)第一種風(fēng)險(xiǎn)，1993年，聯(lián)合國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與合作組織(OECO)提出了食品安全性評(píng)估的“實(shí)質(zhì)等同性”原則。如果準(zhǔn)基因作物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品具有實(shí)質(zhì)等同性，則可以認(rèn)為是安全的。最早提出對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理的是歐盟，1998年，歐盟在世界上簽署第一個(gè)法案，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)簽說(shuō)明；1999年，要求出口到歐盟的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有I %的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染；2002年，歐盟將標(biāo)識(shí)的最低限量降低到0.9%。日本，澳大利亞，新西蘭對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做了不同規(guī)定，域值從1-5%不
坐寸ο我國(guó)于2001年5月9日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，于2002年I月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)，標(biāo)識(shí)和進(jìn)口安全管理三個(gè)配套管理辦法，確定了第一批實(shí)施標(biāo)識(shí)管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實(shí)施。為了能夠?qū)D(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品做出綜合評(píng)價(jià)，除了需要各國(guó)政府和國(guó)際機(jī)構(gòu)制定科學(xué)的安全評(píng)價(jià)體系以及嚴(yán)格的管理法規(guī)外，建立有效的方法體系對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測(cè)也很重要，這是對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)和實(shí)施監(jiān)管的基礎(chǔ)，也是農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易健康發(fā)展的重要保障。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)要求方法要快速，準(zhǔn)確，靈敏，并且還得考慮適應(yīng)大樣品量，目標(biāo)基因種類多等特點(diǎn)。因此，目前轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)主要是檢測(cè)樣品是否含有外源蛋白質(zhì)(基因表達(dá)產(chǎn)物)和是否含有外源基因(DNA)。轉(zhuǎn)基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試紙條檢測(cè)、Western雜交等方法檢測(cè)，主要從待測(cè)樣品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基質(zhì)，利用與目的蛋白(抗原)特異性結(jié)合的特性，通過(guò)偶聯(lián)抗體與抗原抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，但是這種方法要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，只能作為輔助檢測(cè)手段。轉(zhuǎn)基因作物的核酸檢測(cè)方法主要有兩種核酸分子雜交技術(shù)(Sourthernblot) ,PCR檢測(cè)技術(shù)。其中PCR檢測(cè)方法是最主要,最準(zhǔn)確地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，競(jìng)爭(zhēng)性定 量PCR方法，熒光定量PCR方法等等。目前，國(guó)內(nèi)外推廣使用的是定性PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。通過(guò)聚合酶的作用，在體外快速特異地?cái)U(kuò)增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增到百萬(wàn)倍，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后很容易觀察，因而具有快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)。然而，PCR方法反應(yīng)體系和操作過(guò)程比較復(fù)雜，需要專業(yè)人員；所需PCR儀價(jià)格在5萬(wàn)元左右，擴(kuò)增時(shí)間2-3小時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果的電泳時(shí)間需要I小時(shí)左右；電泳常用染料EB為強(qiáng)致癌物質(zhì)，有較強(qiáng)毒性，且難以實(shí)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。所以，在科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中均需要一種快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop-MediatedIsothermal Amplification,以下簡(jiǎn)稱LAMP法)是日本榮研化學(xué)株式會(huì)社于2000年前后開(kāi)發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前尚未有將LAMP法應(yīng)用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種基于上述試劑盒的恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的檢測(cè)方法。本發(fā)明的上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒主要由四條引物、DNA聚合酶、反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照組成，以上液體分別置于容器中。本發(fā)明的恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒還可以有顯色劑。其中(1)、根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034的外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處的序列設(shè)計(jì)了 4條引物，應(yīng)用上述四條引物，擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)域，四條引物是外引物I :CTATGTAAGAGGTGTTTGAAJn SEQ ID No. I 所示；外引物2 :GTAAGATGTGAGTATGATCC，如 SEQ ID No. 2 所示；內(nèi)引物 I :GTCCATCTATCAAATCAGCACCGTCTATCCACGGTCCGTGCGCACC，如 SEQ IDNo. 3所示；內(nèi)引物 2 GAACAACATCTCTGGAGTCGGTGAGTCCGGCGTACTGCGCCACC,如 SEQ IDNo. 4 所
/Jn ο上述引物可以通過(guò)高通量DNA合成儀按照操作說(shuō)明書(shū)合成，并通過(guò)HPLC(高壓液相法)純化。
引物混合液將合成引物干粉分別配成濃度為ΙΟΟμΜ的母液，然后取外引物I、外弓丨物2各1μ 1，內(nèi)引物I、內(nèi)引物2各8μ 1，充分混合。(2) —種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，例如可采用Bst DNA聚合酶濃度為7-9υ/μ 1，優(yōu)選 8υ/μ I ;(3)反應(yīng)液含有IOmM dNTP (三磷酸脫氧核糖核苷)，10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液(耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液)反應(yīng)緩沖液，150mM MgSO4水溶液，三者的體積比是7-9 4-6 2，優(yōu)選 IOmM dNTP/10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液/150mM MgSO4 = 8/5/2 ;(4)陽(yáng)性對(duì)照為濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備質(zhì)粒并提取其DNA。本發(fā)明的恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒還可以有顯色劑熒光染料SYBR Green I。本發(fā)明采用上述試劑盒恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034及其衍生品種的方法，包括以下步驟(I)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品的DNA提取過(guò)程采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨法)提取純化樣品DNA ；(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ul PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物I μ 1，反應(yīng)液12. 5 μ 1，DNA聚合酶I μ 1，檢測(cè)模板DNA 2_5 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA替代模板DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代模板DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63-65°C反應(yīng)60-90min，并在80°C持續(xù)2min ；(3)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果將反應(yīng)管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應(yīng)，觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)沉淀則為陽(yáng)性，無(wú)沉淀則為陰性。其原理是通過(guò)評(píng)估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀的量來(lái)進(jìn)行。其具有極高的特異性，可通過(guò)濁度儀檢測(cè)反應(yīng)管中的沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。在試劑盒中含有顯色劑的情況下，在(2)中得到產(chǎn)物中加入1-2 μ I顯色劑，混勻，紫外燈下或肉眼觀察，若顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，橙色則為陰性。其中常規(guī)CTAB法提取轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034DNA的方法為(I)取轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034,約IOOmg,放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反復(fù)加入3-4次,磨碎成粉末為止。(2)加入I. 5ml預(yù)熱至65°C的CTAB提取緩沖液，充分混合、懸浮試樣，65°C保育30min,期間不停顛倒混勻；(3)約12000g離心lOmin。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管,加入I倍體積的苯酹氯仿異戊醇(25 24 I)，充分混合。約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；(4)加入I倍體積的氯仿異戍醇(24 I),充分混合。約12000g離心15min。
轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；(5)加入2倍體積的CTAB沉淀緩沖液，室溫靜置保育60min ；12000g離心15min，棄上清；加入350 μ I氯化鈉溶液溶解沉淀；12000g離心IOmin,轉(zhuǎn)移上清至一新離心管；(6)加入O. 6倍體積異丙醇，倒置離心管輕柔混合，室溫放置20min，12000g離心 15min。棄上清。加入500 μ 170%乙醇溶液,并顛倒離心管數(shù)次。12000g離心lOmin。棄上清；(7)干燥DNA沉淀，加100 μ ITE緩沖液溶解DNA。本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP法)是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的四條引物，特異性的識(shí)別靶基因序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果在同一鏈上周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。采用4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63-65°C對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)需在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間依據(jù)模板DNA質(zhì)量變化,一般為90min或更少,在60_90min的短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率可以達(dá)到IO9-IOiq個(gè)拷貝數(shù)。加入模板DNA，在63_65°C經(jīng)60_90min反應(yīng)后，在80°C持續(xù)2min后終止。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需要熱循環(huán)，且由于擴(kuò)增是在恒溫條件下進(jìn)行，因此不需要PCR儀等昂貴儀器。在反應(yīng)中，在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中Mg離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀。本發(fā)明具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等有益效果(I)快速高效整個(gè)擴(kuò)增只用60_90min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)IO9-IOltl個(gè)拷貝；(2)操作簡(jiǎn)便不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恒定溫度儀就能反應(yīng)和檢測(cè)，條件比較溫和；(3)高特異性本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034的外源基因序列設(shè)計(jì)了四條特異性引物應(yīng)用上述四條引物，擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)域，因此具有高度特異性；(4)高靈敏度最低檢測(cè)極限可達(dá)到10個(gè)拷貝；(5)鑒定簡(jiǎn)便可通過(guò)觀察觀察加入SYBR Green I顏色變化或者是否存在焦磷酸鎂沉淀來(lái)判斷擴(kuò)增與否，無(wú)需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的模板DNA的提取方法采用常規(guī)CTAB法。
具體實(shí)施方式實(shí)施例I含顯色劑的試劑盒及其檢測(cè)方法按下列配方制備恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒(I)引物混合液將合成引物干粉分別配成濃度為ΙΟΟμΜ的母液，然后取外引物I、外引物2各1μ 1，內(nèi)引物I、內(nèi)引物2各8μ 1，充分混合，其中引物序列分別為外引物I :CTATGTAAGAGGTGTTTGAA ;如 SEQ ID No. I 所示；外引物2 GTAAGATGTGAGTATGATCC ;如 SEQ ID No. 2 所示；內(nèi)引物 I :GTCCATCTATCAAATCAGCACCGTCTATCCACGGTCCGTGCGCACC ；如 SEQ IDNo. 3所示；內(nèi)引物 2 GAACAACATCTCTGGAGTCGGTGAGTCCGGCGTACTGCGCCACC ;如 SEQ IDNo. 4 所示；⑵DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8U/ μ I ; (3)反應(yīng)液10mM dNTP/10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液 /150mM MgSO4 = 8/5/2 ；(4)顯色劑熒光染料 IXSYBR Green I ；(5)陽(yáng)性對(duì)照為濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA，或用含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代模板DNA ;陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。用上述試劑盒按以下方法對(duì)某玉米品種進(jìn)行檢測(cè)(I)DNA模板準(zhǔn)備過(guò)程采用常規(guī)CTAB法，提取轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的模板DNA ；(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ul PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,Bst DNA聚合酶，I μ 1，模板DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA替代模板DNA，或用含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代模板DNA ;設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代模板DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63°C反應(yīng)60min，并在80°C持續(xù)2min ；(3)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在⑵中得到產(chǎn)物中加入I μ I顯色劑，混勻，肉眼觀察。無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈現(xiàn)黃色，有擴(kuò)增反映的管子變成綠色。本實(shí)施例中，PCR管顯綠色，表明待檢玉米種子中含有或全部為轉(zhuǎn)基因玉米Μοη89034及其衍生品種，含有轉(zhuǎn)基因玉米Μοη89034成分。實(shí)施例2不含顯色劑的試劑盒及其檢測(cè)方法試劑盒除缺少實(shí)施例I中的顯色劑外，其余同實(shí)施例I.檢測(cè)方法除分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果步驟外，其余同實(shí)施例1，分析判斷結(jié)果的方法為將反應(yīng)管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應(yīng),觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)沉淀則為陽(yáng)性，無(wú)沉淀則為陰性。本實(shí)施例中，PCR管出現(xiàn)沉淀，表明待檢玉米種子中含有或全部為轉(zhuǎn)基因玉米Μοη89034及其衍生品種，含有轉(zhuǎn)基因玉米Μοη89034成分。實(shí)施例3PCR反應(yīng)與本發(fā)明檢測(cè)方法靈敏度的比較按下列配方制備恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Μοη89034及其衍生品種的試劑盒(I)引物混合液將合成引物干粉分別配成濃度為ΙΟΟμΜ的母液，然后取外引物I、外引物2各I μ 1，內(nèi)引物I、內(nèi)引物2各8 μ 1，充分混合，其中引物序列分別為
外引物I :CTATGTAAGAGGTGTTTGAA ;如 SEQ ID No. I 所示；外引物2 GTAAGATGTGAGTATGATCC ;如 SEQ ID No. 2 所示；內(nèi)引物 I :GTCCATCTATCAAATCAGCACCGTCTATCCACGGTCCGTGCGCACC ；如 SEQ IDNo. 3所示；內(nèi)引物 2 GAACAACATCTCTGGAGTCGGTGAGTCCGGCGTACTGCGCCACC ;如 SEQ IDNo. 4 所示；(2) DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，也可采用其他DNA聚合酶，濃度為8U/μ I ;(3)反應(yīng)液10mM dNTP/10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液 /150mM MgSO4 = 8/5/2 ；(4)顯色劑熒光染料 IXSYBR Green I ；
(5)陽(yáng)性對(duì)照為濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。用上述試劑盒按以下方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種進(jìn)行檢測(cè)(I)DNA模板準(zhǔn)備過(guò)程采用CTAB法提取純化含有轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034成分的DNA5%,0. 5%,O. 1%,0. 05%,O. 01%,O. 05%的樣品的 DNA ；(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ul PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物I μ 1，反應(yīng)液12. 5 μ 1，DNA聚合酶I μ 1，模板DNA 5 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA替代模板DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代模板DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于65°C反應(yīng)90min,并在 80°C持續(xù) 2min ；(3)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果將反應(yīng)管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應(yīng)，觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)沉淀則為陽(yáng)性，無(wú)沉淀則為陰性。陽(yáng)性對(duì)照、5%、0· 5%,O. 1%,0. 05%,O. 01%,O. 005%均出現(xiàn)沉淀顯示為陽(yáng)性結(jié)果，陰性對(duì)照無(wú)沉淀產(chǎn)生。也可以在(2)中得到產(chǎn)物中加入Iy I顯色劑，混勻，肉眼觀察。無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈現(xiàn)黃色，有擴(kuò)增反映的管子變成綠色。本實(shí)施例中，陽(yáng)性對(duì)照、5%、0. 5%,O. 1%,0. 05%,O. 01%,O. 005%均出現(xiàn)沉淀顯
示為陽(yáng)性結(jié)果，PCR管顯綠色；陰性對(duì)照管子呈現(xiàn)黃色。(4)PCR反應(yīng)引物采用本方法反應(yīng)中的外引物I和外引物2。PCR反應(yīng)為25 μ I體系，10XPCR Buffer (PCR 反應(yīng)緩沖液，Promega 公司)2. 5 μ I, IOmM dNTPs (Promega 公司)0·5μ 1，上、下游引物分別對(duì)應(yīng)外引物I和外引物2，各0·5μ l，Taq酶(5U/μ I，Promega公司)0. 5 μ 1，DNA模板I μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)至25 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，95°C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，72 °C 延伸 7min。PCR 產(chǎn)物取 10μ I 與 2%瓊脂糖凝膠電泳，IOOV電壓下40min，通過(guò)凝膠成像分析儀觀察結(jié)果，.對(duì)應(yīng)條帶分別為M，DL600DNAMa rker (DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn));1，陽(yáng)性對(duì)照；2,5% ；3,0. 5% ;4，0· 1% ；5,0. 05% ;6，0.01% ；7,0. 005% ;8，陰性對(duì)照。其中PCR方法的靈敏度為O. 05%，而6，7顯示為陰性結(jié)果O由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的試劑盒的靈敏度的結(jié)果可以達(dá)到O. 005%的濃度，而PCR方法的靈敏度為O. 05%，而O. 01%或以下顯示為陰性結(jié)果；經(jīng)比對(duì)，本發(fā)明的試劑盒及方法靈敏度明顯高于PCR方法的敏感度，能檢測(cè)出更低含量的樣品。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒，主要由四條引物、DNA聚合酶、反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照組成，以上液體分別置于容器中，其中 (1)引物混合液將合成引物干粉分別配成濃度為IOOyM的母液，然后取外引物I、外引物2各I yl，內(nèi)引物I、內(nèi)引物2各8 y 1，充分混合，四條引物為外引物 I :CTATGTAAGAGGTGITTGAAJn SEQ ID No. I 所示；外引物 2 :GTAAGATGTGAGTATGATCC，如 SEQ ID No. 2 所示；內(nèi)引物 I :GTCCATCTATCAAATCAGCACCGTCTATCCACGGTCCGTGCGCACC，如 SEQ IDNo. 3 所示；內(nèi)引物 2 :GAACAACATCTCTGGAGTCGGTGAGTCCGGCGTACTGCGCCACC，如 SEQ IDNo. 4 所示； (2)DNA聚合酶濃度為7-9U/U1 ； (3)反應(yīng)液含有IOmMdNTP、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4水溶液，三者的體積比是7_9 : 4~6 : 2 ； (4)陽(yáng)性對(duì)照為濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA,陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒，其特征在于 (1)DNA聚合酶為BstDNA聚合酶，濃度為8U/yl ; (2)反應(yīng)液為IOmM dNTP/10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液/150mM MgSO4 = 8/5/2 體積比。
3.權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034及其衍生品種的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品的DNA提取過(guò)程采用CTAB法提取純化樣品DNA ； (2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物混合物I U 1，反應(yīng)液12.5 yl，DNA聚合酶I ii 1，模板DNA 2-5 U I，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 U I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代模板DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代模板DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63-65°C反應(yīng)60-90min，并在80°C持續(xù)2min ； (3)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果將反應(yīng)管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應(yīng)，觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)沉淀則為陽(yáng)性，無(wú)沉淀則為陰性。
4.如權(quán)利要求I所述的一種恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒，還有顯色劑熒光染料SYBR Green I。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒，其特征在于 (1)DNA聚合酶為BstDNA聚合酶，濃度為8U/yl ; (2)反應(yīng)液為IOmM dNTP/10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液/150mM MgSO4 = 8/5/2 體積比。
6.權(quán)利要求4所述的試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034及其衍生品種的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品的DNA提取過(guò)程采用CTAB法提取純化樣品DNA ； (2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物混合物I U 1，反應(yīng)液.12.5 yl，DNA聚合酶I ii 1，模板DNA 2-5 u I，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 U I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因玉米89034的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代模板DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代模板DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63-65°C反應(yīng)60-90min，并在80°C持續(xù)2min ； (3)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在(2)中得到產(chǎn)物中加入1-2 ill顯色劑，混勻，若顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，橙色則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種的試劑盒及方法。試劑盒主要由四條引物、DNA聚合酶、反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照組成，以上液體分別置于容器中；試劑盒還可以有顯色劑。其檢測(cè)方法是通過(guò)提取待檢玉米品種的DNA、采用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63-65℃對(duì)樣品DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，短時(shí)間擴(kuò)增效率可達(dá)到109-1010個(gè)拷貝，其鑒定采用加入SYBR Green I觀察顏色變化或者利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化判斷擴(kuò)增與否，檢測(cè)待檢玉米品種是否含有或?yàn)檗D(zhuǎn)基因玉米Mon89034及其衍生品種。本發(fā)明具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等有益效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102776268SQ20111011868
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日 公開(kāi)號(hào)201110118682.發(fā)明者葉宇鑫, 李志勇, 楊堅(jiān), 石磊, 袁瑛娜, 高東微, 高蘇娟 申請(qǐng)人:廣州迪澳生物科技有限公司